JP5647677B2 - 新規組成物 - Google Patents
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Description
オリゴ2(配列番号2):TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
オリゴ3(配列番号3):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ4(配列番号4):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
オリゴ5(配列番号5):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
代替的なCpGオリゴヌクレオチドは、それらがその中に重要でない欠失または付加を有する上記配列を含んでいてもよい。
リポソーム製剤の形態で3−脱アシル化MPLとQS21とを含むアジュバント組成物を調製した。それは以下のようにして調製した:すなわち、
A.リポソームの調製法:
有機溶媒中、脂質(例えば、合成ホスファチジルコリン)、コレステロール、及び3−O−脱アシル化MPLの混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、水溶液(例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水[100mMのNaCl、20mMのリン酸塩 pH6.1])を添加し、すべての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液を、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、DLSで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ90nm+/−10nmに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを濾過滅菌した。
工程1:濃縮リポソームの希釈
Na2/Kリン酸塩バッファ100mM pH6.1を、注射用水に加えて10倍に希釈し、リン酸塩バッファ濃度を最終製剤において10mMにした。次いで、注射用水(WFI)中30%(w/v)ソルビトール溶液を加えて、最終製剤において4.7%の濃度にし、そしてそれを、室温で、15〜45分間撹拌した。
臑動ポンプを使用して、QS21バルク貯蔵品(200mlを、室温で24時間又は4℃で2日で解凍した)を、200ml/分の速度で、撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を100μg/mlにした。その混合物を、15〜45分間、撹拌した。
濾過滅菌法は、PALL Corporationから市販されているポリエーテルスルフォン(PES)フィルターによって、400ml/分の一定速度で行った。
リポソーム製剤の形態で3−O−脱アシル化MPL及びQS21を含み、且つソルビトール(ASA(ソルビトール)と呼ぶ)を含有するアジュバント組成物を得た。次いで、それを4℃で貯蔵した。
A.リポソームの調製法:
有機溶媒中脂質(例えば、合成ホスファチジルコリン)、コレステロール、及び3−脱アシル化MPL(3D−MPL)の混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を加え、全ての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液を、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、DLSで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ90nm+/−10nmに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを、0.22μmのPES膜で濾過滅菌した。
工程1:濃縮リポソームの希釈
Na2/Kリン酸塩バッファ100mM pH6.45を、注射用水に加えて10倍に希釈し、最終製剤においてリン酸塩バッファ濃度を10mM及びNaCl濃度を150mMにした。この混合物を、室温で5分間、攪拌した。次いで、濃縮リポソーム(それぞれ40mg/ml、10mg/ml、及び2mg/mlのDOPC、コレステロール、及びMPLで作られている)を混合物に加えて、最終製剤におけるMPLの濃度を100μg/mlにした。続いて、その混合物を、室温で、5〜15分間、撹拌した。
QS21バルク貯蔵品(200mlを、室温で24時間又は4℃で2日で解凍した)を、磁気撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を100μg/mlにした。その混合物は、室温で撹拌した。
濾過滅菌法は、PALL Corporationから市販されているポリエーテルスルフォン(PES)フィルターによって行った。
ASAの最終組成物は、1ml当たり、2mgのDOPC、500μgのコレステロール、100μgの3−O−脱アシル化MPL、100μgのQS21であった。
QS21は、赤血球(RBC)を溶解することが知られている。150mMのNaClを含む等価なアジュバント組成物(ASA(150mMのNaCl))に関して認められるのと同じ方法で確実にQS21溶解活性をクエンチするために、実施例1で調製したASA(ソルビトール)アジュバント組成物を試験した。
− ベースレベル(OD>0.1)に比べて高い
− ODのバッファ(「0μg」QS21)に比べて約3倍高い
− 曲線の上昇部分において
− 各試験について測定した。
化学的には、3D−MPLは、4、5又は6位がアシル化された鎖を有する3−脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。各異なる3D−MPL分子は、同族体と呼ばれている。同族体の組成は、一定のままであり、同族体割合間のシフトはないことが重要である。使用されるいかなるバッファも、アジュバント組成物を作るために使用される濃縮リポソーム中における組成と同族体組成を同じにできることも重要でもある。
5.1 CpG(CpG 2006を、すべての実施例で使用する)を有するPRAMEの調製
5.1.1 実施例6及び実施例7、実験1及び実験2において使用する、ASA(150mMのNaCl)と一緒にCpGを有するPRAMEの調製
30%(w/v)のスクロース溶液(注射用水中で調製した)を、注射用水に加え、5%のスクロース濃度にした。次いで、トリス−HClバッファ100mM pH9.5を加えて、トリスバッファ濃度を75mMにした。次いで、ホウ酸塩バッファ100mM pH9.8を加えて、ホウ酸塩バッファ濃度を5mMにした。10%(w/v)のPoloxamer188 溶液(注射用水中で調製した)を注射用水に加えて、0.313%の濃度にした。
濃縮アジュバント調製物
10倍濃縮されたpH6.1のPBS modを、注射用水に加えて10倍に希釈し、最終製剤において1倍濃縮バッファにした。リポソームと、400μg/mlに予備希釈されたQS21から作られる予備混合溶液を、別々に調製した。そのプレミックスを、室温で、15分間、磁気混合した。プレミックスで使用した濃縮リポソームは、40mg/mlのDOPC、10mg/mlのコレステロール、及び2mg/mlの3ー脱アシル化MPLで作られている。そのプレミックスを、PBSに加えて、最終製剤において、MPL濃度を200μg/ml及びQS21濃度を200μg/mlにした。続いて、その混合物を、室温で、15〜30分間、磁気撹拌した。次いで、約23mg/mlでCpGを加えて、最終濃度を1680μg/mlにした。続いて、その混合物を、室温で、15〜30分間、磁気撹拌した。6.1+/−0.1であるようにpHをチェックした。ASを、0.22μmのPESフィルターで濾過し、使用するまで4℃で貯蔵した。
25%のスクロース、25mM pH9.8のホウ酸塩、及び10%のLutrolを、WFIに加えて、それぞれ、最終製剤において、9.25%、5mM、及び0.24%とした。2倍濃縮AS+CpG調製物を加えて、最終製剤では1倍濃縮にした。この混合物を、室温で5分間、攪拌した。スクロース3.15%とホウ酸塩5mM中PRAME抗原を加え、そしてその混合物を室温で5分間撹拌した。
濃縮アジュバント調製物
液体製剤のためのASAを、次のようにして調製した。リン酸塩バッファ1M(pH6.1、100倍希釈する場合)を、磁気撹拌しながら、WFIに加えて、濃縮リポソームにおける50mMのリン酸塩濃度を考慮しながら、最終濃度を45mMにした。次いで、ソルビトール35%を、最終的には21.15%の濃度にした。その混合物に対して、40mg/mlのDOPC、10mg/mlのコレステロール、及び2mg/mlの3−脱アシル化MPLで作られた濃縮リポソームを加えて、最終MPL濃度を450μg/mlにした。QS21バルク(5000μg/ml程度で)を加えて、QS21の最終濃度を450μg/mlにした。その混合物を室温で15分間撹拌する。pHをチェックし、pH6.1+/−0.1に調整した。このASAの最終濃度は、それぞれ、MPLが450μg/ml、QS21が450μg/ml、リン酸塩が45mM、NaClが22.5mM、ソルビトールが21.15%であった。
30%(w/v)のスクロース溶液(注射用水中で調製した)を、注射用水に加えて、最終製剤におけるスクロース濃度を4%にした。次いで、トリス−HClバッファ1M pH9.0を加えて、最終製剤におけるトリスバッファ濃度を16mMにした。次いで、ホウ酸塩バッファ100mM pH9.8を加えて、最終製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を4mMにした。次いで、10%(w/v)のPoloxamer188 溶液(注射用水中で調製した)を加えて、最終製剤における濃度を0.24%にした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、約20mg/ml濃度の(注射用水中)CpG溶液を加えて、最終製剤における濃度を840μg/mlにした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、PRAME抗原バッファ(ホウ酸塩5mM − スクロース3.15% pH 9.8)を加えて、PRAME抗原濃度を1000μg/mlに調整した。次いで、PRAME抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を8μg/mlにした。その混合物を、室温で15分間、磁気撹拌した(150回転/分)。ソルビトール中4.5倍濃縮ASを加えて、MPL及びQS21の最終濃度を100μg/mlにした。pHをチェックした(+/−8.0)。
30%(w/v)のスクロース溶液(注射用水中で調製した)を、注射用水に加え、製剤におけるスクロース濃度を5%にし、次いで、ホウ酸塩バッファ100mM pH9.8を加えて、この製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を5mMにし、次いで、トリス−HClバッファ100mM pH9.0を加えて、20倍に希釈して、この製剤におけるトリスバッファ濃度を5mMにした。次いで、10%(w/v)のPoloxamer188 溶液(注射用水中で調製した)を加えて、最終製剤における濃度を0.3%にした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、約20mg/ml濃度の(注射用水中)CpG溶液を加えて、製剤における濃度を1050μg/mlにした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、PRAME抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を1250μg/mlにした。その混合物を、室温で15分間、磁気撹拌した(150回転/分)。pHを9.4に調整した。得られた混合物を、3mlのガラスバイアルの中に0.5mlだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。
30%(w/v)のスクロース溶液(注射用水中で調製した)を、注射用水に加え、製剤においてスクロース濃度を5%にした。次いで、トリス−HClバッファ1M pH9.0を加えて、50倍に希釈して、この製剤におけるトリスバッファ濃度を20mMにし、次いで、ホウ酸塩バッファ100mM pH9.8を加えて、20倍に希釈して、この製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を5mMにした。次いで、10%(w/v)のPoloxamer188 溶液(注射用水中で調製した)を加えて、最終製剤における濃度を0.3%にした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、約20mg/ml濃度の(注射用水中)CpG溶液を加えて、製剤における濃度を1050μg/mlにした。その混合物を、室温で5分間、磁気撹拌した(150回転/分)。次いで、PRAME抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を1250μg/mlにした。その混合物を、室温で15分間、磁気撹拌した(150回転/分)。pHを9.1に調整した。得られた混合物を、3mlのガラスバイアルの中に0.5mlだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。
5.2.1 実施例6における、CpGを有するNY−ES01の調製
Na/K2リン酸塩バッファ200mM pH 6.3を、磁気撹拌しながら、注射用水に加えて20倍に希釈し、最終製剤において12.5mMにした。次いで、その混合物に対して、以下の賦形剤を、以下の順序で加えた:すなわち、最終的に0.3125%に達するまで10%w/vのモノチオグリセロールを、0.0625%に達するまで5%w/vのPoloxamer188を、最終的に5%に達するまで25%のスクロースを、そして6.25mMに達するまで287mMのL−アルギニンベース(L−Arginine base)を加えた。次いで、その混合物に対して約20mg/mlのCpGバルクを加えて、最終製剤において1050μg/mlの濃度にした。その混合物を、室温で、磁気撹拌(約150回転/分)しながら、10分間保持した。pHは、7.1+/−0.3であるようにチェックした。磁気撹拌を増加させ渦巻かせた。次いで、NY−ESO1を加えて、最終濃度を750μg/mlにした。次いで、磁気撹拌を約150回転/分まで低下させ、混合物を室温で5分間撹拌した。アリコートを採取して、最終的なpH(それは、7.02でなければならない)をチェックした。次いで、最終バルクを凍結乾燥させた。
図4は、塩濃度を5mMに低減し且つアジュバント組成物中にソルビトールを含有させると、(それぞれ実施例5.1.1及び5.2.1で調製された)免疫原性組成物におけるPRAME及びNY−ESO−1の両方の「塩析」が防止されることを示している。図4において:
1.ASA 150mM NaClバッファにおいて再構成されたPRAME抗原。
4.ASAソルビトールバッファにおいて再構成されたNYESO−1抗原。
実験1:
6〜8週齢の20匹の雌のCB6F1マウス(C57BL/6とBalb/Cマウスとの雑種)から成る7つの群を、ヒト用量の1/10に相当するASA+CpGの一定用量(5μgのMPL、5μgのQS21、及び42μgのCpG7909を含む50μL)中に配合したPRAMEタンパク質の筋注(二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射)で2回免疫した。下記のように、最後の免疫化から14日後に、マウスの4つの群(各群n=8)に対して、10+5個のCT26−PRAME腫瘍細胞を皮下に接種した。マウスの7つの群は:
− 第1群:バッファ
− 第2群:PRAMEタンパク質が沈殿する「典型的な」ASA(150mMのNaCl)中に再懸濁させた共凍結乾燥されたPRAME + CpG
− 第3群:ASA(スクロース)中に再懸濁させた共凍結乾燥されたPRAME+CpG
− 第4群:ASA(スクロース − 25℃で48時間インキュベーション)中に再懸濁させた共凍結乾燥されたPRAME+CpG
− 第5群:ASA(ソルビトール)中に再懸濁させた共凍結乾燥されたPRAME+CpG
− 第6群:PRAME+ASA − 70mMのNaCl+CpGを含む「液体」製剤
− 第7群:PRAME+ASA − 70mMのNaCl+CpG(+poloxamer)を含む「液体」製剤、であった。
腫瘍成長
1群当たりの、表面(mm2)(+SD)によって測定された時間経過に対する平均腫瘍成長が、図6に示してある。PRAMEを配合したASA(150mMのNaCl)+CpG、及びASA液体製剤中PRAMEは、PRAME ASA(ソルビトール)+CpGに比べて、腫瘍防御がより低い(腫瘍成長がより大きい)。
PRAME ASA−CpG腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にIFNγ及びTNFαのようなサイトカインを産生できるCD4及びCD8T細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。第二免疫化の7日後に、サイトカイン(IFNγ及びTNFα)を産生するCD4及びCD8T細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞を細胞内サイトカイン染色(ICS)することによって測定した。
6〜8週齢の24匹の雌のCB6F1マウス(C57BL/6とBalb/Cマウスとの雑種)から成る4つの群を、ヒト用量の1/10に相当するASA+CpGの一定用量(5μgのMPL、5μgのQS21、及び42μgのCpG7909を含む50μL)中に配合したPRAMEタンパク質の筋注(二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射)で4回免疫した。
− 第1群:バッファ
− 第2群:PRAMEタンパク質が沈殿する「典型的な」ASA(150mMのNaCl)中に再懸濁させた共凍結乾燥させたPRAME + CpG
− 第3群:ASA(ソルビトール)中に再懸濁させた共凍結乾燥させたPRAME+CpG
− 第4群:PRAME+ASA − 「液体」製剤+CpG(+poloxamer)であった。
− 体液性応答(n=12)
− サイトカインを分泌するT細胞の能力による細胞性応答(3匹のマウスから成るn=4群)
− 腫瘍接種に対する防御効果(n=12)
すべてのマウスは、ASA+CpGアジュバント系(5μgのMPL、5μgのQS21、及び42μgのCpG)のヒト用量の1/10中0.4μgのPRAMEを受容した。
腫瘍成長
1群当たりの、表面(mm2)(+SD)によって測定された時間経過に対する平均腫瘍成長が、図9に示してある。PRAME配合ASA(150mMのNaCl)+CpGは、PRAME ASA(ソルビトール)+CpGに比べて、より低い腫瘍防御(より大きい腫瘍成長)を誘導する。同様な防御は、PRAME ASA(ソルビトール)+CpGと、ASA液体製剤+CpG中PRAMEとに関しても観察された。
後述するように、マウス血清(n=12)を、4回の免疫化の最後から14日後に、PRAME特異的抗体の存在に関して、ELISAによって試験した。抗体応答(総Ig)を、被覆抗原として精製組換えPRAMEタンパク質を使用するELISAによって、評価した。免疫動物からの血清を、PRAME特異的抗体の存在に関して分析した。4回の免疫化後に得られた標準力価の幾何平均(n=12匹のマウス)+/−95%信頼区間が、図7に示してある。典型的なASA(150mMのNaCl)を含むPRAME/ASA+CpGは、非常に小さい抗体応答を誘導し、一方、ASA(ソルビトール)を含むPRAME/ASA+CpGは、非常に高い抗体価を誘導する。この応答は、液体製剤ASAによって誘導される応答と同様である。
PRAME ASA−CpG腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にIFNγ及びTNFαのようなサイトカインを産生できるCD4及びCD8T細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。4回目の免疫化の14日後に、サイトカイン(IFNγ及びTNFα)を産生するCD4及びCD8T細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞を細胞内サイトカイン染色(ICS)することによって測定した。
CT26−PRAME腫瘍モデル及び腫瘍成長
CT26−PRAME細胞系は、PRAMEのcDNAをコードする哺乳類細胞発現プラスミドpCDNA3(カリフォルニア州カールズバッドにあるInvitrogen社製)をCT26結腸癌細胞系に形質移入することによって、発生させた。G418(200μg/ml)による選択と、限界希釈クローニングとにより、定量的リアルタイムPCRによって測定されるPRAME(CT26−PRAME)を発現するクローンを得た。(10−3 PRAME mRNAコピー/ヒト腫瘍によるPRAME発現レベルの範囲内にあるマウスβアクチンのコピー)。
血清を添加する前に、イムノプレートを、4℃で一晩、PRAME抗原で被覆した。37℃で90分間、血清と反応させた後、マウス免疫グロブリンに対するビオチン化ウサギ完全抗体を、37℃で90分間、加えた。抗原抗体複合体を、37℃で30分間、ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と一緒にインキュベートすることによって、可視化した。次いで、この複合体を、室温で10分間、テトラメチルベンジジン(TMB)を添加することによって、可視化し、そして、その反応を0.2MのH2SO4で停止させた。光学密度は、450nmで記録した。
CD4及びCD8T細胞によるIFNg及びTNFa産生は、PRAMEタンパク質配列全体をカバーするオーバーラップしている15merペプチドのプールで2時間刺激した後、免疫マウス(4つの群、1群当たり3匹のマウスから成る)の脾臓細胞に関して細胞内サイトカイン染色(ICS)を使用してフローサイトメトリー(Becton Dickinsonから入手されるLSR2)で測定した。
− PRAME配列全体をカバーする、11アミノ酸だけオーバーラップしている123種の15merペプチドのプールによって、免疫動物の脾臓細胞を再刺激した。96穴プレート(U)において、ペプチド(1μg/ml/ペプチド)を、2μg/mlの抗CD49dと2μg/mlの抗CD28とを含む最終体積200μlのRPMI 5%FCS中で、37℃で2時間、10+6個のT細胞(脾臓細胞)と混合する。
・CD4/CD8染色:
− 細胞を96穴プレート(円錐形ウェル)に移した。
− 250μlのFACSバッファ(PBS1%FCS)で洗浄
− 細胞のペレットを、4℃で10分間、50μlのFACSバッファ中2.4G2 1/50を使用してインキュベートした。
・細胞の透過処理:
− 4℃で20分間にわたって、200μlのcytoFix−cytoPerm溶液を使用して、ペレットをインキュベートした。
− 50μlのpermWASH1x溶液中Mix IFNγ APC(希釈Mab:1/50)及びTNFα FITC(希釈Mab:1/50)を使用して、4℃で2時間、ペレットをインキュベートした。
Brefeldin (Gologi Plug): BD カタログ番号555029
Cytofix/cytoperm: Pharmingen (BD) カタログ番号 554722
Perm/wash buffer: Pharmingen(BD) カタログ番号 554723
Rat anti Mouse CD49d 精製NA LE: BD カタログ番号 553154
Rat anti Mouse CD28 精製NA LE: BD カタログ番号 553295
Rat anti Mouse CD8a perCp: BD カタログ番号553036
Rat anti Mouse CD4 PE: BD カタログ番号556616
Rat anti Mouse IFNγ APC: BD カタログ番号554413
Rat anti Mouse TNFα FITC: BD カタログ番号554418
Anti−mouse CD16/CD32 (2.4G2) Becton Dickinson カタログ番号553142(0.5mg/ml)
Claims (16)
- (a)リポソーム製剤中の3D−MPL及びQS21と、(b)ソルビトール又はスクロースとを含む水性アジュバント組成物であって、該アジュバント組成物における塩化ナトリウム濃度が30mM未満である、上記水性アジュバント組成物。
- 前記塩化ナトリウム濃度が10mM未満である、請求項1記載の水性アジュバント組成物。
- 前記塩化ナトリウム濃度が、5mM未満である、請求項2記載の水性アジュバント組成物。
- 実質的に塩化ナトリウムを含んでいない、請求項3記載の水性アジュバント組成物。
- 前記ソルビトールの濃度が3%〜15%(w/v)である、請求項1〜4のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。
- 前記ソルビトールの濃度が4%〜10%(w/v)である、請求項5記載の水性アジュバント組成物。
- 5mMの塩化ナトリウム及び5%〜6%w/vのソルビトールを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。
- 前記アジュバント組成物におけるイオン強度が100mM未満である、請求項1〜7のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。
- 抗原と、請求項1〜8のいずれかに記載の水性アジュバント組成物とを含む、免疫原性組成物であって、該抗原は、PRAME若しくはNYESO−1のいずれか、又はその断片から選択され、該断片は、少なくとも8アミノ酸長であり、主要なエピトープが保持され、そして前記断片が天然の抗原と交差反応する免疫応答を誘導できるものである、前記免疫原性組成物。
- CpGオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- 少なくとも一種の抗原を含む凍結乾燥組成物を、請求項1〜8のいずれかに記載の水性アジュバント組成物で再構成する工程を含む、請求項9又は10に記載の免疫原性組成物を調製する方法であって、該抗原は、PRAME若しくはNYESO−1のいずれか、又はその断片から選択され、該断片は、少なくとも8アミノ酸長であり、主要なエピトープが保持され、そして前記断片が天然の抗原と交差反応する免疫応答を誘導できるものである、前記方法。
- 前記凍結乾燥組成物が、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 前記抗原が、イオン強度が100mMを超える溶液中で可溶性ではない、請求項11又は12に記載の方法。
- (i)抗原を含む凍結乾燥組成物(ここで、該抗原は、PRAME若しくはNYESO−1のいずれか、又はその断片若しくは誘導体から選択される)と、(ii)請求項1〜8のいずれかに記載の水性アジュバント組成物とを含む、キット。
- 前記凍結乾燥組成物がCpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項14記載のキット。
- 前記抗原が、前記イオン強度が100mMを超える溶液中で可溶性ではない、請求項14又は15に記載のキット。
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