BRPI0715660A2 - anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, mÉtodos para reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar inflamaÇço, prurite e arranhadura em um mamÍfero, e, anticorpo isolado - Google Patents

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Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, MÉTODOS PARA REDUZIR, BLOQUEAR, INIBIR, OU NEUTRALIZAR INFLAMAÇçO, PRURITE E ARRANHADURA EM UM MAMÍFERO, E, ANTICORPO ISOLADO. São obtidas novas composições derivadas de sítios de ligação em antígeno de imunoglobulinas tendo afinidade por IL-3 1. As composições exibem propriedades de ligação imunológicas de moléculas de anticorpo capazes de ligação especificamente em uma IL-3 1 de humano. São obtidas regiões CDR derivadas de mesmos ou diferentes grupos de imunoglobulinas. Também são obtidos polipeptídeos de cadeia única nos quais os domínios VH e VL estão ligados. As moléculas sFv podem incluir grupos de polipeptideo ancilares que podem ser bioativos, ou que proporcionam um sítio de ligação para outros grupos úteis. As composições são úteis em ensaios de ligação específicos, esquemas de purificação por afinidade, seleção de toxina ou droga, imagem, e agentes terapêuticos imunológicos ou genéticos para doenças inflamatórias. A invenção deste modo proporciona polipeptideos novos, os DNAs codificadores daqueles polipeptídeos, cassetes de expressão compreendendo aqueles DNAs, e métodos de indução da produção dos polipeptídeos. A invenção adicionalmente proporciona as seqtiências de aminoácidos das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais e o uso destes anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo juntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, MÉTODOS PARA REDUZIR, BLOQUEAR, INIBIR, OU NEUTRALIZAR INFLAMAÇÃO, PRURITE E ARRANHADURA EM UM MAMÍFERO, E, ANTICORPO ISOLADO" FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A pele desempenha um papel importante no sistema imune e consiste de camadas. A epiderme é uma camada superficial. Debaixo da epiderme está a derme, uma camada de tecido conjuntivo. Debaixo da derme, está a hipoderme, uma camada de quantidades grandes de tecido adiposo. Linfócitos T circulantes migram para a pele sob condições normais e inflamatórias. O antígeno linfócito cutâneo (CLA) é considerado um receptor residente para células-T com tropismo para a pele. Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14:13-18, 2004.
Várias doenças de pele são conhecidas em expressarem níveis altos de células-T CLA+, incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso. Há uma necessidade de tratamento de tais doenças de pele mediadas por célula-T.
As atividades in vivo demonstradas da família de citocinas ilustram o potencial clínico enorme de, e a necessidade de, outras citocinas, agonistas de citocina, e antagonistas de citocina. IL-31, uma citocina recentemente identificada, quando sobre-expressada em camundongos, resulta em sintomas semelhantes à dermatite. Tanto células-T residentes em pele quanto epidérmicos têm estado implicados na patologia de doenças de pele em humanos. A presente invenção atende às necessidades pela obtenção de antagonistas para citocina pró-inflamatória IL-31. Tais antagonistas da presente invenção, que podem bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a atividade de IL-31, incluem receptores IL-3 IRA solúveis e anticorpos neutralizadores anti-IL-31. A invenção adicionalmente proporciona usos dos mesmos em doença inflamatória, bem como composições e métodos relacionados.
Tecnologia de anticorpo monoclonal tem proporcionado uma vasta coleção de agentes terapêuticos bem como diagnósticos para uso em identificação e tratamento de doença. Muitas aplicações clínicas têm focalizado anticorpos monoclonais murinos anti-humano, que são produzidos em células de camundongo mas que especificamente se ligam em um antígeno de humano. Em adição, anticorpos quiméricos compostos de seqüências de aminoácido de humano e de não-humano estão sendo desenvolvidos. Particularmente, moléculas de anticorpo híbridas tendo regiões variáveis derivadas de, por exemplo, uma imunoglobulina murina fiisionada em regiões constantes derivadas de uma imunoglobulina de humano têm sido descritos. Veja e.g., Pat. U.S. No. 4.816.567; Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; e Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224. Ademais, visto que regiões constantes não são exigidas para ligação ou reconhecimento de antígeno, fragmentos de anticorpo tais como F(ab), F(ab')2 e Fv que não compreendem a porção Fc têm sido identificados como candidatos úteis para terapia clínica.
Numerosas moléculas biossintéticas e recombinantes compreendendo sítios de ligação em antígeno de roedor têm sido descritas. Particularmente, moléculas tendo sítios de ligação em antígeno de roedor construídas diretamente sobre anticorpos de humano por graftização apenas do sítio de ligação de roedor, em vez de o domínio variável inteiro, em domínios de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de humano têm sido descritas. Veja, e.g., Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 e Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536. Moléculas tendo um sítio de ligação em antígeno nas quais pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade (CDRS) do domínio variável é derivada de um anticorpo monoclonal murino e as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula são derivadas de imunoglobulina de humano têm sido descritas em Publicação de Patente U.K No. GB 2.276.169, publicada aos 21 de Setembro de 1994. Numerosos polipeptídeos de sítio de ligação em antígeno de cadeia única e moléculas de Fv de cadeia única (sFv) também têm sido descritos. Veja, e.g., Pat. U.S. Nos. 5.132.405 e 5.091.513 de Huston et al.; e Pat. U.S. No. 4.946.778 de Ladner et al.
A(s) função(ões) efetora(s) do domínio Fc de um anticorpo incluem fagocitose, liberação de mediadores inflamatórios, regulação de produção de anticorpos, e o mais importante citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). O grau com o qual qualquer uma destas funções efetoras são induzidas depende da interação do domínio Fc com os mediadores de proteína relevantes, Clq e os receptores Fcy, e difere dependendo das regiões constantes (Fc) de subclasse de IgG e de sua interação com estas proteínas.
O domínio Fc de IgGl interage com FcyRI, FcyRIIa, e FcyRIII sobre células efetores de sistema imune. O papel preciso dos receptores Fcy diferentes permanece para ser elucidado mas FcyRIIIA é considerado em ser o receptor mediador de ADCC mais importante expressado primariamente em células NK mas também monócitos e macrófagos. IgGl também se liga em Clq e pode causar CDC que é mediada principalmente por células NK expressando FcyRIII. O domínio IgG4 Fc tem largamente reduzido afinidade de ligação por Clqe receptores Fcy diferentes, correspondendo às ADCC e CDC reduzidas. Enquanto que IgG 1 mostra atividade geralmente alta para ambas ADCC e CDC, IgG4 é considerada em ter uma atividade baixa ou nula para ADCC ou CDC.
A afinidade de ligação de IgG4 mAb efetor negativo é grandemente reduzida se não abolida quando comparada com os outros mAbs de isótipo IgG. Contudo, a capacidade para interagir com o receptor Brambell (FcRn) é retida em IgG4 afetando deste modo a farmacocinética do mAb de isótipo IgG4 através de uma meia-vida aumentada.
Assim, há uma necessidade de moléculas que proporcionem as seqüências de aminoácidos de anti-IL3 de humano conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano para tratar inflamação mediada por IL-31. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 é um alinhamento das seqüências de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias leves e cadeias pesadas de clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, e 294.144.3.5.
Figura 2 é um alinhamento das seqüências de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias leves e cadeias pesadas de clones 292.12.3.1 e 292.84.1.6.
Figuras 3 e 4 são um alinhamento um alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leves e pesadas de anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL31 de humano. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Antes de descrever a invenção em detalhe, pode ser útil para o seu entendimento a definição dos seguintes termos: Como aqui usado, o termo "anticorpos" inclui anticorpos
policlonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, anticorpos monoclonais, e fragmentos de ligação em antígeno, tais como fragmentos proteolíticos Fab e F(ab')2. Anticorpos intactos ou fragmentos geneticamente engenhados, tais como anticorpos quiméricos, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia única e semelhante, bem como polipeptídeos e peptídeos de ligação em antígeno sintéticos, também estão incluídos. Anticorpos de não-humano podem ser humanizados por graftização de CDRs de não-humano em regiões constantes e de molde de humano, ou por incorporação dos domínios variáveis inteiros de não-humano (opcionalmente "ocultando-os" com uma superfície humana-semelhante pela substituição de resíduos expostos, sendo que o resultado é um anticorpo "folheado"). Em alguns casos, anticorpos humanizados podem reter resíduos de não-humano dentro dos domínios de molde de região variável de humano para intensificar as características de ligação apropriadas. Através de humanização de anticorpos, meia-vida biológica pode ser aumentada, e o potencial para reações imunes adversas sob administração a humanos é reduzido.
O termo "anticorpo quimérico" ou "anticorpos quiméricos" refere-se aos anticorpos cujos genes de cadeias leves e pesadas têm sido construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de genes de regiões constantes e variáveis de imunoglobulina pertencendo a espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser unidos nos segmentos constantes de humano, tais como gama 1 e gama 3. Um anticorpo quimérico terapêutico típico é deste modo uma proteína híbrida composta do domínio de ligação em antígeno ou variável de um anticorpo de camundongo e o domínio constante de um anticorpo de humano, embora outras espécies de mamífero possam ser usadas.
Como aqui usado, o termo "imunoglobulina" refere-se a uma proteína consistindo de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leves e pesadas são juntas responsáveis pela ligação em um antígeno, e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras de anticorpo.
"Cadeias leves" de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável na terminação-NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante kappa ou lambda na terminação- COOH. "Cadeias pesadas" de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos), são similarmente codificadas por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante acima mencionados (cerca de 330 aminoácidos). Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsílon, e definem o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. (Veja geralmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (incorporada como referência em sua totalidade para todos os propósitos).
Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste de uma região "de molde" interrompida por três regiões hipervariáveis. Deste modo, o termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação em antígeno. A região hipervariável compreende os resíduos de aminoácido de uma "Região Determinante de Complementaridade" ou "CDR" (i.e., resíduos 24-34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de
cadeia pesada (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,
th
Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (i.e., resíduos 26- 32 (LI), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917) (ambas as quais são aqui incorporadas como referências). Resíduos de "Região de molde" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável como aqui definido. As seqüências das regiões de molde das cadeias leves ou pesadas diferentes estão relativamente conservadas dentro de uma espécie. Assim, uma "região de molde de humano" é uma região de molde que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, normalmente 90-95% ou mais) à região de molde de uma imunoglobulina de humano naturalmente ocorrente. A região de molde de um anticorpo, que é as regiões de molde combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDR's. As CDR's são primariamente responsáveis pela ligação de um epitopo de um antígeno.
Conseqüentemente, o termo imunoglobulinas "humanizadas" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo uma região de molde de humano e uma ou mais CDR1S de uma imunoglobulina de não-humano (normalmente de camundongo ou rato). A imunoglobulina de não-humano proporcionando as CDR1S é chamada de a "doadora" e a imunoglobulina de humano proporcionando o molde é chamada de a "aceptora". Regiões constantes não necessitam estar presentes, mas se estiverem, elas precisam ser substancialmente idênticas às regiões constantes de imunoglobulina de humano, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, preferivelmente cerca de 95% ou mais idênticas. Disso, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto possivelmente as CDR's, são substancialmente idênticas às partes correspondentes das seqüências de imunoglobulina de humano natural.Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina de cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Por exemplo, um anticorpo humanizado não incluiria um anticorpo quimérico típico como definido acima, e.g., porque a região variável inteira de um anticorpo quimérico é não-humana.
O termo "anticorpos geneticamente alterados" significa anticorpos nos quais a seqüência de aminoácidos tem sido variada daquela de um anticorpo nativo. Por causa da relevância das técnicas de DNA recombinante na geração de anticorpos, não é necessário se prender às seqüências de aminoácidos encontradas em anticorpos naturais; anticorpos podem ser reprojetados para obter as características desejadas. As variações possíveis são muitas e variam da mudança de apenas um ou uns poucos aminoácidos ao reprojeto completo de, por exemplo, a região constante ou variável. Mudanças na região constante serão feitas, em geral, com o propósito de melhorar ou alterar as características, tais como fixação de complemento, interação com membranas e outras funções efetoras. Mudanças na região variável serão feitas para melhorar as características de ligação em antígeno.
Em adição aos anticorpos imunoglobulinas podem existir em
uma variedade de outras formas incluindo, por exemplo, de cadeia única ou Fv, Fab, e (Fab1)2, bem como diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos híbridos multivalentes ou multiespecíficos (como descrito acima e em detalhe em: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias únicas (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), que são aqui incorporadas como referências). (Veja, geralmente, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984), e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), que são aqui incorporadas como referências). Como aqui usados, os termos "Fv de cadeia única",
"anticorpos de cadeia única", "Fv" ou "scFv" referem-se aos fragmentos de anticorpo que compreende as regiões variáveis de ambas as cadeias pesada e leve, mas falta as regiões constantes, mas dentro de uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, um anticorpo de cadeia única adicionalmente compreende um linker polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que ele forme a estrutura desejada que permitiria a ligação em antígeno. Anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhe por Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); veja também Publicação de Patente Internacional No. WO 88/01649 e Pat. U.S. Nos. 4.946.778 e 5.260.203, cujas descrições são aqui incorporadas como referências para qualquer propósito. Em modalidades específicas, anticorpos de cadeia única também podem ser bi-específicos e/ou humanizados.
Um "fragmento Fab" é compreendido de uma cadeia leve e o
Chi e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios Cm e CH2, de tal modo que uma ligação de dissulfeto intercadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.
Um "fragmento F(ab')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domíniosCHi e C H2, de tal modo que ligação de dissulfeto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas.
Pesos moleculares e comprimentos de polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (e.g., eletroforese em gel) serão entendidos como sendo valores aproximados. Quando um tal valor é expressado como "cerca de" X, o valor informado será entendido como sendo acurado em ±10%.
Todas as referências aqui citadas são incorporadas como referências em suas totalidades.
A presente invenção é baseada em parte na determinação das seqüências de aminoácidos de anticorpos monoclonais que foram descritos em Pedido de Patente U.S. de co-propriedade de No. Serial 11/430.066, depositado aos 8 de Maio de 2006, que foi publicado aos 7 de Dezembro de 2006 como Publicação de Patente U.S. No. 2006-0275296, aqui incorporada como referência. Hibridomas expressando anticorpos monoclonais neutralizadores para IL-31 de humano descrita acima foram depositados com o depósito de patente em American Type Tissue Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd, Manassas VA 20110-2209) como depósitos originais sob o Tratado de Budapeste e receberam os seguintes Nos de Acesso: clone 292.12.3.1 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6815, depositado aos 28 de Junho de 2005); clone 292.72.3.1 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6816, depositado aos 28 de Junho de 2005); clone 292.63.5.3 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6829, depositado aos 6 de Julho de 2005); clone 292.118.6.4 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6830, depositado aos 6 de Julho de 2005); clone 294.163.2.1 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6831, depositado aos 6 de Julho de 2005); clone 292.84.1.6 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6871, depositado aos 19 de Julho de 2005); clone 294.35.2.6.3 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6872, depositado aos 19 de Julho de 2005); clone 294.154.5.6 Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6875, depositado aos 19 de Julho de 2005); e clone 294.144.3.5 (Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6873, depositado aos 19 de Julho de 2005). A presente invenção proporciona seqüências de aminoácidos
das regiões variáveis de cadeias leves e pesadas dos anticorpos monoclonais produzidos por estes hibridomas para serem usados para gerar anticorpos e fragmentos de anticorpo, que se ligam no ligante IL-31 e podem ser usados conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano, por exemplo pela expressão como uma proteína de fusão, para antagonizar IL-31 deste modo inibido, bloqueando, reduzindo, ou neutralizando inflamação em geral, e os sintomas de dermatite e doenças pruríticas. Tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo, compreendem ou consistem de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, e podem ser quiméricos, humanizados, ou fragmentos de anticorpo que neutralizam, inibem, reduzem, previnem ou minimizam os efeitos de IL-31 sobre seu receptor. Resultados clínicos do anticorpo ou dos fragmentos de anticorpo podem ser uma redução em doenças inflamatórias, tais como dermatite e doenças pruríticas como mais adiante aqui descrito. Em uma modalidade, a dermatite é dermatite atópica. Em outra modalidade a dermatite é prurigo nodular. Em outra modalidade, a dermatite é eczema.
IL-31 é uma citocina de célula-T recentemente descoberta que, quando sobre-expressada em camundongos, resulta em sintomas semelhantes a dermatite. Veja também, Dillon, et al., Nature Immunol. 5:752-760, 2004. Ambos queratinócitos epidérmicos e de células-T residentes em pele têm estado implicados na patologia de doenças de pele em humanos. Expressão de proteína e IL-31 mRNA é restrita à população de células-T CLA+ residente em pele em ambos pacientes com dermatite atópica (AD) e indivíduos normais, enquanto que análise do receptor para IL-31, IL-3 IRA, por imuno- histoquímica(IHC) sugere níveis ligeiramente mais altos de expressão de IL- 31 RA sobre queratinócitos de pele em biopsias de pele de sofredores de AD crônica ou aguda comparados com indivíduos normais.
IL-31 é o nome HUGO para uma citocina que tem sido previamente descrita como Zcytol7rlig em um pedido de Patente U.S. publicado (veja número de publicação de 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003, aqui incorporada como referência). Veja também, Dillon, et al., Nature Immunol., supra. O receptor heterodimérico para IL-31 também foi descrito em 20030224487 como zcytorl7 (nome HUGO, IL-3 IRA) que forma um heterodímero com receptor beta OncostatinM (OSMRbeta). IL-31 foi isolada de uma biblioteca de cDNA gerada de células de sangue periférico de humano (hPBCs), que foram selecionadas para CD3. CD3 é um marcador de superfície de célula único para células de origem linfóide, particularmente células-T. A seqüência de polipeptídeo para IL-31 de humano é mostrada em SEQ ID ΝΟ:2. A seqüência de polipeptídeo para 11-31 murina é mostrada em SEQ ID NO:4. Como aqui usado o termo, IL-31 significa IL-31 como usada em Publicação de Patente U.S. de Número 20030224487, como mostrado acima. A seqüência de sinal secretório de IL-31 é compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala), e o polipeptídeo maduro é compreendido de resíduos de aminoácido 24 (Ser) a 164 (Thr) (como mostrado em SEQ ID NO:2). Ademais análise de seqüenciamento N-terminal de IL-31 purificada de células 293T mostrou uma terminação-N em resíduo 27 (Leu) como mostrado em SEQ ID NO:2, com o polipeptídeo maduro compreendido de resíduos de aminoácido 27 (Leu) a 164 (Thr) (como mostrado em SEQ ID NO:2).
IL-31 é o nome HUGO para uma citocina que tem sido previamente descrita como Zcytol7rlig em um Pedido de Patente U.S. Publicado (veja número de publicação 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003, aqui incorporada como referência). Veja também, Dillon, et al., Nature Immunol., supra. O receptor heterodimérico para IL-31 também foi descrito em 20030224487 como zcytorl7 (nome HUGO, IL-3 IRA) que forma um heterodímero com receptor beta OncostatinM (OSMRbeta). IL-31 foi isolada de uma biblioteca de cDNA gerada de células de sangue periférico de humano (hPBCs) ativadas, que foram selecionadas para CD3. CD3 é um marcador de superfície de célula único para células de origem linfóide, particularmente células. As seqüências de polinucleotídeo e de polipeptídeo para IL-31 de humano são mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. As seqüências de polinucleotídeo e de polipeptídeo para IL-31 murina são mostradas em SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente. Como aqui usado o termo, IL-31 significa IL-31 como usada em Publicação de Patente U.S. de número 20030224487, como mostrado acima. A seqüência de sinal secretório de IL-31 é compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala), e o polipeptídeo maduro é compreendido de resíduos de aminoácido 24 (Ser) a 164 (Thr) (como mostrado em SEQ ID NO:2). Ademais análise de seqüenciamento N-terminal de IL-31 purificada de células 293T mostrou uma terminação-N em resíduo 27 (Leu) como mostrado em SEQ ID NO:2, com o polipeptídeo maduro compreendido de resíduos de aminoácido 27 (Leu) a 164 (Thr) (como mostrado em SEQ ID NO:2).
A seqüência de polipeptídeo para o IL-3 IRA (receptor de IL-
31) é mostrada em SEQ ID NO:5, e a seqüência de polipeptídeo para receptor beta OncostatinM (OSMRbeta) é mostrada em SEQ ID NO:6.
Os receptores IL-3 IRA e OSMRbeta pertencem à subfamília de receptores de citocina de Classe I que inclui, mas não é limitada a, aos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF e G- CSF (para uma revisão veja, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" em Cytokine 5(2): 95-106, 1993). A subunidade IL-3 IRA é totalmente descrita em Pedido de Patente PCR de Propriedade Comum de No. USO 1/20484 (Publicação WIPO de No. WO 02/00721). Análise da distribuição em tecido do mRNA da subunidade IL-3 IRA revelou expressão em subconjuntos de células-T CD4+ e CD8+ ativadas, monócitos CD 14+, e expressão mais fraca em células-B CD 19+. Além disso, o mRNA estava presente em ambas as linhagens de célula monocítica em repouso ou ativadas THP-I (ATCC No. TIB-202), U937 (ATCC No. CRL-1593.2) e HL60 (ATCC No. CCL-240).
Inibição, neutralização, ou bloqueio de transdução de sinal pelas moléculas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e/ou um domínio variável de cadeia pesada, chamadas aqui de "moléculas ligantes de IL-31" ou "antagonistas de IL-31", pode ser medido por numerosos ensaios conhecidos por uma pessoa experiente na arte. Por exemplo, ensaios medindo uma redução em proliferação incluem ensaios para redução de um corante tal como AlamarBlue™ (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-5-3-carbóxi-metóxi-fenil- 2H-tetrazólio; hidróxido de 2,3-bis(2-metóxi-4-nitro-5-sulfo-fenil)-5-[(fenil- amino)-carbonil]-2H-tetrazólio; e cloreto de ciano-ditolil-tetrazólio (que estão comercialmente disponíveis em Polysciences, Inc., Warrington, PA); ensaios de mitogênese, tal como medição de incorporação de 3H-timidina; ensaios de exclusão de corante usando, por exemplo, negro de naftaleno ou azul de tripano; captação de corante usando diacetil-fluoresceína; e liberação de cromo. Veja, em geral, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 3ra ed., Wiley-Liss, 1994, que é aqui incorporado como referência. Em adição ao acima, veja Publicação de Patente U.S. Publicada de Número 20030224487, (Sprecher, Cindy et al., 2003) para um exemplo de células- BaF3 expressando IL-3 IRA e OSMRbeta de comprimento total.
Métodos para preparar os polinucleotídeos codificadores dos anticorpos aqui descritos (incluindo DNA e RNA) são bem conhecidos na arte. RNA total pode ser preparado usando extração em isotiocianato de guanidínio seguida por isolamento por centrifugação em um gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poli (A)+ RNA é preparado a partir de RNA total usando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-12, 1972). DNA complementar (cDNA) é preparado a partir de poli(A)+ RNA usando métodos conhecidos. Na alternativa, DNA genômico pode ser isolado. Polinucleotídeos codificadores de anticorpos anti- IL-31 são então identificados e isolados por, por exemplo, hibridização ou PCR.
A presente invenção também inclui moléculas ligantes de IL- 31 ou antagonistas de IL-31 que se ligam em fragmentos de polipeptídeos de IL-31 e moléculas de ácido nucleico codificadoras de tais fragmentos funcionais. Uma IL-31 "funcional" ou seu fragmento funcional como aqui definido é caracterizada(o) por sua atividade proliferativa ou diferenciadora, por sua capacidade para induzir ou inibir funções celulares especializadas, ou por sua capacidade para se ligar especificamente em um anticorpo anti- IL-31 ou IL-3 IRA ou anticorpo ou heterodímeros RA/OSMRbeta destes receptores (quer solúveis quer imobilizados). Como previamente aqui descrito, IL-31 é caracterizada por uma estrutura de feixe de quatro hélices compreendendo hélice A (resíduos de aminoácido 38-52), hélice B (resíduos de aminoácido 83-98), hélice C (resíduos de aminoácido 104-117) e hélice D (resíduos de aminoácido 137-152), como mostrado em SEQ ID NO:2. Assim, a presente invenção proporciona adicionalmente proteínas de fusão compreendendo: (a) moléculas de polipeptídeo compreendendo uma ou mais das hélices descritas acima; e (b) fragmentos funcionais compreendendo uma ou mais destas hélices. A outra porção do polipeptídeo da proteína de fusão pode ser contribuída por outra citocina de feixe de quatro hélices, tal como IL-15, IL-2, IL-4 e GM-CSF, ou por um peptídeo de sinal secretório não-nativo e/ou não- relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão.
A presente invenção também proporciona moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que se ligam em fragmentos de polipeptídeo ou peptídeos compreendendo uma porção possuindo epitopo de um polipeptídeo de IL-31 aqui descrito. Tais fragmentos ou peptídeos podem compreender um "epitopo imunogênico", que é uma parte de uma proteína que induz uma resposta de anticorpo quando a proteína inteira é usada como um imunógeno. Peptídeos possuindo epitopo imunogênico podem ser identificados usando métodos padrão (veja, por exemplo, Geysen et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA Ml3998 (1983)). A ligação dos anticorpos nestes fragmentos funcionas resulta em inibição, bloqueio, neutralização, e/ou redução em transdução de sinal de IL-31 sobre seu receptor cognato.
Em contraste, fragmentos de polipeptídeo ou peptídeos podem compreender um "epitopo antigênico", que é uma região de uma molécula de proteína na qual um anticorpo pode especificamente se ligar. Certos epitopos consistem de um segmento linear ou contíguo de aminoácidos, e a antigenicidade de um tal epitopo não é interrompida por agentes desnaturantes. É sabido na arte que peptídeos sintéticos relativamente curtos que podem imitar epitopos de uma proteína podem ser usados para estimular a produção de anticorpos contra a proteína (veja, por exemplo, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). Conseqüentemente, polipeptídeos e peptídeos possuindo epitopo antigênico da presente invenção são úteis para produzir anticorpos (e.g., anticorpos neutralizadores) que se ligam nos polipeptídeos aqui descritos. Perfis de hidrofilicidade de Hopp/Woods podem ser usados para determinar regiões que têm o potencial antigênico mais alto (Hopp et al., 1981, ibid, e Hopp, 1986, ibid.). Por exemplo, em IL-31 de humano, regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 54-59 de SEQ ID NO:2, resíduos de aminoácido 129-134 de SEQ ID NO:2, resíduos de aminoácido 53-58 de SEQ ID NO:2, resíduos de aminoácido 35-40 de SEQ ID NO:2, e resíduos de aminoácido 33-38 de SEQ ID NO:2. Por exemplo, em IL-31 de camundongo, regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 34-39 de SEQ ID NO:4, resíduos de aminoácido 46-51 de SEQ ID NO:4, resíduos de aminoácido 131- 136 de SEQ ID NO:4, resíduos de aminoácido 158-163 de SEQ ID NO:4, e resíduos de aminoácido 157-162 de SEQ ID NO:4.
Polipeptídeos e peptídeos possuindo epitopo antigênico preferivelmente contêm pelo menos quatro a cinco aminoácidos, pelo menos dez a quatorze aminoácidos, ou cerca de quatorze a cerca de trinta aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. Tais polipeptídeos ou peptídeos possuindo epitopo podem ser produzidos por fragmentação de um polipeptídeo IL-31, ou por síntese química de peptídeo, como aqui descrito. Além disso, epitopos podem ser selecionados por exibição de fago de bibliotecas de peptídeos randômicas (veja, por exemplo, Lane e Stephen. Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); e Cortese et al, Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Métodos padrão para identificar epitopos e produzir anticorpos a partir de peptídeos pequenos que compreendem um epitopo são descritos, por exemplo, por Mole, "Epitope Mapping", em Methods in Molecular Biology. Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc.
1992); Price, "Production and Characterization of Synthetie Peptide-Derived Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinicai Application. Ritter e Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge
University Press 1995), e Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology. páginas 9.3.1 - 9.3.5 e páginas 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).
A atividade dos anticorpos como aqui descrito pode ser medida por sua capacidade para inibir, ou reduzir proliferação usando uma variedade de ensaios que medem proliferação de e/ou ligação em células expressando o receptor IL-3 IRA. De interesse particular são mudanças em células dependentes de IL-31. Linhagens celulares adequadas a serem engenhadas para serem dependentes de IL-31 incluem a linhagem celular BaF3 dependente de IL-3 (Palacios e Steinmetz, CeU 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-Pl (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), e M07e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240,
1993). Linhagens celulares dependente de fator podem ser estabelecidas de acordo com métodos publicados (e.g. Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., em Baum et al. Eds., Experimental Hematology
Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soe. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).
A atividade dos anticorpos anti-IL-31 aqui descrita pode ser medida por um microfisiômetro de biossensor baseado em silício que mede a taxa de acidificação extracelular ou a excreção de prótons associada com ligação de receptor e subseqüentes respostas celulares fisiológicas. Um dispositivo exemplar é o Cytosensor™ Microphysiometer manufaturado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Uma variedade de respostas celulares, tal como proliferação de célula, transporte de íons, produção de energia, ativação de receptor e regulatória, e semelhante, pode ser medida por este método. Veja, por exemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzvmol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., L Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998.
Antagonistas também são úteis como reagentes de pesquisa para caracterizar sítios de interação de ligante-receptor. Antagonistas são úteis para inibir expansão, proliferação, ativação, e/ou diferenciação de células envolvidas em regulação de hematopoiese. Inibidores de atividade de IL-31 (antagonistas de IL-31) incluem anticorpos anti-IL-31 e receptores de 11-31 solúveis, bem como outros agentes peptídicos e não-peptídicos (incluindo ribozimas).
Inibição da atividade de IL-31 pode ser medida por numerosos ensaios. Em adição àqueles ensaios aqui mostrados, amostras podem ser testadas para inibição de atividade de IL-31 dentro de uma variedade de ensaios projetados para medir ligação de receptor, a estimulação/inibição de respostas celulares dependentes de IL-31 ou proliferação de células expressando receptor IL-3 IRA.
Um polipeptídeo ligante de IL, incluindo moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também pode ser usado para purificação de ligante. O polipeptídeo é imobilizado sobre um suporte sólido, tal como glóbulos de agarose, agarose reticulada, vidro, resinas celulósicas, resinas baseadas em sílica, poliestireno, poliacrilamida reticulada, ou materiais similares que são estáveis sob as condições de uso. Métodos para ligar polipeptídeos em suportes sólidos são conhecidos na arte, e incluem química de amina, ativação por brometo de cianogênio, ativação por N-hidróxi- succinimida, ativação por epóxido, ativação de sulfidrila, e ativação por hidrazida. O meio resultante geralmente será configurado na forma de uma coluna, e fluidos contendo o ligante são passados através da coluna uma ou mais vezes para permitir que o ligante se ligue no polipeptídeo receptor. O ligante é então eluído usando mudanças em concentração de sal, agentes caotrópicos (guanidina HCl), ou pH para interromper a ligação de ligante- receptor.
Um sistema de ensaio que usa um receptor ligando em ligante (ou um anticorpo, um membro de um par de complemento / anti- complemento) ou um seu fragmento de ligação, e um instrumento de biossensor comercialmente disponível (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) pode ser vantajosamente empregado. Tal receptor, anticorpo, membro de um par de complemento / anti-complemento ou fragmento imobilizado é imobilizado sobre a superfície de um chip receptor. Uso deste instrumento é mostrado por Karlsson, L Immunol. Methods 145:229-40. 1991 e Cunningham e Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Um receptor, anticorpo, membro ou fragmento é covalentemente ligado, usado química de amina ou sulfidrila, em fibras de dextrano que são ligadas em filme de ouro dentro da célula de fluxo. Uma amostra de teste é passada através da célula. Se um ligante, epitopo, ou membro oposto do par de complemento/anti- complemento está presente na amostra, ele se ligará no receptor, anticorpo ou membro imobilizado, respectivamente, causando uma mudança no índice de refração do meio, que é detectado como uma mudança em ressonância de plasmon de superfície do filme de ouro. Este sistema permite a determinação de associação e dissociação, das quais afinidade de ligação pode ser calculada, e avaliação de estequiometria de ligação. Alternativamente, ligação de ligante / receptor pode ser analisada usando tecnologia SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser usadas para bloquear a ação biológica de IL-31 pró-inflamatória e são úteis como agentes terapêuticos antiinflamatórios em uma variedade de doenças como aqui descrito. Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que polipeptídeos possuindo epitopo, antigênico, contêm uma seqüência de pelo menos 6, preferivelmente pelo menos 9, e mais preferivelmente pelo menos a cerca de 30 resíduos de aminoácido contíguos de um polipeptídeo IL-31 (e.g., SEQ ID NO:2). Polipeptídeos compreendendo uma porção maior de um polipeptídeo IL-31, i.e., de 30 a 100 resíduos até o comprimento inteiro da seqüência de aminoácidos estão incluídos. Epitopos imunogênicos ou antígenos também podem incluir etiquetas, adjuvantes, veículos e agentes de transporte ligados, como aqui descrito. Antígenos adequados incluem o polipeptídeo IL-31 codificado por SEQ ID NO:2 do número de aminoácido 24 ao número de aminoácido 164, ou um seu fragmento de 9 a 141 aminoácidos contíguos. Outros antígenos adequados, a IL-31 de comprimento total e madura IL-31, hélices A-D, e hélices individuais ou múltiplas A, B, C, e D, da estrutura de feixe de quatro hélices de IL-31, como aqui descrito. Peptídeos preferidos para uso como antígenos são peptídeos hidrofílicos tais como aqueles preditos por uma pessoa experiente na arte a partir de uma plotagem de hidrofobicidade, como aqui descrito, por exemplo, resíduos de aminoácido 114-119, 101-105, 126-131, 113-118, e 158-162 de SEQ ID NO:2; e resíduos de aminoácido 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 e 157-162 de SEQ ID NO:4. Além disso, epitopos antigênicos de IL-31 como preditos por uma plotagem de Jameson-Wolf, e.g., usando programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI) servem como antígenos preferidos, e são prontamente determinados por uma pessoa experiente na arte.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são consideradas em serem especificamente ligantes se: 1) exibem um nível limite de atividade de ligação, e 2) não reagem cruzadamente significativamente com moléculas de polipeptídeo relacionadas. Um nível limite de ligação é determinado se moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 aqui se ligam em um polipeptídeo, peptídeo ou epitopo de IL-31 com uma afinidade pelo menos 10-vezes maior do que a afinidade de ligação em polipeptídeo de controle (não-IL-31). É preferido que os anticorpos exibam uma afinidade de ligação (Ka) de IO6 M-1 ou maior, preferivelmente IO7 M"1 ou maior, more preferivelmente IO8 M4 ou maior, e mais preferivelmente IO9 M"1 ou maior. A afinidade de ligação de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode ser prontamente determinada por uma pessoa ordinariamente experiente na arte, por exemplo, por análise de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sri- 51: 660-672, 1949).
Se moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 não reagem cruzadamente significativamente com moléculas de polipeptídeo relacionadas é mostrado, por exemplo, pelas moléculas ligantes de IL-31 ou pelos antagonistas de IL-31 detectando polipeptídeo IL-31 mas não polipeptídeos relacionados não conhecidos usando uma análise padrão de Western blot (Ausubel et al., ibid.). Exemplos de polipeptídeos relacionados conhecidos são aqueles mostrados na arte anterior, tais como ortólogos, e parálogos conhecidos, e membros conhecidos similares de uma família de proteínas. Seleção também pode ser feita usando polipeptídeos mutantes de IL-31, e IL-31 de não-humano. Além disso, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser "selecionadas(os) contra" polipeptídeos relacionados conhecidos, para isolar uma população que especificamente se liga nos polipeptídeos IL-31. Por exemplo, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são adsorvidas em polipeptídeos relacionados aderidos em matriz insolúvel; moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 específicas(os) para IL-31 fluirão através da matriz sob condições tampão apropriadas. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995.
Anticorpos monoclonais purificados de meios de cultura de tecido são caracterizados por sua capacidade para bloquear ou reduzir a atividade de ligação de receptor ("ensaio de neutralização") de huIL-31 recombinante purificada sobre células-BaF3/MPL-IL-31. Afinidade de ligação das moléculas ligantes de IL-31 e antagonista de OL-31 pode ser determinada. Anticorpo de Cabra Específico para Anti-IgG-Fc gama de Rato (Jackson) é imobilizado sobre um chip CM5 Biacore. O ensaio é otimizado para ligar cada mAb sobre superfície de captura de anti-Rato e então uma série de concentrações de IL-31 é injetada através de mAb para ver associação (Ka) e dissociação (Kd). Após cada corrida, a superfície é regenerada de volta para o Anticorpo de Anti-Rato com 2 injeções de HCl 20mM. Dados são gerados para cada e programa de computador de avaliação (BIAevaluation software version 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Suécia) é usado para avaliar a cinética da ligação de anticorpo anti-IL-31 na proteína IL-31.
As seqüências de polinucleotídeo e de polipeptídeo das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada de clones de números 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, 292.72.3.1. foram determinadas como mostrado em Exemplo 1. As seqüências de polipeptídeo de terminação amino das regiões variáveis de cadeias leve e pesada de números de clones foram determinadas como mostrado em Exemplo 2.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 em meios de cultura de tecido são caracterizadas por sua capacidade para bloquear, inibir, prevenir, ou reduzir ligação de receptor quando crescido na presença das proteínas recombinantes purificadas IL-31 de humano. Por exemplo, as moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser caracterizadas em numerosas maneiras incluindo binning (i.e, determinação de se cada anticorpo poderia inibir a ligação de qualquer outra ligação), afinidade relativa, e neutralização.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 geradas pelos métodos aqui descritos podem ser testadas para neutralização por uma variedade de métodos. Por exemplo o ensaio de luciferase como descrito em Pedido de Patente U.S. Publicado (veja número de publicação 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003) pode ser usado. Em adição neutralização pode ser testada por medição de um decréscimo na produção de quimiocinas pró- inflamatórias tais como TARC e MDC de culturas de queratinócito na presença de ligante e do anticorpo monoclonal. Neutralização também pode ser medida pelos modelos in vivo aqui descritos.
Em uma modalidade, as moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção são fragmentos de anticorpo de ligação em antígeno de humano da presente invenção e incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, FVs ligados por dissulfeto (sdFv) e fragmentos compreendendo quer um domínio VL quer um domínio VH. Fragmentos de anticorpo ligantes de antígeno, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(eis) (i.e., SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma porção das seguintes: região de dobradiça, domínios CHi, Cro, e Cro. Também estão incluídos na invenção fragmentos ligantes em antígeno também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região de dobradiça, domínios CHi, Cro, e Cro.
Em outra modalidade, as moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção podem ser monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas ou de multiespecificidade maior. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epitopos diferentes de um polipeptídeo da presente invenção ou podem ser específicos para ambos um polipeptídeo da presente invenção bem como para epitopo heterólogo, tal como polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Veja, e.g., Publicações PCT de WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); Pat. U.S. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
A presente invenção também inclui moléculas ligantes de IL- 31 ou antagonistas de IL-31 geneticamente alteradas(os) que são funcionalmente equivalentes às moléculas ligantes de IL-31 ou aos antagonistas de IL-31 descritas(os) acima. Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 modificadas(os) proporcionando estabilidade e/ou eficácia terapêutica melhoradas são preferidas(os). Exemplos de anticorpos modificados incluem aqueles com substituições conservativas de resíduos de aminoácido, e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente deleteriamente a utilidade de ligação em antígeno. Substituições podem variar de mudança ou modificação de um ou mais resíduos de aminoácido a reprojeto completo de uma região desde que a utilidade terapêutica seja mantida. Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção podem ser modificadas(os) após tradução (e.g., acetilação, e fosforilação) ou podem ser sinteticamente modificadas(os) (e.g., a ligação de um grupo marcador).
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 também incluem anticorpos quiméricos ou fragmentos quiméricos, compreendendo uma região variável como aqui descrito e uma região constante derivada de um humano de tal modo que o anticorpo quimérico ou fragmento quimérico tenha uma meia-vida mais longa, e seja menos imunogênico quando administrado a um sujeito humano. O método de preparar anticorpos quiméricos e fragmentos quiméricos é conhecido na arte. As regiões variáveis destas moléculas ligantes de IL-31 ou destes antagonistas de IL-31 podem ser conectadas com uma região constante de uma IgG de humano para formar o anticorpo quimérico desejado. Uma molécula IgG Fc pode ser íusionada nas moléculas ligantes de IL-31. Para evitar indução de função efetora, a molécula IgG Fc pode ser de uma molécula IgG4 Fc. Assim, as seqüências de aminoácidos das regiões variáveis e as regiões variáveis com aqui mostradas podem ser usadas para gerar anticorpos quiméricos sendo que a região constante é uma molécula IgG de humano e as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada podem ser selecionadas daquelas de clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, e 292.72.3.1. Tais anticorpos quiméricos teriam: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; ou j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e seriam usados conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
Tais regiões variáveis também podem ser geradas com ou sem as seqüências de sinal. Assim, as seqüências de aminoácido das regiões variáveis e as regiões variáveis como aqui mostradas podem ser usadas para gerar anticorpos quiméricos sendo que a região constante é uma molécula IgG de humano e as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada podem ter uma seqüência de sinal e podem ser selecionadas daquelas de clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, e 292.72.3.1. Tais anticorpos quiméricos teriam: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; d) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; e) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; f) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; g) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; h) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou j) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 e seriam usados conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Tais regiões variáveis podem ser geradas com ou sem as seqüências de sinal.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 incluem versão humanizada das moléculas ligantes de IL-31 ou dos antagonistas de IL-31 aqui descritos. Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 humanizadas(os) compreendem CDRs de uma imunoglobulina doadora de camundongo e moldes de cadeia leve e de cadeia pesada de uma imunoglobulina aceptora de humano. O método de preparação de anticorpo humanizado é descrito em Pat. U.S. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; e 6.180.370 (cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade como referência). As CDRs destes anticorpos podem ser então graftizadas em quaisquer moldes de humano selecionados, que são conhecidos na arte, para gerar o anticorpo humanizado derivado.
A invenção também proporciona moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que competitivamente inibem a ligação de um anticorpo monoclonal em um polipeptídeo da invenção, preferivelmente o polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na arte, por exemplo, usando os ensaios de ligação competitiva aqui descritos. Em modalidades preferidas, o anticorpo competitivamente inibe a ligação de um anticorpo monoclonal da invenção em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50% no polipeptídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.
A invenção também proporciona moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que competitivamente inibem a ligação de um anticorpo e um epitopo da invenção como determinado por qualquer método conhecido na arte para determinar ligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios aqui descritos. Em modalidades preferidas, o anticorpo competitivamente inibe a ligação em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 da presente invenção incluem derivados que são modificados, por exemplo, mas não por meio de limitação, os derivados incluem moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que têm sido modificadas(os), e.g., por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos bloqueadores / protetores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação em um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 da presente invenção também incluem moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que têm meias-vidas (e.g., meias-vidas séricas) em um mamífero, preferivelmente um humano, de maior do que 15 dias, preferivelmente maior do que 20 dias, maior do que 25 dias, maior do que 30 dias, maior do que 35 dias, maior do que 40 dias, maior do que 45 dias, maior do que 2 meses, maior do que 3 meses, maior do que 4 meses, ou maior do que 5 meses. As meias-vidas aumentadas dos anticorpos da presente invenção ou dos fragmentos dos mesmos em um mamífero, preferivelmente um humano, resultam em um título sérico mais alto de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo no mamífero, e assim, reduz a freqüência da administração de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo e/ou reduz a concentrações de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo a serem administrados.
As meias-vidas in vivo das moléculas ligantes de IL-31 ou dos antagonistas de IL-31 podem ser aumentadas pela modificação (e.g., substituição, deleção ou adição) de resíduos de aminoácido identificados como envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptor FcRn (veja, e.g., Publicações Internacionais Nos. WO 97/34631 e WO 02/060919, que são aqui incorporadas como referências em suas totalidades), ou por ligação de moléculas de polímero tal como poli(etileno-glicol) (PEG) de peso molecular alto. PEG pode ser ligado com ou sem um linker multifuncional quer através de conjugação sítio-específica do PEG na terminação-N- ou -C de tidos anticorpos ou fragmentos de anticorpo quer via grupos epsílon-amino presentes em resíduos de lisina. Derivação de polímero linear ou ramificado que resulta em perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação será rigorosamente monitorado por SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir conjugação apropriada de moléculas de PEG nos anticorpos. PEG não reagido pode ser separado dos conjugados de anticorpo- PEG por, e.g., cromatografia de troca iônica ou de exclusão de tamanho.
É entendido que as moléculas ligantes de IL-31 humanizadas ou os antagonistas de IL-31 humanizados projetadas(os) pelo presente método podem ter substituições de aminoácido conservativas adicionais que substancialmente não têm efeito sobre a ligação em antígeno ou outras funções de imunoglobulina. Para substituições conservativas são intencionadas as combinações tais como gly, ala; vai, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; e phe, tyr.
Métodos para humanizar anticorpos de não-humano são bem conhecidos na arte. Geralmente, imunoglobulinas humanizadas, incluindo anticorpos humanizados, têm sido construídas por meio de engenharia genética. As imunoglobulinas humanizadas que têm sido descritas (Jones et al., op. cit; Verhoeyen et al., op. cit; Riechmann et al., op. cit.) têm compreendido em sua maioria um molde que é idêntico ao molde de uma cadeia de imunoglobulina de humano particular, a aceptora, e as três CDR's de uma cadeia de imunoglobulina doadora de não-humano. Especificamente, anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de anticorpos de espécies não-humanas que se ligam no antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não-humana e regiões de molde de uma molécula de imunoglobulina de humano.
A presente invenção inclui critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos no molde de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são escolhidos para serem iguais aos aminoácidos naquelas posições na doadora em vez de na aceptora, com o propósito de aumentar a afinidade do anticorpo compreendendo a cadeia de imunoglobulina humanizada.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 da presente invenção são geradas(os) baseado em parte no modelo que duas causas contribuidoras da perda de afinidade em meios anteriores de produção de anticorpos humanizados (usando como exemplos anticorpos de camundongo como a fonte de as CDR's) são:
(1) Quando as CDR's de camundongo são combinadas com molde de humano, os aminoácidos do molde próximos das CDR's se tornam de humano em vez de camundongo. Sem intenção de se ligar à teoria, estes aminoácidos mudados podem distorcer ligeiramente as CDR's, porque criam forças hidrofóbicas ou eletrostáticas diferentes do que no anticorpo de camundongo doador, e as CDR's distorcidas podem não fazer contatos efetivos com o antígeno como as CDR's o faziam no anticorpo doador; e
[71 ] (2) Aminoácidos no anticorpo de camundongo original que estão próximos das, mas não são parte das, CDR's (i.e., ainda parte do molde), podem fazer contatos com o antígeno que contribui para afinidade. Estes aminoácidos não perdidos quando o anticorpo é humanizado, porque todos os aminoácidos de molde são tornados de humano.
Para evitar estes problemas, e para produzir anticorpos humanizados que têm uma afinidade forte por um antígeno desejado, a presente invenção usa um ou mais dos seguintes princípios para projetar imunoglobulinas humanizadas. Também, os critérios podem ser usados individualmente, ou quando necessário em combinação, para alcançar a afinidade desejada ou as características almejadas.
Um princípio é que como aceptor, um molde é usado de uma imunoglobulina de humano particular que é incomumente homóloga à imunoglobulina doadora a ser humanizada, ou uso de um molde de consenso de muitos anticorpos de humano. Por exemplo, comparação da seqüência de uma região variável de cadeia pesada (ou leve) de camundongo contra regiões variáveis de cadeia pesada (ou leve) de humano em um banco de dados (por exemplo, o National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource) mostra que a extensão de homologia para regiões de humano diferentes varia grandemente, tipicamente de cerca de 40% a cerca de 60- 70%. Pela escolha como imunoglobulina aceptora uma das regiões variáveis de cadeia pesada (respectivamente leve) de humano que é mais homóloga à região variável de cadeia pesada (respectivamente leve) da imunoglobulina doadora, menos aminoácidos serão mudados ao se ir da imunoglobulina doadora para a imunoglobulina humanizada. Conseqüentemente, e de novo sem intenção de se ligar a teoria, é crido que há uma chance menor de mudança de um aminoácido próximo de CDR's que distorce sua conformação. Além disso, a forma total precisa de um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia de imunoglobulina humanizada pode se parecer mais exatamente à forma do anticorpo doador, também reduzindo a mudança de distorção de CDR's.
Tipicamente, uma das 3-5 seqüências de região variável de cadeia pesada mais homólogas em uma coleção representativa de pelo menos cerca de 10 a 20 cadeias pesadas de humano distintas será escolhida para proporcionar o molde de cadeia pesada, e similarmente para a cadeia leve. Preferivelmente, uma das 1-3 regiões variáveis mais homólogas será usada. A imunoglobulina aceptora selecionada mais preferivelmente terá pelo menos cerca de 65% de homologia na região de molde em relação à imunoglobulina doadora.
Em muitos casos, pode ser considerado preferível usar cadeias leves e pesadas do mesmo anticorpo de humano como seqüências aceptoras, para se ter garantia que as cadeias leves e pesadas de humano farão contatos favoráveis umas com as outras. Neste caso, as cadeias leve e pesada doadoras serão comparadas apenas contra cadeias de anticorpos humanizados cuja seqüência completa é conhecida, e.g., os anticorpos Eu, Lay, Pom, Wol, Sie, Gal, Ou e WEA (Kabat et al., op. cit; ocasionalmente, os últimos poucos aminoácidos de uma cadeia de humano não são conhecidos e precisam ser deduzidos por homologia a outros anticorpos de humano). O anticorpo de humano será escolhido no qual as seqüências de regiões de variáveis de cadeias leve e pesada, tomadas juntas, são no todo mais homólogas às seqüências de região variável de cadeias leve e pesada doadoras. Algumas vezes peso maior serão então dados à seqüência de cadeia pesada. O anticorpo de humano escolhido então proporcionará ambas seqüências aceptoras de cadeias leve e pesada. Na prática, é muitas vezes verificado que o anticorpo Eu de humano servira para este papel.
De acordo com o método "de melhor-ajuste", a seqüência de domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada contra a biblioteca inteira de seqüências de domínio variável de humano. A seqüência de humano que está mais próxima daquela do roedor é então aceita como o modelo (FR) de humano para anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método usa um molde particular derivado da seqüência de consenso de todos os anticorpos de humano de um grupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo molde pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
Independente de como a imunoglobulina aceptora é escolhida, afinidade mais alta pode ser alcançada por seleção de um número pequeno de aminoácidos no molde da cadeia de imunoglobulina humanizada que são iguais aos aminoácidos naquelas posições na doadora em vez de na aceptora. Muitas vezes, resíduos de molde nas regiões de molde de humano serão substituídas pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR donor para alterar, preferivelmente melhoras, ligação em antígeno. Estas substituições de molde são identificadas por métodos bem conhecidos na arte, e.g., por modelagem, das interações dos resíduos de molde e CDR para identificar resíduos de molde importantes para ligação em antígeno e comparação de seqüência para identificar resíduos de molde incomuns em posições particulares. (Veja, e.g., Queen et al., Pat. U.S. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que são aqui incorporadas como referências em suas totalidades). Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, graftização de CDR (EP 239.400; Publicação PCT WO 91/09967; Pat. U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), revestimento de "folheado" (veneering) ou renovação de superfície (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), e rearranjo de cadeia (Pat. U.S. No. 5.565.332). Conformemente, tais anticorpos "humanizados", são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. No. 4.816.567) sendo que substancialmente menos do que um domínio variável de humano intacto tem sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana.
Anticorpos humanizados geralmente tem pelo menos três vantagens potenciais sobre camundongo ou em alguns casos anticorpos quiméricos para uso em terapia de humano:
(1) Devido ao fato de a porção efetora ser de humano, pode interagir melhor com as outras partes do sistema imune de humano (e.g., destruir as célula alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)).
(2) O sistema imune de humano não deve reconhecer a região constante ou de molde do anticorpo humanizado como estranha, e portanto a resposta de anticorpo contra um tal anticorpo injetado deve ser menor do que contra um anticorpo de camundongo totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho.
(3) Anticorpos de camundongo injetados têm sido relatados em terem uma meia-vida em circulação humana muito mais curta do que a meia-vida de anticorpos normais (D. Shaw et al., J. Immunol., 138, 4534- 4538 (1987)). Anticorpos humanizados injetados presumivelmente terão uma meia-vida mais similar à dos anticorpos de humano naturalmente ocorrentes, permitindo que doses menores e menos freqüentes sejam dadas. Em um aspecto, a presente invenção é direcionada ao projeto de anticorpos humanizados que são produzidos pela expressão de segmentos de DNA recombinante codificadores de CDR's de cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina doadora capaz de ligação em um antígeno desejado, tal como IL-31. ligados em segmentos de DNA codificador de regiões de molde de humano aceptoras.
Os segmentos de DNA tipicamente adicionalmente incluirão uma seqüência de DNA de controle de expressão operacionalmente ligada nas seqüências codificadoras de imunoglobulina humanizada, incluindo regiões de promotor naturalmente associadas ou heterólogas. As seqüências de controle de expressão serão sistemas de promotor eucariótico em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas seqüências de controle para hospedeiros procarióticos também podem ser usadas. Uma vez o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão em nível alto das seqüências de nucleotídeos, e, como desejado, a coleção e a purificação das cadeias leves humanizadas, cadeias pesadas humanizadas, dímeros de cadeias leve/pesada humanizados ou anticorpos intactos humanizados, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina podem seguir (veja, S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979), que é aqui incorporada como referência). As moléculas anti- IL31 podem ser preparadas pela expressão em células hospedeiras de mamífero, tais como células de Ovário de Hamster Chinês, e células HEK 293F, por exemplo.
Seqüências de DNA de região constante de humano podem ser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos de uma variedade de células de humano, mas preferivelmente células-B imortalizadas (veja, Kabat op. cit. e WP87/02671). As CDR's para produzir as imunoglobulinas da presente invenção serão similarmente derivadas de anticorpos monoclonais capazes de ligação no antígeno predeterminado, tal como IL-31, e produzidas por métodos bem conhecidos em qualquer fonte de mamífero conveniente incluindo, camundongos, ratos, coelhos, ou outros vertebrados, capazes de produzir anticorpos. Células fonte adequadas para as seqüências de DNA de molde e de região constante, e células hospedeiras para secreção e expressão de imunoglobulina, podem ser obtidas de numerosas fontes, tal como a American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", sexta edição (1988) Rockville, Md. U.S.A., que é aqui incorporada como referência).
Em adição às imunoglobulinas humanizadas especificamente aqui descritas, outras imunoglobulinas modificadas "substancialmente homólogas" às seqüências nativas podem ser prontamente projetadas e manufaturadas utilizando várias técnicas de DNA recombinante bem conhecidas por aqueles pessoas experientes na arte. Regiões de molde de humano diferentes variadas podem ser usadas individualmente ou em combinação como uma base para as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção. Em geral, modificações dos genes podem ser prontamente realizadas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, tal como mutagênese sítio-direcionada (veja, Gillman e Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) e S. Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987), ambas as quais são aqui incorporadas como referências).
Os anticorpos humanizados da invenção incluem fragmentos bem como anticorpos intactos. Tipicamente, estes fragmentos competem com o anticorpo intacto do qual foram derivados pela ligação em antígeno. Os fragmentos tipicamente ligam com uma afinidade de pelo menos IO7 M"1, e mais tipicamente IO8 ou IO9 M"1 (i e., dentro das mesmas faixas que as do anticorpo intacto). Fragmentos de anticorpo humanizado incluem Fab, Fab' F(ab')2, e Fv de cadeias pesadas, cadeias leves separadas. Fragmentos são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
Para outros detalhes em humanização de anticorpos, veja Patentes Européias Nos. EP 239.400, EP 592.106, e EP 519.596; Publicações Internacionais Nos. WO 91/09967 e WO 93/17105; Pat. U.S. Nos. 5.225.539, 5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.766.886, e 6.407.213; e Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805 814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969 973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119 25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13: 353 60; Morea et al., 2000, Methods 20: 267 79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678 84; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9: 895 904; Couto et al., 1995, Câncer Res. 55 (23 Supp): 5973s 5977s; Couto et al., 1995, Câncer Res. 55: 1717 22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235: 959 73; Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; e Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos agora podem ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente copulados para formarem fragmentos F(ab').sub.2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab').sub.2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o praticante experiente. Ademais, exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir FVs de cadeia única e anticorpos incluem aquelas descritas em Pat. U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
A presente invenção inclui anticorpos recombinantemente fusionados ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações tanto covalentes quanto não covalentes) em um polipeptídeo (ou sua porção, preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) da presente invenção para gerar proteínas de fusão. Assim, a invenção também se refere aos imunoconjugados compreendendo o anticorpo aqui descrito conjugado em um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, toxina (e.g. uma toxina enzimaticamente ativa, de origem bacteriana, fungica, de planta ou animal, ou seus fragmentosO, ou um isótopo radioativo (i.e., um radioconj ugado).
A presente invenção inclui anticorpos recombinantemente fusionados ou quimicamente conjugados (incluindo ambas conjugações covalente e não-covalente) em um polipeptídeo (ou sua porção, preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) da presente invenção para gerar proteínas de fusão. A fusão não necessariamente precisa ser direcionada, mas pode ocorrer através de seqüências linker. Os anticorpos podem ser específicos para antígenos diferentes de outros polipeptídeos (ou sua porção, preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) da presente invenção. Por exemplo, anticorpos podem ser usados para selecionar os polipeptídeos da presente invenção para tipos de célula particulares, quer in vitro quer in vivo, por fusão ou conjugação dos polipeptídeos da presente invenção em anticorpos específicos para receptores de superfície celular particulares. Anticorpos fusionados ou conjugados nos polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados em imunoensaios in vitro e métodos de purificação usando métodos conhecidos na arte. Veja e.g., Harbor et al., supra, e Publicação PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); Pat. U.S. No. 5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991), que são incorporadas em suas totalidades como referências.
A presente invenção adicionalmente inclui composições
compreendendo os polipeptídeos da presente invenção (e.g., aqueles compreendendo um epitopo antigênico ou imunogênico) fusionados ou conjugados em seqüências de polipeptídeo heterólogas (e.g., domínios de anticorpo diferentes de regiões variáveis). Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados em uma região Fc de anticorpo, ou sua porção. Por exemplo, polipeptídeos da presente invenção (incluindo fragmentos ou suas variantes), podem ser fusionados com o domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou suas porções (CHi, CH2, CH3, ou qualquer sua combinação e suas porções, resultando em polipeptídeos quiméricos. A porção de anticorpo fusionada em um polipeptídeo da presente invenção pode compreender a região constante, região de dobradiça, domínio CHi, domínio Cm, e domínio Cro ou qualquer combinação de domínios inteiros ou suas porções. Os polipeptídeos também podem ser fusionados ou conjugados em porções de anticorpo acima para formar multímeros. Por exemplo, porções Fc fusionadas nos polipeptídeos da presente invenção podem formar dímeros através de ligação de dissulfeto entre as porções Fc. Formas multiméricas superiores podem ser preparadas pela fusão dos polipeptídeos em porções de IgA e IgM. Métodos de fusão ou conjugação dos polipeptídeos da presente invenção em porções de anticorpo são conhecidos na arte. Veja, e.g., Pat. U.S. Nos. 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; Publicações PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590- 5600 (1995); e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:11337-11341(1992) (ditas referências incorporadas em suas totalidades como referências). Por meio de outro exemplo não limitante, polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou suas variantes) podem ser fusionados com albumina (incluindo mas não limitada à albumina sérica recombinante de humano ou fragmentos ou suas variantes (veja, e.g., Pat. U.S. No. 5.876.969, publicada aos 2 de Março de 1999, Patente EP 0.413.622, e Pat. U.S. No. 5.766.883, publicada aos 16 de Junho de 1998, aqui incorporadas em suas totalidades como referências)). Polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou suas variantes) podem ser fusionados em extremidade quer N-terminal quer C-terminal da proteína heteróloga (e.g., polipeptídeo Fc de imunoglobulina ou polipeptídeo de albumina sérica de humano). Polinucleotídeos codificadores de proteínas de fusão da invenção também estão incluídas na invenção.
Como discutido acima, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados nas porções de anticorpo acima para aumentar a meia-vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em métodos de imunoensaio conhecidos na arte. Ademais, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados nas porções de anticorpo acima para facilitar purificação. Um exemplo relatado descreve proteínas quiméricas consistindo dos dois primeiros domínios do polipeptídeo CD4 de humano e vários domínios das regiões constantes das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas de mamífero. (Veja, e.g., EP 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Liberação aumentada de um antígeno através da barreira epitelial no sistema imune tem sido demonstrada para antígenos (e.g., insulina) conjugados em um parceiro de ligação FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, e.g., Publicações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Os polipeptídeos da presente invenção fusionados ou conjugados em um anticorpo tendo estruturas diméricas ligadas por dissulfeto (devido à IgG) também podem ser mais eficientes em ligação e neutralização de outras moléculas, do que a proteína secretada monomérica ou fragmento de proteína sozinha(o). (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Em muitos casos, a parte Fc em uma proteína de fusão é benéfica em terapia e diagnose, e assim pode resultar em, por exemplo, propriedades farmacêuticas melhoradas. (EP A 232.262). Alternativamente, deleção da parte Fc após a proteína de fusão ter sido expressada, detectada, e purificada, seria desejada. Por exemplo, a porção Fc pode impedir terapia e diagnose se a proteína de fusão é usada como um antígeno para imunizações. Em descoberta de droga, por exemplo, proteínas de humano, tal como hIL-5, têm sido fusionadas com porções Fc para o propósito de ensaios de seleção de produtividade alta para identificar antagonistas de f hIL-5. (Veja, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459- 9471 (1995)0. Tais técnicas também incluem, mas não são limitadas ao, uso de agentes de conjugação bifuncionais (veja e.g., Pat. U.S. Nos. 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; e 5.808.003; cujos conteúdos de cada uma são aqui incorporados em suas totalidades como referências).
Além disso, os polipeptídeos da invenção (e.g., anticorpos ou seus fragmentos) podem ser fusionados para preparar seqüências, tal como um peptídeo para facilitar sua purificação. Em uma outra modalidade, ácidos nucleicos codificadores dos polipeptídeos da invenção (incluindo, mas não limitados aos ácidos nucleicos codificadores de epitopos imunogênicos e/ou antigênicos) também podem ser recombinados com um gene de interesse como uma etiqueta de epitopo (e.g., a etiqueta hemaglutinina ("HA") ou a etiqueta bandeira) para ajudar em detecção e purificação do polipeptídeo expressado. Em modalidades preferidas, a seqüência de aminoácidos de marcador é um peptídeo de hexa-histidina, tal como a etiqueta proporcionada em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311), dentre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina proporciona a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeo para purificação incluem, mas não são limitadas a, à etiqueta "HA", que corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e a etiqueta "bandeira".
A presente invenção adicionalmente inclui moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 conjugadas(os) em um agente diagnóstico ou terapêutico. As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 podem ser usadas(os) diagnosticamente para, por exemplo, monitorar o desenvolvimento ou a progressão de um tumor como parte de um procedimento de teste clínico para, e.g., determinar a eficácia de um dado regime de tratamento, diagnose, detecção, e/ou prevenção. Detecção pode ser facilitada por copulação do anticorpo em uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, e íons de metal paramagnético não-radioativo. Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.741.900 para íons de metal que podem ser conjugados em anticorpos para uso como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína- isotiocyanato, rodamina, diclorotriazinil-amina fluoresceeína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I5131I5111In 99τ
ou Tc.
Ademais, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL- 31 podem ser conjugadas(os) em um grupo terapêutico tal como uma citotoxina, e.g., um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo. Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para células. Exemplos incluem paclitaxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidróxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (e.g., metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tio-guanina, citarabina 5-fluoro-uracila decarbazina), agentes de alquilação (e.g., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclo-tosfamida, busulfan, dibromo-manitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-dicloro- diamina-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e.g., daunorubicina (outrona daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (outrona actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (e.g., vincristina e vimblastina).
Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, o agente terapêutico ou grupo de droga não é para ser entendido como limitado aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o grupo droga pode ser uma proteína ou um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral; a-interferon,.beta.-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti-trombótico, e.g., angiostatina ou endostatina; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de macrofase de granulócitos ("GM- CSF"), fator estimulante de colônias de granulócito ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também pode ser ligadas(os) em suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, poli(cloreto de vinila) ou polipropileno.
Técnicas para conjugar tal grupo terapêutico em anticorpos são bem conhecidos, veja, e.g., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapyem Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
Alternativamente, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser conjugadas(os) em um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo como descrito por Segai em Pat. U.S. No. 4.676.980, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31, com ou sem um grupo terapêutico conjugado nelas (neles), administradas(os) sozinhas(os) ou em combinação com fator(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s) podem ser usadas(os) como um agente terapêutico.
Uma variedade de ensaios conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte pode ser utilizada para detectar ligação de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 em polipeptídeos ou proteínas IL- 31. Ensaios exemplares são descritos em detalhe em Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow e Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Exemplos representativos de tais ensaios incluem: imunoeletroforese concorrente, radioimunoensaio, radioimuno-precipitação, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ensaio dot blot ou Western blot, ensaio de inibição ou competição, e ensaio de sanduíche. Em adição, anticorpos podem ser selecionados para ligação em polipeptídeo ou proteína IL-31 mutante versus de tipo selvagem.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 to IL-31 podem ser usadas(os) para etiquetar células que expressam IL-31; para isolar IL-31 por purificação por afinidade; para ensaios diagnósticos para determinar níveis circulantes de polipeptídeos IL-31; para detectar ou quantificar IL-31 solúvel como um marcador de doença ou patologia subjacente; em métodos analíticos empregando FACS; para selecionar bibliotecas de expressão; para gerar anticorpos anti-idiotípicos; e como anticorpos neutralizadores ou como antagonistas para bloquear atividade de IL-31 in vitro e in vivo. Marcadores ou etiquetas diretos(as) adequados(as) incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhante; marcadores ou etiquetas indiretos(as) podem retratar o uso de biotina-avidina ou de outros pares de complemento / anti- complemento como intermediários. Anticorpos aqui também podem ser direta ou indiretamente conjugados em drogas, toxinas, radionuclídeos e semelhante, e estes conjugados usados para aplicações terapêuticas ou diagnosticas in vivo. Além disso, anticorpos para IL-31 ou seus fragmentos podem ser usados in vitro para detectar IL-31 desnaturada ou seus fragmentos em ensaios, por exemplo, Western Blots ou outros ensaios conhecidos na arte.
A escolha do domínio Fc pode ter implicações sobre (i) as funções efetoras do anticorpo (ligação de FcyR (ADCC) / ligação de Clq (CDC)) e efeitos colaterais potencialmente associados, (ii) suas propriedades farmacocinéticas (ligação de FcRn) incluindo meia-vida, e (iii) possivelmente sobre depuração de complexo imune. A(s) função(ões) efetora(s) do domínio Fc inclui (incluem) fagocitose, liberação de mediadores inflamatórios, regulação de produção de anticorpo, e o mais importante citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). O grau com o qual qualquer uma destas funções efetoras são induzidas depende da interação do domínio Fc com os mediadores de proteína relevantes, Clq e os receptores Fcy, e difere dependendo das regiões constantes (Fc) de subclasse de IgG e sua interação com estas proteínas.
O domínio Fc de IgGl interage com FcyRI, FcyRIIa, e FcyRIII sobre as células efetoras de sistema imune. O papel preciso de receptores Fcy diferentes permanece para ser elucidado mas FcyRIIIA é considerado em se o receptor mediador de ADCC mais importante expressado primariamente sobre células NK mas também monócitos e macrófagos. IgGl também se liga em Clq e pode acionar CDC que é mediada principalmente por células NK expressando FcyRIII. Veja Gessner, J.E., et al., "The IgG Fc Receptor Family", Ann. Hematol. 1998 Jun:76(6): 231-248. O domínio IgG4 Fc tem basicamente reduzido afinidade de ligação por Clq e receptores Fcy diferentes, correspondendo às ADCC e CDC reduzidas. Por exemplo, Sharma et al. examinaram uma comparação direta de um IgGl mAb e seu derivado IgG4, cada um com regiões variáveis idênticas que selecionaram CD4. Ambos mAbs diminuíram expressão de CD4 em níveis de dose iguais e tiveram propriedades farmacocinéticas equivalentes, mas a forma de IgGl mostrou um efeito de ADCC mais potente. Veja Sharma A., et al., "Comparative pharmacodynamics of keliximab and clenoliximab in transgenic mice bearing human CD4". J Pharmacol Exp Ther. 2000 Apr;293(l):33-41.
A afinidade de ligação de IgG4 mAb negativo efetor é grandemente reduzida se não foi abolida quando comparado com outros mAbs de isótipos IgG. Contudo, a capacidade para interagir com o receptor Brambell (FcRn) é mantida em IgG4 afetando assim a farmacocinética do mAb de isótipo IgG4 através de uma meia-vida aumentada. Enquanto IgGl mostre geralmente atividade alta para ambas ADCC e CDC, IgG4 é considerada como tendo atividade baixa ou nula de ADCC ou CDC.
Vários exemplos de mAbs de isótipo IgG4 estão quer no mercado, em uso clínico quer em vários estágios de pesquisa e desenvolvimento. Estes mAbs terapêuticos são desenvolvidos para uma variedade de indicações em oncologia, autoimunidade & inflamação bem como em terapia anti-viral.
Como relatado por Aalberse et al. (Veja Aalberse RC, Schuurman, J. "IgG4 breaking the rules", Immunology 2002, 105: 9-19), (IgG4) de humano existe em duas formas moleculares devido à heterogeneidade de suas pontes de dissulfeto de inter-cadeias pesadas na região de dobradiça em uma porção de IgG4 de humano secretada. Esta heterogeneidade é apenas revelada sob condições não-redutoras, de desnaturação nas quais um "meio-anticorpo" HL é detectado, um fenômeno não visto em outros isótipos IgG de humano. Taylor relata que fenômenos artifactuais durante manuseio de amostra tais scrambling de dissulfeto e reoxidação de dissulfeto sob exposição a redutor podem contribuir para a quantidade de semi-anticorpo presente (Taylor FR, et al., "Suppression of Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Sample Preparation Artifacts for Analysis of IgG4 Half-Antibody". Analytical Bioehemistry 2006, 353: 204-208). Sob condições nativas, interações não eovalentes garantem que o anticorpo é mantido junto como o tetrâmero H2L2. Não obstante, IgG4 tem sido relatada em heterodimerizar com outras moléculas de IgG4 em circulação. Análise das seqüências de dobradiça que conectam o F[ab] e a porção Fc do anticorpo de cadeias pesadas de IgG de humano sugere que a presença de serina em resíduo 241 pode ser a causa desta heterogeneidade: a região de dobradiça de IgG4 contém uma seqüência Cys-Pro-Ser-Cys em vez de uma seqüência Cys-Pro-Pro-Cys em IgGl. Mudança de serina em 241 para prolina (encontrada naquela posição em IgG 1 e IgG2) em cadeia quimérica de humano/camundongo leva à produção de um anticorpo homogêneo e abole a heterogeneidade. Ademais, a IgG4 variante tem significativamente estendido a meia-vida sérica e mostra uma distribuição em tecido melhorada comparada com a IgG4 quimérica original.
Moléculas detectáveis adequadas podem ser direta ou indiretamente ligadas no polipeptídeo ou anticorpo, e incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhante. Moléculas citotóxicas adequadas podem ser direta ou indiretamente ligadas no polipeptídeo ou anticorpo, e incluem toxinas de bactéria ou de planta (por exemplo, difteria, toxina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e semelhante), bem como radionuclídeos terapêuticos, tais como iodo-131, rênio-188 ou ítrio-90 (quer diretamente ligado no polipeptídeo ou anticorpo, quer indiretamente ligado através de um grupo quelante, por exemplo). Polipeptídeos ou anticorpos também podem ser conjugados em drogas citotóxicas, tal como adriamicina. Para ligação indireta de uma molécula citotóxica ou detectável, a molécula citotóxica ou detectável pode ser conjugada com um membro de um par de complemento / anticomplemento, onde o outro membro é ligado na porção de polipeptídeo ou anticorpo. Para estes propósitos, biotina/estreptavidina é um par complemento / anticomplemento exemplar.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem atuar como "antagonistas" de IL-31 para bloquear ligação de IL-31 e transdução de sinal in vitro in vivo. Estas moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 seriam úteis para inibir atividade de IL-31 ou ligação de proteína.
Proteínas de fusão polipeptídeo - toxina ou proteínas de fusão anticorpo - toxina podem ser usadas para inibição de tecido ou célula selecionada(o) (por exemplo, para tratar tecidos ou células de câncer). Alternativamente, se o polipeptídeo tem múltiplos domínios funcionais (i.e., um domínio de ativação ou um domínio de ligação de receptor, mais um domínio de seleção), uma proteína de fusão incluindo apenas o domínio de seleção pode ser adequada para dirigir uma molécula detectável ou uma molécula complementar para um tipo de célula ou tecido de interesse. Em casos onde o domínio apenas proteína de fusão inclui uma molécula complementar, a molécula anti-complementar pode ser conjugada em uma molécula citotóxica ou detectável. Tais proteínas de fusão de domínio - molécula complementar assim representam um veículo ou agente de transporte selecionador genérico para liberação célula/tecido-específica de conjugados de molécula citotóxica / detectável - anti-complementar genéricos.
Um outro objetivo da presente invenção é uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora de qualquer um dos anticorpos aqui acima e abaixo descritos, ou uma sua seqüência degenerada ou fita complementar. Em relação a isto, o termo "molécula de ácido nucleico" inclui todos os tipos diferentes de ácidos nucleicos, incluindo sem limitação ácidos desoxirribonucleicos (e.g., DNA, cDNA, gDNA, DNA sintético, etc.), ácidos ribonucleicos (e.g., RNA, mRNA, etc.) e ácidos peptídeo-nucleicos (PNA). Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de DNA, tal como uma molécula de DNA de fita dupla ou uma molécula de cDNA. O termo "isolado" significa moléculas de ácido nucleico que têm sido identificadas e separadas de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está ordinariamente associada na fonte natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente na forma ou no ambiente na(o) qual ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas portanto são distinguidas da molécula de ácido nucleico específica porque ela existe nas células naturais. Uma seqüência degenerada designa qualquer seqüência de nucleotídeos codificadora de mesma seqüência de aminoácidos como uma seqüência de nucleotídeos de referência, mas compreendendo uma seqüência de nucleotídeos distinta como um resultado da degeneração do código genético.
Um outro objetivo desta invenção é um vetor compreendendo DNA codificador dos anticorpos descritos acima ou abaixo. O vetor pode ser qualquer vetor de expressão ou de clonagem, integrativo ou autonomamente replicativo, funcional em qualquer célula procariótica ou eucariótica. Em particular, o vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fago, epissomo, cromossomo artificial, e semelhante. O vetor pode compreender elementos regulatórios, tais como um promotor, terminador, intensificador, marcador de seleção, origem de replicação, etc. Exemplos específicos de tais vetores incluem plasmídeos procarióticos, tais como plasmídeos pBR, pUC ou pcDNA; vetores virais, incluindo vetores retroviral, adenoviral ou AAV; bacteriófagos; baculovírus; BAC ou YAC, etc., como será discutido abaixo. A seqüência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, DNA é inserido em um sítio(s) de endonuclease de restrição apropriado usando técnicas conhecidas na arte. Construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas por técnicos experientes.
Um outro da presente invenção é uma célula hospedeira recombinante, sendo que a dita célula compreende uma molécula de ácido nucleico ou um vetor como definido acima. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Exemplos de células procarióticas incluem bactérias, tal como E. coli. Exemplos de células eucarióticas são células de levedura, células de planta, células de mamífero e células de inseto incluindo qualquer cultura de célula primária ou linhagem de célula estabelecida (e.g., 3T3, Vero, HEK293, TN5, etc.). Células hospedeiras adequadas para a expressão de proteínas glicosiladas são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de inseto tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células de plantas. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e células COS. Exemplos mais específicos incluem linhagem CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico de humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescerem em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês ADHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)); células Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmão de humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado de humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51). Células de mamífero particularmente preferidas da presente invenção são células CHO.
Como mostrado aqui acima, os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer técnica conhecida por si na arte, tal como por tecnologias recombinantes, síntese química, clonagem, ligações, ou combinações das mesmas. Em uma modalidade particular, os anticorpos são produzidos por tecnologias recombinantes, e.g., pela expressão de um ácido nucleico correspondente em uma célula hospedeira adequada. Outro objetivo desta invenção é portanto um método de produzir um anticorpo da presente invenção, o método compreendendo cultivar uma célula hospedeira recombinante da invenção sob condições que permitem a expressão da molécula de ácido nucleico, e recuperar o polipeptídeo produzido. O polipeptídeo produzido pode ser glicosilado ou não, ou pode conter outras modificações após tradução dependendo do tipo de célula hospedeira usado. Muitos livros e revisões proporcionam ensinamentos sobre como clonar e produzir proteínas recombinantes usando vetores e células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tais como alguns títulos na série "A Practical Approach" publicado por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
Os vetores a serem usados no método de produzir um anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser vetores epissomais ou não/homologamente integrados, que podem ser introduzidos dentro das células hospedeiras apropriadas por qualquer meio adequado (transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, electroporação, precipitação por fosfato de cálcio, microinjeção direta, etc.). Fatores de importância em seleção de um plasmídeo, vetor viral ou retroviral particular incluem: a facilidade com a qual as células recipientes que contêm o vetor podem ser reorganizadas e selecionadas daquelas células recipientes que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em um hospedeiro particular; e se é desejável "transportar" o vetor entre as células hospedeiras de espécies diferentes. Os vetores devem permitir a expressão do polipeptídeo ou das proteínas de fusão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, sob o controle de seqüências regulatórias de iniciação / terminação de transcrição apropriadas, que são escolhidas para serem constitutivamente ativas ou induzíveis em dita célula. Uma linhagem de célula substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isolada para proporcionar uma linhagem de célula estável.
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com
vetores de clonagem ou de expressão aqui descritos para produção de proteína e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação de genes codificadores das seqüências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhante, podem ser selecionadas pelo técnico experiente sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.
Células preferidas a serem usadas na presente invenção são células hospedeiras eucarióticas, e.g. células de mamífero, tais como células de humano, de macaco, de camundongo, e de Ovário de Hamster Chinês (CHO), porque proporcionam modificações após tradução em moléculas de proteína, incluindo dobramento correto ou glicosilação em sítios corretos. Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células de rim de macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), célula de rim de embrião de humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de rim de hamster bebê (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células de pituitária de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de rim de macaco transformadas com SV40 (COS- 1; ATCC CRL 1650), melanoma de osso e carcinoma hepatocelular de humano (por exemplo Hep G2), células embriônicas murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) e numerosas outras linhagens de célula. Células hospedeiras eucarióticas alternativas são células de levedura (e.g., Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.) transformadas com vetores de expressão. Também células de levedura podem realizar modificações de peptídeos após tradução incluindo glicosilação. Existem numerosas estratégias de DNA recombinante que utilizam seqüências de promotor forte e número de cópias alto de plasmídeos que podem ser utilizados para produção das proteínas desejadas em levedura. Células de levedura reorganizam seqüências líder em produtos de gene de mamífero clonado e secretam polipeptídeos possuindo seqüências líder (i.e., pre-peptídeos).
Para produção de rendimento alto, de longa duração de um polipeptídeo recombinante, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens de célula que estavelmente expressam o polipeptídeo de interesse podem ser transformadas usando vetores de expressão que podem conter origem virais de replicação e/ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável no mesmo vetor ou em um vetor separado. Após a introdução do vetor, as células podem ser permitidas crescerem por 1 -2 dias em um meio enriquecido antes de serem mudadas para meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência para seleção, e sua presença permite crescimento e recuperação de células que bem sucedidamente expressam as seqüências introduzidas. Clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Uma linhagem de célula substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isolada para proporcionar uma linhagem de célula estável.
Um método particularmente preferido de produção de rendimento alto de um polipeptídeo recombinante da presente invenção é através do uso de amplificação por di-hidro-folato redutase (DHFR) em células CHO deficientes em DHFR, pelo uso de níveis sucessivamente crescentes de metotrexato como descrito em US 4.889.803. O polipeptídeo obtido pode estar em uma forma glicosilada.
Anticorpos aqui também podem ser expressados em outras células eucarióticas, tais como células de ave, de fungo, de inseto, de levedura, ou de planta. O sistema baculovírus proporciona um meio eficiente para introduzir genes clonados em células de inseto. Os materiais para sistemas de expressão de célula de inseto / baculovírus estão comercialmente disponíveis na forma de kit de, inter alia, Invitrogen.
Em adição às tecnologias de DNA recombinante, os anticorpos desta invenção podem ser preparados por tecnologias de síntese química. Exemplos de tecnologias de síntese química são síntese em fase sólida e síntese em fase líquida. Como uma síntese em fase sólida, por exemplo, o aminoácido correspondendo a terminação-carboxila do polipeptídeo a ser sintetizado é ligado em um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos e, por repetição alternada de reações (e.g., por condensação seqüencial de aminoácidos com seus grupos amino e grupos funcionais de cadeia lateral protegidos com grupos protetores apropriados), a cadeia de polipeptídeo é estendida. Métodos de síntese em fase sólida são basicamente classificados pelo método tBoc e pelo método Fmoc, dependendo do tipo de grupo protetor usado. Proteínas totalmente sintéticas são mostradas na literatura (Brown A et al., 1996).
Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos, formulados, administrados, ou genericamente usados em outras formas alternativas que podem ser preferidas de acordo com o método de uso e/ou de produção desejado. As proteínas da invenção podem ser modificadas após tradução, por exemplo por glicosilação. Os polipeptídeos ou as proteínas da invenção podem ser obtidas em forma isolada (ou purificada) biologicamente ativa, ou como precursores, derivados e/ou seus sais.
Em outra modalidade, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de proteínas de fusão IL-31 podem ser usadas(os) para extermínio in vivo de tecidos alvo onde os receptores de IL-31 são expressados) (Veja, geralmente, Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997). As proteínas de fusão descritas permitem direcionar as moléculas ligantes de IL- 31 ou os antagonistas de IL-31 para um sítio de ação desejado, proporcionando deste modo uma concentração local elevada de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31, seleção de um tecido ou de uma célula indesejável (i.e., um tumor ou uma leucemia), e Iise por células efetoras de célula alvo melhorada mediada por citocina fusionada. Citocinas adequadas para este propósito incluem interleucina 2 e fator estimulante de colônias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF), por exemplo.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 da presente invenção podem ser medidas(os) para sua capacidade para inibir, bloquear, ou neutralizar o ligante de IL-31 como determinado por vários modelos in vivo conhecidos na arte e aqui descritos, incluindo mas não limitados ao modelo NC/Nga, o modelo epicutâneo Ova, o modelo de hipersensibilidade crônica, e o modelo de hapteno crônico.
Tanto células-T residentes em pele quanto queratinócitos epidérmicos têm estado implicados na patologia de doenças de pele em humanos. Expressão de IL-31 mRNA e proteína é restrita à população de células-T CLA+ residentes em pele em humanos. Veja Pedido de Patente U.S. de número 11/353.427, depositado aos 14 de Fevereiro de 2006, aqui incorporado como referência. Como tal, um antagonista para IL-31, incluindo um anticorpo ou antagonista de receptor será útil no tratamento de doenças de epiderme e de pele que têm expressão de células-T CLA+. Tais doenças incluem, por exemplo, dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso. Marcadores de quimiocina tais como TARC e MDC são úteis para medir o efeito de um anticorpo monoclonal neutralizador para IL-31. Os efeitos inibitórios de tratamento com moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) podem ser medidos pela monitoração dos níveis de TARC e MDC.
Dermatite de contato
Dermatite de contato alérgica é definida como uma reação imune mediada por célula-T a um antígeno que entra em contato com a pele. A população de células-T CLA+ é considerada em estar envolvida na iniciação de dermatite porque respostas de célula-T dependente de alérgeno estão basicamente confinadas na população CLA+ de células (Veja Santamaria-Babi, L.F., et al., JExp Med: 181, 1935, (1995)). Dados recentes têm verificado que apenas células-T de memória (CD45RO+) CD4+ CLA+ e não células-T CD8+ T proliferam e produzem ambas as citocinas de tipo-1 (IFN-) e de tipo-2 (IL-5) em resposta a níquel, um alérgeno de hipersensibilidade de contato comum. Ademais, células expressando CLA em combinação com CD4, CD45RO (memória) ou CD69 são aumentadas após estimulação níquel-específica e expressam receptores de quimiocina CXCR3, CCR4, CCRlO mas não CCR6. Veja Moed H., et al., Br J Dermatol:51, 32, (2004).
Em modelos animais, tem sido demonstrado que dermatite alérgica de contato é dependente de célula-T e que as células-T alérgico- responsivas migram para o sítio de aplicação de alérgeno. Veja geralmente: Engeman T.M., et al., J Immunol: 164, 5207, (2000); Ferguson T.A. & Kupper T.S. J Immunol: 150, 1172, (1993); e Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001). Visto que células-T CLA+ produzem IL-31 e estimulação de IL-31 de queratinócitos de pele podem induzir quimiocinas pró-inflamatórias, tais como TARC e MDC, IL-31 pode estar envolvida na patofisiologia de dermatite de contato. Em relação ao uso de um anticorpo anti-IL-31 neutralizador em um modelo em camundongo de hipersensibilidade de contato. Veja Exemplo 5.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) podem ser usadas(os) para melhorar resultado clínico de Hipersensibilidade de Contato por inibição, redução, neutralização, prevenção ou bloqueio de inflamação e/ou arranhadura associada com doença.
Dermatite atópica
Dermatite atópica (AD) é uma doença de pele inflamatória cronicamente reincidente com uma incidência dramaticamente crescente no decorrer das últimas décadas. Clinicamente AD é caracterizada por pápulas e placas elevadamente pruríticas muitas vezes escoriadas que mostram um curso de reincidência crônica. A diagnose de AD é em sua maior parte baseada verificações clínicas maiores e menores. Veja Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999). Histopatologia revela espongiose, hiperparaceratose e paraceratose focai em lesões agudas, enquanto que hiperplasia epidérmica marcante com hiper e paraceratose, acantose/hipergranulose e infiltração perivascular da derme com linfócitos e mastócitos abundantes são as indicações de lesões crônicas.
Células-T desempenham um papel central na iniciação de respostas imunes locais em tecidos e evidência sugere que células-T infiltrando em pele em particular, podem desempenhar um papel chave na iniciação e na manutenção de respostas imunes desreguladas na pele. Aproximadamente 90% de células-T infiltrantes em sítios inflamatórios expressam a Ag linfócito cutâneo-associado (CLA+) que liga E-selectina, uma molécula de adesão induzível sobre endotélio (revisto em Santamaria- Babi L.F., et al., Eur JDermatol: 14, 13, (2004)). Um aumento significativo em células-T CLA+ circulantes dentre pacientes com AD comparados com indivíduos de controle tem sido documentado (veja Teraki Y., et al., Br J Dermatol: 143, 373 (2000), enquanto que outros têm demonstrado que células-T CLA+ de memória de pacientes com AD preferencialmente respondem ao extrato de alérgeno comparadas com a população CLA- (Veja Santamaria-Babi, L.F., et al., JExp Med: 181, 1935, (1995)). Em humanos, a patogênese de distúrbios atópicos da pels tem estado associada com aumentos em células-T CLA+ que expressam níveis aumentados de citocinas de tipo Th-2 como IL-5 e IL-13 9, 10. Veja Akdis M., et al., Eur JImmunol: 30, 3533 (2000); e Hamid Q., et al. Allergy Clin Immunol: 98, 225 (1996).
Camundongos NC/Nga espontaneamente desenvolvem lesões semelhantes a AD que se igualam à AD de humano em muitos aspectos, incluindo sinais e curso clínicos, histopatologia quando alojados em condições livres de patógeno não-específico (não-SPF) a cerca de 6-8 semanas de idade. Em contraste, camundongos NC/Nga mantidos sob condições SPF não desenvolvem lesões de pele. Contudo, início de lesões de pele espontâneas e comportamento de arranhadura podem ser sincronizados em camundongos NC/Nga alojados em uma instalação SPF por injeção intradermal semanal de antígeno de ácaro de poeira bruta. Veja Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003). Portanto, o desenvolvimento de AD em NC/Nga é um modelo útil para a avaliação de agentes terapêuticos novos para o tratamento de AD.
Em adição ao modelo NC/Nga de AD espontânea, sensibilização epicutânea de camundongos usando OVA também pode ser utilizada como um modelo para induzir espessamento dérmico e epidérmico dependente de antígeno com um infiltrado mononuclear em pele de camundongos sensibilizados. Isto normalmente coincide com níveis séricos elevados de IgE específica e total, contudo nenhuma disfunção de barreira de pele ou prurido ocorre neste modelo. Veja Spergel J.M., et al., J Clin Invest, 101: 1614, (1998). Este protocolo pode ser modificado com o propósito de induzir desregulação de barreira de pele e prurite por sensibilização de camundongos transgênicos DO 11.10 OVA TCR com OVA. Aumento do número de células-T antígeno-específicas que poderiam reconhecer o antígeno sensibilizador pode aumentar o nível de inflamação na pele para induzir comportamento de arranhadura e liquenificação / escamação visíveis da pele.
Ambos o modelo de AD espontânea NC/Nga e o modelo DOl 1.10 epicutâneo OVA são usados para avaliar a capacidade das moléculas ligantes de IL-31 ou dos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) para inibir, reduzir, ou neutralizar os efeitos de IL-31. Administração de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode resultar em uma redução em arranhadura que pode ser efetiva no tratamento de doenças pruríticas incluindo, mas não limitadas a, dermatite atópica, prurigo nodular, e eczema, porque cessação de arranhadura interromperá o progresso da dermatite, cujo desenvolvimento é dependente de arranhadura.
Modelos adicionais para medir os efeitos inibitórios das moléculas ligantes de IL-31 ou dos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) são descritos por Umeuchi, H. et al., European Journal of Pharmacology, 518: 133-139, 2005; e por Yoo, J. et al., J. Experimental Medicine, 202:541-549, 2005.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar o resultado clínico de dermatite e doenças pruríticas incluindo dermatite atópica, prurigo nodular, e eczema por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença.
Reações alérgicas cutâneas do tipo retardado induzidas por
droga
Reações alérgicas cutâneas do tipo retardado induzidas por droga são muito heterogêneas e podem refletir muitos eventos patofisiológicos distintos. Veja Brockow K., et al., Allergy: 57, 45 (2002). Mecanismos imunológicos envolvidos nestas reações têm sido mostrados como mediados quer por célula quer por anticorpo. Em alergia à droga imediata uma reação a anticorpo IgE-mediada pode ser demonstrada por um teste intradérmico e/ou de picada de pele positiva após 20 min, enquanto que reações não-imediatas às drogas podem ocorrer mais do que uma hora após a última ingestão de droga e muitas vezes são mediadas por célula-T. Reações de tipo retardado mediadas por célula-T não-imediatas podem ocorrer em pacientes com reações à droga adversas à penicilinas por exemplo. Respostas de célula-T proliferativa às penicilinas têm sido mostradas em serem restritas à subpopulação memória (CD45RO+) CLA+ de células-T de pacientes alérgicos à penicilina enquanto que o subconjunto CD45RO+ CLA- não mostra resposta proliferativa. Veja Blanca M., Leyva L., et al., Blood Cells Mol Dis:31, 75 (2003). Reações de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) podem ser artificialmente produzidas em camundongos, permitindo avaliação de fatores que podem estar envolvidos na iniciação e na perpetuação da resposta DTH. 11-31 moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 neutralizadoras(es) poderiam ser efetivas(os) em reações de hipersensibilidade do tipo retardado. Necrólise epidérmica tóxica (TEN) é uma reação à droga
extremamente severa mas muito rara caracterizada por apoptose muito espalhada de epiderme com bolhas extensivas. Estudos têm mostrado que linfócitos infiltrando a bolha são células-T CLA+ e podem exibir citotoxicidade para queratinócitos epidérmicos. Veja Leyva L., et al.,. J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000); e Nassif A., Bensussan A., et al., J Allergy Clin ImmunohMA, 1209 2004). Um sistema de camundongo transgênico, pelo qual OVA é expressada sob o controle do promotor de queratina-5 (K5) na epiderme e nos queratinócitos foliculares pilosos de camundongos, tem sido gerado para estabelecer um modelo animal para TEN. Células-T CD8 + específicas para OVA, quando adotadamente transferidas para dentro de camundongos K5-OVA, sofrem ativação e proliferação nos linfonodos de drenagem da pele e selecionam a pele de camundongos K5- OVA, resultando em desenvolvimento de lesões de pele que lembram TEN. Veja Azukizawa H., et al., Eur JImmunol: 33, 1879 (2003).
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar o resultado clínico de TEN por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença.
Pênfigo bolhoso
Pênfigo bolhoso é um distúrbio subepidérmico que se manifesta como bolhas subepidérmicas com um infiltrado dérmico de neutrófilos e eosinófilos. Diagnose é caracterizada pela presença de anticorpos antígeno-específicos contra proteínas de adesão específicas da epiderme e da junção dermal-epidermal. Veja Jordon R.E., et al., JAMA: 200, 751 (1967). Estudos analisando o papel de células-T na patogênese de pênfigo bolhoso pela análise de PBL e células-T de bolha de pie têm verificado uma predominância de células-T CLA+ expressando níveis aumentados de citocinas Th2 como IL-4 e IL-13. Veja Teraki Y., et al., J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001). Em pacientes com pênfigo bolhoso após terapia com corticosteróides sistêmicos, a freqüência de células produtoras de interleucina-13, CLA+, mas não de CLA-, é significativamente diminuída. Diminuições em células CLA+ após tratamento com corticosteróide estão associadas com melhoria clínica. Veja Teraki, ibid.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar o resultado clínico de pênfigo bolhoso por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença. Alopecia areata
Alopecia areata (AA) é considerada como uma doença autoimune restrita a tecido de folículos pilosos na qual atividade folicular é reprimida por causa da atividade continuada de infiltrados linfocíticos. AA resulta em trechos de completa perda capilar em qualquer lugar no corpo, embora perda real de folículos pilosos não ocorra, até mesmo em lesões sem pêlos. Embora sinais clínicos de inflamação estejam ausentes, biopsias de pele de sítios de doença ativa mostram inflamação linfocítica perifolicular de primariamente células CD4+, juntamente com um infiltrado intrafolicular de CD8+. Veja Kalish R.S. & Gilhar A. JInvestig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003).
Estudos têm mostrado que linfócitos CD4+ e CD8+ infiltrando em pele de escalpo expressam CLA e, em sangue periférico de indivíduos com AA, a percentagem de linfócitos CLA+ CD4+ ou CD8+ é significativamente mais alta do que aquela de controles normais. Ademais, pacientes com AA severa ou progressiva mostram uma CLA-positividade mais alta comparados com pacientes se recuperando da doença e uma diminuição em percentagem de células CLA+ comparadas com um curso clínico bom. Veja Yano S., et al., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002). Estes estudos portanto sugerem que linfócitos CLA+ podem desempenhar um papel importante em AA. Modelos de xenoenxerto têm demonstrado que células-T ativadas possivelmente desempenham um papel na patogênese de AA. Escalpo lesional de pacientes AA graftizados sobre camundongos nus desenvolve de novo pêlo coincidente com uma perda de linfócitos infiltrantes do enxerto e, transferência de células-T lesionais ativadas para camundongos SCID pode transferir perda de pêlo para explantes de escalpo de humano sobre camundongos SCID. Veja Kalish R.S. & Gilhar A. JInvestig Dermatol Symp Proe: 8, 164(2003).
Uma variedade de terapias imunomodulatórias é parte do tratamento usual para este distúrbio, entretanto nenhuma destas terapias têm sido consistente em sua eficácia. Veja Tang L., et al., JInvest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L., et al., (2004); e Tang L., et al., JAm AcadDermatol: 49, 1013 (2003). Contudo, seus usos em modelos animais válidos proporcionam uma ferramenta para examinar mecanismos moleculares de efeitos terapêuticos. Veja Shapiro J., et al., J Investig Dermatol Symp Proc: 4, 239 (1999); Tang L., et al., "Old wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models" (2003); e Verma D.D., et al., Eur J DermatohXA, 332 (2004).
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar resultado clínico de alopecia areata por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença.
Acne rosácea/Acne vulgar
Acne vulgar, um distúrbio do aparelho pilossebáceo, é o problema de pele mais comum da adolescência. Anormalidades em queratinização folicular são consideradas em produzir a lesão de acne. Acne rosácea é diferenciada de acne vulgar pela presença de pápulas vermelhas, pústulas, cistos e telangiectasia extensiva, mas a ausência de comedões (cabeças brancas). Excreção de sebo aumentada das glândulas sebáceas é um fator maior na patofisiologia de acne vulgar. Outras funções de glândula sebácea também estão associadas com o desenvolvimento de acne, incluindo lipídeos pró-inflamatórios sebáceos; citocinas diferentes localmente produzidas; neuropeptídeos e peptídeos periglandulares, tal como hormônio liberador de corticotrofina, que é produzido por sebocitos; e substância P, que é expressada nas terminações nervosas na vizinhança de glânculas aparentemente saudáveis de pacientes com acne. Veja Zouboulis C.C. Clin Dermatol: 22, 360 (2004).
Embora a patofisiologia de acne vulgar e de acne rosácea permaneça desconhecida, observações clínicas e estudos histopatológicos sugerem que inflamação do folículo pilossebáceo pode ser central para a patogênese de acne rosácea e vulgar. Estudos iniciais sobre análise de subconjuntos de célula-T infiltrando lesões rosáceas indicou que a maioria das células-T expressava CD4. Veja Rufli T. & Buchner S.A. Dermatológica: 169, 1 (1984).
Células-T CD4+ produzem IL-31 e análise IHC de pele para expressão de IL-31 sugere que IL-31 é expressada em glândulas sebácea e sudorípara. Estimulação por IL-31 de queratinócitos epidérmicos induz expressão de quimiocinas que provavelmente resulta em infiltração celular sugerindo que IL-31 pode contribuir para a resposta pró-inflamatória em pele. Veja Dillon S.R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). IL-31 portanto pode contribuir para a patofisiologia de acne rosácea e acne vulgar.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar resultado clínico de acne vulgar por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença.
Prurigo nodular
Prurigo nodular é uma erupção de nódulos liquenificados ou escoriados causada por prurido intratável que é difícil de tratar. Embora fricção crônica resulte em liquenificação, e arranhadura em escoriações lineares, indivíduos que perfuram e arrancam sua pele irritada, sarnenta, tendem a produzir pápulas marcantemente espessadas conhecidas como nódulos de prurigo. Embora prurigo nodular não seja específico para dermatite atópica, muitos pacientes com estes nódulos também têm uma reação atópica, que se manifesta como rinite alérgica, asma, ou alergia alimentar. Células-T representa, a maior parte das células infiltrantes em lesões de prurigo e estas lesões muitas vezes representam a lesão de pele prurítica maior em pacientes atópicos. Tratamento tópico de prurigo nodular com capsaicina, um alcalóide anti-prurítico que interfere com a percepção de pruridos e dor pela depleção de neuropeptídeos como substância P em nervos cutâneos sensoriais pequenos, tem se mostrado em ser um regime efetivo e seguro resultando em limpeza das lesões de pele. Veja Stander S., et al., J Am Acad Dermatol: 44, 471 (2001). Estudos de resposta de coceira em camundongos NC/Nga usando tratamento com capsaicina mostraram que o desenvolvimento espontâneo de lesões de dermatite foi quase completamente prevenido. Ademais, a elevação de níveis séricos de IgE foi significativamente suprimida e números de mastócitos e eosinófilos infiltrantes em pele lesional dos camundongos tratados com capsaicina foram reduzidos. Veja Mihara K., et al., Br J Dermatol: 151, 335 (2004). As observações deste grupo sugerem que comportamento de arranhadura pode contribuir para o desenvolvimento de dermatite pela intensificação de várias respostas imunológicas, deduzindo portanto que prevenção da sensação de coceira e/ou do comportamento de arranhadura associado à coceira pode ser um tratamento efetivo para AD. Veja Mihara K., et al., Br JDermatol: 151, 335 (2004). Assim, os anticorpos anti-IL-31 aqui descritos serão úteis na minimização dos efeitos de AD, prurigo nodular, e outras doenças pruríticas porque é mostrado aqui que reduzem a quantidade de arranhadura em camundongos NC/Nga.
Liberação crônica de IL-31 induz prurite e alopecia em camundongos segundas pelo desenvolvimento de lesões de pele se parecendo dermatite sugerindo que IL-31 pode induzir coceira. Veja Dillon S.R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). O envolvimento de IL-31 em indução de resposta à coceira por dois métodos (i) tratamento com capsaicina de camundongos tratados contra IL-31 e (ii) tratamento contra IL-31 de camundongos nocauteados Tac 1, que têm respostas de dor nociceptiva significantemente reduzidas por causa da falta de expressão de neuropeptídeos é testado em Exemplo 10. Em adição, se neutralização de IL- 31 em camundongos tratados contra IL-31 com moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 poderia prevenir prurite e alopecia é testada em Exemplo 12.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar resultado clínico de prurigo nodular por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença.
Prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele
Células-T CD8+ específicas para Vírus do Herpes Simples (HSV) no sangue periférico e células-T CD8+ específicas para HSV recuperadas de lesões de herpes expressam níveis de CLA onde como células- T CD8+ específicas para vírus do herpes não-pele-trópicos são faltantes de expressão de CLA. Veja Koelle D.M., et al.,JClin Invest: 110, 537 (2002). Linfócitos T CD4+ reativos a HSV-2 também expressam CLA, mas em níveis mais baixos do que aqueles previamente observados para linfócitos T CD8+. Veja Gonzalez J.C., et al., JInfectDis: 191, 243 (2005). Prurite também tem estado associada com infecções virais do herpes (Veja Hung K.Y., et al., Blood Purif: 16, 147 (1998), embora outras doenças virais, como HIV, também têm estado associadas com lesões de pele pruríticas. Prurite intratável, severa, muitas vezes associada com lesões de pele eritematopapulares e hipereosinofilia, é uma condição observada em alguns pacientes 36 infectados com HIV, não-atópicos. Veja Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol; 4, 111 (2003); e Milazzo F., Piconi S., et al., Allergy: 54, 266(1999).
A associação de vírus trópicos de pele com prurite e células-T CLA+ sugere que células-T produzindo IL-31 podem estar envolvidas na patofisiologia de infecções virais.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL- 31 ou pelos antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) pode ser usada para melhorar resultado clínico de prurite associada com vírus trópicos de pele por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou arranhadura associada com a doença. Envolvimento de IL-31 na indução de resposta à coceira, e sua redução, bloqueio, inibição ou neutralização por moléculas ligantes de IL-31 aqui descritas, pode ser medida em numerosas maneiras.
Método I (Tratamento com capsaicina de camundongos tratados contra IL-31):
Animais BALB/c de dez semanas de idade (CRL) são anestesiados e injetados comum agente analgésico, cloridrato de bupranorfina, subcutaneamente a 0,1 mg/kg antes da injeção de 0,25 mL de solução a 4 mg/m L de capsaicina em etanol 10% + Tween-80 10% em solução salina subcutaneamente para dentro da nuca do pescoço. Animais são mantidos anestesiados por pelo menos 30 min após o tratamento com neurotoxina. Quarenta e oito horas mais tarde, bombas osmóticas de 14 dias são implantadas subcutaneamente para liberação contínua de 20 ug/dia de IL-31 por 14 dias. Camundongos são monitorados diariamente para alopecia e prurite usando os seguintes critérios: 0 = sem arranhadura, animal parece normal, 1 = adelgaçamento de pele em áreas pequenas, arranhadura notada, 2 = perda de pêlo menor (porções pequenas), arranhadura, 3 = perda de pêlo moderada, arranhadura, e 4 = perda de pêlo severa, excessiva arranhadura. Quando este experimento foi realizado os resultados demonstraram que embora camundongos não tratados com capsaicina mostrassem um escore de perda de pêlo / arranhadura médio de 2,625 após três dias de liberação de IL- 31, camundongos tratados com capsaicina mostraram um escore significativamente mais baixo de 1. Assim camundongos tratados com capsaicina antes da liberação de IL-31 mostram ambos atraso em incidência de arranhadura e perda de pêlo e um escore mais baixo na intensidade de arranhadura e perda de pêlo durante os seis dias do experimento. Estes dados sugerem que IL-31 induz algum componente neuronal que contribui para a alopecia e a prurite induzidas por IL-31. Portanto, neutralização de IL-31 pelas moléculas ligantes de IL-31 ou pelos antagonistas de IL-31 pode diminuir a incidência e a intensidade de coceira, e portanto de dermatite, em pacientes sofrendo de distúrbios de pele que envolvem coceira.
Método II:
Camundongos que são homozigóticos nulos para o gene Tacl não expressam substância P ou neuroquinina detectável. Estes camundongos têm respostas de dor nociceptiva significativamente reduzidas aos estímulos moderados a intensos e são portanto uma ferramenta útil para estudar a contribuição de peptídeos de taquiquinina para processamento de dor/coceira e estados doentios inflamatórios. Camundongos nocauteados Tac 1, de doze semanas de idade, foram implantados com bombas osmóticas de 14 dias liberando 1 ug/dia de proteína IL-31 e foram observados para alopecia e prurite usando os seguintes critérios: O = sem arranhadura, animal parece normal, 1 = adelgaçamento de pele em áreas pequenas, arranhadura notada, 2 = perda de pêlo menor (porções pequenas), arranhadura, 3 = perda de pêlo moderada, arranhadura, e 4 = perda de pêlo severa, excessiva arranhadura.
Resultados deste estudo mostram que camundongos deficientes Tacl foram menos suscetíveis à perda de pêlo/arranhadura induzidas por IL-31 comparados com camundongos de controle de tipo selvagem. Embora 100% (10/10) dos camundongos de tipo selvagem tiveram evidência desenvolvida de arranhadura e perda de pêlo no dia 6 do tratamento com IL-31, apenas 33,3 % (2/6) dos camundongos deficientes Tacl estavam mostrando sinais de arranhadura e perda de pêlo no mesmo instante de tempo. Estes dados mostram que IL-31 induz um componente neuronal que contribui para o fenótipo de arranhadura / perda de pêlo em camundongos tratados com IL-31 e neutralização de IL-31 por moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode diminuir a incidência de arranhadura no contexto de dermatite.
Método III (Administração de anticorpo neutralizador de IL-
31):
Camundongos fêmeas normais BALB/c (CRL) aproximadamente de 8 a 12 semanas de idade foram implantados subcutaneamente com bombas osmóticas de 14 dias (Alzet, #2002) liberando 1 gg/dia de mIL-31. Grupos de camundongos receberam injeções intraperitoneais (i.p.) de anticorpo monoclonal de rato anti-IL-31 de camundongo a 10 mg/kg (200 ug/camundongo) duas vezes por semana partindo da semana 1 antes da liberação de IL-31. Grupos de controle de camundongos receberam injeções i.p. de veículo (PBS/0,1%BSA) com horários de dosagem idênticos. Camundongos foram classificados diariamente alopecia e prurite usando os seguintes critérios: 0 = sem arranhadura, animal parece normal, 1 = adelgaçamento de pele em áreas pequenas, arranhadura notada, 2 = perda de pêlo menor (porções pequenas), arranhadura, 3 = perda de pêlo moderada, arranhadura, e 4 = perda de pêlo severa, excessiva arranhadura.
Em todos os experimentos, camundongos tratados com mAb de rato anti-mIL-31 tiveram um atraso no início de sintomas de aproximadamente 5 a 7 dias e um escore total menor para alopecia e prurite. Todos os grupos de camundongos tratados com mAb (independente da concentração e da freqüência da dose) desenvolveram alopecia e prurite similar aos camundongos de controle no dia 13 do estudo. Estes dados sugerem que neutralização de IL-31 por moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode atrasar o início da resposta à arranhadura / perda de pêlo induzida por IL-31. Os efeitos de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são medidos por inibição de arranhadura, coceira, dermatite, uma redução em expressão de IL-3 IRA em queratinócitos, e/ou uma redução em escore para alopecia e prurite. Inflamação é uma resposta protetora por um organismo para afastar im agente invasor. Inflamação é um evento em cascata que envolve muitos mediadores humorais e celulares. Por um lado, supressão de respostas inflamatórias pode levar a um hospedeiro imunocomprometido; entretanto, se deixada incontrolada, inflamação pode levar a complicações sérias incluindo doenças inflamatórias crônicas (e.g., artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal e semelhante), choque séptico e falência múltipla de órgãos. O importante é que estes estados doentios compartilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças coletivas que são caracterizadas pela inflamação têm um impacto grande sobre mortalidade e morbidez humanas. Portanto, está claro que polipeptídeos ligantes e anticorpos antiinflamatórios tais como polipeptídeos ligantes e anticorpos anti-IL-31 aqui descritos, poderiam ter potencial terapêutico crucial para um número vasto de doenças humanas e animais, desde asma e alergia até autoimunidade e choque séptico. Como tal, uso de polipeptídeos ligantes e anticorpos anti-IL-31 antiinflamatórios aqui descritos pode ser utilizado terapeuticamente como antagonistas de IL-31 aqui descritos, particularmente em doenças tais como artrite, endotoxemia, doença inflamatória intestinal, psoríase, doença relacionada e semelhante. 1. Artrite
Artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatóide, articulações artríticas como um resultado de lesão, e semelhante, são condições inflamatórias comuns que se beneficiariam do uso terapêutico de polipeptídeos ligantes e anticorpos anti-IL-31 antiinflamatórios, tais como polipeptídeos ligantes e anticorpos anti-IL-31 da presente invenção. Por exemplo, artrite reumatóide (RA) é uma doença sistêmica que afeta o corpo inteiro e é uma das formas mais comuns de artrite. É caracterizada pela inflamação da membrana revestindo a articulação, que causa dor, rigidez, aquecimento, vermelhidão e inchamento. Células inflamatórias liberam enzimas que digerem osso e cartilagem. Como um resultado de artrite reumatóide, a membrana de revestimento de articulação inflamada, a sinóvia, pode invadir e danificar osso e cartilagem levando à deterioração da articulação e dor severa dentre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder sua forma e seu alinhamento resultando em dor e perda de movimento.
Artrite reumatóide (RA) é uma doença imune-mediada particularmente caracterizada por inflamação e subseqüente dano de tecido levando à incapacidade severa e mortalidade aumentada. Uma variedade de citocinas são localmente produzidas nas articulações reumatóides. Estudos numerosos têm demonstrado que IL-I e TNF-alfa, duas citocinas pró- inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos em inflamação sinovial e em destruição progressiva de articulação. De fato, a administração de inibidores de TNF-alfa e de IL-I em pacientes com RA tem levado a uma melhoria dramática dos sinais clínicos e biológicos de inflamação e uma redução de sinais radiológicos de erosão óssea e destruição de cartilagem. Entretanto, apesar destes resultados encorajadores, uma percentagem significativa de pacientes não responde a estes agentes, sugerindo que outros mediadores também estão envolvidos na patofisiologia de artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149. 2002). Um daqueles mediadores poderia ser IL-31, e como tal uma molécula que se liga em ou inibe IL-31, tal como polipeptídeos ligantes ou anticorpos anti IL-31, poderia servir como um agente terapêutico valioso para reduzir inflamação em artrite reumatóide, e outras doenças artríticas. Há vários modelos animais para artrite reumatóide conhecidos
na arte. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), camundongos desenvolvem artrite inflamatória crônica que se parece muito com artrite reumatóide de humano. Visto que CIA compartilha características patológicas e imunológicas similares à RA, isto a torna um modelo ideal para selecionar compostos inflamatórios de humano potenciais. O modelo de CIA é um modelo bem conhecido em camundongos que depende de ambas uma resposta imune, e uma resposta inflamatória, com o propósito de ocorrer. A resposta imune compreende a interação de células-B e células-T CD4+ em resposta ao colágeno, que é dada como um antígeno, e acarreta a produção de anticorpos anti-colágeno. A fase inflamatória é o resultado de respostas de tecido dos mediadores de inflamação, como uma conseqüência de alguns destes anticorpos reagirem cruzadamente com o colágeno nativo do camundongo e ativarem a cascata de complemento. Uma vantagem no uso de modelo de CIA é que os mecanismos básicos de patogênese são conhecidos. Os epitopos relevantes de célula-T e de célula-B sobre colágeno de tipo II têm sido identificados, e vários parâmetros imunológicos (e.g., hipersensibilidade de tipo retardado e anticorpos anti-colágeno) e inflamatórios (e.g., citocinas, quimiocinas, e enzimas degradadoras de matriz) relacionados com a artrite imune-mediada têm sido determinados, e podem assim ser usados para avaliar a eficácia de compostos de teste no modelo de CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei. 61:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).
A administração de polipeptídeos solúveis compreendendo IL-
3 IRA (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos aqui descritos), tais como IL-31RA-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis de IL-31RA para estes camundongos modelo de CIA pode ser usada para avaliar o uso de IL-31RA para melhorar sintomas e alterar o curso da doença. Como uma molécula que modula resposta inflamatória e imune, IL-31, pode induzir a produção de SAA, que está implicado na patogênese de artrite reumatóide, moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem reduzir a atividade de SAA in vitro e in vivo, a administração sistêmica ou local de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode potencialmente suprimir a resposta inflamatória em RA.
2. Endotoxemia
Endotoxemia é uma condição severa comumente resultante de agentes infecciosos tais como bactérias e outros agentes de doença infecciosa, sepsia, síndrome de choque tóxico, ou em pacientes imunocomprometidos sujeitos a infecções oportunísticas, e semelhante. Polipeptídeos ligantes e anticorpos antiinflamatórios terapeuticamente úteis, tais como polipeptídeos ligantes e anticorpos anti-IL-31 da presente invenção, poderiam auxiliar na prevenção e no tratamento de endotoxemia em animais e humanos. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipeptídeos IL-3 IRA, polipeptídeos receptores heterodiméricos e multiméricos, ou parceiros de ligação ou anticorpos anti IL-31 da presente invenção, e semelhante, poderiam servir como um agente terapêutico valioso para reduzir inflamação e efeitos patológicos em endotoxemia. Endotoxemia induzida por lipopolissacarídeo (LPS) utiliza
muitos dos mediadores pró-inflamatórios que produzem efeitos patológicos nas doenças infecciosas e endotoxemia induzida por LPS é um modelo amplamente usado e aceitável para estudar os efeitos farmacológicos de agentes imunomoduladores e pró-inflamatórios potenciais. LPS, produzido em bactérias gram-negativas, é um agente causador maior na patogênese de choque séptico (Glausner et al., Lancet 338:732. 1991). Um estado semelhante a choque pode de fato ser induzido experimentalmente por uma única injeção de LPS em animais. Moléculas produzidas por células respondendo ao LPS podem selecionar patógenos direta ou indiretamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeiro contra patógenos invasores, também podem causar dano. Assim, estimulação massiva de imunidade inata, ocorrendo como um resultado de infecção por bactérias Gram-negativas, leva à produção excessiva de citocinas e de outras moléculas, e ao desenvolvimento de uma síndrome fatal, síndrome de choque séptico, que é caracterizada por febre, hipotensão, coagulação intravascular disseminada, e falência múltipla de órgãos (Dumitru et al. Cell 103:1071- 1083,2000).
Estes efeitos tóxicos de LPS estão relacionados em sua maioria à ativação de macrófago levando à liberação de múltiplos mediadores inflamatórios. Dentre estes mediadores, TNF parece desempenhar um papel crucial, como indicado pela prevenção de toxicidade de LPS pela administração de anticorpos neutralizadores anti-TNF (Beutler et al., Science 229:869. 1985). Está bem estabelecido que a injeção de 1 ug de LPS de E. coli em um camundongo C57B1/6 resultará em aumentos significativos em IL-6, TNF-alfa, IL-1, e proteínas de fase aguda circulantes (por exemplo, SAA) aproximadamente 2 horas após injeção. A toxicidade de LPS parece ser mediada por estas citocinas porque imunização passiva contra estes mediadores pode resultar em mortalidade diminuída (Beutler et al., Science 229:869, 1985). As estratégias de imunointervenção potencial para a prevenção e/ou tratamento de choque séptico incluem mAb anti-TNF, antagonista de receptor de IL-1, LIF, IL-10, e G-CSF. Visto que LPS induz a produção de fatores pró-inflamatórios possivelmente contribuindo com a patologia de endotoxemia, a neutralização de atividade de IL-31, SAA ou de outros fatores pró-inflamatórios pela antagonização de polipeptídeo IL-31 pode ser usada para reduzir os sintomas de endotoxemia, tais como vistos em choque endotóxico. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31.
3. Doença inflamatória intestinal. IBP
Nos Estados Unidos aproximadamente muitas pessoas sofrem de Doença Inflamatória Intestinal (IBD) que pode afetar quer cólon quer reto (colite ulcerativa) ou ambos, intestinos delgado e grosso (doença de Crohn). A patogênese destas doenças não está clara, mas envolvem inflamação crônica dos tecidos acima citados. Agentes terapêuticos potenciais incluem polipeptídeos IL-3 IRA, polipeptídeos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou parceiros de ligação ou anticorpos anti-IL-31 da presente invenção, e semelhante, poderiam servir como um agente terapêutico valioso para reduzir inflamação e efeitos patológicos em IBD e doenças relacionadas.
Colite ulcerativa (UC) é uma doença inflamatória do intestino grosso, comumente chamado de cólon, caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou do revestimento mais interno do cólon. Esta inflamação causa esvaziamento freqüente do cólon, resultando em diarréia. Sintomas incluem soltura das fezes e câimbra abdominal associada, febre e perda de peso. Embora a causa exata de UC seja desconhecida, pesquisa recente sugere que as defesas naturais do corpo estão operando contra proteínas no corpo que o corpo pensar serem estranhas (uma "reação autoimune"). Talvez devido ao fato de se parecerem com proteínas bacterianas no intestino, estas proteínas podem quer instigar quer estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. A medida que o revestimento do cólon é destruído, úlceras formam liberando muco, pus e sangue. A doença normalmente inicia na área retal e pode eventualmente se estender através do intestino grosso. Episódios repetidos de inflamação levam ao espessamento da parede do intestino e do reto com tecido cicatrizado. Morte do tecido do cólon ou sepsia pode ocorrer com doença severa. Os sintomas de colite ulcerativa variam em severidade e seu início pode ser gradual ou súbito. Ataques podem ser provocados por muitos fatores, incluindo estresse ou infecções respiratórias.
Embora correntemente não haja cura disponível para UC, tratamentos são focalizados sobre supressão de processo inflamatório anormal no revestimento do cólon. Tratamentos incluindo corticosteróides imunossupressores (eg. azatioprina, mercaptopurina, e metotrexato) e amino- salicilatos estão disponíveis para tratar a doença. Contudo, o uso por longa duração de imunossupressores tais como corticosteróides e azatioprina pode resultar em efeitos colaterais sérios incluindo adelgaçamento dos ossos, cataratas, infecção, e efeitos em fígado e medula óssea. Nos pacientes nos quais terapias correntes não são bem sucedidas, cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção do cólon inteiro e do reto.
Há vários modelos animais que podem parcialmente imitar colite ulcerativa crônica. O modelo mais amplamente usado é o modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-trinitro-benzeno-sulfônico / etanol (TNBS), que induz inflamação e ulceração crônicas no cólon. Quando TNBS é introduzido no cólon de camundongos suscetíveis via instilação intra-retal, induz resposta imune mediada por célula-T na mucosa colônica, neste caso acarretando uma inflamação mucosal massiva caracterizada por infiltração densa de células-T e macrófagos através da parede inteira do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva (emaciação), diarréia sanguinolenta, prolapso retal, e espessamento de parede de intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).
Outro modelo de colite usa dextrano-sulfato de sódio (DSS), que induz colite aguda manifestada por diarréia sanguinolenta, perda de peso, encurtamento do cólon e ulceração mucosal com infiltração de neutrófilos. Colite induzida por DSS é caracterizada histologicamente por infiltração de células inflamatórias para dentro da lamina própria, com hiperplasia linfóide, dano de cripta focai, e ulceração epitelial. Estas mudanças são consideradas em se desenvolverem devido a um efeito tóxico de DSS sobre o epitélio e por fagocitose de células de lamina própria e produção de TNF-alfa e IFN-gama. Apesar de seu uso comum, várias questões relacionadas com os mecanismos de DSS sobre a relevância para a doença de humano permanecem não resolvidas. DSS é considerada como um modelo dependente de célula-T porque é observada em animais deficientes em célula-T tais como camundongos SCID.
A administração de parceiros de ligação ou anticorpos anti-IL- 31, polipeptídeos compreendendo IL-31RA solúveis (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos), tal como IL-31RA-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis IL-31RA para estes modelos de TNBS ou DSS pode ser usada para avaliar o uso de antagonistas de IL-31 para melhorar sintomas e alterar o curso de doença gastrointestinal. IL-31 pode desempenhar um papel na resposta inflamatória em colite, e a neutralização de atividade de IL-31 pela administração de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 é uma abordagem terapêutica potencial para IBD.
4. Psoríase
Psoríase é uma condição de pele crônica que afeta mais do que sete milhões de americanos. Psoríase ocorre quando células novas de pele crescem anormalmente, resultando em porções de pele inflamadas, inchadas, e escamosas onde a pele velha não tem se soltado suficientemente rápida. Psoríase de placa, a forma mais comum, é caracterizada por porções de pele inflamadas ("lesões") cobertas com escamas brancas prateadas. Psoríase pode estar limitada a algumas placas ou envolver áreas moderadas a extensivas de pele, parecendo mais comumente sobre o escalpo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora seja elevadamente visível, psoríase não é uma doença contagiosa. A patogênese da doença envolve inflamação crônica dos tecidos afetados. Polipeptídeos IL-3 IRA, polipeptídeos receptores heterodiméricos e multiméricos, ou parceiros de ligação ou anticorpos anti-IL-31 da presente invenção, e semelhante, poderia servir como um agente terapêutico valioso para reduzir inflamação e efeitos patológicos em psoríase, outras doenças inflamatórias de pele, alergias de pele e mucosal, e doenças relacionadas.
Psoríase é um distúrbio inflamatório da pele mediado por célula-T que pode causar desconforto considerável. É uma doença para a qual não há cura e afeta pessoas de todas as idades. Psoríase afeta aproximadamente dois por cento das populações da Europa e da América do Norte. Embora indivíduos com psoríase suave possam muitas vezes controlar sua doença com agentes tópicos, mais do que um milhão de pacientes em todo o mundo exigem terapia imunossupressiva sistêmica ou com ultravioleta. Infelizmente, a inconveniência e os riscos da radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam seu uso de longa duração. Além disso, pacientes normalmente têm recorrência de psoríase, e em alguns casos r [sic]
IL-31 foi isolada de tecido conhecido em ter função imunológica importante e que contém células que desempenham um papel no sistema imune. IL-31 é expressada em células de sangue periférico, ativadas, selecionadas CD3+, e tem sido mostrado que expressão de IL-31 aumenta após ativação de célula-T.. Além disso, resultados de experimentos descritos aqui na seção de Exemplos sugerem que polipeptídeos da presente invenção podem ter um efeito sobre o crescimento / a expansão de monócitos / macrófagos, células-T, células-B, células NK e/ou o estado diferenciado de monócitos / macrófagos, células-T, células-B, células NK ou destes progenitores de células. Fatores que tanto estimulam proliferação de progenitores hematopoiéticos quanto ativam células maduras são geralmente conhecidos, contudo, proliferação e ativação também podem exigir fatores de crescimento adicionais. Por exemplo, tem sido mostrado que IL-7 e Steel Factor (ligante c-kit) foram exigidos para formação de colônias de progenitores NK. IL-15 + IL-2 em combinação com IL-7 e Steel Factor foi mais efetivo (Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). Contudo, citocinas não identificadas podem ser necessárias para proliferação de subconjuntos específicos de células NK e/ou progenitores NK (Robertson et. al., Blood 76:2451-2438, 1990). Similarmente, IL-31 pode atuar sozinha ou de acordo com ou sinergicamente com outras citocinas para intensificar crescimento, expansão de proliferação e modificação de diferenciação de monócitos / macrófagos, células-T, células-B ou células NK A presente invenção proporciona um método para inibir a ativação ou diferenciação de monócitos / macrófagos. Monócitos são células incompletamente diferenciadas que migram para vários tecidos onde maturam e se tornam macrófagos. Macrófagos desempenham um papel central em resposta imune pela apresentação de antígeno aos linfócitos e desempenham um papel sustentador como células acessórias para linfócitos pela seleção de numerosas citocinas. Macrófagos podem incorporar moléculas extracelulares e sob ativação têm uma capacidade aumentada para exterminar microorganismos intracelulares e células de tumor. Macrófagos ativados também estão envolvidos em estimulação de inflamação aguda ou local.
A distribuição em tecido de receptores para uma dada citocina oferece uma indicação forte dos sítios potenciais de ação que daquela citocina. Expressão de IL-31RA foi vista em monócitos e células-B, com um aumento dramático de expressão sob ativação para células-T CD3+, CD4+, e CD8+. Em adição, duas linhagens de célula monocítica, THP-I (Tsuchiya et al., Int. J. Câncer 26:171-176. 1980) e U937 (Sundstrom et al., Int. J. Câncer 17:565-577. 1976), também foram positivas para expressão de IL-31RA.
Expressão de OSMR é relatada em ser muito ampla (Mosley et al., JBC 271:32635-32643, 1996). Esta distribuição de receptores de IL-31RA e de OSM confirma um papel para IL-31 em respostas imunes, especialmente expansão de células-T sob ativação ou um papel no ramo de monócito / macrófago do sistema imune.
Assim, modalidades particulares da presente invenção são direcionadas para o uso de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL- 31 como antagonistas em doenças inflamatórias e imunes ou condições tal como pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), câncer pancreático, pancreatite, Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, câncer intestinal e de cólon, diverticulose, doença autoimune, sepsia, transplante de órgãos ou de medula óssea; inflamação devido a trauma, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença de enxerto versus hospedeiro; e onde inibição de inflamação, supressão imune, redução de proliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, células-T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune a um patógeno ou antígeno. Além disso a presença de expressão de IL-31 RA em células imunes ativadas tais como células CD4+ e CD 19+ ativadas mostrou que o receptor IL-31 RA pode estar envolvido nas reações defensivas imunes do corpo contra invasores estranhos: tais como microorganismos e fragmentos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante inflamação e formação de câncer. Como tais, anticorpos e parceiros de ligação da presente invenção que são agonísticos ou antagonísticos para função de receptor IL-31 RA, tal como IL- 31, podem ser usados para modificar resposta imune e inflamação.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem ser usadas(os) dentro de sistemas diagnósticos para a detecção de níveis circulantes de IL-31. Dentro de uma modalidade relacionada, anticorpos ou outros agentes que especificamente se ligam em polipeptídeos IL-31 podem ser usados para detectar polipeptídeos IL-31 circulantes. Níveis elevados ou deprimidos de polipeptídeos ligantes podem ser indicativos de condições patológicas, incluindo câncer. Polipeptídeos IL-31 podem contribuir para processos patológicos e podem ser um marcador indireto de uma doença subjacente.
Em lesões ateroscleróticas, uma das primeiras anormalidades é localização de monócitos / macrófagos em células endoteliais. Estas lesões poderiam ser prevenidas pelo uso de antagonistas para IL-31. Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem ser usadas(os) como antagonistas para a IL-31. Além disso, leucemia monoblástica está associada com uma variedade de anormalidades clínicas que refletem a liberação dos produtos biológicos do macrófago, exemplos incluem níveis altos de lisozima no soro e na urina e febres altas. Além disso, tais leucemias exibem um aumento anormal de células monocíticas. Estes efeitos poderiam possivelmente ser prevenidos pelos antagonistas para IL-31, tal como aqui descrito. Além disso, anti- IL-31 pode ser conjugado em moléculas tais como grupos tóxicos e citocinas, como aqui descrito para dirigir o extermínio de células monocíticas de leucemia.
Visto que IL-31 é expressada em uma célula-T, numa maneira específica para monócito e macrófago, e estas doenças envolvem anormalidades em células monocíticas, tais como proliferação, função, localização, e ativação de células, os polinucleotídeos, polipeptídeos, e anticorpos da presente invenção podem ser usados como diagnósticos para detectar tais anormalidades de célula monocítica, e indicam a presença de doença. Tais métodos envolvem retirar uma amostra biológica de um paciente, tal como sangue, saliva, ou biopsia, e compará-la com uma amostra de controle normal. Métodos histológicos, citológicos, citométricos de fluxo, bioquímicos e outros métodos podem ser usados para determinar os níveis relativos ou a localização de IL-31, ou células expressando IL-31, i.e., monócitos, na amostra do paciente comparado com o controle normal. Uma mudança no nível (aumento ou decréscimo) de expressão de IL-31, ou uma mudança no número ou na localização de monócitos (e.g., aumento ou infiltração de células monocíticas em tecidos onde não estão normalmente presentes) comparado com um controle seria indicativa de doença. Tais métodos diagnósticos também podem incluir o uso de etiquetas radiométricas, fluorescentes, e colorimétricas ligadas nos polinucleotídeos, polipeptídeos ou anticorpos da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos na arte e aqui descritos.
Tem sido mostrado que IL-31 é expressada em células mononucleares ativadas, e pode estar envolvida em regulação de inflamação. Como tais, polipeptídeos da presente invenção podem ser ensaiados e usados para sua capacidade para modificar inflamação, ou pode ser usada como um marcador para inflamação. Métodos para determinar qualidades pró- inflamatórias e antiinflamatórias de IL-31 são conhecidos na arte e aqui discutidos. Além disso, pode estar envolvida em supra-regulação da produção de reagentes de fase aguda, tal como proteína amilóide A sérica (SAA), al- antiquimiotripsina, e haptoglobina, e que expressão de ligante de receptor IL- 3 IRA pode ser aumentada sob injeção de lipopolissacarídeo (LPS) in vivo que estão envolvidas em resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al., Proc. NatT. Acad. Sei. 97:10144-10149. 2000). Produção de proteínas de fase aguda, tal como SAA, é considerada s mecanismo de sobrevivência de duração curta onde inflamação é benéfica; contudo, manutenção de proteínas de fase aguda por períodos mais longos contribui para inflamação crônica e pode ser perigosa para saúde humana. Para revisão, veja Uhlar, CM and Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, e Baumann H. and Gauldie, J1 Immunology Today j_5:74-80, 1994. Além disso, a proteína de fase aguda SAA está implicada na patogênese de várias doenças inflamatórias crônicas, está implicada em aterosclerose e artrite reumatóide, e é o precursor para proteína amilóide A depositada em amiloidose (Uhlar, CM e Whitehead, supra.). Assim, onde um ligante tal como a IL-31 que atua como uma molécula pró-inflamatória e induz produção de SAA, antagonistas seriam úteis em tratamento de doença inflamatória e outras doenças associadas com proteínas de resposta de fase aguda induzida pelo ligante. Tais antagonistas são proporcionados pela presente invenção. Por exemplo, um método de reduzir inflamação compreende administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição de IL-31, ou anticorpo anti-IL-31 (e.g., anticorpo neutralizador) que é suficiente para reduzir inflamação. Além disso, um método de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero com inflamação pode compreender: (1) determinar um nível de proteína amilóide A sérica; (2) administrar uma composição compreendendo um polipeptídeo IL-31 ou um anticorpo anti-IL-31 como aqui descrito em um veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar um nível de pós-administração de proteína amilóide A sérica; (4) comparar o nível de proteína amilóide A sérica em etapa (1) com o nível de proteína amilóide A sérica em etapa (3), sendo que uma falta de aumento ou um decréscimo em nível de proteína amilóide A sérica é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória.
Distribuição em tecido do mRNA correspondendo ao seu cDNA de receptor IL-3 IRA mostrou que nível de mRNA foi mais alto em monócitos e células de próstata, e é elevada em monócitos ativados, e células CD4+ ativadas, células CD8+ ativadas, e células CD3+ ativadas. Disso, receptor IL-3 IRA também está implicado na indução de resposta inflamatória e imune. Assim, modalidades particulares da presente invenção são direcionadas para o uso de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL- 31 em condições ou doenças inflamatórias e imunes tais como, pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), câncer pancreático, pancreatite, Doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn, câncer intestinal e de cólon, diverticulose, doença autoimune, sepsia, transplante de órgãos ou de medula óssea; inflamação devido a trauma, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença de enxerto versus hospedeiro; e onde inibição de inflamação, supressão imune, redução de proliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, células-T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune a um patógeno ou antígeno. Além disso a presença de receptor IL-3 IRA e expressão IL-31 em células imunes ativadas tais como células CD3+, monócitos, CD4+ e CD 19+ ativadas mostrou que receptor IL-3 IRA pode estar envolvido nas reações defensivas imunes contra invasores estranhos: tais como microorganismos e fragmentos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante inflamação e formação de câncer. Como tais, IL-31 e anticorpos anti-IL-31 da presente invenção que sã agonísticos ou antagonísticos para função de receptor IL-31 RA, podem ser usados para modificar resposta imune e inflamação.
Moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são úteis
para:
) Antagonizar ou bloquear sinalização via receptores compreendendo IL-3 IRA no tratamento de inflamação aguda, inflamação como um resultado de trauma, lesão de tecido, cirurgia, sepsia ou infecção, e doenças inflamatórias crônicas tais como asma, doença inflamatória intestinal (IBD), colite crônica, esplenomegalia, artrite reumatóide, episódios inflamatórios agudos recorrentes (e.g., tuberculose), e tratamento de amiloidose, e aterosclerose, Doença de Castleman, asma, e outras doenças associadas com a indução de resposta de fase aguda.
2) Antagonizar ou bloquear sinalização via os receptores de receptor IL-3 IRA no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDM, esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), miastenia grave, artrite reumatóide, e IBD para prevenir ou inibir sinalização em células imunes (e.g. linfócitos, monócitos, leucócitos) via receptor IL-3 IRA (Hughes C et al., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (MAb) para IL-31, também podem ser usados como um antagonista para eliminar células imunes indesejadas para tratar doença autoimune. Asma, alergia e outra doença atópica pode ser tratada com um MAb contra, por exemplo, anticorpos anti-IL-31, receptores solúveis de receptor IL-3 IRA ou heterodímeros IL-31RA/CRF2-4, para inibir a resposta imune ou para eliminar células ofensivas. Bloqueio ou inibição de sinalização via IL-3 IRA, usando os polipeptídeos e os anticorpos da presente invenção, também pode beneficiar doenças do pâncreas, rim, pituitária, e células neuronal. IDDM, NIDDM, pancreatite, e carcinoma pancreático podem se beneficiar. IL-3 IRA pode servir como um alvo para terapia de câncer com MAb onde um MAb antagonista inibe crescimento de câncer e seleciona extermínio imune-mediado. (Holliger P, e Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Mabs para monômeros, homodímeros, heterodímeros e multímeros de receptor IL-3 IRA solúvel também podem ser úteis para tratar nefropatias tais como glomerulosclerose, neuropatia membranas, glomerulonefrite de várias origens, doenças fibroproliferativas do rim, bem como disfunção renal associada com SLE, IDDM, diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renais e outras doenças.
3) Agoniza ou inicia sinalização via os receptores IL-3 IRA no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDM, MS, SLE, miastenia grave, artrite reumatóide, e IBD. IL-31 pode sinalizar linfócitos ou outras células imunes para diferenciar, alterar proliferação, ou mudar produção de citocinas ou proteínas de superfície celular que melhora autoimunidade. Especificamente, modulação de uma resposta de célula-T auxiliadora para alternar padrão de secreção de citocina pode desviar um resposta autoimune para melhorar doença (Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849. 1998). Similarmente, IL-31 pode ser usada para sinalizar, eliminar e desviar células imunes envolvidas em asma, alergia e doença atópica. Sinalização via receptor IL-3 IRA também pode beneficiar doenças do pâncreas, rim, pituitária e células neuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite, e carcinoma pancreático podem se beneficiar. IL-3 IRA pode servir como um alvo para terapia de câncer pancreático com MAb onde uma sinalização de MAb inibe crescimento de câncer e seleciona extermínio imune-mediado (Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998). Similarmente leucemias específicas de célula-T, linfomas, discrasia de célula de plasma (e.g., mieloma múltiplo), e carcinoma podem ser tratadas com anticorpos monoclonais (e.g., anticorpo neutralizador) para receptores solúveis compreendendo IL-3 IRA da presente invenção.
Geralmente, a dosagem de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 administradas(os) variará dependendo de tais fatores como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral do paciente e história médica prévia do paciente. Tipicamente, é desejável proporcionar o paciente recipiente com uma dosagem de polipeptídeo IL-31 que esteja dentro da faixa de cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente / peso corporal do paciente), embora uma dosagem mais baixa ou mais alta possa ser administrada conforme ditem as circunstâncias. Uma pessoa experiente na arte pode determinar prontamente tais dosagens, e ajustes das mesmas, usando métodos conhecidos na arte.
Administração das moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 a um sujeito pode ser tópica, inalante, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão através de um cateter regional, ou por injeção intralesional direta. Quando se administram proteínas terapêuticas por injeção, a administração pode ser por infusão contínua ou por bolo único ou bolos múltiplos. Rotas de administração adicionais incluem oral, membrana-
mucosal, pulmonar, e transcutânea. Liberação oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinóides, microesferas de policianoacrilato, e sistemas baseados em lipídeo (veja, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A exeqüibilidade de uma liberação intranasal é exemplificada por um tal modo de administração de insulina (veja, por exemplo, Hinchcliffe e Ilium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Partículas líquidas ou secas compreendendo IL-31 podem ser preparadas e inaladas com o auxílio de dispersadores de pó seco, geradores de aerossol de líquido, ou nebulizadores (e.g., Pertit e Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de manejo de diabetes AERX, que é um inalador eletrônico seguro com a mão esquerda que libera insulina aerossolizada para dentro dos pulmões. Estudos têm mostrado que proteínas tão grandes quando 48.000 kDa têm sido liberadas através da pele em concentrações terapêuticas com o auxílio de ultra-som de freqüência baixa, que ilustra a exeqüibilidade de administração transcutânea (Mitragotri et al, Science 269:850 (1995)).
Liberação transdermal usando eletroporação proporciona outro meio para administrar uma molécula tendo atividade de ligação em IL-31 (Potts et al, Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
Uma composição farmacêutica compreendendo moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 tendo atividade de ligação em IL- 31 pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio dos quais as proteínas terapêuticas são combinadas em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição é dita em ser um "veículo farmaceuticamente aceitável" se sua administração puder ser tolerada por um paciente recipiente. Solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados são bem conhecidos por aquelas pessoas na arte. Veja, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995). Para propósitos de terapia, moléculas tendo atividade de
ligação em IL-31 e um veículo farmaceuticamente aceitável são administrados a um paciente em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Uma combinação de uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo tendo atividade de ligação em IL-31 e um veículo farmaceuticamente aceitável é dita em ser uma "quantidade terapeuticamente efetiva" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se sua presença resulta em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente recipiente. Por exemplo, um agente usado para tratar inflamação é fisiologicamente significativo se sua presença alivia pelo menos uma porção da resposta inflamatória.
Uma composição farmacêutica compreendendo moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode ser fornecida na forma líquida, em uma forma de aerossol, ou em uma forma sólida. Formas líquidas, como ilustradas por soluções injetáveis, aerossóis, gotícuias, soluções topológicas e suspensões orais. Formas sólidas exemplares incluem cápsulas, tabletes, e formas de liberação controlada. A última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et ah, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et ah, "Protein Delivery with Infusion Pumps", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas, e semelhante.
As moléculas ligantes de IL-31 ou os antagonistas de IL-31 aqui mostradas(os) também podem ser formuladas(os) como imunolipossomos. Lipossomos contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na arte, tais como descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); e Pat. U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com tempo de circulação aumentado são mostrados em Pat. U.S. No. 5.013.556.
Formulações terapêuticas das moléculas ligantes de IL-31 ou dos antagonistas de IL-31 são preparadas para armazenagem por misturação do anticorpo tendo o grau de pureza desejado com estabilizadores, excipientes
ou veículos fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical
th
Sciences 16 edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Estabilizadores, excipientes ou veículos aceitáveis são não tóxicos para pacientes recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecil-dimetil-benzil-amônio; cloreto de hexamatônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol; butil- álcool ou benzil-álcool; alquil-parabenos tais como metil- ou propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menor do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como poli(vinil-pirrolidona); aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (e.g. complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos tais como Tween.TM., Pluronics.TM. ou poli(etileno-glicol) (PEG).
A formulação aqui também pode conter mais do que um composto ativo se necessário para indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente umas as outras. Por exemplo, pode ser desejável adicionalmente proporcionar anticorpos que se ligam em IL-31 em uma formulação. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agent quimioterapêutico ou uma citocina. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito intencionado.
Os ingredientes ativos também podem estar encerrados dentro de microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidróxi-metil- celulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de liberação de droga coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são mostradas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16Λ edition, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a serem usadas para administração in vivo precisam ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matizes estão na forma de artigos moldados, e.g. filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidróxi-etila), ou poli(vinil-álcool)), polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-L-glutamato de etila, copolímero de etileno - acetato de vinila não-degradável, copolímeros of ácido lático - ácido glicólico degradáveis tais como Lupron Depot.TM. (microesferas injetáveis de leuprolida e copolímero de ácido lático - ácido glicólico)), e poli-ácido-D-(-)- 3-hidróxi-butírico. Embora polímeros tais como etileno - acetato de vinila e ácido lático - ácido glicólico permitam liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por período de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um tempo longo, podem se desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação descoberto for formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio de tio-dissulfeto, estabilização poderá ser alcançada pela modificação de resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle de teor de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas.
Polipeptídeos tendo atividade de ligação em IL-31 podem ser encapsulados dentro de lipossomos usando técnicas padrão de microencapsulação de proteína (veja, por exemplo, Anderson et al, Infect1 Immum 31:1099(1981), Anderson et al, CancerRes. 50:1853 (1990), eCohen et al, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", em Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. 111, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al, Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como observado acima, lipossomos terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de compostos. Por exemplo, lipossomos podem compreender derivados lipídicos de poli(etileno- glicol) (Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Microesferas de polímero têm sido projetadas para manter níveis sistêmicos altos de proteínas terapêuticas. Microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis tais como poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), polianidridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etil-vinila não biodegradáveis nas quais proteínas estão encerradas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al, Science 281:1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Nanoesferas revestidas com poli(etileno-glicol) (PEG) também podem proporcionar administração intravenosa de proteínas terapêuticas (veja, por exemplo, Gref et al, Pharm. Biotechnol. 10:167(1997)).
Outras formas de dosagem que podem ser planejadas por aquelas pessoas experientes na arte, são como mostrado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), e porRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
Como uma ilustração, composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit compreendendo um recipiente que compreende polipeptídeo IL-31 ou um antagonista de IL-31 (e.g., um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga em um polipeptídeo IL-31). Polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos na forma de uma solução injetável para doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes de injeção. Alternativamente, um tal kit pode incluir um dispersador de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para administração de um polipeptídeo terapêutico. Dentro de um aspecto a presente invenção refere-se a um
anticorpo isolado que se liga em IL-31 de humano, sendo que o dito anticorpo é um anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal produzido pelo híbrido depositado na American Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito de Patente em ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6815; b) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6816; c) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6829; d) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6830; e) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6831; f) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6871; g) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6872; h) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6875; e i) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6873; e sendo que dito anticorpo compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina que é uma IgG4 de humano. Em uma modalidade, o domínio constante de IgG4 de humano é uma forma mutada estável em solução e com pouca ou nenhuma atividade de complemento. Em uma modalidade particular, o domínio de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é um domínio constante de IgG4 de humano com uma mutação de Ser para Pro na posição 241 (numeração de Kabat).
Dentro de outro aspecto estes anticorpos são usados para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que o domínio de região constante de cadeia leve de imunoglobulina é selecionado do grupo consistindo da região constante de uma cadeia leve kappa ou lambda de imunoglobulina de humano. Preferivelmente, o domínio de região constante de cadeia leve de imunoglobulina é a região constante e uma cadeia leve kappa de imunoglobulina de humano.
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem as seqüências de CDR de clones 292.12.3.1, 292.84.1.6, 292.63.5.3, 294.144.3.5, 292.39.5.3, 292.51.5.2, 292.64.6.5.5, 292.105.4.1, 292.109.4.4, 292.118.6.4, e 292.72.3.1. As seqüências de CDR são mostradas nas Figuras e em Tabela 3, abaixo.
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 51, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 57, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:53; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 54, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 55, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:56. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 51, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 58, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:59; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 60, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 61, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:62. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 63, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 64, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:65; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 66, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 67, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:68. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um
anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 69, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 79, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:71; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 72, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 73, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:74. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um
anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 75, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 76, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:65; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 77, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 78, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:68. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado como aqui mostrado sendo que a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 80, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 817, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:82; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 84, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:85. Em uma modalidade, o anticorpo é usado para tratar doenças incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por droga, prurite associada a vírus e vírus trópicos de pele, vitiligo, linfoma de célula-T cutânea, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e pênfigo bolhoso, como aqui discutidas. Em outra modalidade, quimiocinas tais como TARC ou MDC são medidas.
Dentro de um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo inibe, bloqueia, ou neutraliza a interação de IL-31 (SEQ ID NO:2) com IL-3 IRA (SEQ ID NO:5). Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo monoclonal murino ou fragmento de anticorpo monoclonal murino; (b) um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo humanizado; e (c) um anticorpo monoclonal de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo adicionalmente compreende PEGuilação.
Dentro de outro aspecto, a invenção proporciona, um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada onde o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: a) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e b) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; iii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; iv) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; v) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; vi) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo inibe, bloqueia, ou neutraliza a interação de IL-31 (SEQ ID NO:2) com IL-3 IRA (SEQ ID NO:5). Dentro de outra modalidade o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo monoclonal murino ou fragmento de anticorpo monoclonal murino; (b) um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo humanizado; e (c) um anticorpo monoclonal de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo adicionalmente compreende PEGuilação. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: IOe uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo monoclonal murino ou fragmento de anticorpo monoclonal murino; (b) um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo humanizado; e (c) um anticorpo monoclonal de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo adicionalmente compreende PEGuilação.
Dentro de outro aspecto, a invenção proporciona, um método de reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar inflamação em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de uma modalidade, administração do anticorpo ao mamífero reduz, bloqueia, inibe, ou neutraliza a produção de quimiocinas pró- inflamatórias. Dentro de uma outra modalidade, as quimiocinas pró- inflamatórias são TARC ou MDC. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: IOe uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
Dentro de outro aspecto, a invenção proporciona, um método de reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar prurite em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de outra modalidade o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: IOe uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Dentro de outra modalidade, administração do anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal reduz, bloqueia, inibe, ou neutraliza dermatite. Dentro de uma outra modalidade, a dermatite é dermatite atópica ou prurigo nodular.
Dentro de outro aspecto, a invenção proporciona um método de reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar arranhadura em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de outra modalidade o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano. Dentro de outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética compreendendo cultivar células de sangue periférico ou de medula óssea com uma composição compreendendo uma quantidade de uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) suficiente para reduzir proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas nas células de sangue periférico ou de medula óssea em comparação com as células de sangue periférico ou de medula óssea cultivadas na ausência de receptor de citocina solúvel. Em uma modalidade o método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é como mostrado acima, sendo que as células hematopoiéticas e as células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra modalidade o método para inibir diferenciação ou proliferação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é como mostrado acima, sendo que as células linfóides são macrófagos ou células-T.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de reduzir inflamação induzida por IL-31 compreendendo administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição de uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) suficiente para reduzir inflamação.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero com inflamação compreendendo: (1) determinar um nível de uma molécula inflamatória; (2) administrar uma composição compreendendo uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) em um veículo farmacêutico aceitável; (3) determinar um nível de pós-administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nível da molécula inflamatória em etapa (1) com o nível da molécula inflamatória em etapa (3), sendo que uma falta de aumento ou uma diminuição do nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória. Em uma modalidade, o anticorpo é como mostrado acima, sendo que o anticorpo adicionalmente compreende um radionuclídeo, enzima, substrato, cofator, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de peptídeo, partícula magnética, droga, ou toxina.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética compreendendo cultivar células de sangue periférico ou de medula óssea com uma composição compreendendo uma quantidade de uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) suficiente para reduzir proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas nas células de sangue periférico ou de medula óssea em comparação com as células de sangue periférico ou de medula óssea cultivadas na ausência de receptor de citocina solúvel. Em uma modalidade o método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é como mostrado acima, sendo que as células hematopoiéticas e as células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra modalidade o método para inibir diferenciação ou proliferação induzida por IL-31 de células hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é como mostrado acima, sendo que as células linfóides são macrófagos ou células-T.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de reduzir inflamação induzida por IL-31 compreendendo administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição de uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) suficiente para reduzir inflamação.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero com inflamação compreendendo: (1) determinar um nível de uma molécula inflamatória; (2) administrar uma composição compreendendo uma moléculas de anticorpo ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) em um veículo farmacêutico aceitável; (3) determinar um nível de pós-administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nível da molécula inflamatória em etapa (1) com o nível da molécula inflamatória em etapa (3), sendo que uma falta de aumento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória na qual IL-31 desempenha um papel, compreendendo: administrar um antagonista de IL-31 ao mamífero de tal modo que a inflamação é reduzida, sendo que o antagonista é selecionado do grupo consistindo de uma moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que especificamente se liga(m) em um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo de IL-31 (SEQ ID NO:2). Em uma modalidade, o método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é como mostrado acima, sendo que a doença é uma doença inflamatória crônica. Em outra modalidade, o método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é como mostrado acima, sendo que a doença é uma doença inflamatória crônica selecionada do grupo consistindo de: doença inflamatória intestinal; colite ulcerativa; Doença de Crohn; dermatite atópica; eczema; e psoríase. Em outra modalidade, o método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é como mostrado acima, sendo que a doença é uma doença inflamatória aguda. Em outra modalidade, o método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é como mostrado acima, sendo que a doença é uma doença inflamatória aguda selecionada do grupo consistindo de: endotoxemia; septicemia; síndrome de choque tóxico; e doença infecciosa. Em outra modalidade, o método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é como mostrado acima, sendo que o anticorpo adicionalmente compreende um radionuclídeo, enzima, substrato, cofator, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de peptídeo, partícula magnética, droga, ou toxina.
Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para detectar inflamação em um paciente, compreendendo: obter uma amostra biológica ou de tecido de um paciente; incubar a amostra biológica ou de tecido com moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como aqui mostradas(os) sob condições nas quais as moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 se liga(m) em seu polipeptídeo complementar na amostra biológica ou de tecido; visualizar as moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 ligadas(os) na amostra biológica ou de tecido; e comparar os níveis de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 ligadas(os) na amostra biológica ou de tecido do paciente com uma amostra biológica ou de tecido de controle normal, sendo que um aumento no nível de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 ligadas(os) na amostra biológica ou de tecido do paciente em relação à amostra biológica ou de tecido de controle normal é indicativo inflamação no paciente.
A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLOS Exemplo 1 Determinação de Regiões Variáveis Seqüências de regiões variáveis de cadeias leve e pesada foram determinadas na seguinte maneira:
Extração de RNA /Produção de "5' RACE Readv cDNA": Linhagens de célula de hibridoma (aproximadamente 4,5 χ IO6 células) foram coletadas por centrifugação após lavagem em IX PBS. RNA foi purificado usando "Qiagen's RNeasy mini purification kit" de acordo com as instruções do fabricante. RNA resultante foi exibido sobre um E-Gel 1,2% para validação. Síntese de primeira fita de cDNA foi realizada usando "BD Biosciences BD SMART RACE cDNA Amplification Kit", que proporcionou "5' RACE Ready cDNA".
Amplifícação de Seqüências de Região Variável de Cadeias
Leve e Pesada:
"5' RACE ready cDNA" foi usado como modelo para PCR como descrito em "BD Biosciences BD SMART RACE cDNA Ampliflcation Kit". Amplificações por PCR de ambas as cadeias pesada e leve usaram a IOX UPM ("Universal Primer Mix") proporcionada pelo kit como o 5' PCR oligonucleotídeo. Os 3' PCR oligonucleotídeos foram como segue;
kappa de camundongo (zc54289:5'-
CGACTGAGCCACCTCCAGATGTTAACTGCTCAC-3' SEQ ID NO: 28)
IgGl de camundongo (zc54983:5'-
CAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGG -3' SEQ ID NO: 29)
IgG2a de camundongo (zc55640: 5'-
CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGG -3' SEQ ID NO: 30)
Os produtos de PCR de seqüência de região variável de cadeias leve e pesada foram purificados em gel usando "GE Healthcare illustra GFX tm PCR DNA" e "Gel Be purification Kit" e clonados via "Invitrogen TOPO TA Cloning Kit". Oito colônias individuais por hibridoma por região variável foram selecionadas por PCR de colônia com iniciadores de kit Ml3R e Ml3F e submetidos ao seqüenciamento. Seqüenciamento foi realizado usando "ABI PRISM BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reações para seqüenciamento foram purificadas usando "EdgeBioSystems Centriflex Gel Filtration Cartridges" (Gaithersburg, MD) e corridos em um "ABI PRISM 377 DNA Sequencer" (Applied Biosystems, Foster City, CA). Dados de seqüência resultantes foram montados e editados usando o programa de computador Sequencher v4.1 (GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI.)
Tabela 1 mostra as SEQ ID NO :s para as seqüências de regiões variáveis, que são adicionalmente descritas em Figuras 1 -4.
Tabela 1: Números de Listagem de Seqüências para Regiões
Variáveis Leves e Variáveis Pesadas
Número do Clone SEQ ID NO: da Região Variável de Cadeia Leve SEQ ID NO: da Região Variável de Cadeia Leve com Seqüência de Sinal SEQ ID NO: de Região Variável de Cadeia Pesada SEQ ID NO: da Região Variável de Cadeia Pesada com Seqüência de Sinal 292.12.3.1 8 31 9 32 292.84.1.6 8 com Arg substituída na posição 42 31 com Arg substituída na posição 62 9 com substituições:- Thr na posição 50;- Ser na posição 69;- Asn na posição 77; e- Phe na posição 95 32 com substituições:- Thr na posição 50;- Ser na posição 88;- Asn na posição 95; e- Phe na posição 114 292.63.5.3 10 33 11 34 294.144.3.5 12 35 13 36 292.39.5.3 14 37 15 38 292.51.5.2 16 39 17 40 292.64.6.5.5 18 41 19 42 292.105.4.1 20 43 21 44 292.109.4.4 22 45 23 46 292.118.6.4 24 47 25 48 292.72.3.1 26 49 27 50
Tabela 2 mostra as SEQ ID NO :s para as seqüências das
regiões variáveis, que são adicionalmente descritas em Figuras 1 -4. Tabela 2: Números de Listagem de Seqüências para CDRs de
Regiões Variáveis Leves e Regiões Variáveis Pesadas
Número do Clone CDRl Variável Pesada CDR2 Variável Pesada CDR3 Variável Pesada CDRl Variável Leve CDR2 Variável Leve CDR3 Variável Leve 292.12.3.1 SEQID NO: 51 (CDR1 VH de 292.12.3.1) RYWMQ SEQ ID NO: 52: (CDR2 VH de 292.12.3.1): AIYPGDG DT RYSQKFK G SEQ ID NO: 53: (CDR3 VH of292.12.3.1 ): PDGYYAA PY GMDY SEQ ID NO: 54: (CDR1 VL de 292.12.3.1): RASGNIHN YLA SEQ ID NO: 55: (CDR2 VL de 292.12.3.1): NAKTLAD SEQ ID NO: 56: (CDR3 VL de 292.12.3.1): QHFWSTP WT 292.84.1.6 SEQID NO: 51 (CDR1 VH de 292.12.3.1) RYWMQ SEQ ID NO: 57 (CDR2 VH of292.84.1.6 ): TIYPGDGD T RYSQKFK G SEQ ID NO: 53: (CDR3 VH oG92.12.3.1 ): PDGYYAA PY GMDY SEQ ID NO: 54: (CDR1 VL de 292.12.3.1): RASGNIHN YLA SEQ ID NO: 55: (CDR2 VL de 292.12.3.1): NAKTLAD SEQ ID NO: 56: (CDR3 VL de 292.12.3.1): QHFWSTP WT 292.72.3.1 SEQID NO: 51 (CDR1 VH de 292.12.3.1) RYWMQ SEQ ID NO: 58 (CDR2 VH de 292.72.3.1): AIYPRDGD T RYSQKFK G SEQ ID NO: 59: (CDR3 VH 0O92.72.3.1 ): PDGSYAA PN GMEY SEQ ID NO: 60: (CDR1 VL de 292.72.3.1): RASGSIHN YLA SEQ ID NO: 61: (CDR2 VL de 292.72.3.1): NAETLAD SEQ ID NO: 62: (CDR3 VL de 292.72.3.1): QHFWITP WT 292.63.5.3 SEQID NO: 63 (CDR1 VH de 292.63.5.3) TFIMS SEQ ID NO: 64 (CDR2 VH de 292.63.5.3): TINSGG YY T FHPDSVK G SEQ ID NO: 65 (CDR3 VH de 292.63.5.3): QEGWSSA YF SY SEQ ID NO: 66: (CDR1 VL de 292.63.5.3): KSSQSLLN GS NQKNYLA SEQ ID NO: 67: (CDR2 VL de 292.63.5.3): FASTRDS SEQ ID NO: 68: (CDR3 VL de 292.63.5.3): QQHYDTP YT 292.39.5.3 SEQID NO: 69 (CDR1 VH de 292.39.5.3) TYIMS SEQ ID NO: 70 (CDR2 VH de 292.39.5.3): TINSGG YY T LYPDSVK G SEQ ID NO: 71 (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSA WFAY SEQ ID NO: 72: (CDR1 VL de 292.39.5.3): NSSQSLLN SSN QKNYLA SEQ ID NO: 73: (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEQ ID NO: 74: (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPY T 292.51.5.2 SEQID NO: 75 (CDR1 VH de 292.51.5.2) SFVMS SEQ ID NO: 76 (CDR2 VH de 292.51.5.2): TINSGG YY S FHPDSVK G SEQ ID NO: 65 (CDR3 VH de 292.63.5.3): QEGWSSA YF SY SEQ ID NO: 77 (CDR1 VL de 292.51.5.2): KSSQSLLN SSN QKNYLA SEQ ID NO: 78 (CDR2 VL de 292.51.5.2): FTSTRES SEQ ID NO: 68: (CDR3 VL de 292.63.5.3): QQHYDTP YT 292.64.6.5.5 SEQID NO: 69 (CDR1 VH de 292.39.5.3): TYIMS SEQ ID NO: 70 (CDR2 VH de 292.39.5.3): TINSGG YY SEQ ID NO: 71 (CDR3VH de 292.39.5.3): SEQ ID NO: 72: (CDR1 VL de 292.39.5.3): NSSQSLLN SEQ ID NO: 73: (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEQ ID NO: 74: (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPY T LYPDSVK G QEGWSSA WFAY SSN QKNYLA T 292.105.4.1 SEQID NO: 69 (CDRl VH de 292.39.5.3) TYIMS SEQ ID NO: 70 (CDR2 VH de 292.39.5.3): TINSGGYY T LYPDSVK G SEQ ID NO: 71 (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSA WFAY SEQ ID NO: 72: (CDRl VL de 292.39.5.3): NSSQSLLN SSN QKNYLA SEQ ID NO: 73: (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEQ ID NO: 74: (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPY T 292.109.4.4 SEQID NO: 69 (CDRl VH de 292.39.5.3) TYIMS SEQID NO: 70 (CDR2 VH de 292.39.5.3): TINSGGYY T LYPDSVK G SEQ ID NO: 71 (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSA WFAY SEQ ID NO: 72: (CDRl VL de 292.39.5.3): NSSQSLLN SSN QKNYLA SEQ ID NO: 73: (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEQ ID NO: 74: (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPY T 292.118.6.4 SEQID NO: 69 (CDRl VH de 292.39.5.3) TYIMS SEQ ID NO: 79 (CDR2 VH de 292.118.6.4) TINSGGYY T IYPDSVKG SEQ ID NO: 71 (CDR3VH de 292.39.5.3): QEGWSSA WFAY SEQ ID NO: 72: (CDRl VL de 292.39.5.3): NSSQSLLN SSN QKNYLA SEQ ID NO: 73: (CDR2 VL de 292.39.5.3): FASTGES SEQ ID NO: 74: (CDR3 VL de 292.39.5.3): QQHFSTPY T 294.144.3.5 SEQID NO: 80 (CDRl VH de 292.144.3. 5): TYWIE SEQ ID NO: 81 (CDR2 VH de 292.144.3.5) EILPGRGT T NYN AKFQ G SEQ ID NO: 82 (CDR3 VH de 292.144.3.5) ESKLGDD DY SEQ ID NO: 83: (CDRl VL de 292.144.3.5) SASSSVSY MH SEQ ID NO: 84: (CDR2 VL de 292.144.3.5) :DTTKLAS SEQ ID NO: 85: (CDR3 VL de 292.144.3.5) FQGSEHPL T
Hibridomas, 292.12.3.1 e 292.84.1.6, expressam cadeias leve e
pesada que compartilham um com o outro identidade de seqüência extensiva. Os alinhamentos de seqüência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de 292.12.3.1 e 292.84.1.6 são mostradas em Figura 2. O alto grau de identidade de seqüência compartilhada sugere que as regiões variáveis de cadeia leve são derivadas do mesmo gene de linhagem germinativa de região variável de cadeia leve, enquanto que as regiões variáveis de cadeia pesada também são derivadas de mesmo gene de linhagem germinativa de região variável de cadeia pesada. Adicionalmente, a identidade em todas ambas CDR3 e FR4 de cadeias leve e pesada indica utilização da mesma região JL na cadeia leve, e das mesmas regiões JH e D bem como as adições de nucleotídeo N e P na CDR3 de cadeia pesada. Ambos os hibridomas 292.12.3.1 e 292.84.1.6 expressam cadeias leve kappa, mas 292.12.3.1 expressa uma cadeia pesada de IgGl enquanto que 292.84.1.6 expressa uma cadeia pesada de IgG2a. Parece que ambos estes hibridomas são derivados dos mesmos eventos de rearranjo de Ioci de imunoglobulina de célula-B inicial e que 292.84.1.6 é um resultado de uma subseqüente comutação de classe para uma cadeia pesada de IgG2a. Quer antes de, quer depois de, comutação de classe, 292.12.3.1 e 292.84.1.6 divergiram pela incorporação de outras mutações somáticas que levaram à diferença de um aminoácido na cadeia leve e 4 diferenças de aminoácido na cadeia pesada.
Exemplo 2
Determinação de Seqüência de Proteína Amino-Terminal
Seqüenciamento de proteína N-terminal foi usado para determinar as seqüências de anticorpo de cadeias pesada e leve. Os anticorpos foram processados com e sem tratamento com piroglutamato-amino-peptidase (PGAP). Amostras não tratadas foram processadas pela adição de 100 picomoles (pmol) de proteína e água. Amostras tratadas com PGAP foram processadas pela adição de 100 pmol de proteína, água, 0,03 % SDS, tampão 5X PGAP (Takara Bio Inc., Japão) e enzima pGAP (1 mU) em tampão IX PGAP. A reação com PGAP foi realizada por 10 minutos a 95°C. Este tratamento enzimático removeu os grupos ácido piroglutâmico N- terminalmente bloqueadores. Tampão redutor para SDS foi adicionado em ambas as amostras não tratadas e tratadas com pGAP e então as amostras foram aquecidas por 5 minutos em um banho de água em ebulição. As amostras foram corridas sobre um gel de SDS PAGE em gradiente. O gel foi transferido para uma membrana PVDF e corado com azul coomassie. Duas bandas visíveis foram observadas para cada amostra com pesos moleculares evidentes em SDS PAGE de 50 kDa e 25 kDa. Cada banda foi excisada e submetida ao seqüencialmente de proteína N-terminal. Vinte ciclos de seqüência foram realizados para determinar a seqüência. Exemplo 3
Ensaio de Luciferase em Linhagens de Célula Epitelial Transformada de Humano via Infecção Transiente com um Gene Repórter STAT/SER Adenoviral
Inibição, redução, e/ou neutralização de atividade de IL-31 podem ser medidas pelo ensaio de luciferase. Por exemplo, linhagens de célula de humano transformadas podem ser semeadas em placas de fundo plano de 96 cavidades 10.000 células/cavidade em meio de crescimento regular como especificado para cada tipo de célula. No dia seguinte, as células são infectadas com um construto repórter de adenovírus, KZl36, em uma multiplicidade de infecção de 5.000. O repórter KZ136 contém os elementos STAT em adição a um elemento de resposta sérico. O volume total é 100 ul/cavidade usando DMEM suplementado com L-glutamina 2 mM (GibcoBRL), Piruvato de Sódio 1 mM (GibcoBRL) e suplemento de Insulina - Transferrina - Selênio Ix (GibcoBRL) (daqui em diante referido como meio livre de soro). Células são cultivadas durante a noite.
No dia seguinte, o meio é removido e substituído por 100 μΐ- de meio de indução. O meio de indução é IL-31 de humano diluída em meio livre de soro a 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml e 1,56 ng/ml. Um controle positivo de FBS 20% é usado para validar o ensaio e para garantir que a infecção por adenovírus é bem sucedida. As células são induzidas por 5 horas em cujo tempo o meio é aspirado. As células são então lavadas em 50 μL/cavidade de PBS, e subseqüentemente lisadas em μL/cavidade de tampão de Iise celular IX (Promega). Após uma incubação de Io minutos na temperatura ambiente, 25 μL/cavidade de lisado são transferidos para placas brancas opacas de 96 cavidades. As placas são então lidas em um Luminômetro usando integração de 5 segundos com 40 μL/cavidade de injeção de substrato de luciferase(Promega).
Exemplo 4 Bioensaio de IL-31 Células BAF3 transfectadas com hzCYTOR17 (IL-31RA), hOSMRB, e KZ134 são crescidas para 5xlo5 e IxlO6 células/mL. Células são lavadas com meio de ensaio (RPMI 1640, FBS 10%, L-Glutamina, Piruvato de Sódio, e Pen/Strep (todos da Gibco)) e ressuspensas a 3x105 células/mL em meio de ensaio. Em uma placa opaca de 96 cavidades, padrões hIL-31 são titulados em duplicada a partir de 600 pg/mL a 9,38 pg/mL em meio de ensaio via uma diluição serial de 1:2, de 100 μL/cavidade. Padrões de controle de qualidade são adicionados em duplicata na placa a 350 pg/mL e 35 pg/mL em 100 μΚ Amostras de teste são muitas vezes diluídas 1:2 ou 1:4 e adicionadas em duplicata nas cavidades de amostra. 100 μΐ, das células BAF3 lavadas são adicionados em cada cavidade para uma concentração final de 3x104 células/cavidade. A placa é incubada por 6-24 horas a +37°C em uma incubadora sob CO2 5%. A placa é centrifugada a 1.200RPM por 5 minutos, meio é expulso e 25 μL/cavidade de tampão de Iise (Promega) são adicionados em cada cavidade. Após 10 minutos a placa é lida em um luminômetro (Berthold). O luminômetro adiciona 40 μL/cavidade de mistura de substrato de luciferase (Promega) e é integrada a luminescência por um período de 4 segundos. Valores de luminescência são exportados para uma planilha onde são analisados e convertidos em picogramas de IL-31 por 106 células por mL de volume.
Exemplo 5
Envolvimento de IL-31 em Iniciação e Perpetuação de Hipersensibilidade de Contato In Vivo Método I
Camundongos BALB/c são pintados sobre o dorso médio barbeado com 25 μΙ. de DNFB (2,4, dinitro-fluoro-benzeno, Sigma, St. Louis MO) 0,5% dissolvido em solução de acetona: azeite de oliva (4:1) usando um pipettor. Um grupo de controle de veículo recebe 25 μΕ de apenas acetona: azeite de oliva. Após 5 dias, camundongos são anestesiados com isofluorana em uma câmara de inalação e ambos pavilhões de orelha de animais experimentais e de controle são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) para obter uma medição de linha base. Camundongos são então desafiados pela aplicação de 10 \\L de DNFB 0,25% em acetona: azeite de oliva (4:1) em ambos os lados de cada orelha de todos os camundongos. Hipersensibilidade de contato é medida a 24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelha direita (desafiada) e a orelha esquerda (não desafiada). Todas as medições são feitas com um micrômetro de engenheiro. Valores de fundo são determinados pela diferença em inchamento de orelha entre as orelhas de camundongos não-experimentados.
Sangue inteiro e soro para análise por FACS e/ou ELISA são colhidos antes da matança e orelhas são colhidas para histologia.
Método II (Induz respostas Th2) Camundongos BALB/c são pintados sobre o dorso médio
barbeado com 100 \\L de FITC (fluoresceína-isotiocianato) 0,5% em uma solução 1:1 de acetona/ftalato de dibutila (MSDS disponível usando pipettor nos dias 1, 2 e 8. No dia 13, camundongos são anestesiados com isofluorano em uma câmara de inalação e ambos pavilhões de orelha de animais experimentais e de controle são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) para obter uma medição de linha base. Camundongos são então desafiados pela aplicação de 25 μΙ. de FITC 0,5% (em 1:1 acetona/ftalato de dibutila) na superfície dorsal de cada orelha. Hipersensibilidade de contato é medida a 24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelha direita (desafiada) e a orelha esquerda (não desafiada). Todas as medições são feitas com um micrômetro de engenheiro. Valores de fundo são determinados pela diferença em inchamento de orelha entre as orelhas de camundongos não- experimentados. Sangue inteiro e soro para análise por FACS e/ou ELISA são colhidos antes da matança e orelhas são colhidas para histologia. Método III Hnduz respostas Thl)
Camundongos BALB/c são pintados sobre o dorso médio barbeado com 25 \iL de oxazalona 2% (em acetona / azeite de oliva 4:1) usando pipettor. No dia 7, camundongos são anestesiados com isofluorano em uma câmara de inalação e ambos pavilhões de orelha de animais experimentais e de controle são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) para obter uma medição de linha base. Camundongos são então desafiados pela aplicação de 8 μΙ> de oxazalona na superfície dorsal de cada orelha. Hipersensibilidade de contato é medida a 24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelha direita (desafiada) e a orelha esquerda (não desafiada). Todas as medições são feitas com um micrômetro de engenheiro. Valores de fundo são determinados pela diferença em inchamento de orelha entre as orelhas de camundongos não-experimentados. Sangue inteiro e soro para análise por FACS e/ou ELISA são colhidos antes da matança e orelhas são colhidas para histologia.
Envolvimento de IL-31 na iniciação e na perpetuação de hipersensibilidade de contato são testadas usando as moléculas ligantes de IL- 31 ou os antagonistas de IL-31 aqui descritas(os) contra IL-31 em ambas as fases de sensibilização e de desafio do experimento.
Exemplo 6
Envolvimento de IL-31 em Dermatite atópica In Vivo Método I (Sensibilização de camundongos NC/Nga)
Camundongos NC/Nga de 4 semanas de idade (CRL, Japão) são alojados em condições de quarentena SPF por 4 semanas para aclimatização. Os camundongos são de aproximadamente 10-11 semanas de idade no início da sensibilização por antígeno. Camundongos são anestesiados com isofluorano e os dorsos são barbeados com tosquiadores elétricos. Aproximadamente 10 μg de extrato de Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) (Indoor Biotechnologies, pedido especial) são injetados na nuca do pescoço 3 vezes por semana por 6 a 6 semanas até que os camundongos desenvolvam lesões de pele. Animais de controle recebem 10 μί de injeções intradermais de PBS 3 vezes por semana. O extrato de Dp é preparado de acordo com o método de Matsuoka e colegas. Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003). Resumidamente, 595 mg de extrato de cultura esgotada liofilizada de Dp são dissolvidos em 12 mL de PBS estéril (Gibco). Dp é misturado em um tubo Falcon de 50 mL sobre um vascolejador por 30 minutos. O extrato é centrifugado por 10 minutos a 2.000 rpm e o sobrenadante é colhido e aliquotado em tubos de criofrasco de 1 mL e armazenados a -20°C.
Os efeitos moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL- 31 são medidos por inibição de arranhadura, coceira, e/ou dermatite.
Método II (Sensibilização de camundongos DOl 1.10) Camundongos transgênicos DOl 1.10 são criados em uma colônia doméstica e são entre 9,5 e 14 semanas de idade no início da sensibilização por antígeno. 24 Horas antes da sensibilização epicutânea os camundongos são anestesiados com isofluorano e o tronco inteiro (dorso e abdome) dos camundongos são barbeados com tosquiadores elétricos. Os camundongos são então pelados no dorso com fita cirúrgica Elastin (Johnson and Johnson). Placas de gaze de 1 cm2 são umedecidas com 500 μg de ovalbumina (Calbiochem 32467) ou com PBS estéril (Gibco) e aderidas sobre o lado inferior esquerdo dos camundongos com curativo "DuoDerm Extra Thin Dressing" (ConvaTec 187932). A placa e o curativo são então cobertos por um encobrimento de fita cirúrgica Elastin de modo que os camundongos não pudessem remover ou destruir as placas. As placas são usadas por 7 dias e removidas. Os camundongos são descansados por duas semanas antes de sofrerem outra rodada de sensibilização epicutânea. Camundongos recebem um total de três sensibilizações de uma semana.
Os efeitos de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são medidos pela inibição de arranhadura, coceira, e/ou dermatite e/ou uma redução em expressão de IL-3 IRA em queratinócitos.
Exemplo 7
Redução de TARC e MDC em Resposta ao Anticorpo Anti-IL-31 em modelos de AD em camundongo
Método I
Camundongos NC/Nga de seis semanas de idade (CRL Japão) são sensibilizados intradermalmente com 50 μg de extrato de ácaro de poeira (D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies) três vezes por semana sobre o dorso e classificados para lesões semelhantes a AD. Após 5 semanas de sensibilização os camundongos são mortos e as orelhas direitas foram excisadas e posicionadas dentro de uma cavidade única de uma placa de cultura de 48 cavidades (Corning) suplementada com RPMI+FBS 2% (GIBCO Invitrogen). Placas são posicionadas em incubadoras de umidade controlada sob CO2 5%. Sobrenadantes são colhidos após 24 horas e congelados a -20 0C até análise posterior.
Método II
Camundongos fêmeas NC/Nga de vinte semanas de idade (CRL Japão) são sensibilizados intradermalmente com 10 μg de SEB (Toxin Technology) na orelha e sobre o dorso três vezes por semana. Os camundongos são classificados para lesões semelhantes a AD. Após 5 semanas de sensibilização os camundongos são mortos e perfurações de biopsia de 6 mm foram tiradas da orelha injetada de cada camundongo e posicionadas dentro de uma cavidade única de uma placa de cultura de 48 cavidades (Corning) suplementada com RPMI+FBS 2% (GIBCO Invitrogen). Placas foram posicionadas em incubadoras de umidade controlada sob CO2 5%. Sobrenadantes são colhidos após 24 horas e congelados a -20 0C até análise posterior.
Grupos de camundongos em ambos os estudos são tratados com moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 intraperitonealmente duas vezes por semana iniciando após 1 a 2 semanas de sensibilização.
Concentrações de TARC e MDC nas amostras de sobrenadante de 24 h são medidas por ELISA convencional (R&D Systems).
Exemplo 8
Administração de anticorpo neutralizador de IL-31
Camundongos fêmeas BALB/c normais (CRL) de aproximadamente 8 a 12 semanas de idade são implantados subcutaneamente com bombas osmóticas de 14 dias (Alzet, #2002) liberando 1 μg/dia de mlL- 31. Grupos de camundongos recebem injeções intraperitoneais (i.p.) de anticorpo monoclonal de rato anti-IL-31 de camundongo 10 mg/kg (200 μg/camundongo) duas vezes por semana iniciando 1 semana antes da liberação de IL-31. Grupos de controle de camundongos recebem injeções i.p. de veículo (PBS/BSA 0,1%) com os planejamentos de dosagem idênticos. Camundongos são classificados diariamente para alopecia e prurite usando os seguintes critérios: 0 = sem arranhadura, animal parece normal, 1 = adelgaçamento de pele em áreas pequenas, arranhadura notada, 2 = perda de pêlo menor (porções pequenas), arranhadura, 3 = perda de pêlo moderada, arranhadura, e 4 = perda de pêlo severa, excessiva arranhadura.
Os efeitos de moléculas ligantes de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são medidos por um atraso no início dos sintomas de aproximadamente a 7 dias e um escore total menor para alopecia e prurite.
Exemplo 9
Expressão de Anticorpos Monoclonais anti-IL-31 de Humano Quiméricos
Recombinantes
As seqüências de regiões variáveis de cadeias pesada e leve de dois anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL-31 de humano separados, 292.12.3.1 e 292.63.5.3, foram obtidas por PCR. As seqüências de DNA foram determinadas e os construtos de expressão foram gerados utilizando seqüências de DNA de região constante de humano.
Os construtos de expressão de cadeia leve consistiram de um promotor MPSV/CMV híbrido / intensificador dirigindo a expressão da região variável de camundongo quimérica anti-IL-31 de humano fusionada em uma região constante kappa de imunoglobulina.
Os construtos de expressão de cadeia pesada consistiram de um promotor MPSV/CMV híbrido / intensificador dirigindo a expressão da região variável de camundongo quimérica anti-IL-31 de humano fusionada em uma região constante de imunoglobulina IgG4 de humano com uma substituição de aminoácido na região de dobradiça, Serina 228 mudada para Prolina.
Os construtos de expressão de cadeias leve e pesada codificadores das cadeias leve e pesada quiméricas de cada hibridoma foram co-transfectados em células HEK 293F. Meio condicionado foi colhido após 4 dias. Análise de Western blot demonstrou anticorpo quimérico intacto de tamanho esperado sobre SDS-PAGE não redutor.
A capacidade de ligação em antígeno dos anticorpos quiméricos foi determinada por um protocolo baseado em ELISA para medir EC 5 O aparente (concentração efetiva para ligar 50% de antígeno em uma concentração fixa). O formato de ensaio utilizou uma imobilização de cabra anti-Fc de humano para captura de anticorpos monoclonais de humano de meio condicionado de cultura de célula não processada. Uma série de diluições de IL-31 biotinilada testou o parâmetro "C" de uma forma de 4 parâmetros que resulta na Kd aparente (ou EC50) quer em ng/mL quer em nM de IL31. A sensibilidade de ensaio é suficientemente alta que pode ser avaliado meio condicionado diluído de cultura celular de anticorpo quimérico ou anticorpo monoclonal. A Kd determinada por este método geralmente se aproxima da Kd medida para anticorpos monoclonais homogêneos, purificados medidos usando Biacore. Ambos anticorpos anti-IL31 quiméricos mostram valores de Ec50 similares comparados com anticorpo monoclonal de hibridoma de camundongo "parental" de controle 292.63.5.3 como mostrado em Tabela 3.
Tabela 3
Determinação de EC50 de Meio Condicionado de Transfecções Transientes
de HEK 293F
Amostra EC50 (ng/mL)d EC50 (nM)a Quimérico 292.63.5.3 1,3 0,08 Quimérico 292.12.3.1 2,0 0,12 Meio de controle de HEK 293F Não-transfectada Sem ligação Sem ligação Anticorpo monoclonal de Controle 292.63.5.3 4,3 0,26 (Lote E9289)
a Média de medida dupla
Do discutido acima, será reconhecido que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido aqui descritas para propósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviarem do espírito e do escopo da invenção. Conseqüentemente, a invenção não é limitada exceto pelas reivindicações anexadas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Siadak, Anthony W.
Bilsborough, Janine Rene, Shirley
<120> SEQUENCIAS DE REGIÇAO VARIÁVEL DE ANTICORPOS MONOCLONAIS IL-31 E MÉTODOS DE USO
<130> 06-38PC
<140> PCTUS0777555 <141> 2007-09-04
<150> 60/824,403 <151> 2006-09-01
<150> 60/890,792 <151> 2007-02-20
<160> 85
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 904
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (28)...(519)
<4 00> 1
ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr 1 5
tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102 Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His 15 20 25
acg ttg ccc gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150 Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile 35 40
gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag 198 Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu 45 50 55
gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246 Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu 60 65 70
age cct gac gcc cag ccg cca aac aac ate cac age cca gcc ate cgg 294 Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg 75 80 85
gea tat ctc aag aca ate aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp 90 95 100 105
342 gag ate ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gea cca gaa 390 Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu 110 115 120
aca aac att tet gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc ate 438 Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile 125 130 135
ctg act att tet caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gea cta aaa 486 Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys 140 145 150
tca ttg acc tet gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539 Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr 155 160
ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599
gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659
agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719
tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779
ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839
ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc 899
tcata 904
<210> 2 <211> 164 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Ser His 1
Cys Leu Gly Gly 20
Arg Pro Ser Asp 35
Ser Lys Met Leu 50
Ser Gln Asn Tyr 65
Asn Asn Ile His
Gln Leu Asp Asn 100
Lys Leu Ile Phe 115
Asp Thr His Glu 130
Ser Glu Cys Met 145
Gln Ala Thr Thr
Ser Gly Pro Ser 5
Trp Leu Ala Ser
Asp Val Gln Lys 40
Leu Lys Asp Val 55
Thr Leu Pro Cys 70
Ser Pro Ala Ile 85
Lys Ser Val Ile
Gln Asp Ala Pro 120
Cys Lys Arg Phe 135
Asp Leu Ala Leu 150
Thr Ser Val Leu 10
His Thr Leu Pro 25
Ile Val Glu Glu
Glu Glu Glu Lys 60
Leu Ser Pro Asp 75
Arg Ala Tyr Leu 90
Asp Glu Ile Ile 105
Glu Thr Asn Ile
Ile Leu Thr Ile 140
Lys Ser Leu Thr 155
Phe Leu Phe Cys 15
Val Arg Leu Leu 30
Leu Gln Ser Leu 45
Gly Val Leu Val
Ala Gln Pro Pro 80
Lys Thr Ile Arg 95
Glu His Leu Asp 110
Ser Val Pro Thr 125
Ser Gln Gln Phe
Ser Gly Ala Gln 160
<210> 3 <211> 755 <212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(489) <400> 3
atg ate ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
10 15
tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc age ttg tcc ttc ggt gcc cca 96 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 25 30
ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu 40 45
tet cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gea tet ggg atg 192 Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met 50 55 60
tca gea gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa 240 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80
gea tta acc aac ate tcg gtc ate ata gea cat ctg gag aaa gtc aaa 288 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95
gtg ttg age gag aac aca gta gat act tet tgg gtg ata aga tgg cta 336 Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu 100 105 110
aca aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tet gtg cct 384 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro 115 120 125
gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val 130 135 140
tta aag cag ttc tca aac tgc atg gea gaa ctg cag gct aag gac aat 480 Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160
act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529
Thr Thr Cys
gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589
cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649
tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709
catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755
<210> 4 <211> 163 <212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 4
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
10 15
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
25 30
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu 40 45 Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
50 55 60
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
85 90 95
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
100 105 110
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
115 120 125
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
130 135 140
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160
Thr Thr Cys
<210> 5 <211> 662 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 5
Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp
10 15
Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala
25 30
Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg
40 45
Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr
50 55 60
Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80
Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe
85 90 95
Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu
100 105 110
Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg
115 120 125
Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys
130 135 140
Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro 145 150 155 160
Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg
165 170 175
Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg
180 185 190
Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr
195 200 205
Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp
210 215 220
Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240
Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly
245 250 255
Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
260 265 270
Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn
275 280 285
Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu
290 295 300
His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320
Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu
325 330 335
Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp
340 345 350
Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp
355 360 365
Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser
370 375 380
Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys 385 390 395 400
Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His
405 410 415
Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
420 425 430
Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys
435 440 445
Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly
450 455 460
Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480
Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser
485 490 495
Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser
500 505 510
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe
515 520 525
Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu
530 535 540
Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn 545 550 555 560
Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser
565 570 575
Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu
580 585 590
Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro
595 600 605
Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn
610 615 620
Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly 625 630 635 640
Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser
645 650 655
Ser Cys Pro Thr Ser Ile 660
<210> 6 <211> 979 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6
Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu
10 15
Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu
25 30
Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu
40 45
His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys
50 55 60
Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His
85 90 95
Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val
100 105 110
Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe
115 120 125
Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr
130 135 140
Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160
Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn
165 170 175
Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp
180 185 190
Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn
195 200 205
Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu
210 215 220
Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240
Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr
245 250 255
Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser
260 265 270
Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys
275 280 285
Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu
290 295 300
Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320
Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro
325 330 335
Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr
340 345 350
Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile
355 360 365
Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys
370 375 380
Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 385 390 395 400
Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser
405 410 415
Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu
420 425 430
Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr
435 440 445
Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys
450 455 460
Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480
Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val
500 505 510
Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn
515 520 525
Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser
530 535 540
Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560
Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn
565 570 575
Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590
Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg
595 600 605
Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala
610 615 620
Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640
Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe
645 650 655
Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His
660 665 670
Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys
675 680 685
Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu
690 695 700
Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala 705 710 715 720
Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu
725 730 735
His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val
740 745 750
Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu
755 760 765
Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser
770 775 780
Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser 785 790 795 800
Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr
805 810 815
Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu
820 825 830
Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser
835 840 845
Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala
850 855 860
Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser Pro Lys Ala 865 870 875 880
Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala
885 890 895
Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu
900 905 910
Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp
915 920 925
Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His Cys Ser Glu
930 935 940
Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro 945 950 955 960
Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu 965 970 975
His Tyr Cys
<210> 7 <211> 6 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Glu-Glu tag peptide
<400> 7 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> VARIANTE <222> (42)...(42) <223> Xaa é Lys ou Arg
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Xaa Ser Pro Gln Leu Leu Val
40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 9 <211> 122 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> VARIANTE <222> (50)...(50) <223> Xaa é Ala ou Thr
<220>
<221> VARIANTE <222> (69)...(69) <223> Xaa é Thr ou Ser
<220>
<221> VARIANTE <222> (77)...(77) <223> Xaa é Ser ou Asn
<220>
<221> VARIANTE <222> (95)...(95) <223> Xaa é Tyr ou Phe
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45 Gly Xaa Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Xaa Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Asn Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Xaa Cys
85 90 95
Ala Phe Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 10 <211> 112 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asp Met Ser Glu Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
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85 90 95
His Tyr Asp Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 110
<210> 11 <211> 119 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Phe His Pro Asp Ser Val
50 55 60
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85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 12 <211> 105 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 12
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro
1 5
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser
40
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50 55
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15
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 30
Asn Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 45
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75 80
Gln Gly Ser Glu His Pro Leu Thr 90 95
Ile 105
<210> 13 <211> 117 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Glu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ser Lys Leu Gly Asp Asp Asp Tyr Trp Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 14 <211> 113 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
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85 90 95
His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Arg <210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
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50 55 60
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85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 16 <211> 113 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His
40 45
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Arg
<210> 17 <211> 120 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe His Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 18 <211> 113 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Arg
<210> 19 <211> 120 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 HO
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Mus
musculus <400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Arg
<210> 21 <211> 120 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 22 <211> 113 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Arg
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus rausculus
<4 00> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
10 15
Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Met Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Arg
<210> 25 <211> 120 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr 25 30 Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 26 <211> 107 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 26
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr
25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
40 45
Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 27 <211> 122 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 27
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Arg Tyr
25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Pro Asn Gly Met Glu Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28
cgactgagcc acctccagat gttaactgct cac 33
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
caggggccag tggatagaca gatggggg
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 30
caggggccag tggatagacc gatgggg
<210> 31 <211> 127 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> VARIANTE <222> (62)...(62) <223> Xaa é Lys ou Arg
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<400> 31
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr -20 -15 -10 -5
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
10
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn
20 25
Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Xaa Ser Pro
35 40
Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 45 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
65 70 75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
80 85 90
Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 95 100 105
28
27
<210> 32 <211> 141 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> VARIANTE <222> (69)...(69) <223> Xaa é Ala ou Thr <220>
<221> VARIANTE
<222> (88) ... (88)
<223> Xaa é Thr ou Ser
<220>
<221> VARIANTE <222> (95)...(95) <223> Xaa é Ser ou Asn
<220>
<221> VARIANTE <222> (114) . . . (114) <223> Xaa é Tyr ou Phe
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 32
Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 10 15
Val Tyr Ser Gln 20 Val Gln Leu Gln Gln 25 Ser Gly Ala Glu Leu 30 Ala Arg Pro Gly Ala 35 Ser Val Asn Leu Ser 40 Cys Lys Ala Ser Gly 45 Tyr Thr Leu Thr Arg 50 Tyr Trp Met Gln Trp 55 Val Lys Gln Arg Pro 60 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Xaa Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly 85 Lys Ala Xaa Leu Thr 90 Ala Asp Lys Ser Ser 95 Xaa Thr Ala Tyr Met 100 Gln Leu Asn Asn Leu 105 Ala Ser Glu Asp Ser 110 Ala Val Tyr Xaa Cys 115 Ala Phe Pro Asp Gly 120 Tyr Tyr Ala Ala Pro 125 Tyr Gly Met Asp Tyr 130 Trp Gly Gln Gly Thr 135 Ser Val Thr Val Ser 140 Ser
<210> 33 <211> 132 <212> PRT <213> Mus
musculus
<22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<400> 33
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Asp
25 30
Met Ser Glu Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80
Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Tyr Asp Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Arg 130
<210> 34 <211> 138 <212> PRT
<213> Mus musculus
<22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 34
Met Asn Phe Val Arg Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
Ser Thr Phe Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Phe His Pro 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135
<210> 35 <211> 127 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1) ... (21)
<4 00> 35
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Asn Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Thr Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Gln Gly
100 105 110
Ser Glu His Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile 115 120 125
<210> 36
<211> 136
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 36
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys
25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
40 45
Ser Thr Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Ala Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Glu Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Thr Glu Ser Lys Leu Gly Asp Asp Asp Tyr Trp Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 37
<211> 133
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 37
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Arg 130 <210> 38
<211> 139
<212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> SINAL
<222> (1)...(19)
<4 00> 38
Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135
<210> 39 <211> 133 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<400> 39
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Thr Ser Thr Arg 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Met Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Tyr Asp Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Arg 130
<210> 40 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 40 Met Asn Phe Val 1
Val Gln Cys Glu 20
Pro Gly Gly Ser 35
Ser Ser Phe Val 50
Glu Trp Val Ala 65
Asp Ser Val Lys
Thr Leu Tyr Leu 100
Tyr Tyr Cys Ala 115
Trp Gly Gln Gly 130
Leu Ser Leu Ile 5
Val Gln Leu Val
Leu Lys Leu Ser 40
Met Ser Trp Val 55
Thr Ile Asn Ser 70
Gly Arg Phe Thr 85
Gln Met Ser Ser
Arg Gln Glu Gly 120
Thr Leu Val Thr 135
Phe Leu Ala Leu 10
Glu Ser Gly Gly 25
Cys Ala Ala Ser
Arg Gln Ser Pro 60
Gly Gly Tyr Tyr 75
Ile Ser Arg Asp 90
Leu Arg Ser Glu 105
Trp Ser Ser Ala Val Ser Ala
Ile Leu Lys Gly 15
Asp Leu Val Lys 30
Gly Phe Thr Phe 45
Glu Lys Arg Leu
Ser Phe His Pro 80
Asn Ala Lys Asn 95
Asp Thr Ala Ile 110
Tyr Phe Ser Tyr 125
<210> 41
<211> 133
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 41
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Arg 130
<210> 42 <211> 139 <212> PRT
<213> Mus musculus
<22 0> <221> SINAL <222> (1)...(19
<4 00> 42 Met Asn Phe Val 1
Val Gln Cys Glu
20
Pro Gly Gly Ser 35
Ser Thr Tyr Ile 50
Glu Trp Val Ala 65
Asp Ser Val Lys
Thr Leu Ser Leu 100
Tyr Phe Cys Ala 115
Trp Gly Gln Gly 130
Leu Ser Leu Ile 5
Val Gln Leu Val
Leu Lys Leu Ser 40
Met Ser Trp Val 55
Thr Ile Asn Ser 70
Gly Arg Phe Thr 85
Gln Leu Ser Ser
Arg Gln Glu Gly 120
Thr Leu Val Thr 135
Phe Leu Ala Leu 10
Glu Ser Gly Gly 25
Cys Ala Ala Ser
Arg Gln Ser Pro 60
Gly Gly Tyr Tyr 75
Ile Ser Arg Asp 90
Leu Arg Ser Glu 105
Trp Ser Ser Ala Val Ser Ala
Ile Leu Lys Gly 15
Asp Leu Val Lys 30
Gly Phe Thr Phe 45
Glu Lys Arg Leu
Thr Leu Tyr Pro 80
Asn Ala Lys Asn 95
Asp Thr Ala Met 110
Trp Phe Ala Tyr 125
<210> 43 <211> 133 <212> PRT
<213> Mus musculus <22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 43
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Arg 130
<210> 44 <211> 139 <212> PRT
<213> Mus musculus <22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(19) <400> 44
Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135
<210> 45 <211> 133 <212> PRT
<213> Mus musculus <220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 45
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ile Cys Asn Ser Ser Gln Ser
40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Gly 65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Arg 130
<210> 46 <211> 139 <212> PRT
<213> Mus musculus <22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<4 00> 46
Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
Ser Thr Tyr Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135
<210> 47 <211> 133 <212> PRT <213> Mus muscul
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 47 Met Glu Ser Gln 1
Gly Ala Cys Ala 20
Met Ser Val Gly 35
Leu Leu Asn Ser 50
Arg Pro Gly Gln 65
Glu Ser Gly Val
Phe Thr Leu Thr 100
Phe Cys Gln Gln 115
Lys Leu Glu Ile 130
Thr Gln Val Leu 5
Asp Ile Val Met
Gln Lys Val Thr 40
Ser Asn Gln Lys 55
Ser Pro Arg Leu 70
Pro Asp Arg Phe 85
Ile Ser Asn Val
His Phe Ser Thr 120
Arg
Met Phe Leu Leu 10
Thr Gln Ser Pro 25
Met Ile Cys Asn
Asn Tyr Leu Ala 60
Leu Val Tyr Phe 75
Met Gly Ser Gly 90
Gln Ala Glu Asp 105
Pro Tyr Thr Phe
Leu Trp Val Ser 15
Ser Ser Leu Ala 30
Ser Ser Gln Ser 45
Trp Tyr Gln Gln
Ala Ser Thr Gly 80
Ser Gly Thr Asp 95
Leu Ala Asp Tyr 110
Gly Gly Gly Thr 125
<210> 48 <211> 139 <212> PRT
<213> Mus musculus <22 0>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 48
Met Asn Phe Val Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe 35
Lys Thr Tyr Ile 50
Glu Trp Val Ala 65
Asp Ser Val Lys
Thr Leu Tyr Leu 100
Tyr Tyr Cys Ala 115
Trp Gly Gln Gly 130
40
Met Ser Trp Val 55
Thr Ile Asn Ser 70
Gly Arg Phe Thr 85
Gln Met Ser Ser
Arg Gln Glu Gly
120
Thr Leu Val Thr 135
Arg Gln Ser Pro 60
Gly Gly Tyr Tyr 75
Ile Ser Arg Asp 90
Leu Arg Ser Glu 105
Trp Ser Ser Ala Val Ser Ala
45
Glu Lys Arg Leu
Thr Ile Tyr Pro 80
Asn Ala Lys Asn 95
Asp Thr Ala Met 110
Trp Phe Ala Tyr 125
<210> 49 <211> 127 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(20)
<4 00> 49
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
25 30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Ser
40 45
Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Glu Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Ile Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125
<210> 50 <211> 141 <212> PRT <213> Mus
musculus
<220>
<221> SINAL <222> (1)...(19)
<400> 50
Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly
10 15
Val Tyr Ser Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu
40 45
Thr Arg Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly 85 Lys Ala Thr Leu Thr 90 Ala Asp Lys Ser Ser 95 Thr Thr Ala Tyr Met 100 Gln Leu Ser Ser Leu 105 Ala Ser Glu Asp Ser 110 Ala Val Tyr Tyr Cys 115 Ala Tyr Pro Asp Gly 120 Ser Tyr Ala Ala Pro 125 Asn Gly Met Glu Tyr 130 Trp Gly Gln Gly Ser 135 Ser Val Thr Val Ser 140 Ser
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 51
Arg Tyr Trp Met Gln 1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 52
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
10 15
Gly
<210> 53 <211> 13 <212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 53
Pro Asp Gly Tyr Tyr Ala Ala Pro Tyr Gly Met Asp Tyr 10
<210> 54 <211> 11 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 54
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 10
<210> 55 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 55
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5
<210> 56 <211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 56
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 57 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 57
Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
10 15
Gly
<210> 58 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 58
Ala Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
10 15
Gly
<210> 59 <211> 13 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 59
Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Pro Asn Gly Met Glu Tyr 10
<210> 60 <211> 11 <212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 60
Arg Ala Ser Gly Ser Ile His Asn Tyr Leu Ala 10
<210> 61 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 61
Asn Ala Glu Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 62
Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 63 <211> 5 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 63
Thr Phe Ile Met Ser 1 5
<210> 64 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 64
Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Phe His Pro Asp Ser Val Lys
10 15
Gly
<210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Mus
musculus
<400> 65
Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Tyr Phe Ser Tyr 10
<210> 66 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 66
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gly Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
10 15
Ala
<210> 67 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 67
Phe Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5 <210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 68
Gln Gln His Tyr Asp Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 69
Thr Tyr Ile Met Ser 1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 70
Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val Lys
10 15
Gly
<210> 71 <211> 11 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 71
Gln Glu Gly Trp Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 10
<210> 72 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 72
Asn Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
10 15
Ala
<210> 73 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 73
Phe Ala Ser Thr Gly Glu Ser 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 74
Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 75 <211> 5 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 75
Ser Phe Val Met Ser 1 5
<210> 76 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 76
Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Ser Phe His Pro Asp Ser Val Lys
10 15
Gly
<210> 77 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 00> 77
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
10 15
Ala
<210> 78 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 78
Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 79 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 79
Thr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Tyr Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
31
10 15
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 80
Thr Tyr Trp Ile Glu 1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 81
Glu Ile Leu Pro Gly Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ala Lys Phe Gln
10 15
Gly
<210> 82 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 82
Glu Ser Lys Leu Gly Asp Asp Asp Tyr 1 5
<210> 83 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 83
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 10
<210> 84 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 84
Asp Thr Thr Lys Leu Ala Ser 1 5
<210> 85 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 85 Phe Gln Gly Ser Glu His Pro Leu Thr 1 5

Claims (26)

1. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
2. Método para reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar inflamação em um mamífero, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: IOe uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo ao mamífero reduz, bloqueia, inibe, ou neutraliza a produção de quimiocinas pró-inflamatórias.
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as quimiocinas pró-inflamatórias são TARC ou MDC.
5. Método para reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar prurite em um mamífero, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que administração do anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo reduz, bloqueia, inibe, ou neutraliza dermatite.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dermatite é dermatite atópica ou prurigo nodular.
8. Método para reduzir, bloquear, inibir, ou neutralizar arranhadura em um mamífero, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao mamífero um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e j) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
9. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo inibe, bloqueia, ou neutraliza a interação de IL-31 (SEQ ID NO:2) com IL-3 IRA (SEQ ID NO:5).
10. Método de acordo com as reivindicações 2, 5, ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo inibe, bloqueia, ou neutraliza a interação de IL-31 (SEQ ID NO:2) com IL-3 IRA (SEQ ID NO:5).
11. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo monoclonal murino ou fragmento de anticorpo murino; (b) um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado; e (c) um anticorpo monoclonal humano.
12. Método de acordo com as reivindicações 2, 5, ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo ou fragmento de anticorpo monoclonal murino; (b) um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado; e (c) um anticorpo monoclonal humano.
13. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo adicionalmente compreende PEGuilação.
14. Método de acordo com as reivindicações 2, 5, ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo adicionalmente compreende PEGuilação.
15. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada onde o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: a) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e b) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; iii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; iv) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; v) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; vi) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
16. Método de acordo com as reivindicações 2, 5, ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada onde o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo de: a) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; e b) um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal que compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: i) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; iii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; iv) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; v) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; vi) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e vii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
17. Anticorpo monoclonal ou método de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
18. Anticorpo monoclonal ou método de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compete pela ligação específica em um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: a)) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: IOe uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; c) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; d) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; f) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; g) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e h) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e sendo que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é usado conjuntamente com uma molécula IgG4 Fc de humano.
19. Anticorpo isolado que se liga a IL-31 humano, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo humanizado derivado do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado na American Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito de Patente em ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6815; b) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6816; c) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6829; d) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6830; e) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6831; f) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6871; g) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6872; h) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA- 6875;e i) Designação de Depósito de Patente em ATCC de PTA-6873; e sendo que dito anticorpo compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina que é uma IgG4 de humano. Em uma modalidade, o domínio constante de IgG4 de humano é uma forma mutada estável em solução com pouca ou nenhuma atividade ativadora de complemento. Em uma modalidade particular, o domínio de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é um domínio constante de IgG4 de humano com uma mutação de Ser para Pro na posição 241 (numeração de Kabat).
20. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o domínio de região constante de cadeia leve de imunoglobulina é selecionado do grupo consistindo de a região constante de uma cadeia leve kappa ou lambda de imunoglobulina.
21. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 51, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 57, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:53; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 54, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 55, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:56.
22. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 51, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 58, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:59; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 60, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 61, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:62.
23. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 63, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 64, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:65; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 66, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 67, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:68.
24. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 69, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 79, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:71; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 72, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 73, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:74.
25. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 75, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 76, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:65; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 77, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 78, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:68.
26. Anticorpo isolado como aqui mostrado, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável de cadeia pesada compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 80, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 817, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:82; e b) o domínio variável de cadeia leve compreende primeira seqüência de CDR consistindo de seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, uma segunda seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO: 84, e uma terceira seqüência de CDR consistindo de SEQ ID NO:85.
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