KR101473686B1 - 비-이온성 등장제를 포함하는 애쥬번트 조성물 - Google Patents
비-이온성 등장제를 포함하는 애쥬번트 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌, 및 비이온성 등장제를 포함하는 애쥬번트 및 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도는 100mM 미만이다.
Description
본 발명은 비-이온성 등장제(isotonicity agent)를 포함하며 낮은 염 농도를 갖는, 특히 100mM 또는 그 미만의 염화나트륨 농도를 갖는 수성 애쥬번트(adjuvant) 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항원 또는 항원 제제 및 상기 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
애쥬번트는 때때로 임의의 주어진 항원에 대해 유도된 면역 반응을 향상시키기 위해 사용된다. 그러나, 백신 또는 면역원성 조성물 내로 애쥬번트를 포함시키면, 구성성분의 조제의 복잡성(complexity)뿐 아니라 백신 조성물의 제형화 및 분배의 복잡성이 증가된다. 애쥬번트 구성성분뿐 아니라, 항원 구성성분의 각각의 조제가 포뮬레이터(formulator)에 의해 고려되어야 한다. 특히, 항원 구성성분과 애쥬번트 구성성분의 상용성이 고려되어야 한다. 이는 특히 동결건조된 항원 또는 항원 제제가 애쥬번트 제제와 함께 재구성하고자 하는 경우이다. 이러한 환경에서, 애쥬번트 제제의 완충액이 항원 또는 항원 제제에 대해 적합하고, 항원의 면역원성 또는 용해도가 애쥬번트에 의해 영향을 받지 않는 것이 중요하다.
발명의 요약
본 발명자들은 몇몇 항원이 "염석(salting out)"으로 알려져 있는 현상에 특히 감수성인 것을 발견하였으며, 이러한 염석은 염화나트륨과 같은 염으로의 포화에 의한 단백질 용액으로부터의 단백질의 침전으로 정의될 수 있다. 본 발명자들은 감수성 항원이 150mM 만큼 낮은 염화나트륨의 농도에서 응집되고 침전될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 리포좀 제형 중의 톨-유사 수용체(TLR) 4 효능제(agonist) 및 사포닌, 및 비-이온성 등장제를 포함하는 수성 등장성 애쥬번트 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 100mM 미만이다.
본 발명은 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌, 및 비-이온성 등장제를 포함하는 수성 등장성 애쥬번트 조성물을 추가로 제공하며, 여기서, 상기 조성물 중의 이온 강도는 100mM 미만이다.
또한, 본 발명은 "염석"되기 쉬운 단백질 항원뿐 아니라 그렇지 않은 단백질 항원을 비롯한 더 넓은 범위의 단백질 항원에 대해서 사용될 수 있는 수성 등장성 애쥬번트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 또는 항원 제제, 및 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌 및 비-이온성 등장제를 포함하는 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물 및 상기 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 상기 애쥬번트 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 100mM 미만이다.
도 1. QS21 용해 활성 곡선.
도 2. 상이한 ASA 제형 중의 각각의 3D-MPL 동종체(congener)의 백분율.
도 3. PRAME/CpG의 동결건조를 위해 사용되는 동결-건조 사이클.
도 4. ASA(150mM NaCl) 및 ASA(소르비톨) 중에 재구성된 PRAME 및 NYESO-1 간의 그림상 비교.
도 5. 실험 1에서 상이한 애쥬번트 조성물과 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 체액성 반응.
도 6. 실험 1에서 상이한 애쥬번트 조성물과 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스에서의 종양 보호.
도 7. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA(70mM NaCl)와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 체액성 반응.
도 8. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 CD4+ 반응.
도 9. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스에서의 종양 보호.
도 2. 상이한 ASA 제형 중의 각각의 3D-MPL 동종체(congener)의 백분율.
도 3. PRAME/CpG의 동결건조를 위해 사용되는 동결-건조 사이클.
도 4. ASA(150mM NaCl) 및 ASA(소르비톨) 중에 재구성된 PRAME 및 NYESO-1 간의 그림상 비교.
도 5. 실험 1에서 상이한 애쥬번트 조성물과 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 체액성 반응.
도 6. 실험 1에서 상이한 애쥬번트 조성물과 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스에서의 종양 보호.
도 7. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA(70mM NaCl)와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 체액성 반응.
도 8. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스의 CD4+ 반응.
도 9. 실험 2에서 ASA(150mM NaCl), ASA(소르비톨) 또는 액체 제제 ASA와 함께 제형화된 PRAME/CpG로 면역화된 마우스에서의 종양 보호.
발명의 상세한 설명
본 발명은 수성 애쥬번트 조성물 중의 염화나트륨과 같은 염인 등장제의 비이온성 등장제로의 대체 또는 부분 대체를 기재한다.
비경구 투여에 대하여, 세포 변형 또는 용해를 방지하기 위해 용액이 생리학적으로 등장성(즉, 약제학적으로 허용가능한 몰삼투압농도(osmolality)를 가짐)이어야 하는 것이 주지되어 있다. "등장제"는 생리학적으로 허용되며, 적합한 장성(tonicity)을 제형(예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물)에 부여하여 제형과 접촉하고 있는 세포막을 가로지르는 물의 순유동(net flow)을 방지하는 화합물이다.
100mM 이상의 염화나트륨을 함유하는 수성 애쥬번트 조성물, 예컨대 국제 특허 공개 WO2005/112991호 및 국제 특허 공개 WO2008/142133호의 애쥬번트 시스템 A(ASA) 또는 국제 특허 공개 WO2007/068907호에 개시된 리포좀 애쥬번트가 알려져 있다. 국제 특허 공개 WO2008/142133호에 기재된 바와 같이, 이러한 애쥬번트 조성물은 백신접종 전에 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물을 재구성하기 위한 희석제로서 사용될 수 있다. 이러한 재구성된 조성물이 등장성이며, 즉, 신체 및 혈액의 세포에서 관찰되는 것과 실질적으로 동일한 염 농도를 함유하여, 주입시에 세포 수축 또는 팽창이 야기되지 않게 하는 것이 중요하다. 일반적으로, 염화나트륨이 등장제로 사용된다. 본 발명자들은 특정 항원이 고농도의 염을 함유하는 용액 중에 있는 경우, 용액 중의 단백질이 응집되거나 응고되는 과정인 "염석"에 특히 감수성인 것을 발견하였다.
단백질 항원이 응집하는 염의 농도는 단백질마다 다르다. 본 발명자들은 상대적으로 낮은 염의 농도, 예컨대 약 100mM 미만의 염화나트륨에서 응집할 항원의 그룹을 동정하였다. 이는 알려져 있는 특정 애쥬번트 조성물은 응집이 발생하기 때문에, 이들 항원을 포함하는 조성물의 재구성 또는 그와 함께 사용하기에 적합하지 않음을 의미한다.
본 발명은 이러한 항원, 즉, 100mM 미만의 염화나트륨의 염 농도에서 응집하는 이들 항원과 함께 사용될 수 있는 수성 애쥬번트 조성물을 제공한다. 본 발명의 수성 애쥬번트 조성물은 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌, 및 비이온성 등장제를 포함하며, 여기서, 애쥬번트 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 약 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만이다. 특정 실시형태에서, 애쥬번트 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 10mM 미만이거나, 5mM이거나 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 애쥬번트 조성물에는 염화나트륨이 본질적으로 없다. 본질적으로 없다는 것은 염화나트륨의 농도가 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 것(즉, 1mM, 2mM 또는 3mM)을 의미한다.
숙련자는 공지된 기법 및 키트(kit)를 사용하여 나트륨((Na+) 및 염소(Cl-) 이온의 농도를 용이하게 시험할 수 있다. 예를 들어, 나트륨은 바이오서플라이(Biosupply)로부터의 소듐 엔자이머틱 어세이 키트(Sodium Enzymatic Assay Kit)(카탈로그 번호: BQ011EAEL)와 같은 키트를 사용하여 결정할 수 있다. 염소는 바이오서플라이로부터의 클로라이드 엔자이머틱 어세이 키트(Chloride Enzymatic Assay Kit)(카탈로그 번호: BQ006EAEL)와 같은 키트를 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명은 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌, 및 비이온성 등장제를 포함하는 수성 등장성 애쥬번트 조성물을 추가로 제공하며, 여기서, 이온 강도는 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만이다. 특정 실시형태에서, 애쥬번트 조성물 중의 이온 강도는 10mM 미만이거나 5mM 또는 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 애쥬번트 조성물은 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 이온 강도를 갖는다.
본 발명의 애쥬번트 또는 면역원성 조성물의 이온 강도는 숙련자에게 알려져 있는 기법, 예를 들어, 전도도 측정기(conductivity meter)를 사용하여 측정할 수 있다.
항원 조성물과 병용할 본 발명의 수성 애쥬번트 조성물에 사용하기에 적합한 비이온성 등장제는 인간에서의 사용에 적합할 뿐 아니라, 항원 조성물 내의 항원과 상용성이고, 추가로 애쥬번트 조성물의 기타 구성성분과 상용성이어야 할 것이다.
특히, 수성 애쥬번트 조성물은 애쥬번트 조성물과 병용되는 경우 항원 조성물 내의 항원이 용액 중에 계속 유지되면서, 이들의 면역원성을 보유할 수 있게 해야 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 적합한 비이온성 등장제는 폴리올, 당(특히, 수크로오스, 프룩토오스, 덱스트로오스 또는 글루코오스) 또는 글리신과 같은 아미노산이다. 일 실시형태에서, 폴리올은 당 알코올, 특히 C3-6 당 알코올이다. 예시적인 당 알코올에는 글리세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자일리톨, 리비톨, 소르비톨, 만니톨, 둘시톨 및 이디톨이 포함된다. 이러한 실시형태의 구체적인 예에서, 적합한 비이온성 등장제는 소르비톨이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물 중의 비이온성 등장제는 수크로오스 및/또는 소르비톨이다.
일 실시형태에서, 수성 애쥬번트 조성물 내의 폴리올의 적합한 농도는 약 3 내지 약 15%(w/v), 특히 약 3 내지 약 10%(w/v), 예를 들어 약 3 내지 약 7%(w/v), 예를 들어 약 4 내지 약 6%(w/v)이다. 이러한 실시형태의 특정 예에서, 폴리올은 소르비톨이다.
수성 애쥬번트 조성물은 리포좀 제형 중의 톨-유사 수용체(TLR) 4 효능제 및 사포닌을 포함한다. 이는 사포닌 및 TLR-4 효능제가 리포좀과 함께 제형화되는 것을 의미한다.
용어 "리포좀"은 일반적으로 수성 내부를 둘러싸는 단일- 또는 다중적층(특히 형성되는 지질막의 수에 따라 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 적층(lamellar)) 지질 구조를 지칭한다. 리포좀 및 리포좀 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 리포좀을 형성할 수 있는 지질은 지방 또는 지방-유사 성질을 갖는 모든 물질을 포함한다. 리포좀 중의 지질을 구성할 수 있는 지질은 글리세리드, 글리세로포스포리피드, 글리세로포스피노리피드, 글리세로포스포노리피드, 설포리피드, 스핑고리피드, 인지질, 아이소프레놀리드, 스테로이드, 스테아린, 스테롤, 아케오리피드(archeolipid), 합성 양이온 지질 및 탄수화물 함유 지질을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 리포좀은 인지질을 포함한다. 적합한 인지질은 다음을 포함한다(그러나 이에 제한되지 않는다): 포스파티딜콜린의 합성에서 중간체인 포스포콜린(PC); 천연 인지질 유도체: 천연 인지질로서의 난(egg) 포스포콜린, 난 포스포콜린, 대두 포스포콜린, 수소화 대두 포스포콜린, 스핑고마이엘린; 및 합성 인지질 유도체: 포스포콜린(다이데카노일-L-α-포스파티딜콜린[DDPC], 다이라우로일포스파티딜콜린[DLPC], 다이미리스토일포스파티딜콜린[DMPC], 다이팔미토일 포스파티딜콜린[DPPC], 다이스테아로일 포스파티딜콜린[DSPC], 다이올레오일 포스파티딜콜린[DOPC], 1-팔미토일, 2-올레오일포스파티딜콜린[POPC], 다이엘라이도일 포스파티딜콜린[DEPC]), 포스포글리세롤(1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[DMPG], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[DPPG], 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[DSPG], 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤[POPG]), 포스파티드산(1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티드산[DMPA], 다이팔미토일 포스파티드산[DPPA], 다이스테아로일-포스파티드산[DSPA]), 포스포에탄올아민(1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DMPE], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DPPE], 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DSPE], 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[DOPE]), 포스포세린, 폴리에틸렌 글리콜[PEG] 인지질(mPEG-인지질, 폴리글리세린-인지질, 기능화된-인지질, 말단 활성화된-인지질). 일 실시형태에서, 리포좀은 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함한다. 일 실시형태에서, 고도로 정제된 포스파티딜콜린이 사용되고, 포스파티딜콜린(난), 수소화 포스파티딜콜린(난), 포스파티딜콜린(대두), 수소화 포스파티딜콜린(대두)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 리포좀은 포스파티딜에탄올아민[POPE] 또는 이의 유도체를 포함한다.
리포좀 크기는 인지질의 조성 및 이의 제조에 사용되는 방법에 따라 30nm 내지 수 ㎛로 다양할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 리포좀 크기는 50nm 내지 500nm 범위, 추가의 실시형태에서 50nm 내지 200nm 범위일 것이다. 동력학적 레이져 광 산란은 당업자에게 널리 공지된 리포좀의 크기를 측정하기 위해 사용되는 방법이다.
리포좀은 적합하게는 중성 지질, 예컨대 적합하게는 실온에서 비결정질인 포스파티딜콜린, 예컨대 난황 포스파티딜콜린, 다이올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 또는 다이라우릴 포스파티딜콜린을 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 리포좀은 DOPC를 함유한다. 또한, 리포좀은 포화 지질로 구성된 리포좀에 대해 리포좀-사포닌 구조의 안정성을 증가시키는 하전된 지질을 함유할 수 있다. 이들 경우에, 하전된 지질의 양은 적합하게는 1 내지 20%(w/w), 바람직하게는 5 내지 10%이다. 스테롤 대 인지질의 비는 1 내지 50%(몰/몰), 적합하게는 20 내지 25%이다.
본 발명에 사용하기에 특히 적합한 사포닌은 퀼(Quil) A 및 이의 유도체이다. 퀼 A는 남아메리카산 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)로부터 단리된 사포닌 제제이며, 1974년의 달스가르드(Dalsgaard) 등의 문헌["Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254]에 의해 애쥬번트 활성을 갖는 것으로 처음 기재되었다. 퀼 A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 단리되었고 이는 애쥬번트 활성을 보유하고 퀼 A(EP 0 362 278호), 예를 들어, QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로서 공지됨)과 관련된 독성은 없었다. QS-21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이고 이는 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 주요 IgG2a 항체 반응을 유도한다. QS21은 본 발명의 관점에서 바람직한 사포닌이다.
본 발명의 적합한 형태에서, 면역원성 조성물 내의 사포닌 애쥬번트는 사포나리아 몰리나 퀼 A의 유도체, 바람직하게는 퀼 A의 면역학적 활성 분획, 예컨대 QS-17 또는 QS-21, 적합하게는 QS-21이다.
구체적인 실시형태에서, QS21은 이의 덜 반응원성(reactogenic)인 조성물로 제공되며, 여기서, 이는 예컨대 콜레스테롤과 같은 외인성 스테롤을 사용하여 켄칭된다. QS21이 외인성 콜레스테롤을 사용하여 켄칭되는 덜 반응원성인 조성물의 몇몇 특정 형태가 존재한다. 사포닌/스테롤은 리포좀 제형 구조로 존재한다(WO 96/33739호, 실시예 1).
적합한 스테롤은 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤을 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 애쥬번트 조성물은 스테롤로서 콜레스테롤을 포함한다. 이들 스테롤은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 콜레스테롤은 동물 지방에서 발견되는 천연 발생 스테롤로서 문헌[Merck Index, 11th Edn., page 341]에 기재되어 있다.
활성 사포닌 분획이 QS21인 경우, QS21:스테롤의 비는 전형적으로 약 1:100 내지 1:1(w/w), 적합하게는 1:10 내지 1:1(w/w), 바람직하게는 1:5 내지 1:1(w/w)일 것이다. 적합하게는 과량의 스테롤이 존재하며, QS21:스테롤의 비는 1:2(w/w) 이상이다. 일 실시형태에서, QS21:스테롤의 비는 1:5(w/w)이다. 스테롤은 적합하게는 콜레스테롤이다.
수성 애쥬번트 조성물은 톨-유사 수용체 4(TLR-4) 효능제를 포함한다. "TLR 효능제"는 직접적인 리간드로서 또는 간접적으로 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해, TLR 신호전달 경로를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 구성성분을 의미한다(문헌[Sabroe et al, JI 2003 p1630-5]). TLR4 효능제는 TLR-4 신호전달 경로를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있다. TLR-4 효능제의 적합한 예는 지질다당류, 적합하게는 지질 A의 비독성 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A, 또는 보다 특히 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다.
3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 엔.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals N.A.)에 의해 제품명 MPL로 시판되며, 문헌에 MPL 또는 3D-MPL로 언급된다. 예를 들어, 미국 특허 4,436,727호; 4,877,611호; 4,866,034호 및 4,912,094호를 참조하길 바란다. 3D-MPL은 주로, IFN-g(Th1) 표현형을 수반하는 CD4+ T 세포 반응을 증진시킨다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화학적으로는, 이는 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화 쇄의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서는 소립자 3D-MPL을 사용하여, 수성 애쥬번트 조성물을 제조할 수 있다. 소립자 3D-MPL은 이것이 0.22 ㎛ 필터를 통하여 멸균-여과될 수 있게 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 국제 특허 공개 WO94/21292호에 기재되어 있다. 바람직하게는 분말 3D-MPL을 사용하여 본 발명의 수성 애쥬번트 조성물을 제조한다.
사용될 수 있는 기타 TLR-4 효능제는 국제 특허 공개 WO 98/50399호 또는 미국 특허 6,303,347호(AGP의 제조 방법이 또한 기재되어 있다)에 기재된 것과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP), 적합하게는 RC527 또는 RC529, 또는 미국 특허 6,764,840호에 기재된 바와 같은 AGP의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
적합한 기타 TLR-4 효능제는 국제 특허 공개 WO 2003/011223호 및 국제 특허 공개 WO 2003/099195호에 기재된 바와 같고, 예를 들어 국제 특허 공개 WO2003/011223호의 페이지 4-5 또는 국제 특허 공개 WO2003/099195호의 페이지 3-4에 기재된 화합물 I, 화합물 II 및 화합물 III, 특히 국제 특허 공개 WO2003/011223호에 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680, 및 ER804764로서 기재된 화합물이다. 예를 들어, 한 가지 적합한 TLR-4 효능제는 ER804057이다.
본 발명의 수성 애쥬번트 조성물은 사포닌 및 TLR-4 효능제 둘 모두를 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 애쥬번트 조성물은 QS21 및 3D-MPL을 포함한다.
3D-MPL과 같은 지질다당류와 같은 TLR-4 효능제는 애쥬번트 조성물의 인간 용량당 1 내지 100㎍의 양으로 사용될 수 있다. 3D-MPL은 약 50㎍, 예를 들어 40 내지 60㎍, 적합하게는 45 내지 55㎍, 또는 49 내지 51㎍, 또는 50㎍의 수준으로 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 애쥬번트 조성물의 인간 용량은 3D-MPL을 약 25㎍, 예를 들어 20 내지 30㎍, 적합하게는 21 내지 29㎍ 또는 22 내지 28㎍, 또는 28 내지 27㎍, 또는 24 내지 26㎍, 또는 25㎍의 수준으로 포함한다.
QS21과 같은 사포닌은 애쥬번트 조성물의 인간 용량당 1 내지 100㎍의 양으로 사용될 수 있다. QS21은 약 50㎍, 예를 들어 40 내지 60㎍, 적합하게는 45 내지 55㎍, 또는 49 내지 51㎍, 또는 50㎍의 수준으로 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 애쥬번트 조성물의 인간 용량은 QS21을 약 25㎍, 예를 들어 20 내지 30㎍, 적합하게는 21 내지 29㎍, 또는 22 내지 28㎍, 또는 28 내지 27㎍, 또는 24 내지 26㎍, 또는 25㎍의 수준으로 포함한다.
TLR4 효능제 및 사포닌 둘 모두는 수성 애쥬번트 조성물 중에 존재하며, TLR4 효능제 대 사포닌의 중량비는 적합하게는 1:5 내지 5:1, 적합하게는 1:1이다. 예를 들어, 3D-MPL이 50㎍ 또는 25㎍의 양으로 존재하면, 적합하게는 QS21은 또한 수성 애쥬번트 조성물의 인간 용량당 각각 50㎍ 또는 25㎍의 양으로 존재할 수 있다.
애쥬번트가 액체 형태의 항원 조성물과 병용될 경우, 애쥬번트 조성물은 의도된 인간 용량의 최종 부피의 대략 절반인 인간 용량으로 적합한 부피로 존재할 것이다. 예를 들어, 1㎖의 의도된 최종 인간 용량에 대하여 500㎕ 부피의 애쥬번트, 또는 0.5㎖의 의도된 최종 인간 용량에 대하여 250㎕ 부피이다. 애쥬번트 조성물은 항원 조성물과 병용되는 경우 백신의 최종 인간 용량을 제공하기 위하여 희석된다. 그러한 용량의 최종 부피는 물론 애쥬번트 조성물의 초기 부피 및 애쥬번트 조성물에 첨가되는 항원 조성물의 부피에 따라 달라질 것이다. 대안적인 실시형태에서, 수성 애쥬번트를 사용하여 동결건조된 항원 조성물을 재구성한다. 이 실시형태에서, 애쥬번트 조성물의 인간 용량으로 적합한 부피는 인간 용량의 최종 부피와 대략적으로 동일하다. 액체 애쥬번트 조성물은 동결건조된 항원 조성물을 함유하는 바이얼에 첨가되며, 동결건조된 항원 조성물을 재구성하기 위해 사용된다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물을 본 명세서에서 정의된 수성 애쥬번트 조성물로 재구성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, (i) 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물 및 (ii) 본 명세서에 기재된 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, (i) 본 명세서에 기재된 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물 및 (ii) 본 명세서에 기재된 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
일 실시형태에서, 동결건조된 조성물은 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 2008/142133호에 기재된 바와 같은 TLR-9 효능제를 추가로 포함한다.
대안적인 실시형태에서, CpG가 항원과 함께 공동-동결건조되지 않는 키트가 제공된다. CpG는 수성 애쥬번트 조성물과 혼합되거나 수성 또는 동결건조된 형태로 개별 바이얼에 존재할 수 있다. 따라서, 대안적인 실시형태에서, (i) 본 명세서에 기재된 항원을 포함하는 동결건조된 조성물; (ii) 수성 애쥬번트 조성물; 및 (iii) TLR9 효능제(예를 들어, 면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 TLR-9 효능제는 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 특히 비메틸화 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 96/02555호, 국제 특허 공개 WO 99/33488호 및 미국 특허 5,865,462호에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물에 사용하기에 적합한 TLR9 효능제는 임의로, 3개 이상, 적합하게는 6개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 다이뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유하는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 뉴클레오티드에 이어진 구아닌 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 사이 결합은 포스포로다이티오에이트, 또는 가능하게는 포스포로티오에이트 결합이긴 하지만, 포스포다이에스테르 및 혼합 뉴클레오티드 사이 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 기타 뉴클레오티드 사이 결합도 또한 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로다이티오에이트의 제조 방법이 미국 특허 5,666,153호, 미국 특허 5,278,302호 및 국제 특허 공개 WO95/26204호에 기재되어 있다. 상이한 뉴클레오티드 사이 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 혼합 포스포로티오에이트 포스포다이에스테르가 고려된다. 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 기타 뉴클레오티드 사이 결합이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 면역원성 조성물에 포함되기에 적합한 CpG 올리고뉴클레오티드의 예는 하기의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 이들 서열은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드 사이 결합을 함유한다.
OLIGO 1(서열 번호 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2(서열 번호 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3(서열 번호 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(서열 번호 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5(서열 번호 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 상기의 서열을 포함할 수 있고, 이들은 거기에 중요하지 않은 결실 또는 첨가를 갖는다.
본 발명은 항원 또는 항원 제제 및 본 명세서에 기재된 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물을 추가로 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 약 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만의 염화나트륨 농도를 갖는다. 특정 실시형태에서, 면역원성 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 10mM 미만이거나, 약 5mM 또는 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 면역원성 조성물에는 염화나트륨이 본질적으로 없다. 본질적으로 없다는 것은 염화나트륨의 농도가 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 것을 의미한다.
본 발명은 항원 또는 항원 제제 및 본 명세서에 기재된 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물을 추가로 제공하며, 여기서 면역원성 조성물의 이온 강도는 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 조성물 중의 이온 강도는 10mM 미만이거나, 5mM 또는 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 면역원성 조성물은 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 이온 강도를 갖는다.
TLR-9 효능제를 포함하는 동결건조된 항원 조성물을 사용하여 면역원성 조성물이 제조된다면, 면역원성 조성물이 또한 TLR-9 효능제를 포함할 것임이 명백할 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제, TLR9 효능제, 및 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 면역원성 조성물은 약 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만의 염 농도를 갖는다. 이러한 실시형태의 구체적인 실시형태에서, 면역원성 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 10mM 미만이거나 약 5mM 또는 그 미만이다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제, TLR9 효능제, 및 리포좀 제형 중의 TLR-4 효능제 및 사포닌을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 이온 강도는 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 조성물 중의 이온 강도는 10mM 미만이거나 5mM 또는 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 면역원성 조성물은 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 이온 강도를 갖는다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제, TLR9 효능제, 및 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 면역원성 조성물은 약 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만의 염 농도를 갖는다. 이러한 실시형태의 구체적인 예에서, 면역원성 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 10mM 미만이거나 약 5mM 또는 그 미만이다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제, TLR9 효능제, 및 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 이온 강도는 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만이다. 특정 실시형태에서, 면역원성 조성물 중의 이온 강도는 10mM 미만이거나 5mM 또는 그 미만이다. 추가의 구체적인 실시형태에서, 면역원성 조성물은 0mM이거나 0mM에 매우 가까운 이온 강도를 갖는다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제, 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 QS21, 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서, 면역원성 조성물은 약 50mM 미만, 예컨대 약 40mM, 30mM, 20mM 또는 15mM 미만의 염 농도를 갖는다. 이러한 실시형태의 구체적인 예에서, 면역원성 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 10mM 미만이거나 5mM 또는 그 미만이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에 사용되는 항원 또는 항원 제제는 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM 초과의 농도의 염화나트륨을 포함하는 용액과 혼합하고/하거나 이를 사용하여 용해시킨 후에, 침전되거나 응고되거나 응집되는 임의의 항원이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에 사용되는 항원 또는 항원 제제는 이온 강도가 100mM 미만, 예컨대 90mM, 80mM, 70mM, 60mM, 50mM, 40mM, 30mM, 20mM, 15mM 또는 10mM 미만인 용액과 혼합하고/하거나 이를 사용하여 용해시킨 후에, 침전되거나 응고되거나 응집되는 임의의 항원이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항원은 5mM 또는 그 미만의 이온 강도를 갖는 용액에서 침전되거나 응고되거나 응집된다.
당업자는 항원을 이러한 용액에 혼합시킴으로써, 항원이 상기 규정을 충족시키는지를 결정할 수 있다. 상기 규정을 충족시키지 않는 항원은 여전히 용액 상태로 존재할 것이며, 즉 액체는 용해 24시간 후에 침전물 없이 여전히 투명할 것이다. 용액에서 혼합되고/거나 용해된 후에, 침전되거나 응고되거나 응집되는 항원은 육안 검사에 의해 용액의 흐림으로 침전된 것으로 관찰될 수 있다. 게다가, 가시적으로 검출가능하지 않은 응집물은 SEC-HPLC를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 관찰될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 제제는 HIV, 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 유래되거나, 종양 관련 항원이다. 특정 실시형태에서, 종양 관련 항원은 PRAME 또는 NYESO-1 중 하나 또는 이의 단편 또는 유도체로부터 선택된다.
PRAME(DAGE로도 알려져 있음)는 본 발명의 종양 관련 항원으로 사용될 수 있는 항원이다. 항원 및 이의 제제는 미국 특허 5,830,753호에 기재되어 있다. PRAME는 주석이 달린 인간 유전자 데이터베이스 H-Inv DB에서 하기의 수탁 번호로 찾는다: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1 및 CR620272.1.
또한, PRAME 항원을 포함하는 융합 단백질도 사용될 수 있다. PRAME, 또는 이의 단편 또는 유도체는 임의로 이종 융합 파트너와의 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있다. 특히, PRAME 항원은 적합하게는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B 단백질 D 또는 이의 부분 또는 이의 유도체와의 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 단백질 D의 부분은 적합하게는 분비 서열 또는 신호 서열을 포함하지 않는다.
적합하게는 융합 파트너 단백질은 융합 단백질 서열의 N-말단에 또는 그 내에 아미노산 Met-Asp-Pro를 포함하며, 여기서, 융합 파트너 단백질은 단백질 D의 신호 서열 또는 분비 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 융합 파트너 단백질은 대략적으로 또는 정확하게는 단백질 D의 아미노산 17 내지 127, 18 내지 127, 19 내지 127, 또는 20 내지 127을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 단백질 D를 갖는 융합 단백질에 기초한 적합한 PRAME 항원은 국제 특허 공개 WO2008/087102호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
NY-ESO-1은 본 발명의 종양 관련 항원으로 사용될 수 있는 다른 항원이다. NY-ESO-1, 또는 이의 단편 또는 유도체는 임의로 이종 융합 파트너와의 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있다. NY-ESO-1은 US5804381호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다. 단백질 NY-ESO-1은 대략 180개 아미노산 길이이며, 다음과 같은 3개의 영역으로 이루어진 것으로 기재될 수 있다: (a) 아미노산 약 1-70인 N-말단 영역, (b) 아미노산 약 71-134인 중심 영역 및 (c) 아미노산 약 135-180인 C 말단 영역. NY-ESO-1은 예를 들어, 추가의 CT 항원 또는 이의 단편인 LAGE-1과의 융합체로서의 융합 단백질로 사용될 수 있으며, 국제 특허 공개 WO2008/089074호를 참조하길 바라며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다. NY-ESO-1의 단편이 사용되는 경우, 이들은 적합하게는 하나 이상의 MHC 클래스(Class) 1 또는 클래스 2 에피토프, 예컨대 A31, DR1, DR2, DR4, DR7, DP4, B35, B51, Cw3, Cw6 및 A2(국제 특허 공개 WO2008/089074호 참조)로 알려져 있는 것을 포함한다.
이와 같이 NaCl에 감수성이 아니지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 항원은 예를 들어, MAGE-3 패밀리, 예컨대 MAGE-A3의 MAGE 항원 또는 이의 단편 또는 유도체이다. MAGE-3 항원은 예컨대 NY-ESO-1과 병용하여 제형화되기에 적합한 것으로 기재되었고, 국제 특허 공개 WO2005/105139호를 참조하길 바라며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
MAGE-A3와 같은 MAGE 항원은 그대로 또는 유도체의 형태, 예컨대 화학적으로 개질된 유도체 및/또는 이종 융합 파트너와의 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, MAGE 항원은 감소된 이황화 결합을 함유하여, 예컨대, 카복사미드 또는 카복시메틸 기로 유도체화된 유리 티올을 형성할 수 있고, 국제 특허 공개 WO99/40188호를 참조하길 바라며, 이 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다. 특히, MAGE 항원은 적합하게는 헤모필러스 인플루엔자 B 단백질 D 또는 이의 부분 또는 이의 유도체와의 융합 단백질의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 대략 단백질 D의 처음 1/3 또는 단백질 D의 N-말단 100 내지 110 아미노산이 융합 파트너로서 사용될 수 있으며, 국제 특허 공개 WO99/40188호를 참조하길 바란다.
추가의 실시형태에서, 항원 또는 항원 조성물은 본 명세서에 기재된 항원의 임의의 것의 유도체일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "유도체"는 이의 천연 발생 형태에 비해 개질된 항원을 지칭한다. 본 발명의 유도체는 본래 항원과 충분하게 유사하여, 항원 특성을 보유하며, 여전히 본래 항원에 대하여 면역 반응이 유도되게 할 수 있다. 주어진 유도체가 이러한 면역 반응을 유도하는지 아닌지는 ELISA 또는 유세포분석(flow cytometry)과 같은 적합한 면역학적 검정법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 하나 이상의 에피토프, 예컨대 CTL 에피토프, 전형적으로는 8개 이상의 아미노산의 펩티드를 함유하는 종양 관련 항원의 단편 또는 항원의 유도체를 지칭한다. 8개 이상, 예컨대 8개 내지 10개 아미노산 또는 20개, 50개, 60개, 70개, 100개, 150개 또는 200개 이하의 아미노산 길이의 단편은 단편이 항원성을 나타내는 한, 다시 말하면, 주요 에피토프(예컨대 CTL 에피토프)가 단편에 의해 보유되며, 단편이 천연 발생 종양 관련 항원과 상호작용하는 면역 반응을 유도할 수 있는 한, 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 여겨진다. 예시적인 단편은 8 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 50개, 50 내지 60개, 60 내지 70개, 70 내지 100개, 100 내지 150개, 150 내지 200개 아미노산 잔기 길이일 수 있다(이들 범위 내의 임의의 값을 포함).
본 발명은 의약(medicine), 특히, 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 암의 면역요법 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 추가로 제공한다.
이러한 실시형태의 구체적인 예에서, 본 발명은 전립선, 유방, 직장결장(colorectal), 폐, 췌장, 신장, 난소 또는 흑색종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암의 면역요법 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 유효량으로 제공하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에서의 암의 치료 또는 예방 방법을 추가로 제공한다.
이러한 실시형태의 구체적인 예에서, 본 발명은 전립선, 유방, 직장결장, 폐, 췌장, 신장, 난소 또는 흑색종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예의 수단으로 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예
1:
애쥬번트
조성물
ASA
(소르비톨)의 제조
리포좀 제형 중의 3-탈아실화된 MPL 및 QS21을 포함하는 애쥬번트 조성물을 제조하였다. 이를 다음과 같이 제조하였다:
A.
리포좀의
제조 방법:
유기 용매 중의 지질(예컨대 합성 포스파티딜콜린), 콜레스테롤 및 3-O-탈아실화된 MPL의 혼합물을 진공 하에 건조시켰다. 그 다음, 수성 용액(예컨대 인산염 완충된 염수[100mM NaCl, 20mM 인산염 pH 6.1])을 첨가하고, 모든 지질이 현탁될 때까지 용기를 진탕시켰다. 그 다음, 이러한 현탁액을 고전단 혼합기(high shear mixer)로 사전균질화시킨 다음, 리포좀 크기가 DLS로 측정하여 대략 90nm+/-10nm로 감소될 때까지 고압 균질화시켰다. 그 다음, 리포좀을 멸균 여과하였다.
B.
ASA
제형:
단계 1:
농축
리포좀의
희석
10배 희석되는 경우, Na2/K 인산염 완충액 100mM pH6.1을 최종 제형 중의 10mM 인산염 완충액 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가하였다. 그 다음, 최종 제형 중의 4.7%의 농도에 도달하도록 주사용 물(WFI) 중의 30%(w/v) 소르비톨 용액을 첨가하였다 - 이를 실온에서 15 내지 45분 동안 교반하였다.
그 다음, 농축 리포좀(각각 40㎎/㎖, 10㎎/㎖ 및 2㎎/㎖의 DOPC, 콜레스테롤 및 MPL로 제조)을 최종 제형 중의 100㎍/㎖ MPL 농도에 도달하도록 혼합물에 첨가하였다.
이후에, 혼합물을 실온에서 15 내지 45분 동안 교반하였다.
단계 2:
QS21
첨가
연동펌프를 사용하여, QS21 벌크 스톡(bulk stock)(200㎖을 위해, 실온에서 24시간 녹이거나 4 ℃에서 2일 동안 녹임)을 최종 제형 중의 100㎍/㎖ 농도에 도달하도록 자기 교반 하에서 200㎖/분의 속도의 연동펌프로 희석된 리포좀에 첨가하였다. 혼합물을 15 내지 45분 동안 교반하였다.
최종 ASA 제형은 100㎍의 MPL/㎖ 및 100㎍의 QS21/㎖을 함유하였다.
단계 3: pH를 6.1+/-0.3으로 체크하였다.
단계 4: 멸균 여과
멸균 여과를 폴 코포레이션(PALL Corporation)으로부터의 폴리에테르설폰(PES) 필터 상에서 400㎖/분의 고정 속도로 수행하였다.
단계 5: +2 ℃ 내지 +8 ℃에서의 보관.
리포좀 제형 중의 3-O-탈아실화된 MPL 및 QS21을 함유하며, 소르비톨을 함유하는 애쥬번트 조성물(지정된 ASA(소르비톨))을 수득한 다음, 4 ℃에서 보관하였다.
실시예
2:
애쥬번트
조성물
ASA
(150
mM
NaCl
)의 제조
A.
리포좀의
제조 방법:
유기 용매 중의 지질(예컨대 합성 포스파티딜콜린), 콜레스테롤 및 3-탈아실화된 MPL(3D-MPL)의 혼합물을 진공 하에서 건조시켰다. 그 다음, 인산염 완충된 염수를 첨가하고, 모든 지질이 현탁될 때까지, 용기를 진탕시켰다. 그 다음, 이러한 현탁액 WA를 고전단 믹서를 사용하여 사전균질화시킨 다음, 리포좀 크기가 DLS로 측정하여 대략 90nm+/-10nm로 감소될 때까지 고압 균질화시켰다. 그 다음, 리포좀을 0.22㎛ PES 막 상에서 멸균 여과하였다.
B.
ASA
제형:
단계 1: 농축
리포좀의
희석
10배 희석되는 경우, Na2/K 인산염 완충액 100mM pH6.45 및 NaCl 1.5M을 각각 최종 제형 중의 10mM 인산염 및 NaCl 150mM 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가하였다. 이러한 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 그 다음, 농축 리포좀(각각 40㎎/㎖, 10㎎/㎖ 및 2㎎/㎖의 DOPC, 콜레스테롤 및 MPL로 제조)을 최종 제형 중의 100㎍/㎖ MPL 농도에 도달하도록 혼합물에 첨가하였다. 이후에, 혼합물을 실온에서 5 내지 15분 동안 교반하였다.
단계 2: QS21 첨가
QS21 벌크 스톡(200㎖을 위해, 실온에서 24시간 녹이거나 4 ℃에서 2일 동안 녹임)을 최종 제형 중의 100㎍/㎖ 농도에 도달하도록 자기 교반 하에서 희석된 리포좀에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다.
단계 3: pH를 6.1+/-0.1이 되도록 체크하였다.
단계 4: 멸균 여과
멸균 여과를 폴 코포레이션으로부터의 폴리에테르설폰(PES) 필터 상에서 수행하였다.
단계 5: +2 ℃ 내지 +8 ℃에서의 보관
ASA의 최종 조성은 1㎖당 2mg DOPC, 500㎍ 콜레스테롤, 100㎍ 3-O-탈아실화된 MPL, 100㎍ QS21이었다.
실시예
3.
QS21
용해 활성
QS21은 적혈구(RBC)를 용해시키는 것으로 알려져 있다. 실시예 1에서와 같이 제조된 ASA(소르비톨) 애쥬번트 조성물을 시험하여, QS21 용해 활성이 150mM NaCl을 함유하는 동등한 애쥬번트 조성물(ASA (150mM NaCl))에서 관찰되는 것과 동일한 방법으로 켄칭되었음을 보장하였다.
QS21 용해 활성을 닭 적혈구(RBC)를 사용하여 용혈 검정으로 측정하였다. RBC를 4 ℃에서 550g로 원심분리하였다. 상층액을 폐기하였다. 펠렛을 조심스레 PBS 완충액에 재현탁화시켜, 초기 부피에 도달시키고, 상층액이 더 이상 적색이 아닐 때까지 동일한 작업을 반복하였다(일반적으로 3회). 바로 사용하지 않는다면, 펠렛을 4 ℃에서 최대 3 내지 4일 동안 보관하거나(사용하는 날 다시 세정하였다), 같은 날 사용된다면, 완충액 중에 대략 10배 희석하였다.
QS21 용량 범위 곡선을 ASA 완충액에서(시험할 ASA 샘플에 따른 염 또는 소르비톨 완충액 중에서) 즉석으로 만들고, 애쥬번트 샘플(500㎕ 또는 900㎕ ASA의 등가물을 의미하는 50㎍ 또는 90㎍ QS21 등가물을 함유함)을 제조하였다. 최종 부피를 적당한 완충액(시험되는 샘플의 완충액의 기능으로서 소르비톨을 함유하거나 함유하지 않음)과 함께 샘플 및 표준물질 중에서 900㎕로 조정하였다. 유백광 때문에 ASA는 광학 밀도(OD)를 간섭한다. 따라서, ASA "블랭크(blank)"를 준비하고, 이들의 OD를 ASA 시험 샘플의 OD로부터 감산하였다. 이들 블랭크는 샘플에서 시험되는 부피와 동일한 ASA 부피에 상응하나, 완충액을 사용하여 1㎖로 조정하였다. 이들 블랭크에는 RBC를 첨가하지 않았다. 그 다음, 표준물질 및 샘플을 실온(RT)에서 30분 동안 RBC(900㎕의 표준물질 및 샘플에 첨가된 100㎕의 희석된 RBC)와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 샘플을 900g에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 540nm에서의 광학 밀도를 측정하였다.
용해 활성의 측정을 제한 시험(limit test)으로 시행하였다.
1. 검출의 한계(LOD)를 하기의 OD를 야기하는 QS21의 가장 낮은 농도로서 규정하였다:
- 베이스(base) 수준보다 더 높은 OD(OD>0.1)
- OD의 완충액("o㎍" QS21)보다 약 3배 더 높은 OD
- 곡선의 상승 부분 내의 OD
- 각 시험에 대해 결정된 OD.
2. 애쥬번트 샘플에 대한 OD가 ODLOD보다 더 컸다면, 애쥬번트 샘플 내의 QS21 용해 활성은 양성으로 유지되었다.
QS21 곡선의 예:
*50㎍ QS21 등가물을 시험하였다. 150mM 염화나트륨 완충액.
이러한 검정에서 검출의 한계는 0.9㎍ QS21에서 0.12의 OD였다.
150mM 염화나트륨을 포함하는 애쥬번트 조성물 중에서의 QS21 켄칭은, 시험한 50㎍ QS21의 등가물에 대하여 98.2% 초과인 것으로 평가되었다. 시험한 90㎍의 등가물의 경우에, 결론은 99% 초과이다.
그 다음, QS21 켄칭을 소르비톨 및 오직 5mM의 염화나트륨을 포함하는 등가물 애쥬번트 조성물과 비교하였다. 4 ℃에서의 ASA의 보관 후에, 또는 안정성 촉진(37 ℃에서 7일) 후에 데이터를 생성하였다. 소르비톨 중의 ASA에 대하여, QS21 표준 곡선을 소르비톨 함유 완충액 중에서 작성하였다.
*시험한 90㎍ QS21의 등가물을 제외하고는, 시험한 50㎍ QS21의 등가물
QS21이 낮은 염화나트륨 완충액 중에서 적절히 켄칭된 것으로 결론지었다.
실시예
4:
MPL
동종체
화학적으로, 3D-MPL은 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 쇄의 혼합물이다. 각각의 개별 3D-MPL 분자는 동종체로 불린다. 동종체 조성물이 동종체의 비율 간의 이동 없이, 계속 불변하게 유지되는 것이 중요하다. 또한, 사용되는 임의의 완충액이 동종체 조성물을 애쥬번트 조성물을 제조하는데 사용되는 농축 리포좀에서와 동일하게 할 수 있는 것이 중요하다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 동종체 조성물을 3D-MPL 농축 리포좀(농축 리포좀 LIP07-217, 도 2의 첫번째 열), 150mM NaCl 완충액 중에 3D-MPL 리포좀 및 QS21을 포함하는 애쥬번트 조성물(애쥬번트 150mM NaCl 또는 ASA(150mM NaC), 두번째 열), 및 소르비톨 및 5mM NaCl 완충액 중에 3D-MPL 리포좀 및 QS21을 포함하는 애쥬번트 조성물(애쥬번트 소르비톨 또는 ASA(소르비톨), 3 내지 7열)에서 시험하였다.
또한, 동종체 조성물을 제조 및 37 ℃에서의 유지 후 0일 및 7일에 ASA(소르비톨) 애쥬번트의 2개의 롯트(lot)에서 시험하여, 시간이 지남에 따른 변화가 없었음을 보장하였다(도 2의 마지막 4개의 열을 참조하길 바란다).
농축 리포좀 또는 ASA(소르비톨) 샘플 중의 MPL의 테트라-, 펜타- 및 헥사-아실화된 동종체의 상대 분포를 IP-HPLC-Fluo 검출(ARD)로 측정하였다. 표준물질 및 샘플 둘 모두를 단실하이드라진으로 유도체화시켰으며, 이러한 단실하이드라진은 이당류 백본(backcone) 상에 Fluo-활성 발색단을 혼입시킨다. 유도체화된 샘플을 이온쌍 시약(ion pair reagent)으로서의 테트라부틸암모늄 하이드록시드(TBAOH)를 사용하여 C18 역상 컬럼 상에서 분석하였다. 상이한 그룹(테트라아실, 펜타아실 및 헥사아실)에서 동일한 수의 지방 아실 기를 함유하는 동종체를 용출시켰다. 각 그룹의 피크 영역을 모든 MPL 동종체의 전체 피크 영역과 비교함으로써, 동종체의 분포를 추론하였다.
도 2는 각각의 동종체의 백분율을 보여준다. 동종체 조성에서 애쥬번트 완충액 간의 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 동종체 조성은 소르비톨 완충액 중에서 시간이 지남에 따라 변함이 없었다.
실시예
5:
실시예
6 및 7에서 사용되는 조성물의 제조
5.1
CpG
를 사용한
PRAME
의 제조(
CpG
2006을 모든
실시예에서
사용)
5.1.1
실시예
6 및
실시예
7 실험 1 및 2에서 사용된
ASA
(150
mM
NaCl
)와 함께
CpG
를 사용한
PRAME
의 제조
30%(w/v) 수크로오스 용액(주사용 물에서 제조)을 5%의 수크로오스 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가하였다. 그 다음, Tris-HCl 완충액 100mM pH 9.5를 75mM Tris 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 붕산염 완충액 100mM pH 9.8을 5mM 붕산염 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 10%(w/v) 폴록사머(Poloxamer) 188 용액(주사용 물에서 제조)을 0.313%의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, 약 20 ㎎/㎖(주사용 물 중의)의 농도의 CpG 용액을 최종 제형 중에 1050㎍/㎖의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, PRAME 항원을 1250㎍/㎖의 단백질 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). pH를 체크하였다(9.51). 수득된 혼합물을 3㎖ 유리 바이얼(vial)에 0.5㎖까지 채운 다음, 동결 건조시켰다.
도 3은 PRAME를 위해 사용된 동결 건조 사이클을 예시한 것이다(기간=40 시간).
생성된 동결건조 케이크(cake)를 150mM NaCl을 포함하는 실시예 2에서와 같이 제조된 수성 애쥬번트 조성물 625㎕를 사용하여 재구성하였다. 동결건조 케이크는 16mM Tris, 4mM 붕산염, 4% 수크로오스, 0.24% 폴록사머 188, 840㎍/㎖ CpG 및 1000㎍/㎖ PRAME의 최종 조성을 사용한 재구성 후에, 올바른 항원/애쥬번트 비를 갖도록 1.25 배 과량의 항원 용량을 함유하였다.
5.1.2
실시예
7의 실험 1에서의 "액체 제형"(70
mM
NaCl
)을 위한
CpG
를 사용한
PRAME
의 제조
농축
애쥬번트
제제
10배 희석되는 경우 10배 농축 PBS 모델(mod) pH 6.1을 최종 제형 중에 1배 농축 완충액에 도달하도록 주사용 물에 첨가하였다. 400㎍/㎖로 사전희석된 리포좀 및 QS21로 제조된 사전혼합된 용액을 따로 제조하였다. 사전혼합물(premix)을 실온에서 15분 동안 자기 혼합하였다. 사전혼합물에 사용된 농축 리포좀은 40㎎/㎖ DOPC, 10㎎/㎖ 콜레스테롤 및 2㎎/㎖ 3-탈아실화된 MPL로 제조된다. 사전혼합물을 최종 제형 중에 200㎍/㎖의 MPL 농도 및 200㎍/㎖의 QS21 농도에 도달하도록 PBS에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15 내지 30분 동안 자기 교반하였다. 그 다음, 약 23㎎/㎖의 CpG를 1680㎍/㎖의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15 내지 30분 동안 자기 교반하였다. pH가 6.1+/-0.1이 되게 체크하였다. AS를 0.22 ㎛ PES 필터 상에서 여과하고, 사용시까지 4 ℃에서 보관하였다.
최종 제형
수크로오스 25%, 붕산염 25mM pH9.8 및 루트롤(Lutrol) 10%를 최종 제형 중에 각각 9.25%, 5mM 및 0.24%에 도달하도록, WFI에 첨가하였다. 2배 농축 AS+CpG 제제를 최종 제형 중에 1배 농축을 야기하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 그 다음, 수크로오스 3.15%, 붕산염 5mM 중의 PRAME 항원을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다.
5.1.3
실시예
7의 실험 2에서의 "액체 제형"을 위한
CpG
를 사용한
PRAME
의 제조
농축
애쥬번트
제제
액체 제형에 대한 ASA를 다음과 같이 제조하였다. 인산염 완충액 1M(100배 희석되는 경우 pH 6.1)을 농축 리포좀 중의 50mM 인산염 농도를 반영하는 최종 45mM에 도달하도록, 자기 교반 하에서 WFI에 첨가하였다. 그 다음, 소르비톨 35%를 21.15% 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. 40㎎/㎖ DOPC, 10㎎/㎖ 콜레스테롤 및 2㎎/㎖ 3-탈아실화된 MPL로 제조된 농축 리포좀을 450㎍/㎖의 최종 MPL 농도에 도달하도록 혼합물에 첨가하였다. QS21 벌크(약 5000㎍/㎖)를 450㎍/㎖의 최종 QS21 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. pH를 체크하고, pH 6.1+/-0.1로 조정하였다. 이러한 ASA 중의 최종 농도는 각각 MPL에 대해서는 450㎍/㎖, QS21에 대해서는 450㎍/㎖, 45mM 인산염, 22.5mM NaCl, 21.15% 소르비톨이었다.
최종 제형
30%(w/v) 수크로오스 용액(주사용 물에서 제조)을 최종 제형 중에 4%의 수크로오스 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가하였다. 그 다음, Tris-HCl 완충액 1M pH 9.0을 최종 제형 중에 16mM Tris 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 붕산염 완충액 100mM pH 9.8을 최종 제형 중에 4mM 붕산염 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 10%(w/v) 폴록사머 188 용액(주사용 물에서 제조)을 최종 제형 중에 0.24%의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, 약 20㎎/㎖(주사용 물 중의)의 농도의 CpG 용액을 최종 제형 중에 840㎍/㎖의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, PRAME 항원 완충액(붕산염 5mM - 수크로오스 3.15% pH 9.8)을 첨가하여, PRAME 항원 농도를 1000㎍/㎖로 조정하였다. 그 다음, PRAME 항원을 최종 제형 중에 8㎍/㎖의 단백질 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 소르비톨 중의 4.5배 농축 AS를 100㎍/㎖ MPL 및 QS21의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. pH를 체크하였다(+/-8.0).
5.1.4
실시예
7의 실험 1에서의
ASA
(소르비톨) 및
ASA
(수크로오스)를 위한 CpG를 사용한
PRAME
의 제조
30%(w/v) 수크로오스 용액(주사용 물에서 제조)을 제형 중에 5%의 수크로오스 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가한 다음, 붕산염 완충액 100mM pH 9.8을 이러한 제형 중에 5mM 붕산염 완충액 농도에 도달하도록 첨가한 다음, 20배 희석되는 경우, Tris-HCl 완충액 100mM pH 9.0을 이러한 제형 중에 5mM Tris 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 10%(w/v) 폴록사머 188 용액(주사용 물에서 제조)을 제형 중에 0.3%의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, 약 20㎎/㎖(주사용 물 중의)의 농도의 CpG 용액을 제형 중에 1050㎍/㎖의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, PRAME 항원을 최종 제형 중에 1250㎍/㎖의 단백질 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). pH가 9.4인 것으로 측정되었다. 그 다음, 수득된 혼합물을 3㎖ 유리 바이얼에 0.5㎖까지 채운 다음 동결 건조시켰다.
ASA(소르비톨)를 다음과 같은 약간의 차이와 함께 실시예 1에서 언급된 바와 같이 제조하였다: 소르비톨 농도는 4.6%였고, 희석된 농축 리포좀으로의 첨가 전에 QS21을 400㎍/㎖로 사전희석하였다.
ASA(수크로오스)를 다음과 같은 차이와 함께 실시예 1에서 언급된 바와 같이 제조하였다: 소르비톨을 수크로오스(30%(w/v) 수크로오스 용액의 스톡 용액을 사용하고, 최종 수크로오스 농도는 8.3%이다)로 대체하고, 희석된 농축 리포좀으로의 첨가 전에, QS21을 400㎍/㎖로 사전희석하였다.
생성된 동결건조 케이크를 625㎕의 수성 애쥬번트 조성물로 재구성하였고, 최종 조성물은 4mM Tris, 4mM 붕산염, 4% 수크로오스, 0.24% 폴록사머 188, 840㎍/㎖ CpG 및 1000㎍/㎖ PRAME을 포함하였다.
5.1.5
실시예
7의 실험 2에서의
ASA
(소르비톨)를 위한
CpG
를 사용한
PRAME
의 제조
30%(w/v) 수크로오스 용액(주사용 물에서 제조)을 제형 중에 5%의 수크로오스 농도에 도달하도록 주사용 물에 첨가한 다음, 50배 희석되는 경우, Tris-HCl 완충액 1 M pH 9.0을 이러한 제형 중에 20mM Tris 완충액 농도에 도달하도록 첨가하고, 이어서 20배 희석되는 경우 붕산염 완충액 100mM pH 9.8을 이러한 제형에서 5mM 붕산염 완충액 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 10%(w/v) 폴록사머 188 용액(주사용 물에서 제조)을 제형에서 0.3%의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, 약 20㎎/㎖(주사용 물 중의)의 농도의 CpG 용액을 제형 중에 1050㎍/㎖의 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). 그 다음, PRAME 항원을 최종 제형 중에 1250㎍/㎖의 단백질 농도에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 자기 교반하였다(150 rpm). pH가 9.1로 측정되었다. 수득된 혼합물을 3㎖ 유리 바이얼에 0.5㎖까지 채운 다음 동결 건조시켰다.
ASA 소르비톨을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생성된 동결건조 케이크를 625㎕의 수성 애쥬번트 조성물을 사용해 재구성하였고, 최종 조성물은 16mM Tris, 4mM 붕산염, 4% 수크로오스, 0.24% 폴록사머 188, 840㎍/㎖ CpG 및 1000㎍/㎖ PRAME을 포함하였다.
5.2
CpG
를 사용한
NY
-
ESO1
의 제조
5.2.1
실시예
6에서의
CpG
를 사용한
NY
-
ESO1
의 제조
20배 희석되는 경우, Na/K2 인산염 완충액 200mM pH 6.3을 최종 제형 중에 12.5mM에 도달하도록 자기 교반 하에서 주사용 물에 첨가하였다. 그 다음, 하기의 부형제를 다음의 순서로 혼합물에 첨가하였다: 10%(w/v)의 모노티오글리세롤을 최종 0.3125%에 도달하도록, 5% w/v의 폴록사머 188을 0.0625%에 도달하도록, 수크로오스 25%를 최종 5%에 도달하도록, 그리고 L-아르기닌 베이스(base) 287mM를 6.25mM에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 약 20㎎/㎖의 CpG 벌크를 최종 제형 중에 1050㎍/㎖의 농도에 도달하도록 이러한 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 자기 교반하에서 유지시켰다(약 150rpm). pH를 7.1+/-0.3이 되도록 체크하였다. 자기 교반을 증가시켜, 소용돌이를 생성하였다. 그 다음, NY-ESO1을 750㎍/㎖의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다. 그 다음, 자기 교반을 약 150rpm으로 감소시키고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 분취물을 취하여 최종 pH를 체크하였다(7.02이어야 함). 그 다음, 최종 벌크를 동결건조시켰다.
생성된 동결건조 케이크를 625㎕의 ASA 완충액(150mM NaCl 및 소르비톨)으로 재구성하였다
실시예
6.
완충액으로서
소르비톨을 포함하는
애쥬번트
조성물에서의 "염석"의 방지
도 4는 염 농도를 5mM로 감소시키고, 애쥬번트 조성물 중에 소르비톨을 포함시키는 것이 면역원성 조성물에서 PRAME 및 NY-ESO-1 둘 모두(각각 실시예 5.1.1 및 5.2.1에서 제조됨)의 "염석"을 방지하는 것을 보여준다. 도 4에서:
1은 ASA 150mM NaCl 완충액에서 재구성된 PRAME 항원이다.
2는 ASA 소르비톨 완충액에서 재구성된 PRAME 항원이다.
3은 ASA 150mM NaCl 완충액에서 재구성된 NYESO-1 항원이다.
4는 ASA 소르비톨 완충액에서 재구성된 NYESO-1 항원이다.
도 4는 ASA(150mM NaCl) 및 ASA(소르비톨)에서 재구성된 PRAME 및 NYESO-1 간의 사진상의 비교이다. 관찰될 수 있는 바와 같이, ASA(150mM NaCl)에서 재구성된 PRAME은 ASA(소르비톨)에서 재구성된 PRAME에 비해 혼탁한 것으로 나타났다. 유사하게, ASA(150mM NaCl)에서 재구성된 NY-ESO는 ASA(소르비톨)에서 재구성된 NY-ESO 항원에 비해 혼탁한 것으로 나타났다.
실시예
7. 생체 내 마우스 모델
실험 1:
20마리의 6 내지 8주령의 암컷 CB6F1 마우스(C57BL/6 및 Balb/C 마우스의 잡종) 7개 그룹을 인간 용량의 1/10에 상응하는 고정된 용량의 ASA+CpG(5㎍ MPL, 5㎍ QS21 및 42㎍ CpG7909를 함유하는 50㎕)에서 제형화된 PRAME 단백질을 사용하여, 근육내로 2회 면역화시켰다(2주 마다, 좌측 및 우측 장딴지근에 교대 주사). 마지막 면역화 14일 후에, 마우스의 4개의 그룹(n=8 각각의 그룹)에 하기에 기재된 바와 같이 10e5 CT26-PRAME 종양 세포로 피하 공격(challenge)하였다. 마우스의 7개 그룹은 다음과 같다:
- 그룹 1 : 완충액
- 그룹 2: PRAME 단백질이 침전되는 "통상적인" ASA(150mM NaCl)에 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 3: ASA(수크로오스)에 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 4: ASA(수크로오스 - 25 ℃에서 48시간 인큐베이션)에 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 5: ASA(소르비톨)에 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 6: PRAME+ASA - 70mM NaCl+CpG를 함유하는 "액체" 제형
- 그룹 7: PRAME+ASA - 70mM NaCl+CpG(+폴록사머)를 함유하는 "액체" 제형.
마지막 면역화 7일 후에, T-세포의 사이토카인 분비 능력에 의한 세포 반응(3마리 마우스의 n=4 그룹)을 분석하였다.
모든 마우스에 ASA+CpG 애쥬번트 시스템의 인간 용량의 1/10(5㎍의 MPL, 5㎍의 QS21 및 42㎍의 CpG) 중의 0.4㎍의 PRAME을 제공하였다.
결과:
종양 성장
그룹당 표면(㎟)(+SD)으로 측정되는 바와 같은 시간이 지남에 따른 평균 종양 성장을 도 6에 나타내었다. ASA(150mM NaCl)+CpG에서 제형화된 PRAME 및 ASA 액체 제형 중의 PRAME은 PRAME ASA(소르비톨)+CpG 보다 더 낮은 종양 보호(더 큰 종양 성장)을 유도한다.
세포 반응(2회 면역화 7일 후-처리 그룹당 3마리 마우스의 n=4 그룹):
PRAME ASA-CpG 종양 항원을 사용한 마우스의 면역화 후에, IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인을 생성할 수 있는 CD4 및 CD8 T-세포의 빈도를 상이한 제형이 기능적 세포 반응을 유도하는 능력을 반영하기 위해 사용하였다. 2차 면역화 7일 후에, 사이토카인(IFNγ 및 TNFα)을 생성하는 CD4 및 CD8 T-세포의 백분율을 면역화된 마우스의 비장 세포에서의 세포내 사이토카인 염색(ICS)으로 측정하였다.
IFNγ 및 TNFα를 생성하는 CD4의 %(평균 +/- 표준편차)를 도 5에 나타내었다.
측정가능한 CD8 반응이 이러한 실험에서 관찰되지 않았다.
ASA(150mM NaCl)+CpG에서 제형화된 PRAME 단백질이 침전하고, ASA(소르비톨)+CpG에서 제형화된 PRAME에 비해 더 낮은 특이적 T-세포 반응을 유도하는 것으로 나타났다. PRAME 단백질을 ASA(소르비톨)+CpG 및 ASA "액체" 제형(70mM NaCl)+CpG(통계적 차이 없음)에서 제형화한 경우 유사하게 우수한 PRAME 특이적 CD4 반응을 수득하였다. 또한, 체액성 면역 반응을 시험하였으나, 2회 주사 후의 데이터는 해석할 수 없었다.
실험 2:
24마리의 6 내지 8주령의 암컷 CB6F1 마우스(C57BL/6 및 Balb/C 마우스의 잡종) 4개 그룹을 인간 용량의 1/10에 상응하는 고정된 용량의 ASA+CpG(5㎍ MPL, 5㎍ QS21 및 42㎍ CpG7909를 함유하는 50㎕)에서 제형화된 PRAME 단백질을 사용하여, 근육내로 4회 면역화시켰다(2주 마다, 좌측 및 우측 장딴지근에 교대 주사). 마지막 면역화 14일 후에, 마우스의 4개의 그룹(n=12 각각의 그룹)에 하기에 기재된 바와 같이 10e5 CT26-PRAME 종양 세포를 피하 공격하였다. 마우스의 4개 그룹은 다음과 같다:
- 그룹 1 : 완충액
- 그룹 2: PRAME 단백질이 침전되는 "통상적인" ASA(150mM NaCl)에서 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 3: ASA(소르비톨)에서 재현탁화된 공동동결건조된 PRAME+CpG
- 그룹 4: PRAME+ASA - "액체" 제형+CpG(+폴록사머)
마지막 면역화 14일 후에, 면역 반응을 다음과 같은 상이한 판독치를 사용하여 분석하였다:
- 체액성 반응(n=12)
- T-세포의 사이토카인 분비 능력에 의한 세포 반응(3마리 마우스의 n=4 그룹)
- 종양 공격에 대한 보호 효과(n=12).
모든 마우스에 ASA+CpG 애쥬번트 시스템의 인간 용량의 1/10(5㎍의 MPL, 5㎍의 QS21 및 42㎍의 CpG) 중의 0.4㎍의 PRAME을 제공하였다.
결과:
종양 성장
그룹당 표면(㎟)(+SD)으로 측정되는 바와 같은 시간이 지남에 따른 평균 종양 성장을 도 9에 나타내었다. ASA(150mM NaCl)+CpG에서 제형화된 PRAME는 PRAME ASA(소르비톨)+CpG 보다 더 낮은 종양 보호(더 큰 종양 성장)를 유도한다. 유사한 보호가 PRAME ASA(소르비톨)+CpG 및 ASA 액체 제형 중의 PRAME+CpG에서 관찰되었다.
샘플 분석:
체액성
반응:
마우스 혈청(n=12)을 하기에 기재된 바와 같이, 4회 면역화의 마지막 면역화 14일 후에, PRAME-특이적 항체의 존재에 대해 ELISA로 시험하였다. 항체 반응(전체 Ig)을 코팅 항원으로서 정제된 재조합 PRAME 단백질을 사용하여 ELISA로 평가하였다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 PRAME 특이적 항체의 존재에 대해 분석하였다. 4회 면역화 후에 수득되는 표준 역가의 기하 평균(n=12 마우스) +/- 95% 신뢰 구간을 도 7에 나타내었다. 통상적인 ASA(150mM NaCl)를 함유하는 PRAME/ASA+CpG는 매우 적은 항체 반응을 유도하는 한편, ASA(소르비톨)를 함유하는 PRAME/ASA+CpG는 매우 높은 항체 역가를 유도한다. 이러한 반응은 액체 제형 ASA에 의해 유도되는 것과 유사하다.
세포 반응(4차 면역화 14일 후 - 처리 그룹당 3마리 마우스의 n=4 그룹):
PRAME ASA-CpG 종양 항원을 사용한 마우스의 면역화 후에, IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인을 생성할 수 있는 CD4 및 CD8 T-세포의 빈도를 상이한 제형이 기능적 세포 반응을 유도하는 능력을 반영하기 위해 사용하였다. 4차 면역화 14일 후에, 사이토카인(IFNγ 및 TNFα)을 생성하는 CD4 및 CD8 T-세포의 백분율을 면역화된 마우스의 비장 세포에서의 세포내 사이토카인 염색(ICS)으로 측정하였다.
IFNγ 및 TNFα를 생성하는 CD4의 %(평균 +/- 표준편차)를 도 8에 나타내었다. p-값은 대부분 0.05 미만이며, 이는 그룹 2와 그룹 3 및 4 간의 유의미한 차이를 나타낸다.
측정가능한 CD8 반응이 이러한 실험에서 관찰되지 않았다.
ASA(150mM NaCl)+CpG에서 제형화된 PRAME 단백질이 침전하고, ASA(소르비톨)+CpG에서 제형화된 PRAME에 비해 통계적으로 더 낮은 특이적 T-세포 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 반면, PRAME 단백질을 ASA(소르비톨)+CpG 및 ASA "액체" 제형+CpG에서 제형화한 경우 유사하게 우수한 PRAME 특이적 CD4 반응을 수득하였다.
방법
CT26
-
PRAME
종양 모델 및 종양 성장
CT26 결장 암종 세포주를 PRAME에 대한 cDNA를 암호화하는 포유류 발현 플라스미드, 즉 pCDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 트랜스펙션(transfecting)시킴으로써, CT26-PRAME 세포주를 생성하였다. G418(200㎍/㎖)을 사용한 선별 및 제한 희석 클로닝으로 정량적 리얼-타임(real-time) PCR로 결정시 PRAME을 발현하는 클론(CT26-PRAME)을 생성하였다(인간 종양에 의한 PRAME 발현의 수준의 범위 내에 있는 10e-3 PRAME mRNA 카피 / 마우스 β 액틴의 카피).
CT26 PRAME 세포를 10% 우태아 혈청, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루브산나트륨 및 0.1 % β-머캅토에탄올이 있는 RPMI 배지에서 5% CO2와 함께 37℃에서 시험관 내에서 성장시켰다. 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지로 2회 세정하고, 상기 기재된 바와 같이 PRAME을 사용한 마지막 면역화 14일 후에 CB6F1 마우스의 4개 그룹의 우측 옆구리에 200㎕ RPMI 배지 중에서 피하 주사하였다. 개별 종양 성장을 일주일에 2회 측정하였다. 각각의 종양의 2개의 주요 직경의 생성물을 시간이 지남에 따라 기록하고, 데이터를 각각의 동물 그룹에서 평균 종양 표면(㎟)으로 나타내었다.
샘플 분석:
체액성
반응
혈청의 첨가 전에, 이뮤노플레이트(immunoplate)를 PRAME 항원으로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 37 ℃에서 90분 동안 혈청과의 반응 후에, 마우스 면역글로불린에 대한 비오티닐화된 토끼 전체 항체를 37 ℃에서 90분 동안 첨가하였다. 항원-항체 복합체는 37 ℃에서 30분 동안 스트렙트아비딘-비오티닐화된 퍼옥시다아제 복합체와의 인큐베이션에 의해 드러났다. 그 다음, 이러한 복합체는 실온에서 10분 동안 테트라메틸 벤지딘(TMB)의 첨가에 의해 드러났으며, 반응을 0.2 M H2SO4로 중단시켰다. 광학 밀도를 450 nm에서 기록하였다.
샘플 분석 방법: 세포 반응(
IFNg
/
TNFa
생성)
CD4 및 CD8 T-세포에 의한 IFNg 및 TNFa 생성을 전체 PRAME 단백질 서열을 포괄하는 중첩 15mer 펩티드의 풀을 사용한 2시간 자극 후에, 면역화된 마우스(그룹당 3마리 마우스의 4개 그룹)의 비장 세포에서의 세포내 사이토카인 염색(ICS)을 사용하여 유세포분석(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)으로부터의 LSR2)으로 측정하였다.
T 세포의 자극:
- 면역화된 동물의 비장 세포를 PRAME의 전체 서열을 포괄하는 11개 아미노산이 중첩되는 123개의 15mer 펩티드의 풀을 사용하여 재자극하였다. 펩티드(1㎍/㎖/펩티드)를 2㎍/㎖의 항 CD49d 및 2㎍/㎖의 항 CD28을 함유하는 200㎕의 RPMI 5% FCS의 최종 부피로 96 웰 플레이트(U)에서 10e6 T 세포(비장 세포)와 37 ℃에서 2시간 동안 혼합하였다.
- 인큐베이션 후에, 50㎕의 브레펠딘(brefeldin)(1/1000)을 RPMI 5% FCS에 첨가하였다.
세포내
염색:
· CD4/CD8 염색:
- 세포를 96 웰 플레이트(원뿔형 웰)에 전달
- 4 ℃, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리
- 250㎕의 FACS 완충액(PBS 1% FCS)으로 세정
- 세포의 펠렛을 FACS 완충액 중의 2.4G2 1/50 50㎕와 함께 4 ℃에서 10분 동안 인큐베이션
- FACS 완충액 중의 마스터 믹스(Master mix) CD4-PE(희석 Mab: 1/200) 및 CD8PerCP(희석 Mab: 1/200) 50㎕를 4 ℃에서 30분 동안 첨가
- FACS 완충액에서의 세정(1200RPM-10분)
· 세포의 투과화(Permeabilisation):
- 펠렛을 4 ℃에서 20분 동안 cytoFix-cytoPerm 용액 200㎕와 함께 인큐베이션
- permWASH 1x로 세정(1200RPM-10분) - permWASH 용액은 10x 농축이며, 멸균수로 희석함
· IFNγ 및 TNFα 세포내 염색:
- 펠렛을 4 ℃에서 2시간 동안 permWASH 1x 용액 중의 Mix IFNγ APC(희석 Mab: 1/50) 및 TNFα FITC(희석 Mab: 1/50) 50㎕와 함께 인큐베이션
- permWASH 1X로 세정(1200RPM-10분)
- 펠렛을 FACS 완충액 중에 재현탁화
- FACS 분석.
브레펠딘(골로지 플러그(Gologi Plug)): BD 카탈로그 번호 555029
Cytofix/cytoperm: 파민젠(Pharmingen, BD) 카탈로그 번호 554722
Perm/wash 완충액: 파민젠(BD) 카탈로그 번호 554723
랫트 항 마우스 CD49d 정제된 NA LE: BD 카탈로그 번호 553154
랫트 항 마우스 CD28 정제된 NA LE: BD 카탈로그 번호 553295
랫트 항 마우스 CD8a perCp: BD 카탈로그 번호 553036
랫트 항 마우스 CD4 PE: BD 카탈로그 번호 556616
랫트 항 마우스 IFNγ APC: BD 카탈로그 번호 554413
랫트 항 마우스 TNFα FITC: BD 카탈로그 번호 554418
항-마우스 CD16/CD32(2.4G2) 벡톤 딕킨슨 카탈로그 번호 553142(0.5㎎/㎖).
SEQUENCE LISTING
<110> Lemoine, Dominique
Henderickx, Veronique
<120> Novel Compositions
<130> VB63569
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
<400> 1
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tccatgacgt tcctgatgct 20
Claims (24)
- (a) 리포좀 제형 중의 3D-MPL 및 사포닌; 및
(b) 비이온성 등장제(isotonicity agent)를 포함하는 수성 애쥬번트(adjuvant) 조성물로서,
상기 애쥬번트 조성물 중의 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도가 100mM 미만이고 상기 비이온성 등장제가 폴리올인, 수성 애쥬번트 조성물. - 제 1항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도가 80mM 미만인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도가 30mM 미만인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도가 10mM 미만인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도 또는 이온 강도가 5mM 미만인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 5항에 있어서, 본질적으로 염화나트륨을 함유하지 않는 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리올이 소르비톨인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 소르비톨의 농도가 3% 내지 15%(w/v)인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 소르비톨의 농도가 4% 내지 10%(w/v)인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사포닌이 퀼A(QuilA) 또는 이의 유도체인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 퀼A의 유도체가 QS21인 수성 애쥬번트 조성물.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 5mM 염화나트륨 및 5% 내지 6%(w/v) 소르비톨을 포함하는 수성 애쥬번트 조성물.
- 항원 또는 항원 제제 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는, 전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암 및 흑색종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 항원 또는 항원 제제가, 이온 강도가 5mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM 보다 큰 용액 또는 염 농도에서 불용성인 면역원성 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 항원 또는 항원 제제가 종양 관련 항원으로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 항원이 PRAME 또는 NY-ESO-1 중 어느 하나, 또는 이의 단편 또는 유도체로부터 선택되는 면역원성 조성물.
- 제 13항에 있어서, CpG 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 항원 또는 항원 제제 및 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는, 전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암 및 흑색종 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물을 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 정의된 수성 애쥬번트 조성물을 사용하여 재구성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물이 TLR9 효능제를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 TLR9 효능제가 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드인 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 항원 또는 항원 제제가, 이온 강도가 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM 보다 큰 용액 또는 염 농도에서 불용성인 방법.
- (i) 항원 또는 항원 제제를 포함하는 동결건조된 조성물 및 (ii) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 수성 애쥬번트 조성물을 포함하는 키트.
- 제 21항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물이 TLR9 효능제를 추가로 포함하는 키트로서, 상기 TLR9 효능제가 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드인 키트.
- 제 21항에 있어서, 상기 항원 또는 항원 제제가, 이온 강도가 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM 보다 큰 용액 또는 염 농도에서 불용성인 키트.
- 삭제
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