KR101484656B1 - 액체 디메틸 에테르를 이용한 고도 불포화 지질의 추출 - Google Patents

액체 디메틸 에테르를 이용한 고도 불포화 지질의 추출 Download PDF

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Abstract

식물 또는 동물 물질로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 획득하기 위한 공정으로서, 상기 물질과 액체 디메틸 에테르를 접촉시켜 지질을 함유하는 에테르 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔류물을 수득하는 단계, 상기 식물 또는 동물 물질의 잔류물로부터 상기 용액을 분리시키는 단계, 및 상기 용액으로부터 지질을 회수하는 단계를 포함하는 공정.

Description

액체 디메틸 에테르를 이용한 고도 불포화 지질의 추출{EXTRACTION OF HIGHLY UNSATURATED LIPIDS WITH LIQUID DIMETHYL ETHER}
본 발명은 분리 기술과 관련이 있다. 특히, 본 발명은 액체 디메틸 에테르 (DME), 및 선택적으로 또한 근임계(near-critical) 이산화탄소로 물질, 예컨대, 건조 또는 부분 건조 식물 또는 씨앗(해양종(marine species) 또는 육지종(terrestrial species) 포함), 또는 동물 생성물(해양종 또는 육지종 포함)을 추출하여, 고도 불포화 지질, 특히 고도 불포화 복합 지질이 풍부한 추출물, 및 선택적으로, 기능 식품으로서 유용하거나, 수용성 효소 및/또는 단백질을 추출하는데 유용한 잔류물을 수득하는 방법과 관련이 있다.
고도 불포화 지질(지방산 사슬내에 3개 이상의 불포화 부위, 및 18개 이상의 탄소를 갖는 지질)은 인체내에서 다양한 물질대사적 역할을 지닌다. 이들은 유아의 뇌 및 시력(eyesight) 발달에 필수적이며, 또한 심혈관 건강, 정신 건강, 및 면역과 염증 상태에 유익할 수 있다. 이러한 지질의 생물학적 특성은 대개 존재하는 지방산의 유형에 좌우되며, 및 고도 불포화 지방산을 함유한 지질은 생물 활성이 가장 좋다. 일반적으로, 이러한 고도 불포화 지방산은 육상 식물과 동물의 복합 지질에서 유의적인 양으로만 발견되나, 수중 동물의 중성 및 복합 지질 둘 모두에서도 나타날 수도 있다.
인지질은 복합 지질의 서브세트이다. 이들은 모든 포유동물 세포막의 필수 성분이며, 세포막의 유동성, 및 막을 통한 분자의 소통을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 고도 불포화 아라키돈산(C20:4 w-6)은 동물로부터 유래된 2차 산물, 에컨대, 인간이 아닌 동물의 젓으로부터의 인지질에 매우 낮은 농도로 존재하거나 존재하지 아니한다. 아라키돈산은 유아의 성장에 매우 중요하며, 그래서 인간이 아닌 동물의 젓으로 제조된 이유식은 이러한 지방산으로 보충된다. 따라서, 이러한 목적을 위해 이 지방산의 공급원을 확보하기 위한 요구가 존재한다. 수많은 동물 조직, 특히 기관 및 분비기관(glands)의 복합 지질은, 알(eggs)이므로, 아라키돈산이 풍부하다.
또한 이끼(Mosses)와 양치류(ferns)는 복합 지질 형태로 높은 수준의 아라키돈산을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 그러므로 이러한 고도 불포화 지방산(HUFA)을 복합 지질 형태로 회수할 수 있는 추출 기술을 발견하는 것이 요망되는데, 이는 특히, 상기 복합 지질 형태의 지방산은 산화에 대한 보호를 제공하기 때문에 그러하다.
해양 개체(거대 조류 및 미세 조류(algae), 생선살(fish flesh), 알 및 간, 연체동물(molluscs), 무척추동물)는 중성 및/또는 복합 지질 형태의 HUFA 에이코사펜타에노산(C20:5 w-3) 및 도코사헥사에노산(C20:6 w-3)의 풍부한 공급원이다. 이러한 지방산들은 또한 이유식 보충을 위해 필요하며 신경학적 장애, 심혈관 질환, 염증, 및 혈액내 지질 함량을 조절하기 위한 용도로 요구된다. 또한 이러한 다중불포화(polyunsaturated) 지방산을 회수할 수 있는 추출 기술을 발견하는 것이 요 망될 수 있다.
유사하게, 특정 식물로부터의 씨앗, 특히 소나무(pinus trees; podocarp trees)로부터의 씨앗은 비-메틸렌 간섭 다중 불포화 지방산(non-methylene interrupted polynusaturated fatty acids)(C20:3 및 C20:4)이 풍부한 복합 지질을 함유한다. 비-메틸렌 간섭 지방산은 포만 조절을 위해 사용되며 유력한 항염증제로서 사용된다. 그러므로 이러한 다중불포화 지방산을 회수할 수 있는 추출 기술을 발견할 필요성이 존재한다.
초임계(Supercritical) CO2를 사용한 중성 지질의 추출은 널리 공지되어 있는데, 특히 씨앗 오일의 추출에서 그러하다. 일반적으로 이러한 공정들의 단점은 거대한 고압력 용기(전형적으로 300바(bar) 이상의 압력이 사용됨)가 원료 물질을 담기위해 요구되며, 이는 생산 플랜트가 매우 비싸지게 한다. 높은 유량(flow rate) 및 긴 추출 시간이 또한 요구되는데, 이는 오일이 초임계(supercritical) CO2 내에서 매우 낮은 용해도를 갖기 때문이다(전형적으로 100g의 용매 당 1g의 오일). 해양종들로부터의 지질의 추출과 관련된 공개문헌은 드물다. US 6,083,536호는 염증성 질환의 치료에 유용한 무극성 지질 추출을 얻기 위하여 미정제 동결-건조 홍합(mussel) 분말로부터의 무극성 지질의 추출 공정을 기술하고 있다. 신선한 홍합은 동결-건조 및 CO2 추출에 앞서 타르타르산으로 안정화된다. 추출물의 조성 데이터가 미제시되어 있고, 이들은 CO2에 불용성이므로, 복합 지질이 추출되지 아니한다.
US 4,367,178호는 중성 지질을 추출하고 불용성 인지질을 잔류시키기 위해 초임계 CO2를 사용함으로써 미정제 대두(soy) 레시틴을 정제하고. 그에 따라 상기 레시틴 중의 인지질을 농축하기 위한 공정을 기술하고 있다. 미정제 레시틴은 대두 오일의 관용적인 탈고무화(degumming)에 의해 생산되어 왔다. 초임계 CO2의 용해력(solvent power)을 증가시키기 위해 에탄올과 같은 공용매의 사용이 CO2의 한계점을 극복하기 위해 제안되어 왔다.
EP 1,004,245 A2호는 건조된 알이 중성 지질을 제거하기 위해 제일 먼저 초임계 CO2로 추출되고, 그런 다음 초임계 CO2 및 실온에서 액체인 유기 공-용매로 추출되거나, 인지질을 추출하기 위한 유기 용매(CO2 없이)로 추출되는 공정을 기술하고 있다. 두가지 옵션 모두는 불완전 인지질 추출의 단점을 갖는다. 또한 상기 두 옵션은 탈지된(defatted) 알 분말 중에 용매 잔류물을 남겨두게 되고, 이는 결국 단백질의 변성을 가져 온다. 초임계 CO2 추출로 획득된 중성 알 지질은, 실시예 3에 제시된 바와 같이, 무시할만한 수준의 고도 불포화 지방산을 지닌다.
앙트필드 등[Arntfield et al. (JAOCS, 69, 1992, 823 -825)]은 알 단백질이 공-용매로서 CO2 및 메탄올을 이용한 추출 후 실질적으로 변성된다는 것을 보여준다. 초임계 CO2와 함께 에탄올의 사용은 인지질의 불완전한 추출을 초래한다. 포스파티딜 콜린은 가장 용이하게 추출되는 인지질이나, 다른 모든 인지질은 용해도가 매우 낮거나 불용성이며 추출되지 아니한다(Teberliker et al., JAOCS, 78, 2002, 115-119). 슈리에너 등[Schriener et al., Journal of Food Lipids, 13, 2006, 36-56)은 알의 난황(yolk) 지질내 대부분의 고도 불포화 지방산이 포스파티딜 에탄올아민으로 존재하며, 이것은 이 공정으로 추출되지 아니한다는 것을 보여준다.
PCT 국제공개공보 WO 02/092540호는 HUFA를 함유하는 극성 지질 및 다른 오일과 극성 지질의 혼합물의 의학적 용도를 개시하고 있다. 추출 방법은 알코올 및 원심분리를 사용하는 것으로 개시되어 있으나, 더 상세한 사항은 제시되어 있지 않다. 상기 공보는 또한 극성 지질-풍부 분획이 탈고무화의 산업적 공정에 의해 식용 씨앗 오일 추출의 부산물로 획득될 수 있음을 개시하고 있다.
젖은(wet) 인지질-함유 물질로부터의 HUFA를 함유하는 인지질의 추출에 관한 공정이 PCT 국제공개공보 WO 2005/072477호에 기술되어 있다. 지방족 알코올, 및 특히, 이소프로판올 및/또는 n-프로판올이 사용된다. 인지질을 함유하는 물질은 상기 인지질이 용매 중에 용해되기에 충분히 높은 온도에서 수용성 지방족 알코올과 접촉되며, 한편, 변성된 단백질은 용액으로부터 침전된다.
DME는 이전에 생난(raw egg) 난황(US 4,157,404호) 및 건조된 알 분말(US 4,234,619호)으로부터의 지질의 추출에 사용되어 왔다. 상기 공정은 지질 및 단백질 성분들의 별개 스트림(streams)으로의 분별(fractionation)을 초래한다. US 4,157,404호는 생난 난황(50-55% 수분 함량)으로부터의 지질 추출을 기술하고 있으나, 이 공정에서 단백질이 변성된다. 기술된 공정은 또한 회수된 지질 및 수분 혼합물이 이후 20% 이하의 수분 함량으로 탈수될 필요가 있는데, 이것은 이후 중성-지질 풍부 및 복합 지질/물-풍부 상의 상 분리를 가져온다. US 4,234,619호는 알이 건조한 경우 단백질이 변성되지 아니하나, 인지질은 단지 부분적으로 추출될 수 있음을 개시하고 있다. 기술된 공정에서, DME는 -30℃ 내지 4O℃의 온도 범위에서 사용되었으며, 분무 건조된 전체 알 분말이 사용되었고, 인지질은 단지 최대 70% 수율로 획득되었다. 해당 발명의 요망되는 생성물은 이의 본래 인지질 함량의 30% 이상을 함유하고 콜레스테롤을 함유하지 않는 알 분말이었다. 고도 불포화 지방산의 회수 및 농축 공정은 개시된바 없다. 더욱이, 전체 지질 추출물 중의 중성 지질 및 복합 지질의 별개 분획으로의 분리는, 사용된 낮은 추출 및 분리 온도로 인해 확인되지 아니하였다.
PCT 국제공개공보 WO 2004/066744호는 근임계 추출을 이용한 수용성 유제품 스트림으로부터 지질의 추출에 대해 기술하고 있으며, 여기서 DME는 용매이다. 상기 공보는 또한 초임계 CO2와 액체 DME가 건조 유장(whey) 단백질 농축물(WPC) 유제품 분말로부터 유용한 수율로 지질을 추출할 수 없음을 개시하고 있다. 상기 공정은 건조 동물 또는 식물 조직으로부터의 HUFA 극성 지질을 추출하기 위한 방법을 개시하고 있지 아니하다. 유장 단백질은 동물 또는 식물 조적에서 발견되지 아니하며, 획득된 지질은 고도 불포화 지방산을 함유하지 아니한다.
NZ 535894호는 유 지방 구상 막 단백질을 함유하는 분무 건조 유제품으로부터의 지질 추출을 기술하고 있는데, 상기 유제품은 탈지 분유의 생산에서 나오는 밀크 리포단백질/지질/락토오스 혼합물이다. 단백질은 밀크의 크림 분획과 연관되어 있고, 동물 또는 식물 조직내에서 발견되지 아니한다. 액체 DME를 사용한 추출에 의하여 높은 락토오스 함량(여기서 높은 락토오스 함량은 전체 분말의 질량에 대하여 30% 이상을 의미함)을 지니는 이 유제품 분말 스트림으로부터 지질을 추출하기 위한 시도는 성공적이지 아니하였며, 분말의 생산에 앞서 락토오스 함량을 감소시킬 필요가 있었다. 상기 문헌은 건조된 동물 또는 식물 조직으로부터 HUFA 지질을 추출하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있지 아니한데, 이는 상기 지질이 HUFA를 함유하지 않기 때문이다. 추출 후 잔여 분말은 여전히 약 6-8%의 복합 지질을 함유한다.
PCT 국제공개공보 WO 2006/058382호는 액체 DME를 사용하여 소정 범위의 물질로부터 추출물을 획득하기 위한 공정을 기술하고 있다. 그러나, 상기 공보에는 HUFA의 추출과, 중성 지질로부터의 복합 지질의 분리에 대하여 기술하고 있지 아니하다. 기술된 공정은 액체 DME를 사용한 단순한 통상적 공정이다. 실제로, 상세하게 기술된 유일한 공정은 HUFA를 함유하지 아니한 호호바(Jojoba) 씨앗으로부터 추출물을 획득하기 위해 액체 DME를 사용한 공정이다.
동물 및 식물 물질로부터 유래된 생성물에 존재하는 단백질 및 다른 복합 탄수화물의 유형(및 상기 물질이 건조되는 방법)이 지질이 성공적으로 추출될 수 있는지 여부를 결정한다는 것은 명백하다. 식물 또는 동물 조직내에 존재하는 단백질 및 복합 탄수화물은 동물로부터 유래된 2차 생성물, 예컨대, 밀크에서 발견되는 것들과 상당히 다르다. 그러므로 지질, 및 특히 고도 불포화 지방산을 함유하는 복합 지질이 디메틸 에테르를 사용하여 세포 및 조직과 연관된 단백질 및 탄수화물을 함유한 식물 또는 동물 조직으로부터 추출될 수 있는지 여부를 임의의 확실성을 가지고 예상하는 것은 일반적으로 불가능하다.
놀랍게도, 출원인은 액체 DME가 식물 또는 동물 물질로부터 HUFA를 획득하기 위한 효율적인 추출용 용제로 사용될 수 있다는 것과, 특히 중성 및 복합 지질로 구성된 지질 추출물 중의 잔류 DME가 복합 지질을 함유한 고무-유사(gum-like) 상의 형성을 가능하게 하며, 상기 복합 지질은 상기 중성 지질로부터 용이하게 분리된다는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 고도 불포화 지방산을 함유한 지질을 획득하기 위한 공정을 제공하거나, 적어도 다른 공정들의 유용한 대안책을 제공하는 것이다.
발명에 대한 진술
제 1 양상에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 식물 또는 동물 물질로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 획득하기 위한 공정을 제공한다:
(i) 지질을 함유한 디메틸 에테르 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔여물을 얻기 위해 상기 물질과 액체 디메틸 에테르를 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 식물 또는 동물 물질의 잔여물로부터 상기 용액을 분리시키는 단계; 및
(iii) 상기 용액으로부터 지질을 회수하는 단계.
본 발명의 바람직한 특정 구체예들에서, 단계 (i)에서 상기 물질과 접촉된 후 형성된 상기 용액은 중성 지질 및 복합 지질을 함유한다.
바람직하게는, 상기 중성 지질은 상기 복합 지질과 함께 상기 용액으로부터 회수된다. 그런 다음 상기 중성 지질은 상기 복합 지질로부터 분리되는 것이 바람 직하다.
상기 복합 지질은 상기 회수 단계 (iii) 동안 용해된 디메틸 에테르와 고무 상(gum phase)을 형성할 수 있다. 바람직하게는, 복합 지질을 함유한 고무 상은 중성 지질을 함유한 용액으로부터 분리된다.
바람직하게는, 상기 중성 지질은 상 분리에 의해 상기 복합 지질로부터 분리된다. 원심분리가 상기 분리를 보조하기 위해 사용될 수도 있다. 가열이 원심분리에 앞서 사용될 수 있다. 그런 다음, 상기 복합 지질은 진공 건조에 의해 건조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 공정은 또한 단계 (iii)의 상기 용액으로부터 회수된 상기 지질을 하기 단계들에 따라 초임계 CO2로 처리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다:
(iv) 중성 지질을 함유하는 CO2 용액 및 복합 지질의 잔여물을 수득하기 위해 단계 (iii)의 상기 용액으로부터 회수된 상기 지질을 초임계 CO2와 접촉시키는 단계;
(v) 상기 복합 지질의 잔여물로부터 상기 중성 지질을 함유하는 CO2 용액을 분리시키는 단계; 및
(vi) 상기 CO2 용액으로부터 상기 중성 지질을 회수하는 단계.
본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 단계 (i)에서 액체 디메틸 에테르와 접 촉되는 상기 식물 또는 동물 물질이 하기 단계들에 따라서 근임계 CO2로 제일 먼저 처리된다:
a. 중성 지질을 함유한 CO2 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔여물을 얻기 위해 상기 물질과 근임계 CO2를 접촉시키는 단계;
b. 상기 식물 또는 동물 물질의 잔여물로부터 상기 CO2 용액을 분리시키는 단계; 및
c. 상기 CO2 용액으로부터 지질을 회수하는 단계.
본 발명의 바람직한 공정에서, 상기 식물 또는 동물 물질은 사용전에 건조되거나 부분적으로 건조된다. 바람직하게는 상기 식물 또는 동물 물질은 상기 물질내의 물의 중량이 30 중량% 미만이 되도록, 더 바람직하게는 상기 물질 내의 물의 중량이 5 중량% 이상이 되도록 건조된다. 바람직하게는, 상기 식물 또는 동물 물질은 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 건조된다.
본 발명의 특정 구체예들에서, 상기 식물 또는 동물 물질은 냉동된(frozen) 젖은 바이오매스(biomass)이다. 전형적으로, 냉동된 젖은 바이오매스는 추출에 앞서 마쇄된다.
바람직하게는, 상기 복합 지질 중 하나 이상은 인지질, 강글리오시드(ganglioside), 당지질, 세레브로시드(cerebroside), 또는 스핑고지질이고, 전형적으로는 인지질이다. 상기 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 스핑고미엘린, 카디오리핀, 플라즈마로겐(plasmlogens), 알킬아실인지질, 포스포노리피드(phosphonolipids), 리소인지질, 세라미드 아미노에틸포스포네이트 및 포스파티드산 중의 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 당지질은 갈락토리피드, 강글리오시드, 설포퀴노보이슬디아실글리세리드(sulphoquinovoysldiacylglycerides), 타우로당지질, 글리코스핑고인지질, 및 만노실 지질을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 복합 지질에 함유된 고도 불포화 지방산은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 아라키돈산(AA), 알파- 및 감마-리놀레산, 피놀레산, 스시아돈산(sciadonic acid), 콜룸빈산(columbinic acid), 디호모리놀레산, 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid), 주니페론산(juniperonic acid), 스테아리돈산, 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA), 및 도코사헥사에노산(DHA) 중의 어느 하나 이상을 포함한다.
상기 식물 또는 동물 물질은 동물 기관, 동물 분비기관(glands), 거대 해조 및 미세 해조, 발효로 배양되는 지질-함유 미생물, 특히, 곰팡이, 조류, 효모 및 박테리아; 패류, 어류, 해양 무척추동물, 알, 식물 씨앗, 식물 잎, 식물 바늘잎(needles), 양치류 엽상체(fern fronds), 이끼 및 지의(lichen)로 구성된 군 중의 어느 하나로부터 수득되는 것이 또한 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예들에서, 상기 액체 디메틸 에테르는 근임계 디메틸 에테르이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 공정에 의해 획득된 고도 불포화 지 방산을 함유하는 지질을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 공정에 의해 획득된 복합 지질을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 공정에 의해 획득된 중성 지질을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 공정에 의해 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질이 추출되는, 식물 또는 동물 물질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 공정에 의해 고도 불포화 지방산을 함유하는 복합 지질이 추출되는, 식물 또는 동물 물질의 기능 식품, 식품 보충제, 또는 효소 공급원으로서의 용도를 제공한다.
상세한 설명
정의
지방산은 전형적으로 6개 이상의 탄소 원자들의 탄화수소 사슬을 지니는 임의의 포화 또는 불포화 지방족 카르복시산을 의미한다. 지방산은 탄소 원자의 수(예를 들어, C20), 불포화 부위의 수(예를 들어, C20:4), 지방산의 메틸 말단으로부터의 첫번째 불포화 부위의 위치(예를 들어, C20:4 w-3), 및 불포화 부위를 얼마나 많은 탄소들이 분리(separation)시키는지에 따라 분류된다. 일반적으로 1개의 탄소가 불포화 부위를 분리시키고("메틸렌 간섭형(methylene interrupted)"으로 공지됨), 컨주게이션된 경우(불포화 부위를 분리시키는 탄소가 없음)에만 축약된 명칭으로 표기되거나, 1개 이상의 탄소에 의해 분리되며("비-메틸렌 간섭형"으로 공지됨) 지방산의 메틸 말단으로부터의 탄소의 위치들이 표기된다(예를 들어, 5, 11, 14 C20:3). 지방산은 중성 지질 및 복합 지질 둘 모두의 구성 성분이다. 중성 지질에서, 지방산들은 에스터 또는 에테르 결합을 통해서만 글리세롤에 결합된다. 지방산들은 또한 비결합된 상태로 존재할 수 있으며, 그에 따라 "유리 지방산"으로 지칭된다. 복합 지질에서, 지방산 및 기타 (극성) 구성 성분들이 글리세롤에 부착된다.
다중불포화 지방산(PUFA)는 2개 이상의 불포화 부위를 지니는 지방산을 의미한다.
고도 불포화 지방산(HUFA)은 지방산 사슬내에 3개 이상의 불포화 부위, 및 18개 이상의 탄소 원자를 지니는 지방산을 의미한다. 일예는 아라키돈산(AA), 알파- (ALA) 및 감마-리놀레산(GLA), 피놀레산, 스시아돈산, 콜룸빈산, 디호모리놀레산, 디호모피놀레산, 주니페론산, 스테아리돈산, 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA), 및 도코사헥사에노산(DHA)을 포함한다.
복합 지질은 지방산 (및 밀접하게 관련된 에테르, 아민 및 탄화수소 유도체); 극성 인기(phosphorous group)(일반적으로 포스페이트 에스테르 또는 인산), 및/또는 아미노 알코올, 및/또는 탄수화물; 및 글리세롤을 포함하는, 3개 이상의 빌딩 블록(building blocks)으로 이루어진 지질이다. 복합 지질은 이로만 국한되는 것은 아니지만, 인지질, 강글리오시드, 당지질, 세레브로시드, 및 스핑고리피드를 포함한다. 인지질의 예는 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 세린(PS), 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 이노시톨(PI), 스핑고미엘린(SM), 카디오리핀(CL), 플라즈마로겐, 리소인지질, 및 포스파티드산을 포함한다.
중성 지질은 극성 인기 또는 탄수화물을 함유하지 아니한, 1 또는 2개의 빌딩 블록으로 이루어진 지질이다. 상기 빌딩 블록은 지방산, 글리세롤, 스테롤, 지방 알코올, 아민, 카로테노이드 및 천연적으로 생성되는 탄화수소를 포함한다. 중성 지질은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 지방산, 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드, 세라미드, N-아실에탄올아민, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드 및 카로테노이드 에스테르를 포함한다.
DME-수화(hydrated) 복합 지질은 DME와 약한 결합을 형성한 복합지질을 의미하는데, 물 분자로 수화된 지질과 유사체이다.
임계점은 물질의 액체 및 증기 상태가 합치되는 지점을 의미한다.
초임계는 물질의 임계점 이상의 압력-온도 영역을 의미한다. 물질의 임계점 이상이지만, 이에 근접한 지점에서, 물질은 액체 및 기체 둘 모두의 특성을 지니는 유체 상태로 존재한다. 상기 유체는 액체에 유사한 밀도, 및 기체에 유사한 점도 및 열확산성을 지닌다.
미임계(Subcritical)는 물질에 대한 증기압과 동일 또는 그 이상이지만, 임계 온도 미만의 압력-온도 영역을 의미한다. 용어 "액화가스(liquefied gas)" 및 "응축된 액화가스"는 상기 동일 영역을 기술하기 위해 사용될 수 있는데, 여기서 기체의 증기압은 추출 온도에서 3 바(bar) 이상이다.
근임계(Near-critical)는 물질의 임계점에 근접한 압력-온도 영역을 의미하며, 그에 따라 미임계 및 초임계 둘 모두를 포함한다. 근임계는 감소된 온도 범위 0.70 ≤ Tr ≤ 1.25을 포함하며(여기서 Tr은 임계 온도, DME의 Tc로 나뉘어진 온도이다); 압력은 T < TC인 경우 P > Pv(여기서 Pv는 증기압임)이고, T ≥ TC인 경우 P > PC(여기서 PC는 임계압임)인 범위에 있다.
기능식품(Nutraceutical)은 식품으로부터 분리 또는 정제되고, 일반적으로 식품과 대개 비연관된 의학적 형태로 판매되며, 생리학적 이점을 지니거나 만성 질환에 대한 예방을 제공하는 것으로 입증된 생산물을 의미한다.
발명
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 식물 또는 동물 물질로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 획득하기 위한 공정을 제공한다:
(i) 지질을 함유한 디메틸 에테르 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔여물을 얻기 위해 상기 물질과 액체 디메틸 에테르를 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 식물 또는 동물 물질의 잔여물로부터 상기 용액을 분리시키는 단계; 및
(iii) 상기 용액으로부터 지질을 회수하는 단계.
상기 식물 또는 동물 물질은 HUFA를 지니는 지질을 함유한 임의의 동물 조직 또는 식물 조직일 수 있다. 특히, 상기 공정은 동물 기관 및 분비기관, 해양 거대조류 및 미세조류, 발효로 배양되는 지질-함유 미생물, 특히 곰팡이, 조류, 효모 및 박테리아; 소형 해양 동물(패류 및 무척추동물), 알, 및 식물의 씨앗과 관련이 있다. 상기 식물 또는 동물 조직은 세포성 물질, 단백질, 지질 및 탄수화물을 포함하나, 식물 또는 동물로부터 유래된 2차 생성물, 예컨대 밀크를 포함하지 아니하는, 식물 또는 동물 물질의 일부분 또는 전체를 포함할 수 있다.
DME는 정상 실온 및 압력에서 기체이나, 액체 형태에서는 천연 생성물로부터 물질의 추출을 위한 효과적인 용매가 되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 공정에 사용되는 상기 액체 DME는 전형적으로 근임계 DME이다. 바람직하게는, 액체 DME의 압력은 추출 온도에서 증기압과 적어도 동일하며, 더 바람직하게는 증기압보다 10바 이상 높다. 온도는 바람직하게는 273-373K의 범위내에 있고, 더 바람직하게는 313-353K의 범위 이내에 있다. 더 높은 추출 온도는 고도 불포화 지방산이 농축된 복합 지질이 더 높은 수율로 얻어 지게 한다. 전형적인 추출 온도는 대략 333K이다. 이 온도에서 전형적인 추출 압력은 40바인데, 이는 DME의 증기압 보다 충분히 높아서, 바이오매스가 젖어 있는 경우, 물의 최대 추출을 보장한다.
본 공정에 의해 획득된 지질은 일반적으로 소정 범위의 결합된 HUFA을 지니는 복합 지질의 혼합물이다. 혼합물의 조성은 사용된 식물 또는 동물 물질의 공급원에 주로 좌우될 것이다. 식물 또는 동물 물질이 또한 중성 지질을 함유하는 경우, 그때에는 상기 중성 지질도 본 공정에서 추출될 수도 있을 것이다.
본 출원인은 중성 및 복합 지질로 이루어진 지질 추출물 중의 잔여(residual) DME가 복합 지질을 함유하는 고무-유사 상 및 중성 지질을 함유하는 액체상의 형성을 가져온다는 것을 발견했는데, 단 상기 중성 지질이 유리 지방산 및/또는 부분 글리세리드를 고 농도(5 질량% 이상)로 함유하지 아니함을 조건으로 한다. 상기 고무 상은 중성 지질을 함유한 액체상 보다 더 높은 밀도의 반-고체 액체이다. DME는 물과 인지질 사이에 형성된 것과 유사하게 복합 지질(특히, 인지질)과 약한 결합을 형성할 수 있다고 가정된다. 고무-유사 상의 소위 DME-수화 복합 지질은 상기 중성 지질로부터 용이히게 분리될 수 있다.
추출물의 회수가 진행되는 동안 열의 사용, 지질 혼합물에서 중성 지질 대 복합 지질의 비율, 및 상기 중성 지질의 조성은 DME-수화 복합 지질의 형성을 촉진하기 위한 중요한 인자들이다. 총 지질 혼합물이 높은 수준의 유리 지방산 및/또는 부분 글리세리드 없이 약 50-90%의 중성 지질을 함유하고, 지질 혼합물이 실온에서 액체이면, 추출물의 회수 공정, 및 압력 손실 및/또는 가열에 의한 상기 추출물로부터의 DME의 연이은 탈기(degassing)는 복합체의 형성을 초래할 수 있다. 고무-유사 상 및 액체상의 분리는 가열 및/또는 원심분리의 이용으로 가속화된다. 따라서 획득된 DME-수화 복합 지질 상은 여전히 일부 중성 지질을 함유하나, 상기 중성 지질 상은 복합 지질이 결여되어 있다. 이러한 발견은 특히 알 지질, 및 어류 두부(head) 지질에 적용될 수 있다.
액체 DME는 젖은 바이오매스 또는 마른 바이오매스 둘 모두로부터 중성 및 복합 지질 둘 모두의 추출에 사용될 수 있는데, DME로부터의 분리후 혼합 추출물이 생성된다. 바이오매스가 젖어 있는 경우, 물이 또한 추출될 것이고, 관용적인 수단, 예컨대 진공하의 증발, 막 분리, 또는 상 분리, 특히 원심분리에 의해 상기 지질로부터 분리된다. 이후 상기 중성 지질을 분리 및 회수하기 위한 근임계 이산화탄소를 사용한 상기 혼합 추출물의 추가 추출에 대한 옵션이 존재하는데, 이는 HUFA를 함유한 복합 지질로 더 농축된 추출물이 수득되게 한다. 상기 복합 지질은 수화되어 있지 아니하며 물 또는 DME를 제거하기 위한 추가 가공을 요하지 아니한다.
식물 또는 동물 물질은 액체 DME로 추출하기 이전에 중성 지질을 제거하기 위해 근임계 이산화탄소로 추출될 수 있다. 이러한 가공 단계의 순서는 복합 지질이 풍부한 추출물이 획득될 수 있게 한다.
바람직하게는 근임계 이산화탄소 압력은 73.2바 이상이며, 온도 범위는 304.2 내지 373K(초임계 영역)이거나; 이산화탄소 압력은 증기압과 동일하거나 이를 초과하며, 온도 범위는 273 내지 304.1K(미임계 영역)이다. 더 바람직하게는, 이산화탄소 압력은 250바 이상이며, 온도 범위는 313 내지 353K이다.
본 발명의 특정 구체예의 핵심 요소는 액체 DME로의 추출 이전에 상기 식물 또는 동물 물질의 건조 또는 부분 건조이다. 식물 및 동물 물질은 전형적으로 총 물질의 60-80 중량%의 수분 함량을 지닌다. 추출에 앞서 상기 물의 일부 또는 전부의 제거는, 고정 부피의 물질의 경우, 물의 양이 감소되기 때문에 지질의 수율은 더 커지게 되는 실제적인 이점을 갖는다. 그러므로, 거대 부피 가공 장치에 대한 필요의 감소, 또는 고정된 부피 가공 식물에 대한 더 많아진 재료처리량(throughput) 및 지질 수율이 존재한다. 그러나, 본 공정은 또한 젖은 바이오매스에 적용될 수 있는데, 이는 건조 비용 예방, 및 지질을 분해시키거나 이들의 추출을 막는 건조된 바이오매스 매트릭스 내부에서 이들의 캡슐화를 초래할 수 있는 효소의 불활성화에 유리할 수 있다.
본 출원인은 또한 중요하게도 식물 또는 동물 물질을 건조시켜야 되지만, 물을 함께 제거하지 않는 것이 유리하다는 것을 발견하였다. 추출되는 물질의 물 함량이 총 물질의 30 중량% 수준 미만으로 감소되는 경우, 본 발명의 공정은 상기 물질내에 존재하는 효소 및 기타 단백질의 상당한 분해 또는 변성없이 수행될 수 있다. 그러므로, 추출후 식물 또는 동물 물질의 잔여물은 다양한 응용, 예컨대 단백질은 풍부하고 지방은 감소된, 영양 보충제(nutritional supplements), 예를 들어, 탈지된 소간(bovine liver)과 같은 보디 빌딩 제품; 프로테아제, 리파아제, 트랜스글루타미나아제와 같은 효소 공급원으로서 특히 유용할 수 있다. 효소의 분해는 잔여물의 유용성을 제한할 수 있다.
복합 지질은 이들의 극성에 있어서 아주 다양하며, 그래서 식물 또는 동물 조직내에 존재하는 대부분의 인지질이 추출될 수 있는 용매 또는 용매 혼합물을 찾아내는 것은 어렵다. 추출 공정 동안 잔여 단백질 및/또는 복합 비-지질 분자를 변성시키지 아니하는 용매 시스템을 발견하기는 훨씬 더 어렵기 때문에, 그래서 탈지된 잔여 물질은 효소와 같은 비-지질 성분들을 추출하기 위해, 또는 상기 탈지된 잔여 물질을 기능 식품으로 사용하기 위해 이용될 수 있다. 놀랍게도, 본 출원인은 40℃ 이상의 온도에서 사용된 액체 DME가, 추출에 앞서 물질을 건조시킨 경우, 잔여 탈지 물질의 변성없이, 모든 복합 및 중성 지질을 높은 수율로 얻도록 하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
일반적인 절차
하기 4가지 비제한적인 일반적인 절차는 본 발명의 공정이 어떻게 진행될 수 있는지를 제시한다.
1. DME 추출
a. 물 함량이 30% 이하가 되도록 식물 또는 동물 조직을 건조시킨다. 물 함량은 필요한 경우 DME가 물을 함유하고 있음을 보장하기 위해 선택된다.
b. 입자 크기가 2㎜ 이하가 되도록 식물 물질을 잘게 부순다.
c. 특정 조건에서 액체 DME와 식물 또는 동물 물질을 접촉시킨다.
d. 식물 또는 동물 물질로부터 적재된(laden) DME를 분리시킨다.
e. DME로부터 HUFA-풍부 지질 추출물을 회수한다.
지질 추출물이 또한 중성 지질을 함유하는 경우, 다음 추가 단계들이 수행될 수 있다:
f. 상 분리에 의해 중성 지질로부터 DME-수화 복합 지질을 분리시킨다.
g. 상기 수화 복합 지질로부터 DME를 제거한다.
선택적으로, 효소를 획득하기 위해, 잔여 탈지 동물 물질은 추가로 수용액으로 추출될 수 있다.
2. DME 추출에 뒤이은 CO2 추출
a. 물 함량이 10% 이하가 되도록 식물 또는 동물 조직을 건조시킨다.
b. 입자 크기가 2㎜ 이하가 되도록 식물 물질을 잘게 부순다.
c. 특정 조건에서 액체 DME와 식물 또는 동물 물질을 접촉시킨다.
d. 식물 또는 동물 물질로부터 적재된 DME를 분리시킨다.
e. DME로부터 HUFA-풍부 복합 및 중성 지질 추출물을 회수한다.
f. 상기 HUFA-풍부 복합 지질 추출물과 초임계 CO2를 접촉시킨다.
g. 초임계 CO2 및 용해된 중성 지질로부터 중성-지질 제거된(depleted) HUFA-풍부 복합 지질을 분리 및 회수한다.
h. CO2로부터 상기 중성 지질을 회수한다.
3. CO2 추출후 뒤이어 DME 추출
a. 물 함량이 10% 이하가 되도록 식물 또는 동물 조직을 건조시킨다.
b. 입자 크기가 2㎜ 이하가 되도록 식물 물질을 잘게 부순다.
c. 특정 조건에서 초임계 CO2와 식물 또는 동물 물질을 접촉시킨다.
d. 중성 지질 제거된 식물 또는 동물 물질로부터 초임계 CO2를 분리시킨다.
e. CO2로부터 상기 중성 지질을 회수한다.
f. 특정 조건에서 식물 또는 동물 물질과 액체 DME를 접촉시킨다.
g. 식물 또는 동물 물질로부터 적재된 DME를 분리시킨다.
h. DME로부터 HUFA-풍부 복합 지질 추출물을 회수한다.
4. 젖은 바이오매스의 DME 추출
a. 필요한 경우 바이오매스를 동결시킨다.
b. 필요한 경우, 동결된 식물 또는 동물 물질을 5 mm 이하의 입자 크기로 잘게 부순다.
c. 특정 조건에서 식물 또는 동물 물질과 액체 DME를 접촉시킨다.
d. 식물 또는 동물 물질로부터 적재된 DME를 분리시킨다.
e. DME로부터 HUFA-풍부 지질 추출물 및 물을 회수한다.
f. 지질로부터 물을 분리시킨다.
지질 추출물이 또한 중성 지질을 함유하는 경우, 다음 추가 단계들이 수행될 수 있다:
g. 특정 조건에서 HUFA-풍부 지질 물질과 초임계 CO2를 접촉시킨다.
h. 초임계 CO2 및 용해된 중성 지질로부터 중성-지질 제거된 HUFA-풍부 복합 지질을 분리 및 회수한다.
i. CO2로부터 상기 중성 지질을 회수한다.
상기 일반적인 절차에서, 단계 a로부터 결과적으로 얻어진 분무 건조된 분말, 예를 들어, 난황 분말이 사용되어 단계 b가 일반적인 절차 1 내지 3에서 불필요할 수 있다.
실시예 1: 건조된 소간(beef iiver)의 추출
대략 8kg의 신선한 전체 소간을 지방 육가공 공장으로부터 획득하였다. 상기 간에서 피부 지방 적층물, 연골 및 피부를 제거하고, 그런 다음 거대한 덩어리로 잘랐다. 상기 덩어리를 으깨진 고기 반죽이 나오게 하는, 고기다지는 기구에 넣었다. 7913.5g의 다져진 간을 이후 동결-건조 트레이에 놓았으며, 그런 다음, 상기 트레이를 고체물질이 완전히 냉동될 때까지 냉동기에 놓아 두었다. 그런 다음, 상기 트레이를 동결 건조기에 놓고, 수분 함량이 대략 2-5%가 될 때까지 건조시켰다. 고체물질은 31.9%의 수율로 얻어졌는데, 추출 전 마쇄(grinding)를 위한 물질 2526.7g이 획득되었다. 상기 트레이로부터의 고체물질을 구멍 크기가 ~ 1mm인 체판(sieve plate)을 지닌 나이프 밀(knife mill)로 잘게 부수었다. 미세하게 마쇄된 고체물질을 이후 40바, 313K에서 근임계 DME로 추출하였다. 29.316kg의 근임계 DME를 90분 동안 일정한 유량으로 고체물질(2472.6 g)에 연속적으로 통과시켰다. 고체물질을 통과한 후, DME는 연속적으로 압력 감소 밸브 및 열 교환기를 통과하여, DME가 기체로 전환되는 분리 용기로 들어갔다. 지질은 상기 기체로부터 침전되었으며 상기 분리 용기로부터 지질을 회수하였다. DME를 콘덴서/서브 쿨러 열 교환기 및 펌프를 통해 상기 추출 용기로부터 되돌려 재활용하였다. 363.69g의 지질을 13.96%의 수율로 획득하였다. 지질은 53%의 인지질을 함유하였는데, 상기 인지질 중 46.2%는 포스파티딜 콜린(PC)이었고, 10.2%는 포스파티딜 이노시톨(PI)이었으며, 2.3%는 포스파티딜 세린(PS)이었고, 16.6%는 포스파티딜 에탄올아민(PE)이었으며, 3.9%는 스핑고미엘린(SM)이었고, 6.6%는 카디오리핀(CL)이었으며, 8%는 확인불가능하였다. 전체 지질은 4.5%의 아라키돈산(AA), 7.4%의 도코사펜타에노산(DPA), 2.1%의 에이코사펜타에노산(EPA) 및 5.9%의 알파-리놀레산(AA)을 함유하였다. 탈지된 간은 스포츠 영양 보충제로서 사용될 수 있다.
실시예 2: 소 심장의 추출
대략 8kg의 신선한 전체 소 심장을 지방 육가공 공장으로부터 획득하였다. 상기 심장에서 피부 지방 적층물, 연골 및 피부를 제거하고, 그런 다음 거대한 덩어리로 잘랐다. 상기 덩어리를 고기다지는 기구에 넣었다. 다져진 심장을 이후 동결-건조 트레이에 놓았으며, 그런 다음, 상기 트레이를 고체물질이 완전히 냉동될 때까지 냉동기에 놓아 두었다. 그런 다음, 상기 트레이를 동결 건조기에 위치시키고, 수분 함량이 대략 2-5%가 될 때까지 건조시켰다. 고체물질은 22.7%의 수율로 얻어졌는데, 추출 전 마쇄를 위한 물질 1725.7g이 획득되었다. 상기 트레이로부터의 고체물질을 구멍 크기가 ~ 1mm인 체판을 지닌 나이프 밀로 잘게 부수었다. 미세하게 마쇄된 고체물질을 이후 40바, 313K에서 근임계 DME로 추출하였다. 29.52kg의 근임계 DME를 90분 동안 고체물질에 연속적으로 통과시켰다. 고체물질을 통과한 후, DME는 연속적으로 압력 감소 밸브 및 열 교환기를 통과하여, DME가 기체로 전환되는 분리 용기로 들어갔다. 지질은 상기 기체로부터 침전되었으며 상기 분리 용기로부터 지질이 회수되었다. DME를 콘덴서/서브 쿨러 열 교환기 및 펌프를 통해 상기 추출 용기로부터 되돌려 재활용하였다. 202.71g의 지질을 12.3%의 수율로 획득하였다. 지질은 30%의 인지질을 함유하였는데, 상기 인지질 중 28.3%는 포스파티딜 콜린(PC)이었고, 4.4%는 포스파티딜 이노시톨(PI)이었으며, 0%는 포스파티딜 세린(PS)이었고, 13.7%는 포스파티딜 에탄올아민(PE)이었으며, 6.6%는 스핑고미엘린(SM)이었고, 27.9%는 카디오리핀(CL)이었으며, 12.2%는 확인불가능하였다. 전체 지질은 5.6%의 아라키돈산(AA), 2.0%의 도코사펜타에노산(DPA), 2.8%의 에이코사펜타에노산(EPA) 및 5.9%의 알파-리놀레산(AA)을 함유하였다.
실시예 3: CO 2 에 뒤이은 DME를 이용한 분무 건조된 난황의 추출
본 실시예는 중성 지질이, HUFA가 풍부한 복합 지질 농축물을 획득하기 위하여 DME를 이용한 재-추출 이전에 고체 원료 물질로부터 제일 먼저 추출될 수 있음을 보여준다. 본 실시예는 또한 높은 추출 온도가 분무 건조 분말로부터 복합 지질을 높은 수율로 획득하기 위해 사용어야만 한다는 것을 보여준다. 10.67kg의 분무 건조된 난황 분말을 300바, 313K에서 초임계 CO2로 추출하였다. 530.34kg의 초임계 CO2를 고체물질에 연속적으로 통과시키고, 이후 순차적으로 2단계 감압과정을 거쳤는데, 압력은 오직 중성 지질(4.26kg, 40.0 질량%의 수율)을 함유하는 알 오일을 회수하기 위해 처음에 313K에서 90바로 감압되었고, 그런 다음 소수의 중성 지질 분획(0.26kg, 2.4 질량%의 수율)을 회수하기 위해 323K에서 58바로 감압되었다. 상기 중성 지질은 아라키돈산 및 도코사헥사에노산을 각각 1% 미만으로 함유하였다. 그런 다음 2.98kg의 중성-지질 제거된 난황 분말을 실시예 1 및 2에 따라서 293K에서, 60분 동안 40바로 16.24kg의 액체 DME로 추출하였다. 중성 지질이 결여된 283.4g의 복합 지질 추출물을 획득하였으며, 수율은 전체 지방 난황 분말 질량 기준으로 6.8 질량%에 달하였다. 분말을 상기와 마찬가지로 313K에서 50분 동안 13.1kg의 액체 DME로 재추출하였다. 중성 지질이 결여된 추가 191.3g의 복합 지질 추출물을 수득하였으며, 추가 수율은 전제 지방 난황 분말 질량 기준으로 4.6 질량%에 달하였다. 따라서 총 지질 수율은 53.8%이었다. 중성 지질이 결여된 복합 지질을 높은 수율로 획득하기 위해, 313K 이상의 온도에서 분말을 추출하는 것이 요구된다. 탈지된 난황 분말은 지방을 낮추기 위해 요구되는 베이킹(baking) 적용에 사용될 수 있다.
실시예 4: DME를 이용한 분무 건조 난황의 추출
본 실시예는 추출물 상에서 소량의 DME가 DME 추출후 복합 지질로부터 중성 지질을 분리시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 4.119kg의 분무 건조 난황 분말을 323K 및 40바에서 액체 DME로 추출하였다. 8.517kg의 근임계 DME를 고체물질에 연속적으로 통과시켰다. 고체물질을 통과한 후, DME는 연속적으로 감압 밸브 및 열 교환기를 거쳐, 상기 DME가 기체로 전환되는, 가열된 분리 용기를 통과하였다. 지질을 상기 기체로부터 침전시키고 가열된 밸브를 통해 분리 용기로부터 회수하였다. DME를 콘덴서/서브 쿨러 열 교환기 및 펌프를 거쳐 상기 추출 용기로 되돌려 재활용하였다. 분리 용기로부터 회수된 지질(2197.86g, 53.3%의 수율)을 잔여 DME의 대부분이 제거되도록 가열시켰고, 그런 다음 원심분리하여 상기지질을 중성 지질이 풍부한 상 및 DME-수화 복합 지질이 풍부한 상으로 분리시켰다. 총 지질의 75.3%를 이루는, 상기 중성 지질-풍부 상은 1 질량% 미만의 복합 지질을 함유하고 아라키돈산 또는 DHA를 함유하지 아니하였다. 총 지질의 24.7%를 이루는, 극성 지질 풍부 상은 95%를 초과하는 극성 지질을 함유하였다. 극성 지질은 5.89%의 아라키돈산 함량 및 2.46%의 DHA 함량을 지녔다.
실시예 5: 동결-건조된 난황의 추출
본 실시예는 난황 동결-건조가 추출을 위한 지질의 유용성을 개선시킨다는 것을 보여준다. 신선한 알을 지방 가게에서 구매하였고, 그런 다음 수작업으로 난황과 흰자를 분리시켰다. 상기 흰자는 폐기되었다. 난황을 실온에서 블렌딩하고, 그런 다음 둥근 바닥 진공 플라스크에 넣고, 냉동시키고 난 다음 동결-건조시켰다. 73.05g의 동결 건조된 난황을 이후 40바, 333K에서 598.1g의 액체 DME로 추출하였다. 2%의 아라키돈산과 1%의 DHA를 함유하는 47.01g의 노란색 액체 추출물을 64 질량%의 수율로 획득하였는데, 이는 난황 분말에 대한 이론적 총 지질 수율과 동일한 수율이다. 잔여 난황 분말 및 비-추출된 동결-건조 난황 분말 수 용해도를 분무 건조 난황 분말(탈지되고 비-추출됨)과 비교하였다. 신선하고 추출된 분무 건조 난황 분말은 물에 용해되지 아니하였는데, 이는 분무 건조 공정이 변성을 초래한다는 것을 제시한다. 동결-건조된 단백질(추출 이전 및 이후)은 물에서 22%의 용해도를 지녔으며, 한편 신선한 난황 단백질은 58%가 용해되었다. 추출된 단백질은 저 지방 영양 보충제로서 사용될 수 있다.
실시예 6: DME와 CO 2 를 사용한 동결 건조된 홍합 분말의 추출
본 실시예는 탈지된 홍합 고체물질에서의 효소 활성이 지질의 추출 후에 유지된다는 것을 보여준다. 냉동된 녹색입(green-lipped) 홍합 슬러리를 부분적으로 해동시키고 디쥬싱(dejuicing) 장치를 통과시켜, 거대한 덩어리(고체물질)로부터 미세 고체물질 및 액체(슬러리 쥬스)를 분리시켰다. 슬러리의 일부를 실시예 12에 기술된 바와 같은 가공을 위해 따로 떼어 놓았다. 잔여 슬러리 쥬스 및 고체물질을 별개로 동결-건조시켰고, 그런 다음 제일 먼저 DME로 추출하였다. 그 결과 얻어진 미정제 추출물을 이후 초임계 CO2로 재추출하였다. 대조 DME 추출을 또한 직접적으로 냉동된 다음 동결-건조시킨 슬러리에 대해 실시하였다(표 1에 전체 분말). 일부 효소 활성을 초래한, 마쇄 및 탈수 단계로 인한 수율에 있어서 어느 정도의 변동성(variability)이 존재하였다. 건조 분말의 질량 기준 백분율로서 지질 수율, 추출물 중의 복합 지질 함량, 및 최종 생성물 중의 EPA와 DHA 함량이 표 1에 제시되어 있다.
표 1: 녹색입 홍합으로부터의 HUFA 함유 복합 지질의 추출
기질 총 DME 수율 CO2 추출후
복합 지질 수율		 복합 지질 생성물
중의 EPA, DHA %
전체 분말 8.3 3.4 11.6, 10.8
슬러리 고체물질 11.9 3.8 11.9, 10.7
슬러리 액체 6.4 미측정 20.4, 11.7
추출물 중의 인지질 프로파일은 다음과 같다: 포스파티딜콜린 31.9%, 포스파티딜에탄올아민 24.5%, 포스파티딜이노시톨 3.9%, 포스파티딜세린 3.1%, 포스포노리피드 1.1%, 세라마이드 2-아미노에틸포스포네이트 17.0%. 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민 수치는 또한 플라즈마로겐을 포함한다.
지질 제거후 홍합 분말의 포스포리파아제 활성을 다음과 같이 측정하였다. 탈지된 녹색입 홍합 분말(8g) 고체물질을 40㎖의 증류수와 혼합한 다음 원심분리하였다. 상청액 홍합 제조물의 분취액(aliquot)(20㎖)를 24%의 PC, 34%의 PE 및 12%의 PS를 함유하는 1g의 모델 인지질 혼합물에 첨가하고 40℃에서 유화시키고 난 다음 이 온도에서 16시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물 샘플(0.2㎖)을 31P-NMR로 인지질 조성에 대해 분석하였다. 인지질의 가수분해 정도는 표 2에 제시되어 있는데, 여기서 L은 리소(lyso)[모 인지질로부터 한개 지방산이 가수분해됨)를 의미하며, G는 글리세로(glycero)[모 인지질로부터 2개의 지방산이 가수분해됨]을 의미하며, tot는 비손상(intact)되고 가수분해된 총 인지질을 의미한다. PC와 PE의 경우 가수분해 정도가 명백하게 컸다. 그러나, 주요 부류의 경우의 총 가수분해 인지질과 더불어 비손상 인지질 프로파일은 출발 물질의 그것과 상당히 차이가 나타났는데, 이는 다른 반응이 일어났음을 시사하였다. 몇몇 새로운 미확인 피크들이 31P-NMR 스펙트럼에서 형성되었으며, 이들 피크들은 포스포리파아제 C 활성을 가진 생성물의 지표가 될 수 있으며, 이러한 불일치를 설명할 수 있다.
표 2: 홍합 효소 추출물을 사용한 인지질 가수분해
스트림 인지질 유형 및 가수분해 생성물
PC tot PC LPC GPC PE tot PE LPE GPE PS tot PS LPS
피드 24.0 23.5 0.5 34.0 33.8 0.2 12.2
생성물 18.3 0 7.5 10.8 27.3 0 16.1 11.2 7.9 7.0 0.9
실시예 7: DME를 사용한 호키 머리(Hoki heads)의 추출
본 실시예는 중성 지질이, DME와 인지질(DME-수화) 간의 일시적 복합체 형성으로 인하여 DME 추출후 해양계열(marine-based) 복합 지질로부터 분리될 수 있다는 것을 보여준다. 냉동된 호키 어류 머리를 잘게 다지는 기계에 통과시켰다. 다져진 머리를 이후 동결-건조기 트레이에 올려 놓고, 재냉동시키고, 그런 다음 동결-건조시켰다. 이후 건조된, 다져진 머리를 추가로 나이프 밀로 잘게 바수어 분말이 되게 한 다음, 40바 및 333K에서 DME를 사용하여 추출하였다. 1970.6g의 분말을 실시예 4에 기술된 일반적 방법을 이용하여 15.408kg의 DME로 추출하였다. 갈색의, 액체 지질-풍부 추출물을 획득하였으며, 상기 추출물은 정치(standing)시 중성 지질 풍부 상과 인지질 풍부 상으로 분리되기 시작하였다. 상 분리가 가속되도록 추출물을 원심분리하였다. 상단부, 중성 지질 상은 2.5%의 인지질만 함유하였다. 하단부, "고무" 상은 19.2 질량%로 DME-수화 인지질을 함유하였다. 그 후, 하단부 상 중의 DME를 진공하에서 제거하여 33.2%의 인지질, 및 0.5%의 강글리오시드를 함유하는 추출물을 수득하였다. 이 복합 지질 농축물은 5.8%의 EPA, 12.7%의 DHA 및 3.6%의 기타 HUFA를 함유하였다.
실시예 8: DME를 사용한 레몬(Lemon) 생선살의 추출
본 실시예는 HUFA가 매우 풍부한 복합 지질이 생선살로부터 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 신선한 레몬 생선살를 입방체로 썰고 이후 동결-건조시켰다. 그 후, 건조된 고기 입방체를 추가로 나이프 밀로 잘게 부수어 분말로 만들고, 그런 다음 40바 및 333K에서 DME를 사용하여 추출하였다. 135.95g의 분말을 실시예 1과 2에 기술된 일반적 방법을 이용하여 886.7g의 DME로 추출하였다. 인지질(64 질량%)이 매우 풍부한, 노란색, 반-고체 추출물을 2.6%의 수율로 획득하였다. 상기 추출물의 인지질 분획은 46.2%의 PC, 7.9%의 PI, 3.5%의 PS, 25.0%의 PE, 5.2%의 SM 및 7.9%의 CL을 함유하였다. 추출물은 특히 DHA가 풍부하였는데, 총 지방산의 24.9%이었다. 상기 복합 지질 추출물은 또한 4.5%의 DPA, 5.3%의 EPA, 및 6.7%의 AA를 함유하였다. 비-변성된 어류 단백질은 식품 보충제로서 사용될 수 있다.
실시예 9: DME를 이용한 소(Ovine)와 돼지 췌장의 추출, 및 초임계 CO 2 를 이용한 지질 추출물의 재-추출
본 실시예는 초임계 CO2가 미정제 DME 추출물로부터 중성 지질을 재-추출하기 위해 사용될 수 있으며, 활성 포스포리파아제와 단백질가수분해 효소가 잔여 고체물질로부터 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 동결-건조된 소 및 돼지 췌장 샘플을 40바 및 333K에서 액체 DME를 사용하여 추출하였다. 120.72g의 소 췌장을 실시예 1과 2에 기술된 일반적인 방법을 이용하여 1193.4g의 DME로 추출하였다. 중성 지질이 매우 풍부한 노란색/녹색, 반-고체 추출물을 44.8%의 수율로 수득하였다. 추출물은 19%의 인지질, 0.7% AA 및 0.7%의 DPA 만을 함유하였다. 120.18g의 돼지 췌장을 실시예 1과 2에 기술된 일반적인 방법을 이용하여 1240.2g의 DME로 추출하였다. 중성 지질이 매우 풍부한 노란색, 반-고체 추출물을 24.0%의 수율로 수득하였다. 추출물은 13%의 인지질, 1.5%의 AA 만을 함유하였고 EPA 또는 DPA를 함유하지 아니하였다. 그 후, 미정제 소 및 돼지 췌장 추출물을, 추가 중성 지질이 추출물로 회수되지 아니할 때까지, 300바 및 333K에서 초임계 CO2로 재추출하였다. 추출물과 잔여 복합 지질 농축물을 이후 재-분석하였다. 소 복합 지질은 2.3%의 AA, 1.4%의 EPA 및 1.8%의 ALA를 함유하였다. 돼지 복합 지질은 4.8%의 AA 및 각각 1% 미만의 EPA와 DPA를 함유하였다. 그 후, 잔여 탈지된 소 및 돼지 췌장 세포를, 이들의 단백질분해 활성 및 포스포리파아제 활성에 관해 시험하였다.
포스포리파아제 활성을 다음과 같이 측정하였다. 탈지된 소(0.65g) 또는 돼지 췌장(0.98g) 고체물질을 20㎖의 증류수에 혼합하고, 이후 원심분리하였다. 상청액 췌장 제조물 분취액(2㎖)을, 물(10㎖) 중에 ~ 24%의 PC, 34 %의 PE 및 12%의 PS(1g)를 함유한 모델 인지질 혼합물의 에멀젼에 첨가하고, 16시간 동안 40℃에서 유지하였다. 반응 혼합물 샘플(0.2㎖)을 31P-NMR로 인지질 조성에 대해 분석하였다. 가수분해 정도는 표 3에 제시되어 있는데, 여기서 L은 리소[모 인지질로부터 1개 지방산이 가수분해됨)를 의미하며, G는 글리세로[모 인지질로부터 2개의 지방산이 가수분해됨]을 의미한다. 돼지 췌장은 유의한 포스포리파아제 A2 활성을 나타내었으며, PE>PS>PC의 가수분해 우선성을 보였다. 소 췌장은 돼지 췌장 보다 PE 및 PC에 대한 훨씬 더 낮은 포스포리파아제 A2 활성을 나타내었으나, PS에 대한 유사한 수준의 가수분해를 보여주었다.
표 3: 포스포리파아제 A2 활성
리파아제 스트림 인지질 유형 및 가수분해 생성물
PC LPC GPC PE LPE GPE PS LPS
돼지 피드 23.5 33.8 12.2
생성물 16.3 6.7 0.5 11.0 16.3 0.4 6.9 5.0
소 피드 24.2 32.6 12.0
생성물 23.0 1.2 0 28.7 3.9 0 7.1 4.0
DME 추출후 남아 있는 프로테아제 활성을 다음과 같이 측정하였다. DME로 추출된 돼지 췌장 동결-건조 분말(0.9834g)을 25㎖의 100mM CaCl2(39mg/㎖)로 추출하고, DME로 추출된 소 췌장(0.65g)을 25 ㎖의 100 mM CaCl2(26mg/㎖)로 추출하였다. 추출물을 효소의 자가 활성화 이전 및 이후에 시험하였고 냉동된 돼지 및 양 췌장으로부터 제조된 표준 췌장 추출물과 대비하였다. 수율은 DME로 추출된 분말의 경우 표 4에 제시되어 있고, 동결된 참조 샘플의 경우 표 5에 제시되어 있다..
표 4. DME로 추출된 동결 건조 췌장 분말로부터의 췌장 프로테아제의 수율
수율 비교 돼지 소
효소(기질)
농도(mM) 		활성화 수율
μmol/분/g 		수율
μmol/분/g
트립신(BApNA)
(0.045mM) 		이전 0.634 1.17
이후 11.6 0.33
엘라스타아제 I(SAAApNA)
(0.25mM) 		이전 18.9 1.9
이후 67.4 0
키모트립신(SAAPFpNA)
(0.22mM) 		이전 254.5 1.9
이후 1265 12.3
키모트립신(SFpNA)
(0.09mM) 		이전 0.947 1.13
이후 4.1 0.21
엘라스타아제 II(MeOSAAPVpNA)
(0.5mM) 		이전 21.4 1.17
이후 44.0 1.54
트립신(BAEE)
(1mM) 		이전 264.3 유닛/g 489.8 유닛/g
이후 1182.7 유닛/g 1884.3 유닛/g
키모트립신(BTEE)(1mM) 이전 403.5 유닛/g 64.0 유닛/g
카르복시펩티다아제 B(Hip Arg)
(1mM) 		이전 1177.9 유닛/g 1.87 유닛/g
표 5: 냉동 돼지 및 양 췌장으로부터 추출 및 활성화된 표준 프로테아제 수준
효소 기질 돼지 양 유닛
트립신 BAEE 168,500 93,250 조직의 유닛/g
키모트립신 SGGFpNA 0.48 0.675 μmol/분/g
엘라스타아제 I SAAApNA 0.67 0.25 μmol/분/g
엘라스타아제 II SAAPIpNA 10.8 16.825 μmol/분/g
데이터는 표준 조건을 이용한 25g의 양 및 돼지 췌장의 추출에 근거하고 있다. 활성화가 완료된 후, 효소 활성을 측정하였는데, 트립신의 최대 활성 수준에 도달된 후 트립신 활성에서 작은 감소로 측정하였다. 엘라스타아제 II 활성을 검출하기 위해 사용된 기질 SAAPLpNA는 또한 엘라스타아제 I 및 키모트립신에 의해 가수분해된다. 그러므로, 엘라스타아제 II 활성을 이 기질을 이용하여 평가하였다.
DME를 이용한 동결-건조된 췌장의 추출은 돼지 췌장의 전반적인 프로테아제 함량에서의 감소를 거의 초래하지 아니하였다. DME로 사전에 추출된 동결-건조 소 췌장에서 검출된 더 낮아진 효소 활성 수준은 종 변이 및/또는 췌장이 수득된 동물의 연령 탓일 수 있다. 상당한 수준의 자가 활성화가 DME로 가공된 분말에서 관찰되었으며, 이는 pH 조정으로 유도된 전구효소(proenzyme) 활성화에 앞서 비교적 높은 수준의 프로테아제의 초기 검출에 의해 측정되었다. 검출된 초기 트립신 활성은 활성화에 더 적당한 값(예를 들어, pH 8.5)으로 추출물 pH의 조정시, 전구효소의 활성화를 완결시키는데 충분하였다. 대조적으로, 동결된 췌장으로부터의 췌장 전구효소의 활성화는 외인성(exogenous) 트립신의 첨가를 필요로 한다.
활성화된 동결 췌장 및 DME 추출 동결-건조 췌장으로부터 수득된 단백질 가수분해 프로파일의 비교는 상당한 효소 활성이 DME 추출후에 유지된다는 것을 보여준다. 냉동된 췌장으로부터의 엘라스타아제 I의 전형적인 추출 효율은 0.67μmol/분/g의 조직에 해당하는 수율을 가져왔으며, 반면 DME로 추출된 동결-건조된 돼지 췌장으로부터 획득된 추출 효율은 67.4μmol/분/g의 조직에 해당하는 수율을 가져왔다. 트립신 수율은 예상한 것보다 더 낮은 것으로 드러났으나, 이것은 냉동된 췌장으로부터의 추출이 진행되는 동안 활성을 감소시키는 트립신 매개 가수분해를 겪게 되는 다른 프로테아제의 예상된 수율보다 더 높은 수율을 설명할 수 있다.
실시예 10: DME를 이용한 호키 간의 추출
본 실시예는 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질이 젖은 바이오매스로부터 직접적으로 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 시중에서 구매한 냉동된, 전체 호키 어류 간을 거대 전체 크기를 지니는 우르쉘(Urschel) 그라인더를 통과시켜 간을 덩어리로 부수었다. 불린 간을 이후 60℃, 40바에서 2시간 동안 DME로 추출하였다. 31.996kg의 DME를 6.7427kg의 젖은 간에 통과시켰다. 물과 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질로 이루어진 2.234kg의 추출물을 수득하였다. 부분적으로 추출된 잔여 고체물질을 이후 재혼합하고 동일 조건에서 3시간 동안 DME로 재추출하였다. 48.46kg의 DME를 간에 통과시키고, 추가 1.834kg의 추출물을 회수하였는데, 대부분이 물이었다. 전체적으로, 2.3082kg의 오일을 수분 증발 후 획득하였다. 이 오일은 9.35%의 DHA, 1.43%의 DPA, 4.91%의 EPA, 1.3%의 C20:4 w-3, 0.6%의 AA 및 1.9%의 C18:3 및 C18:4 w-3을 함유하였다. 잔여 고체물질을 트랜스-글루타미나아제 활성에 관해 시험하였으나, 효소는 추출 과정에서 불활성화되었다.
실시예 11: 비-메틸렌 간섭 지방산이 풍부한 지질을 획득하기 위한 DME를 이용한 소나무 씨의 추출
본 실시예는 소나무 씨앗을 DME로 추출하여 비-메틸렌 간섭 지방산이 풍부한 지질을 획득할 수 있다는 것을 보여준다. 시중에서 구매가능한 소나무 종 비오타 오리엔탈리스(Biota Orientalis)의 씨앗을 DME로 추출하기 전에 부분적으로 냉압착(cold-press)하였다. 잔여 냉압착된 씨앗 케이크는 중성 오일 기준으로 대략 35 질량%를 함유하였다(사전-압착 기준 26%). 압착된 씨앗 케이크를 60℃, 40바에서 150분간 DME로 추출하였다. 37.06kg의 DME를 14.0385kg의 부분적으로 압착된 씨앗에 통과시켰다. 5.942kg의 추출물을 수득하였는데, 이 추출물은 중성 지질, 복합 지질 및 물의 혼합물이었다. 추출물을 원심분리함으로써 상을 분리시켰다. 4.847kg의 중성 지질 오일은 상단부 상으로 분리되었다. 이 오일은 9.9%의 주니페론산(C20:4 비-메틸렌 간섭 지방산), 4.3% 스시아돈산(C20:3 비-메틸렌 간섭 지방산) 및 33.2%의 알파 리놀레산을 함유하였다. 0.488kg의 미확인 복합 지질은 중간 상으로 분리되었다. 상기 미확인 복합 지질은 주 지질 생성물과 유사한 지방산 조성을 지녔다.
실시예 12: 중성 및 복합 지질을 분리하기 위하여, DME 추출에 뒤이은 초임계 CO2 추출을 이용한 녹색입 홍합 슬러리의 추출
본 실시예는 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질이 동물 조직의 슬러리로부터 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 실시예 6에서 생산된 녹색입 홍합 고체물질의 슬러리를 건조없이 추출하였다. 이 경우에 있어서, 세분된 홍합 고체물질을 함유한 슬러리를 고압에서 추출 용기로 펌핑하고, 40바의 압력 및 60℃의 온도에서 용기 내부의 수직 스택틱 믹서(vertical static mixer)에서 DME와 병류적으로(co-currently) 접촉되었다. 추출된 고체물질은 상기 추출 용기의 바닥에 침전되었다. DME와 용해된 지질 및 물은 용기의 상단부에 남아 있었으며, 이후 이전 실시예에 기술된 것과 같은 분리 용기로 이끄는 감압 밸브 및 열 교환기를 통과하였다. 333K 및 40바에서 52.906 kg의 DME를 6.1359kg의 홍합 슬러리 용액에 접촉시켜, 진공하에서 수분 제거후, HUFA가 풍부한 복합 지질 및 중성 지질을 함유하는 80.4g의 추출물을 얻었다(3.4%의 C18:3 및 C18:4 w-3; 18.7%의 EPA, 11.1%의 DHA). 잔여 고체물질을 동결-건조시켜 건조 질량 기준으로 지질의 수율을 결정하였는데, 9.0 질량%인 것으로 확인되었다. 동결-건조된 고체물질을 이후 잘게 부수고 실시예 6에서와 동일한 방법으로 재추출하였으며, 단지 0.3 질량%의 추가 수율이 획득되었는데, 이는 슬러리로부터의 추출이 거의 완벽하였음을 보여준다. 49.74 그램의 지질 추출물을 이후 333K 및 300바에서 초임계 CO2로 재추출하였으며, 29.10 그램의 중성 지질이 얻어졌다(총 지질 질량 기준으로 58.4% 수율). 추출물에는 HUFA(4.0%의 C18:3 및 C18:4 w-3; 20.2%의 EPA, 11.0%의 DHA)가 풍부하였다. 실시예 6에 기술된 거의 모든 유형의 복합 지질인, 잔여물에도 HUFA(2.4%의 C18:3 및 C18:4 W-3; 17.2%의 EPA, 12.6%의 DHA)가 풍부하였다.
실시예 13: HUFA가 풍부한 복합지질로부터 중성 지질을 분리하기 위하여, 초임계 CO2 추출에 뒤이은, DME 추출, 및 DME 추출에 뒤이은 초임계 CO2의 재추출을 이용한 동결-건조된 크릴의 추출
본 실시예는 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질이, 중성 지질을 추출하기 위해 제일 먼저 CO2로 추출되고 난 다음, HUFA가 풍부한 복합 지질을 추출하기 위해 DME로 추출되거나, DME를 사용하여 크릴로부터 전체 지질을 추출하고 난 다음, 중성 지질을 제거하기 위해 초임계 CO2로 총 지질 추출물을 재추출함으로써 동결-건조된 크릴로부터 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 12.2%의 지질을 함유하는 180.12g의 동결-건조된 크릴 분말을 300바 및 314K에서 초임계 CO2로 추출하여 11.28g의 지질을 수득하였다. 잔여 크릴 분말을 이후 40바 및 332K에서 DME로 추출하여 20%의 EPA, 15.6%의 DHA, 및 38%의 총 HUFA를 함유한 인지질이 풍부한 3.30g의 지질을 수득하였다. 21.4%의 지질을 함유한 3.0603kg의 제 2 크릴 분말을 40바 및 357K에서 17.271 kg의 DME를 사용하여 파일럿 규모(pilot scale)로 추출하여 652.1 g의 지질-풍부 추출물을 수득하였는데, 상기 추출물은 존재하는 총 지방산 중 14.0%의 EPA 및 9.0%의 DHA를 함유하였다. 100.32g의 이 지질-풍부 추출물을 이후 300바 및 314K에서 26.21kg의 초임계 CO2를 이용하여 재추출하여, 28.8%의 EPA, 21.9%의 DHA 및 55.6%의 총 HUFA를 함유한 인지질(76.6%)이 매우 풍부한 33.04 g의 비-추출된 지질 잔여물을 수득하였다.
실시예 14: DME를 이용한 습식 및 건조 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 바이오매스로부터의 지질 추출
본 실시예에서, 미생물 모르티에렐라 알피나(IRL 176 균주)를 발효시켜 아라키돈산이 풍부한 지질을 생산하였다. 그런 다음 바이오매스를 젖은 바이오매스 또는 건조된 물질 중 어느 하나로 추출하여, 아라키돈산이 매우 풍부한 추출물을 수득하였다. 150 ㎖ 루(roux) 플라스크를 25㎖의 감자 덱스트로오스 아가(PDA)로 제조하였다. 루 플라스크에 0.1㎖의 포자 스톡(spore stock)을 접종하고 이를 실온에서 한달 간 인큐베이션하였다. 농밀한 포자 스톡을 PDA 루 플라스크의 표면으로부터 긁어내고 200㎖의 감자 덱스트로오스 배지를 담은 500㎖ 언배플드(unbaffled) 진탕 플라스크에 접종하였다. 시드 진탕 플라스크를 로터리식 진탕기(180rpm)에서 25℃로, 96시간 동안 인큐베이션하였다. 시드 진탕 플라스크의 15 ㎖ 샘플을 40g/L 글루코오스 및 10g/L 효모를 함유한 13 x 500 ㎖ (총 2000 ㎖) 언배플드 진탕 플라스크에 접종하였다. 생산용 진탕 클라스크를 로터리식 진탕기(180rpm)에서 25℃로 7일간 인큐베이션하였다. 배양물을 수확하고 바이오매스를 여과에 의해 회수하였다(여과지 번호 1). 회수된 세포를 1:1(vol/vol)의 농도로 60℃의 물로 세척하였다. 건조 세포 중량은 12.2g/L이었다. 218.85g의 신선한 젖은 바이오매스를 DME로 추출하였으나, 단지 1.89g의 추출물만이 회수되었으며, 이 추출물은 지질 수준이 낮았다. 이것은 세포가 파열되지 아니하였다는 것을 시사하였다. 그 후, 150.14g의 신선한 젖은 바이오매스의 제 2 배치를 냉동시키고, 그런 다음 잘게 부수고 난 후 333K 및 40바에서 2.416kg의 DME로 추출하였다. 동결 및 이후 마쇄는 세포 파열을 초래하였으며, 이는 오일이 추출되게 하였다. 오일(6.51 g)과 물(99.53 g)의 혼합물이 추출되었다. 오일은 31.8%의 아라키돈산, 13.8%의 GLA, 및 55.9%의 총 PUFA를 함유하였다. 추출 후의 잔여 바이오매스(37.34 g)를 이후 313K에서 강제 순환식 오븐(forced convection oven) 내에서 밤새 건조시켜 최종 건조 질량 30.02g을 수득하였다. 이 건조 바이오매스를 이후 절구와 방망이로 부수었다. 그 후, 27.61g의 이 건조 바이오매스를 333K 및 40바에서 0.840 kg의 DME로 추출하여, 33.2%의 아라키돈산, 14.1%의 GLA, 및 57.3%의 총 PUFA를 함유한 3.87g의 추가 지질을 수득하였다.
실시예 15: DME를 이용한 고도 불포화 조류 지질의 추출
니츠시아 래비스(Nitzschia Laevis)의 혼합영양성(mixotrophic) 및 이종영양성(heterotrophic) 발효로 생산된 58.29g의 젖은 바이오매스를 냉동시키고, 이후 40바 및 333K에서 1,584그램의 DME로 추출하였다. 53.1Og의 전체 추출물을 획득하였는데, 이 추출물은 43.55g의 물, 9.55그램의 중성 및 복합 지질(2.2%의 AA, 11.8%의 EPA 및 2.8%의 DHA를 지님)로 구성되었다. 지질 혼합물을 진공하의 증발을 통해 물로부터 분리시켰다. 2.161g의 건조 지질 혼합물을 300바 및 333K에서 108g의 초임계 CO2로 추출하여, 오직 1.4%의 AA, 8.2%의 EPA, 및 2.2%의 DHA를 함유한 0.560g의 중성 지질을 수득하였다. 추출 후의 잔여 복합 지질 물질은 4.2%의 AA, 20.0%의 EPA, 및 3.4%의 DHA를 함유하였다.
본 발명의 공정은 물질들, 예컨대, 건조 또는 부분 건조된 식물 또는 씨앗(해양종 또는 육지종 포함), 또는 동물 생성물(해양종 또는 육지종 또는 미생물 포함)로부터 고도 불포화 지질(지방산)을 추출하는데 유용하다. 고도 불포화 지질은 뇌 및 유아의 시력 발달에 필수적이며, 또한 심혈관 건강, 정신 건강 및 면역 및 염증 질환에 이로울 수 있다.

Claims (32)

  1. 식물 또는 동물 물질로부터 고도 불포화 지방산을 함유한 지질을 수득하기 위한 공정으로서,
    (i) 지질을 함유한 디메틸 에테르 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔여물을 얻기 위해 상기 식물 또는 동물 물질과 액체 디메틸 에테르를 접촉시키는 단계;
    (ii) 상기 식물 또는 동물 물질의 잔여물로부터 상기 용액을 분리시키는 단계; 및
    (iii) 상기 용액으로부터 지질을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 고도 불포화 지방산은 지방산 사슬 내에 3개 이상의 불포화 부위 및 18개 이상의 탄소 원자를 지니는 지방산인, 공정.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 식물 또는 동물 물질과 접촉 후 형성된 상기 용액이 중성 지질 및 복합 지질을 함유하며, 여기서 복합 지질은 지방산; 극성 인기(polar phosphorous group), 아미노 알코올 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상; 및 글리세롤을 포함하는, 3개 이상의 빌딩 블록(building block)으로 이루어진 지질인, 공정.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 중성 지질이 상기 복합 지질과 함께 상기 용액으로부터 회수되는 공정.
  4. 제 3항에 있어서, (iii) 회수 단계 후에, 상기 중성 지질이 상기 복합 지질로부터 분리되는 공정.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 복합 지질이 회수 단계 (iii) 동안 용해된 디메틸 에테르와 함께 고무 상(gum phase)을 형성하는 공정.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 복합 지질을 함유한 상기 고무 상이 중성 지질을 함유한 상기 용액으로부터 분리되는 공정.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 중성 지질이 상 분리에 의해 상기 복합 지질로부터 분리되는 공정.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 중성 지질이 원심분리에 의해 상기 복합 지질로부터 분리되는 공정.
  9. 제 8항에 있어서, 가열이 원심분리 이전에 이용되는 공정.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 복합 지질이 진공 건조에 의해 건조되는 공정.
  11. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)의 상기 용액으로부터 회수된 상기 지질을 하기 단계들에 따라 근임계(near-critical) CO2로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 공정:
    (iv) 중성 지질을 함유하는 CO2 용액 및 복합 지질의 잔여물을 수득하기 위해 단계 (iii)의 상기 용액으로부터 회수된 상기 지질을 근임계 CO2와 접촉시키는 단계;
    (v) 상기 복합 지질의 잔여물로부터 상기 중성 지질을 함유하는 CO2 용액을 분리시키는 단계; 및
    (vi) 상기 CO2 용액으로부터 상기 중성 지질을 회수하는 단계.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)에서 액체 디메틸 에테르와 접촉되는 상기 식물 또는 동물 물질이 하기 단계들에 따라서 근임계 CO2로 제일 먼저 처리되는 공정:
    a. 중성 지질을 함유한 CO2 용액 및 식물 또는 동물 물질의 잔여물을 얻기 위해 상기 식물 또는 동물 물질과 근임계 CO2를 접촉시키는 단계;
    b. 상기 식물 또는 동물 물질의 잔여물로부터 상기 CO2 용액을 분리시키는 단계; 및
    c. 상기 CO2 용액으로부터 상기 중성 지질을 회수하는 단계.
  13. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질이 사용전에 건조되거나 부분적으로 건조되는 공정.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질은 상기 물질 내의 물이 30 중량% 미만이 되도록 건조되는 공정.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질은 상기 물질 내의 물이 5 중량% 이상이 되도록 건조되는 공정.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질은 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 건조되는 공정.
  17. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질은 동결된 젖은 바이오매스(wet biomass)인 공정.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 동결된 젖은 바이오매스가 단계 (i) 이전에 마쇄(grinding)되는 공정.
  19. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합 지질 중 하나 이상이 인지질, 강글리오시드(gangliosides), 당지질, 세레브로시드(cerebrosides), 또는 스핑고지질인 공정.
  20. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합 지질 중 하나 이상이 인지질인 공정.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 스핑고미엘린, 카디오리핀, 플라즈마로겐([plasmalogens), 알킬아실인지질, 포스포노리피드(phosphonolipids), 리소인지질, 세라미드 아미노에틸포스포네이트, 및 포스파티드산 중의 어느 하나 이상을 포함하는 공정.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 당지질이 갈락토리피드, 강글리오시드, 설포퀴노보이슬디아실글리세리드(sulphoquinovoysldiacylglycerides), 타우로당지질(tauroglycolipds), 글리코스핑고인지질, 및 만노실 지질을 포함하는 공정.
  23. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 내에 함유된 고도 불포화 지방산이, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 아라키돈산, 알파- 및 감마-리놀레산, 피놀레산, 스시아돈산(sciadonic acid), 콜룸빈산, 디호모리놀레산, 에이코사테르라에노산(eicosatetraenoic acid), 주니페론산(juniperonic acid), 스테아리돈산(stearidonic acid), 에이코사펜타에노산, 도코사펜타에노산, 및 도코사헥사에노산 중의 어느 하나 이상을 포함하는 공정.
  24. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 동물 물질이 동물 기관, 동물 분비기관(glands), 거대 해조 및 미세 해조, 곰팡이(filamentous fungi), 박테리아, 효모, 패류, 어류, 해양(marine) 무척추동물, 알(eggs), 식물 씨앗(seeds), 식물 잎, 식물 바늘잎(needles), 양치류 엽상체(fern fronds), 이끼 및 지의(lichen)로 구성된 군 중의 어느 하나로부터 획득되는 공정.
  25. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 디메틸 에테르가 근임계 디메틸 에테르인 공정.
  26. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 공정에 의해 획득된 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질로서, 상기 고도 불포화 지방산은 지방산 사슬 내에 3개 이상의 불포화 부위 및 18개 이상의 탄소 원자를 지니는 지방산인, 지질.
  27. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 공정에 의해 획득된 복합 지질로서, 여기서 복합 지질은 지방산; 극성 인기, 아미노 알코올 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상; 및 글리세롤을 포함하는, 3개 이상의 빌딩 블록으로 이루어진 지질인, 복합 지질.
  28. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 공정에 의해 획득된 중성 지질.
  29. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 공정에 의해 고도 불포화 지방산을 함유한 지질이 추출되는, 식물 또는 동물 물질로서, 상기 고도 불포화 지방산은 지방산 사슬 내에 3개 이상의 불포화 부위 및 18개 이상의 탄소 원자를 지니는 지방산인, 식물 또는 동물 물질.
  30. 제 29항에 있어서, 기능 식품(nutraceutical)으로 사용되는, 식물 또는 동물 물질.
  31. 제 29항에 있어서, 식품 보충제로 사용되는, 식물 또는 동물 물질.
  32. 제 29항에 있어서, 효소 공급원으로 사용되는 식물 또는 동물 물질.
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