CN102458457A - 包含非离子等渗剂的佐剂组合物 - Google Patents
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Abstract
提供了包含在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷、以及非离子等渗剂的佐剂和免疫原性组合物，其中氯化钠的浓度或离子强度小于100mM。
Description
技术领域
本发明涉及包含非离子等渗剂且具有低浓度的盐，特别是具有以100mM或低于100mM的氯化钠浓度的水性佐剂组合物。本发明还涉及包含抗原或抗原性制剂和所述水性佐剂组合物的免疫原性组合物。
背景技术
佐剂有时用于改善对于任何给定抗原产生的免疫应答。然而，佐剂包括到疫苗或免疫原性组合物内增加组分制备的复杂性以及疫苗组合物的分布和配制的复杂性。佐剂组分和抗原组分各自的制备必须由配制者加以考虑。特别地，应考虑抗原组分与佐剂组分的相容性。这特别是其中冻干抗原或抗原性制剂预期用佐剂制剂重构的情况。在此类情况下，重要的是佐剂制剂的缓冲液适合于抗原或抗原性制剂，并且抗原的免疫原性或可溶性不受佐剂影响。
发明概述
本发明人已发现某些抗原对称为“盐析”的现象特别敏感，所述盐析可以定义为通过用盐例如氯化钠饱和从其溶液中沉淀蛋白质。本发明人已发现在低至150mM的氯化钠浓度时，敏感抗原可以聚集且沉淀。
因此，本发明提供了包含在脂质体制剂中Toll样受体（TLR）4激动剂和皂苷，以及非离子等渗剂的水性等渗佐剂组合物，其中所述组合物中氯化钠的浓度小于100mM。
本发明进一步提供了包含在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷，以及非离子等渗剂的水性等渗佐剂组合物，其中所述组合物中的离子强度小于100mM。
此外，本发明提供了可以用于更广泛范围的蛋白质抗原的水性等渗佐剂组合物，所述蛋白质抗原包括对“盐析”敏感的那些以及不敏感的那些。
本发明还提供了包含抗原或抗原性制剂和水性佐剂组合物的免疫原性组合物和用于制备所述免疫原性组合物的方法，所述水性佐剂组合物包含在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷，以及非离子等渗剂，其中所述佐剂组合物中氯化钠的浓度小于100mM。
附图简述
图1. QS21裂解活性曲线。
图2. 在不同ASA制剂中每种3D-MPL同源物(congener)的百分率。
图3. 用于PRAME/CpG冻干的冷冻干燥循环。
图4. 在ASA（150mM NaCl）和ASA（山梨醇）中重构的PRAME和NYESO-1之间的图示比较。
图5. 在实验1中用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫接种的小鼠的体液应答。
图6. 在实验1中用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫接种的小鼠中的肿瘤保护。
图7. 在实验2中用ASA（150mM NaCl）、ASA（山梨醇）或液体制剂ASA（70mM NaCl）配制的PRAME/CpG免疫接种的小鼠的体液应答。
图8. 在实验2中用ASA（150mM NaCl）、ASA（山梨醇）或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫接种的小鼠的CD4+应答。
图9. 在实验2中用ASA（150mM NaCl）、ASA（山梨醇）或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫接种的小鼠中的肿瘤保护。
发明详述
本发明描述了用非离子等渗剂的替换或部分替换在水性佐剂组合物中的等渗剂，所述等渗剂为盐例如氯化钠。
众所周知对于肠胃外施用，溶液应是生理学等渗的（即具有药学可接受的摩尔渗透压浓度）以避免细胞畸变或裂解。“等渗剂”是生理学耐受的且对制剂（例如本发明的免疫原性组合物）赋予合适张力的化合物，以预防水跨越与制剂接触的细胞膜的净流动。
包含100 mM氯化钠或更多的水性佐剂组合物是已知的，例如在WO 2005/112991和WO2008/142133中的佐剂系统A（ASA）或在WO2007/068907中公开的脂质体佐剂。如WO2008/142133中所示，此类佐剂组合物可以用作稀释剂，以在疫苗接种前重构包含抗原或抗原性制剂的冻干组合物。重要的是此类重构的组合物是等渗的，即含有与机体和血液的细胞中发现的基本上相同的盐浓度，从而使得在注射时不引起细胞皱缩或扩张。一般地，氯化钠用作等渗剂。本发明人已发现某些抗原对“盐析”特别敏感，即当在溶液中含有高浓度的盐时，在溶液中的蛋白质聚集或凝固（coagulate）的过程。
蛋白质抗原聚集时的盐浓度在蛋白质之间不同。本发明人已鉴定了在相对低的盐浓度时，例如在约100mM或更少的氯化钠时，将聚集的一组抗原。这意味着某些已知佐剂组合物不适合于重构包含这些抗原的组合物或与包含这些抗原的组合物一起使用，因为聚集发生。
本发明提供了可以与此类抗原一起使用的水性佐剂组合物，所述抗原即在低于100mM氯化钠的盐浓度时聚集的那些抗原。本发明的水性佐剂组合物包含在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷，以及非离子等渗剂，其中佐剂组合物中氯化钠的浓度低于约100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个具体实施方案中，佐剂组合物中氯化钠的浓度低于10mM或在或低于5mM。在一个进一步具体实施方案中，佐剂组合物基本上不含氯化钠。基本上不含意指氯化钠的浓度在或非常接近于0 mM（即1mM、2mM或3mM）。
使用已知技术和试剂盒，技术人员可以容易地测试钠（Na+）和氯（Cl-）离子的浓度。例如，钠可以使用试剂盒例如来自Biosupply的钠酶促测定试剂盒（目录号：BQ011EAEL）进行测定。氯化物可以使用试剂盒例如来自Biosupply的氯化物酶促测定试剂盒（目录号：BQ006EAEL）进行测定。
本发明进一步提供了包含在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷，以及非离子等渗剂的水性等渗佐剂组合物，其中离子强度小于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个具体实施方案中，佐剂组合物中的离子强度低于10mM或在或低于5mM。在一个进一步具体实施方案中，佐剂组合物具有在或非常接近于0 mM的离子强度。
本发明的佐剂或免疫原性组合物的离子强度可以使用技术人员已知的技术例如使用电导仪进行测量。
用于在与抗原组合物组合的本发明的水性佐剂组合物中使用的合适的非离子等渗剂将需要适合于在人中使用，以及与抗原组合物内的抗原相容且与佐剂组合物的其他组分进一步相容。
特别地，水性佐剂组合物必须是这样的，使得当与佐剂组合物组合时，抗原组合物内的抗原能够保留在溶液中且保留其免疫原性。
在本发明的一个实施方案中，合适的非离子等渗剂是多元醇、糖（特别是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖）或氨基酸例如甘氨酸。在一个实施方案中，多元醇是糖醇特别是C3-6糖醇。示例性糖醇包括甘油、赤藓醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、卫矛醇和艾杜糖醇。在这个实施方案的具体例子中，合适的非离子等渗剂是山梨醇。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的组合物中的非离子等渗剂是蔗糖和/或山梨醇。
在一个实施方案中，在水性佐剂组合物内多元醇的合适浓度是约3 - 约15％（w/v），特别是约3 - 约10％（w/v），例如约3 - 约7 ％（w/v），例如约4 - 约6％（w/v）。在这个实施方案的具体例子中，多元醇是山梨醇。
水性佐剂组合物包含在脂质体制剂中的Toll样受体激动剂（TLR）4激动剂和皂苷。这意味着皂苷和TLR-4激动剂用脂质体进行配制。
术语“脂质体”一般指封装水性内部的单或多层（取决于形成的脂质膜数目，特别是2、3、4、5、6、7、8、9或10层）脂质结构。脂质体和脂质体制剂是本领域众所周知的。能够形成脂质体的脂质包括具有脂肪或脂肪样性质的所有物质。可以构成脂质体中的脂质的脂质可以选自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦酰脂（glycerophosphinolipids）、甘油磷酸酯、硫脂、鞘脂、磷脂、异戊二烯、类固醇、硬脂、甾醇、archeolipids、合成阳离子脂质和含碳水化合物的脂质。
在一个实施方案中，脂质体包含磷脂。合适的磷脂包括（但不限于）：其为磷脂酰胆碱合成中的中间产物的磷酸胆碱（PC）；天然磷脂衍生物：蛋磷酸胆碱、蛋磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化大豆磷酸胆碱、作为天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物：磷酸胆碱（二癸酰-L-α-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰，2-油酰磷脂酰胆碱[POPC]、二反油酰磷脂酰胆碱[DEPC]）、磷酸甘油（1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG]）、磷脂酸（1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA]）、磷酸乙醇胺（1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE]）、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂（mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化的磷脂、末端激活的磷脂）。在一个实施方案中，脂质体包含1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一个实施方案中，使用高度纯化的磷脂酰胆碱，并且可以选自磷脂酰胆碱（蛋）、氢化磷脂酰胆碱（蛋）、磷脂酰胆碱（大豆）、氢化磷脂酰胆碱（大豆）。在一个进一步的实施方案中，脂质体包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。
取决于磷脂组成和用于其制备的方法，脂质体大小可以从30 nm到数μm。在本发明的特定实施方案中，脂质体大小将在50 nm - 500 nm的范围中，并且在进一步实施方案中，50 nm - 200 nm。动态激光散射是本领域技术人员众所周知的用于测量脂质体的大小的方法。
脂质体适当地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，这在室温适当地是非结晶的，例如蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）或二月桂酰磷脂酰胆碱。在一个特定实施方案中，本发明的脂质体含有DOPC。脂质体还可以包含荷电脂质，这增加关于由饱和脂质组成的脂质体的脂质体-皂苷结构的稳定性。在这些情况下，荷电脂质的量适当地是1 - 20％w/w，优选5 - 10％。固醇或磷脂的比值是1 - 50％（摩尔/摩尔），适当地20 - 25％。
用于在本发明中使用的特别合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美树皂树（Quillaja Saponaria Molina）中分离的皂苷制剂，并且首先由Dalsgaard等人在1974年（“Saponin adjuvants”，Archiv. für die gesamte Virusforschung，第44卷，Springer Verlag，Berlin，第243-254页）描述为具有佐剂活性。已通过HPLC分离Quil A的纯化片段，这保留佐剂活性而无与Quil A相关的毒性（EP 0 362 278），例如QS7和QS21（也称为QA7和QA21）。QS-21是衍生自皂树树皮的天然皂苷，这诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体应答。QS21是在本发明的背景中的优选皂苷。
在本发明的合适形式中，在免疫原性组合物内的皂苷佐剂是saponaria molinaquil A的衍生物，优选Quil A的免疫原性活性部分，例如QS-17或QS-21，适当地QS-21。
在一个具体实施方案中，QS21以其更少反应原性（reactogenic）组合物提供，在其中它用外源固醇例如胆固醇猝灭。存在几个具体形式的更少反应原性的组合物，在其中QS21由外源胆固醇猝灭。皂苷/固醇在脂质体制剂结构中（WO 96/33739，实施例1）。
合适的固醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体实施方案中，佐剂组合物包含胆固醇作为固醇。这些固醇是本领域众所周知的，例如胆固醇作为在动物脂肪中发现的天然存在的固醇公开于Merck Index，第11版，第341页中。
当活性皂苷部分是QS21时，QS21 ：固醇的比值一般是1:100 - 1:1（w/w）数量级，适当地1:10 - 1:1（w/w），且优选1:5 - 1:1（w/w）。存在适当过量的固醇，QS21:固醇的比值是至少1:2（w/w）。在一个实施方案中，QS21:固醇的比值是1:5（w/w）。固醇适当地是胆固醇。
水性佐剂组合物包含Toll样受体（TLR）4激动剂。“TLR激动剂”意指作为直接配体或通过内源或外源配体的生成间接地，能够引起通过TLR信号途径的信号应答的组分（Sabroe等人，JI 2003 p1630-5）。TLR4激动剂能够引起通过TLR-4信号途径的信号应答。TLR-4激动剂的合适例子是脂多糖，适当地脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更具体而言3-脱酰单磷酰脂质A（3D – MPL）。
3D-MPL在名称MPL下由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.销售，并且文件自始至终称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-g（Th1）表型的CD4+ T细胞应答。3D-MPL可以根据GB 2 220 211 A中公开的方法产生。在化学上，它是具有4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，小颗粒3D-MPL可以用于制备水性佐剂组合物。小颗粒3D-MPL具有这样的粒子大小，从而使得它可以通过0.22μm滤器无菌过滤。此类制剂在WO 94/21292中描述。优选地，粉末状3D-MPL用于制备本发明的水性佐剂组合物。
可以使用的其他TLR-4激动剂是烷基氨基葡糖苷磷酸盐（AGPs），例如WO98/50399或美国专利号6,303，347中公开的那些（还公开了用于制备AGPs的方法），适当地如美国专利号中公开的RC527或RC529或AGPs的药学可接受的盐。
其他合适的TLR-4激动剂如WO2003/011223和WO 2003/099195中描述的，例如在WO2003/011223的第4-5页上或在WO2003/099195的第3 – 4页上的化合物I、化合物II和化合物III，且特别是在WO2003/011223中作为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764公开的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4激动剂是ER804057。
本发明的水性佐剂组合物包含皂苷和TLR-4激动剂。在一个具体实施方案中，水性佐剂组合物包含QS21和3D-MPL。
TLR-4激动剂例如脂多糖例如3D-MPL可以以1 - 100μg /佐剂组合物的人剂量的量使用。3D-MPL可以以约50μg的水平使用，例如40 - 60 μg，适当地45 - 55 μg或49 - 51 μg或50μg。在一个进一步的实施方案中，佐剂组合物的人剂量包含以约25μg的水平使用的3D-MPL，例如21 - 29μg或22 - 28μg或 28 - 27μg或 24 - 26μg、或25μg。
皂苷例如QS21可以以1 - 100μg /佐剂组合物的人剂量的量使用。QS21可以以约50μg的水平使用，例如40 - 60 μg，适当地45 - 55 μg或49 - 51 μg或50μg。在一个进一步的实施方案中，佐剂组合物的人剂量包含以约25μg的水平使用的QS21，例如21 - 29μg或22 - 28μg或 28 - 27μg或 24 - 26μg、或25μg。
TLR-4激动剂和皂苷都存在于水性佐剂组合物中 - TLR-4激动剂与皂苷的重量比值适当地是1:5 - 5:1，适当地1:1。例如，当3D-MPL以50μg或25μg的量存在时，那么适当地QS21也可以分别以50μg或25μg /水性佐剂组合物的人剂量的量存在。
当佐剂待与液体形式的抗原组合物组合时，佐剂组合物将在人剂量适当体积中，这是人剂量的预期最终体积的约一半。例如，500 μl体积的佐剂用于1 ml的预期最终人剂量，或250 μl体积用于0.5 ml的预期最终人剂量。当与抗原组合物组合时，佐剂组合物是稀释的，以提供疫苗的最终人剂量。此类剂量的最终体积当然将取决于佐剂组合物的起始体积和加入佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。在一个可替代实施方案中，水性佐剂用于重构冻干的抗原组合物。在这个实施方案中，佐剂组合物的人剂量适当体积大约等于人剂量的最终体积。液体佐剂组合物加入含有冻干抗原组合物的小瓶中，并且用于重构冻干的抗原组合物。
本发明因此提供了用于制备免疫原性组合物的方法，其包括用如本文定义的水性佐剂组合物重构包含如本文描述的至少一种抗原或抗原性制剂的冻干组合物的步骤。
在本发明的一个进一步实施方案中，提供了包含（i）包含抗原或抗原性制剂的冻干组合物和（ii）如本文描述的水性佐剂组合物的试剂盒。
在本发明的一个特定实施方案中，提供了包含（i）如本文描述的包含抗原或抗原性制剂的冻干组合物和（ii）如本文描述的水性佐剂组合物的试剂盒。
在一个实施方案中，冻干组合物进一步包含例如如WO 2008/142133中所示的TLR-9激动剂。
在一个可替代实施方案中，提供了其中CpG不与抗原一起共冻干的试剂盒。CpG可以与水性佐剂组合物混合，或以水性或冻干形式在分开小瓶中。相应地，在一个可替代实施方案中，提供了包含（i）如本文描述的包含抗原的冻干组合物；（ii）水性佐剂组合物；和（iii）TLR9激动剂（例如免疫刺激性CpG寡核苷酸）的试剂盒。
用于在本发明的试剂盒中使用的TLR-9激动剂是免疫刺激性寡核苷酸，特别是含有未甲基化的CpG基序的寡核苷酸。此类寡核苷酸是众所周知的，并且例如在WO 96/02555、WO 99/33488和US 5,865，462中描述。用于在本文描述的免疫原性组合物中使用的合适TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，任选含有由至少3个、适当地至少6个或更多个核苷酸分开的2个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸随后为鸟嘌呤核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代硫酸酯，或可能地是硫代硫酸酯键合，尽管还可以使用磷酸二酯和其他核苷酸间键合，包括具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代硫酸酯的方法在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中描述。考虑了包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合的硫代硫酸酯磷酸二酯。可以使用稳定寡核苷酸的其他核苷酸间键合。
适合于包括在本文描述的免疫原性组合物中的CpG寡核苷酸的例子具有下述序列。在一个实施方案中，这些序列含有硫代硫酸酯修饰的核苷酸间键。
可替代的CpG寡核苷酸可以包含在其中它们具有对于其的不连贯缺失或添加的上述序列。
本发明进一步提供了包含抗原或抗原性制剂和如本文描述的水性佐剂组合物的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物具有低于约100mM的氯化钠浓度，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物中氯化钠的浓度低于10mM或在或低于约5mM。在一个进一步具体实施方案中，免疫原性组合物基本上不含氯化钠。基本上不含意指氯化钠的浓度在或非常接近于0 mM。
本发明进一步提供了包含抗原或抗原性制剂和如本文描述的水性等渗佐剂组合物的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物的离子强度小于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物中的离子强度低于10mM或在或低于5mM。在一个进一步具体实施方案中，免疫原性组合物具有在或非常接近于0 mM的离子强度。
显而易见的是，如果免疫原性组合物已使用包含TLR-9激动剂的冻干的抗原组合物进行制备，那么免疫原性组合物也将包含TLR-9激动剂。因此，在一个实施方案中，提供了包含抗原或抗原性制剂、TLR9激动剂、以及在脂质体制剂中TLR-4激动剂和皂苷的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物具有低于约100mM的盐浓度，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在这个实施方案的具体例子中，免疫原性组合物中氯化钠的浓度低于10mM或在或低于约5mM。
在一个进一步的实施方案中，提供了包含抗原或抗原性制剂、TLR9激动剂、以及在脂质体制剂中TLR-4激动剂和皂苷的免疫原性组合物，其中离子强度小于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物中的离子强度低于10mM或在或低于5mM。在一个进一步具体实施方案中，免疫原性组合物具有在或非常接近于0 mM的离子强度。
在一个进一步的实施方案中，提供了包含抗原或抗原性制剂、TLR9激动剂、以及在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物具有低于约100mM的盐浓度，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在这个实施方案的具体例子中，免疫原性组合物中氯化钠的浓度低于10mM或在或低于约5mM。
在一个进一步的实施方案中，提供了包含抗原或抗原性制剂、TLR9激动剂、以及在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21的免疫原性组合物，其中离子强度小于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20 mM或15 mM。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物中的离子强度低于10mM或在或低于5mM。在一个进一步具体实施方案中，免疫原性组合物具有在或非常接近于0 mM的离子强度。
在一个进一步的实施方案中，提供了包含抗原或抗原性制剂以及在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21、和CpG寡核苷酸的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物具有低于约50mM的盐浓度，例如低于约40mM、30mM、20 mM或15 mM。在这个实施方案的具体例子中，免疫原性组合物中氯化钠的浓度低于10mM或在或低于5mM。
在一个实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原或抗原性制剂是任何抗原，其在与溶液混合和/或用溶液溶解后沉淀、凝固或聚集，所述溶液包含超过50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的氯化钠浓度。
在一个实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中使用的抗原或抗原性制剂是任何抗原，其在与溶液混合和/或用溶液溶解后沉淀、凝固或聚集，其中离子强度小于100mM，例如低于90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15 mM或10mM。在一个特定实施方案中，本发明的抗原在具有在或低于5mM的离子强度的溶液中沉淀、凝固或聚集。
本领域技术人员可以通过在此类溶液中混合抗原测定抗原是否满足这个定义。不满足这个定义的抗原在溶解后24小时将仍在溶液中，即液体仍将是澄清的，不含沉淀。在溶液中混合和/或溶解后沉淀、凝固或聚集的抗原可以通过目视检查通过溶液的混浊看出是沉淀的。此外，使用技术人员已知的方法可以观察到在视觉上无法检测的聚集，所述方法包括但不限于SEC-HPLC。
在一个进一步的实施方案中，抗原或抗原性制剂衍生自HIV、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）或其肿瘤相关抗原。在一个特定实施方案中，肿瘤相关抗原选自PRAME或NYESO-1或其片段或衍生物。
PRAME（也称为DAGE）是可以用作本发明的肿瘤相关抗原的抗原。该抗原及其制备在美国专利号5,830,753中描述。PRAME在Annotated Human Gene Database H-Inv DB中在下述登记号下发现：U65011.1、BC022008.1、AK129783.1、BC014974.2、CR608334.1、AF025440.1、CR591755.1、BC039731.1、CR623010.1、CR611321.1、CR618501.1、CR604772.1、CR456549.1和CR620272.1。
还可以使用包含PRAME抗原的融合蛋白。可以采用PRAME或其片段或衍生物，任选以具有异源融合配偶体的融合蛋白形式。特别地，PRAME抗原可以适当地以具有B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae B）蛋白质D或其部分或其衍生物的融合蛋白的形式采用。可以采用的蛋白质D的部分适当地不包括分泌序列或信号序列。适当地融合配偶体蛋白质在融合蛋白序列的N末端上或内包含氨基酸Met-Asp-Pro，并且其中融合配偶体蛋白质不包括蛋白质D的分泌序列或信号序列。例如，融合配偶体蛋白质可以包含蛋白质D的大约或确切地氨基酸17 - 127、18 - 127、19 - 127或20 - 127，或由蛋白质D的大约或确切地氨基酸17 - 127、18 - 127、19 - 127或20 - 127组成。基于合适PRAME抗原的具有蛋白质D的融合蛋白在WO2008/087102中描述，所述文件整体引入本文作为参考。
NY-ESO-1是可以用作本发明的肿瘤相关抗原的另一种抗原。可以采用NY-ESO-1或其片段或衍生物，任选以具有异源融合配偶体的融合蛋白形式。NY-ESO-1在US5804381中描述，所述文件整体引入本文作为参考。蛋白质NY-ESO-1长度为约180个氨基酸，并且可以描述为由3个区域组成：（a）其为约氨基酸1-70的N末端区域，（b）其为约氨基酸71-134的中间区域，和（c）其为约氨基酸135-180的C末端区域。NY-ESO-1可以作为融合蛋白例如作为具有LAGE-1的融合物采用，所述LAGE-1是进一步的CT抗原或其片段，参见其文件整体引入本文作为参考的WO2008/089074。当采用NY-ESO-1的片段时，这些适当地包括一个或多个MHC 1类或2类表位，例如称为A31、DR1、DR2、DR4、DR7、DP4、B35、B51、Cw3、Cw6和A2的那些（参见WO2008/089074）。
尽管像这样对NaCl不敏感，但可以依照本发明采用的进一步抗原是例如MAGE-3家族例如MAGE-A3的MAGE抗原或其片段或衍生物。MAGE-3抗原已例如描述为适合于与NY-ESO-1组合配制 - 参见其文件整体引入本文作为参考的WO2005/105139。
MAGE抗原例如MAGE-A3可以像这样或以衍生物例如化学修饰的衍生物形式和/或以具有异源融合配偶体的融合蛋白形式使用。例如MAGE抗原可以含有还原的二硫桥，以形成已例如用甲酰胺或羧甲基衍生的游离硫醇，参见其文件整体引入本文作为参考的WO99/40188。特别地，MAGE抗原可以适当地以具有B型流感嗜血杆菌蛋白质D或其部分或其衍生物的融合蛋白的形式采用。例如适当地蛋白质D的前三分之一或蛋白质D的N末端100 – 110个氨基酸可以作为融合配偶体采用，参见WO99/40188。
在一个进一步的实施方案中，抗原或抗原组合物可以是本文描述的任何抗原的衍生物。如本文使用的，术语“衍生物”指相对于其天然存在的形式修饰的抗原。本发明的衍生物与天然抗原足够相似，以保留抗原性质且仍能够允许针对天然抗原产生免疫应答。给定衍生物是否产生此类免疫应答可以通过适当地免疫学测定例如ELISA或流式细胞术测量。
如本文使用的，术语“片段”指肿瘤相关抗原或抗原的衍生物的片段，其包含至少一个表位，例如CTL表位，一般至少8个氨基酸的肽。长度至少8个例如8-10个氨基酸或高达20、50、60、70、100、150或200个氨基酸的片段视为落入本发明的范围内，只要片段证实抗原性，即主要表位（例如CTL表位）由片段保留，并且片段能够诱导与天然存在的肿瘤相关抗原交叉反应的免疫应答。示例性片段可以是长度8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200个氨基酸残基（包括在这些范围内的任何值）。
本发明提供了用于在医学中特别是在疾病治疗和/或预防中使用的如本文描述的免疫原性组合物。本发明进一步提供了用于在癌症的免疫治疗性处理中使用的如本文描述的免疫原性组合物。
在这个实施方案的具体例子中，本发明提供了用于在选自下述的一种或多种癌症的免疫治疗性处理中使用的如本文描述的免疫原性组合物：前列腺、乳腺、结肠直肠、肺、胰腺、肾、卵巢或黑色素癌。
本发明进一步提供了在有此需要的个体中的癌症治疗或预防方法，其包括给所述个体提供有效量的如本文描述的免疫原性组合物的步骤。
在这个实施方案的具体例子中，本发明提供了选自下述的癌症的治疗或预防方法：前列腺、乳腺、结肠直肠、肺、胰腺、肾、卵巢或黑色素癌。
本发明现在将借助于下述非限制性例子进一步描述。
实施例
实施例1：佐剂组合物ASA（山梨醇）的制备
制备在脂质体制剂中包含3-脱酰MPL和QS21的佐剂组合物。这如下制备：
A. 制备脂质体的方法：
在有机溶剂中的脂质（例如合成磷脂酰胆碱）、胆固醇和3-O-脱酰MPL的混合物在真空下干燥。随后加入水溶液（例如磷酸盐缓冲盐水[100mM NaCl、20mM磷酸盐pH 6.1]），并且搅拌容器直至所有液态在悬浮液中。这种悬浮液随后用高剪切混合器预匀浆化，并且随后高压匀浆化直至脂质体大小减少至通过DLS测量的约90nm+/-10nm。脂质体随后进行无菌过滤。
B. ASA制剂:
步骤1：浓缩脂质体的稀释
将10倍稀释时的Na2/K磷酸盐缓冲液100mM pH6.1加入注射用水中，以达到在最终制剂中的10mM磷酸盐缓冲液浓度。随后加入在注射用水（WFI）中的30％（w/v）山梨醇溶液，以达到在最终制剂中4.7％的浓度 – 这在室温搅拌15 – 45分钟。
浓缩脂质体（由分别以40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和MPL制成）随后加入混合物中，以达到在最终制剂中100μg/ml MPL的浓度。
混合物随后在室温搅拌15 – 45分钟。
步骤2：QS21添加
使用蠕动泵，用蠕动泵以200ml/分钟的速率在磁搅拌下将QS21总体原液（对于200ml，在RT解冻24小时或在4℃解冻2天）加入稀释脂质体中，以达到在最终制剂中的100μg/ml浓度。混合物搅拌15 – 45分钟。
最终ASA制剂含有100μg MPL/ml和100μg QS21/ml。
步骤3：pH经检查为6.1+/-0.3
步骤4：无菌过滤
无菌过滤在来自PALL Corporation的聚苯醚砜（PES）滤器上以400ml/分钟的恒定速率实现。
步骤5：在+2℃ - +8℃贮存
获得佐剂组合物，这包含在脂质体制剂中的3-O-脱酰MPL和QS21且包含山梨醇（命名为ASA（山梨醇）），随后贮存于4℃。
实施例2：佐剂组合物ASA（150mM NaCl）的制备
A. 制备脂质体的方法：
在有机溶剂中的脂质（例如合成磷脂酰胆碱）、胆固醇和3-脱酰MPL（3D-MPL）的混合物在真空下干燥。随后加入磷酸盐缓冲盐水，并且搅拌容器直至所有液态在悬浮液中。这种悬浮液随后用高剪切混合器预匀浆化，并且随后高压匀浆化直至脂质体大小减少至通过DLS测量的约90nm+/-10nm。脂质体随后在0.22μm PES膜上进行无菌过滤。
B. ASA制剂:
步骤1：浓缩脂质体的稀释
将10倍稀释时的Na2/K磷酸盐缓冲液100mM pH 6.45和NaCl 1.5M加入注射用水中，以分别达到在最终制剂中的10mM磷酸盐和NaCl 150mM浓度。这种混合物在室温搅拌5分钟。浓缩脂质体（由分别以40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和MPL制成）随后加入混合物中，以达到在最终制剂中100μg/ml MPL的浓度。混合物随后在室温搅拌5 – 15分钟。
步骤2：QS21添加
在磁搅拌下将QS21总体原液（对于200ml，在RT解冻24小时或在4℃解冻2天）加入稀释脂质体中，以达到在最终制剂中的100μg/ml浓度。混合物在RT搅拌。
步骤3：检查pH以便为6.1+/-0.1。
步骤4：无菌过滤
无菌过滤在来自PALL Corporation的聚苯醚砜（PES）滤器上实现。
步骤5：在+2℃ - +8℃贮存
ASA的最终组成是2mg DOPC、500μg胆固醇、100μg 3-O-脱酰MPL、100μg QS21/1 ml。
实施例3. QS21裂解活性
已知QS21裂解红血细胞（RBC）。测试如实施例1中制备的ASA（山梨醇）佐剂组合物，以确保QS21裂解活性以与用包含150mM NaCl（ASA（150mM NaCl））的等价佐剂组合物可见相同的方式进行猝灭。
使用鸡红血细胞（RBC）通过溶血测定来测量QS21裂解活性。RBC在4℃以550g离心。弃去上清液。团块在PBS缓冲液中小心地重悬浮，以达到起始体积，并且重复相同操作直至上清液不再是红色（一般3次）。如果不直接使用（并且在使用当天再次洗涤），那么团块贮存于4℃最大限度3 – 4天，或如果当天使用，那么在缓冲液中稀释约10倍。
在ASA缓冲液中（在测试ASA样品后在盐中或在山梨醇缓冲液中）当场制备QS21剂量范围曲线，并且制备佐剂样品（包含QS21的50μg或90μg等价物意味着500μl或900μl ASA的等价物）。用足够缓冲液（包含或不包含山梨醇作为测试样品的缓冲液的功能）将最终体积调整至在标准和样品中的900μl。由于其乳光，ASA干扰光密度（OD）。因而制备ASA“空白对照”且从ASA测试的样品的OD中扣除其OD。这些空白对照对应于与样品中测试的体积相同的ASA体积，但用缓冲液调整至1ml。不将RBC加入这些空白对照中。标准和样品随后与RBC（100μl稀释的RBC加入900μl标准和样品中）一起在室温（RT）孵育30分钟。样品随后以900g离心5分钟。在离心后测量在540nm的光密度。
通过有限测试执行裂解活性的测定。
1. 检测限度（LOD）定义为导致下述OD的最低浓度的QS21：
-高于基础水平（OD>0.1）
-为OD的缓冲液（“o μg” QS21）的约3倍
-在曲线的上升部分中
-对于每个测试测定的。
2. 如果关于佐剂样品的OD大于ODLOD，那么QS21裂解产物在佐剂样品中保持为阳性的。
QS21曲线的例子：
*测试50ug QS21等价物。150mM氯化钠缓冲液。
在这个测定中的检测限度在0.9ug QS21和0.12的OD。
在包含150mM氯化钠的佐剂组合物中的QS21猝灭估计为对于测试的50μg QS21等价物超过98.2％。在测试的90μg等价物的情况下，结论是超过99％。
QS21猝灭随后与包含山梨醇和仅5mM氯化钠的等价佐剂组合物比较。在4℃贮存ASA后或在加速稳定性后（在37℃7天）生成数据。对于在山梨醇中的ASA，在含山梨醇的缓冲液中实现QS21标准曲线。
测试的50μg QS21等价物，除*测试的90μg QS21等价物外。
得出结论QS21在低氯化钠缓冲液中充分猝灭。
实施例4：MPL同源物。
在化学上，3D-MPL是具有4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。每种分开的3D-MPL分子称为同源物。重要的是同源物组成保持恒定，在同源物的比例之间没有转变。还重要的是使用的任何缓冲液致使同源物组成与用于制备佐剂组合物的浓缩脂质体中的相同。
如图2上所示，在3D-MPL浓缩脂质体中检查同源物组成（浓缩脂质体LIP07-217，图2的第一个柱），包含在150mM NaCl缓冲液中的3D-MPL脂质体和QS21的佐剂组合物（佐剂150mM NaCl，或ASA（150mM NaCl），第二个柱），和包含在山梨醇和5mM NaCl缓冲液中的3D-MPL脂质体和QS21的佐剂组合物（佐剂山梨醇，或ASA（山梨醇），柱3-7）。
还在制备和在37℃维持后的第0天和7天时在2批ASA（山梨醇）佐剂中检查同源物组成，以确保随着时间过去没有进化（参见图2的最后4个柱）。
通过IP-HPLC-氟检测（ARD）来测定在浓缩脂质体或ASA（山梨醇）样品中MPL的四、五和六酰化同源物的相对分布。标准和样品都用丹磺酰肼衍生，这在二糖主链上引入氟活性生色团。在C18反相柱上使用四丁铵氢氧化物（TBAOH）作为离子对试剂分析衍生的样品。包含相同数目的脂肪酰基的同源物在不同基团（四酰基、五酰基和六酰基）中洗脱。通过比较每个基团的峰面积与所有MPL同源物的总峰面积推导同源物的分布。
图2显示每种同源物的百分比。在佐剂缓冲液之间未发现同源物组成中的显著差异，并且同源物组合物在山梨醇缓冲液中随着时间过去是一致的。
实施例5：组合物的制备以及在实施例6和7中使用
5.1 具有CpG的PRAME的制备（CpG 2006在所有实施例中使用）
5.1.1用ASA（150mM NaCl）制备在实施例6和实施例7实验1和实验2中使用的具有CpG的PRAME
30％（w/v）蔗糖溶液（在注射用水中制备）加入注射用水中，以达到5％的蔗糖浓度。随后加入Tris-HCl缓冲液100mM pH 9.5，以达到75 mM Tris缓冲液浓度。随后加入硼酸盐缓冲液100 mM pH 9.8，以达到5 mM硼酸盐缓冲液浓度。随后加入10％（w/v）泊洛沙姆188溶液（在注射用水中制备），以达到0.313％的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入以约20 mg/ml浓度（在注射用水中）的CpG溶液，以达到在最终制剂中的1050 μg/ml浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入PRAME抗原，以达到1250 μg/ml的蛋白质浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）15分钟。检查pH（9.51）。通过在3 ml玻璃小瓶中的0.5 ml填充所获得的混合物，随后冷冻干燥。
图3举例说明用于PRAME的冷冻干燥循环（持续时间=40小时）。
用包含150mM NaCl如在实施例2中制备的625μl水性佐剂组合物重构所得到的冻干块。冻干块包含1.25倍的过量的抗原剂量，以在用16mM Tris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆 188、840μg/ml CpG和1000 μg/ml PRAME的最终组合物重构后，具有正确的抗原/佐剂比值。
5.1.2用于实施例7实验1中“液体制剂”（70mM NaCl）的具有CpG的PRAME的制备
浓缩的佐剂制剂
将10倍稀释时的PBS mod 10倍浓缩的pH 6.1加入注射用水中，以达到在最终制剂中的1倍浓缩的缓冲液。分开制备以400μg/ml预稀释的由脂质体和QS21制成的预混合溶液。预混合物在室温磁混合15分钟。在预混合物中使用的浓缩脂质体由40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和2mg/ml 3-酰化的MPL制成。将预混合物加入PBS中，以达到在最终制剂中200μg/ml的MPL浓度和200μg/ml的QS21浓度。混合物在RT磁混合15 - 30分钟。随后加入以约23mg/ml的CpG，以达到1680μg/ml的终浓度。混合物在RT磁混合15 - 30分钟。检查pH，以便为6.1+/-0.1。AS在0.22μm PES滤器上过滤，并且贮存于4℃直至使用时。
最终制剂
蔗糖25％、硼酸盐25mM pH9.8和Lutrol 10％加入WFI中，以分别达到在最终制剂中的9.25％、5mM和0.24％。加入2倍浓缩的AS + CpG制剂，导致在最终制剂中的1倍浓缩。混合物在RT搅拌5分钟。随后加入在蔗糖3.15％、硼酸盐5mM中的PRAME抗原，并且混合物在RT搅拌5分钟。
5.1.3用于实施例7的实验2中的“液体制剂”具有CpG的PRAME的制备
浓缩的佐剂制剂
如下制备用于液体制剂的ASA。在磁搅拌下将磷酸盐缓冲液1M（当100倍稀释时pH 6.1）加入WFI中，以达到最终45mM，考虑到浓缩脂质体中的50mM磷酸盐浓度。随后加入山梨醇35％，以达到21.15％最终浓度。由40mg/ml DOPC、10mg/ml胆固醇和2mg/ml 3-脱酰MPL制成的浓缩脂质体加入混合物中，以达到450μg/ml的最终MPL浓度。加入QS21总体（以约5000μg/ml），以达到450μg/ml的最终QS21浓度。混合物在RT搅拌15分钟。检查pH，并且调整至pH 6.1+/-0.1。在这种ASA中的最终浓度分别为对于MPL 450μg/ml、对于QS21 450μg/ml、45mM磷酸盐、22.5 mM NaCl、21.15％山梨醇。
最终制剂
30％（w/v）蔗糖溶液（在注射用水中制备）加入注射用水中，以达到在最终制剂中4％的蔗糖浓度。随后加入Tris-HCl缓冲液1M pH 9.0，以达到在最终制剂中的16 mM Tris缓冲液浓度。随后加入硼酸盐缓冲液100 mM pH 9.8，以达到在最终制剂中的4 mM硼酸盐缓冲液浓度。随后加入10％（w/v）泊洛沙姆188溶液（在注射用水中制备），以达到在最终制剂中0.24％的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入以约20 mg/ml（在注射用水中）浓度的CpG溶液，以达到在最终制剂中840 μg/ml的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入PRAME抗原缓冲液（硼酸盐5 mM – 蔗糖3.15％pH 9.8），以将PRAME抗原浓度调整至1000 μg/ml。随后加入PRAME抗原，以达到在最终制剂中8 μg/ml的蛋白质浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）15分钟。加入在山梨醇中4.5倍浓缩的AS，以达到100μg/ml MPL和QS21的最终浓度。检查pH（+/-8.0）。
5.1.4用于实施例7实验1中ASA（山梨醇）和ASA（蔗糖）的具有CpG的PRAME的制备
30％（w/v）蔗糖溶液（在注射用水中制备）加入注射用水中，以达到在最终制剂中5％的蔗糖浓度，随后加入硼酸盐缓冲液100 mM pH 9.8，以达到在这种制剂中的5 mM硼酸盐缓冲液浓度，随后加入20倍稀释时的Tris-HCl缓冲液100mM pH 9.0，以达到在最终制剂中的5 mM Tris缓冲液浓度。随后加入10％（w/v）泊洛沙姆188溶液（在注射用水中制备），以达到在制剂中0.3％的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入以约20 mg/ml（在注射用水中）浓度的CpG溶液，以达到在制剂中1050 μg/ml的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入PRAME抗原，以达到在最终制剂中1250 μg/ml的蛋白质浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）15分钟。pH测量为9.4。通过在3 ml玻璃小瓶中的0.5 ml填充所获得的混合物，随后冷冻干燥。
ASA（山梨醇）如实施例1中提及的制备，伴随某些轻微差异：在加入稀释的浓缩脂质体之前，山梨醇浓度为4.6％，并且QS21以400μg/ml预稀释。
ASA（蔗糖）如实施例1中提及的制备，伴随下述差异：在加入稀释的浓缩脂质体之前，山梨醇由蔗糖替换（使用30％w/v蔗糖溶液的母液，并且最终蔗糖浓度为8.3％），并且QS21以400μg/ml预稀释。
用625μl水性佐剂组合物重构所得到的冻干块，并且最终组合物包含4mM Tris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆 188、840μg/ml CpG和1000 μg/ml PRAME。
5.1.5用于实施例7的实验2中的ASA（山梨醇）具有CpG的PRAME的制备
30％（w/v）蔗糖溶液（在注射用水中制备）加入注射用水中，以达到在最终制剂中5％的蔗糖浓度，随后加入50倍稀释时的Tris-HCl缓冲液1M pH 9.0，以达到在最终制剂中的20 mM Tris缓冲液浓度，随后加入稀释20倍时的硼酸盐缓冲液100 mM pH 9.8，以达到在这种制剂中的5 mM硼酸盐缓冲液浓度。随后加入10％（w/v）泊洛沙姆188溶液（在注射用水中制备），以达到在制剂中0.3％的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入以约20 mg/ml（在注射用水中）浓度的CpG溶液，以达到在制剂中1050 μg/ml的浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）5分钟。随后加入PRAME抗原，以达到在最终制剂中1250 μg/ml的蛋白质浓度。混合物在RT磁搅拌（150 rpm）15分钟。pH测量为9.1。通过在3 ml玻璃小瓶中的0.5 ml填充所获得的混合物，随后冷冻干燥。
ASA山梨醇如实施例1中描述的制备。用625μl水性佐剂组合物重构所得到的冻干块，并且最终组合物包含16mM Tris、4mM硼酸盐、4％蔗糖、0.24％泊洛沙姆 188、840μg/ml CpG和1000 μg/ml PRAME。
5.2 具有CpG的NY-ESO1的制备
5.2.1实施例6中具有CpG的NY-ESO1的制备。
在磁力搅拌下将20倍稀释时的Na/K2磷酸盐缓冲液200mM pH 6.3加入注射用水中，以达到在最终制剂中的12.5mM。随后将下述赋形剂加入混合物中且以下述次序：以10％w/v的一硫代甘油以达到最终0.3125％，以5％w/v的泊洛沙姆 188以达到最终0.0625％，蔗糖25％以达到最终5％，和L-精氨酸碱287mM以达到6.25mM。随后将以约20mg/ml的CpG总体加入这种混合物中，以达到在最终制剂中1050μg/ml的浓度。混合物在磁搅拌（约150rpm）下在室温维持10分钟。检查pH，并且以便为7.1+/-0.3。增加磁搅拌以产生涡旋。随后加入NY-ESO1以达到750μg/ml的最终浓度。磁搅拌随后减少至约150rpm，并且混合物在室温搅拌5分钟。获得等分试样以检查最终pH（其必须是7.02）。最终总体随后进行冷冻干燥。
用625μl ASA缓冲液（150mM NaCl和山梨醇）重构所得到的冻干块。
实施例6.在包含山梨醇作为缓冲剂的佐剂组合物中“盐析”的阻止。
图4证实在佐剂组合物中减少盐浓度至5mM且包括山梨醇阻止免疫原性组合物中PRAME和NY-ESO-1的“盐析”（分别如实施例5.1.1和5.2.1中制备的）。在图4中：
1. 在ASA 150mM NaCl缓冲液中重构的PRAME抗原。
2. 在ASA山梨醇缓冲液中重构的PRAME抗原。
3. 在ASA 150mM NaCl缓冲液中重构的NYESO-1抗原。
4. 在ASA山梨醇缓冲液中重构的NYESO-1抗原。
图4是在ASA（150mM NaCl）和ASA（山梨醇）中重构的PRAME和NYESO-1之间的照相比较。如可以看出的，与在ASA（山梨醇）中重构的PRAME比较，在ASA（150mM NaCl）中重构的PRAME看起来是混浊的。类似地，与在ASA（山梨醇）中重构的NY-ESO抗原比较，在ASA（150mM NaCl）中重构的NY-ESO看起来是混浊的。
实施例7.体内小鼠模型
实验1:
用对应于1/10th的人剂量（50μL含有5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG7909）在ASA +CpG的固定剂量中配制的PRAME蛋白质2次肌内免疫接种7个组的6 – 8周龄的20只雌性CB6F1小鼠（C57BL/6和Balb/C小鼠的杂种）（每2周，在左和右腓肠肌中交替注射）。在最后一次免疫接种后14天，如下所述，用10e5 CT26-PRAME肿瘤细胞皮下攻击4个组的小鼠（n=8每个组）。7个小鼠组是：
-组1：缓冲液
-组2：在其中PRAME蛋白质沉淀的“标准”ASA（150mM NaCl）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组3：在ASA（蔗糖）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组4：在ASA（蔗糖 – 在25℃孵育48小时）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组5：在ASA（山梨醇）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组6：PRAME + ASA – 含有70mM NaCl的“液体”制剂+CpG
-组7：PRAME + ASA – 含有70mM NaCl的“液体”制剂+CpG（+ 泊洛沙姆）。
在最后一次免疫接种后7天，分析通过T细胞分泌细胞因子的能力的细胞应答（n=3只小鼠的4组）。
所有小鼠接受在ASA +CpG佐剂系统（5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG）的1/10th的人剂量中的0.4μg PRAME。
结果：
肿瘤生长
如通过表面（mm2）（+SD）测量的，随着时间过去的平均肿瘤生长/组呈现于图6中。在ASA液体制剂中PRAME配制的ASA（150mM NaCl）+CpG 和PRAME诱导比PRAME ASA（山梨醇）+ CpG更低的肿瘤保护（更大的肿瘤生长）。
细胞应答（2次免疫接种后7天——n=4组，3只小鼠/组处理）：
在用PRAME ASA-CpG肿瘤抗原免疫接种小鼠后能够产生细胞因子如IFNγ和TNFα的CD4和CD8 T细胞的频率用于反映不同制剂诱导功能细胞应答的能力。第二次免疫接种后7天，通过在免疫接种小鼠的脾细胞上的细胞内细胞因子染色（ICS）测量产生细胞因子（IFNγ和TNFα）的CD4和CD8 T细胞百分率。
产生IFNγ和TNFα的CD4％（平均值+/-标准差）显示于图5中。
在这个实验中未发现可测量的CD8应答。
与在ASA（山梨醇）+ CpG中配制的PRAME比较，在ASA（150mM NaCl）+CpG中配制的PRAME蛋白质显示为沉淀且诱导更低的特异性T细胞应答。当PRAME蛋白质在ASA（山梨醇）+ CpG和ASA“液体”制剂（70mM NaCl）+ CpG中配制时，获得相似地良好的PRAME特异性CD4应答（无统计差异）。还测试了体液免疫应答，但在2次注射后的数据是无法解释的。
实验2：
用对应于1/10th的人剂量（50μL含有5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG7909）在ASA +CpG的固定剂量中配制的PRAME蛋白质4次肌内免疫接种4个组的6 – 8周龄的20只雌性CB6F1小鼠（C57BL/6和Balb/C小鼠的杂种）（每2周，在左和右腓肠肌中交替注射）。在最后一次免疫接种后14天，如下所述，用10e5 CT26-PRAME肿瘤细胞皮下攻击4个组的小鼠（n=12每个组）。4个小鼠组是：
-组1：缓冲液
-组2：在其中PRAME蛋白质沉淀的“标准”ASA（150mM NaCl）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组3：在ASA（山梨醇）中重悬浮的共冻干的PRAME + CpG
-组4：PRAME + ASA –“液体”制剂+CpG（+ 泊洛沙姆）。
在最后一次免疫接种后14天，如下使用不同读出分析免疫应答：
-体液应答（n=12）
-分析通过T细胞分泌细胞因子的能力的细胞应答（n=4组的3只小鼠/组）
-针对肿瘤攻击的保护效应（n=12）。
所有小鼠接受在ASA +CpG佐剂系统（5μg MPL、5μg QS21和42μg CpG）的1/10th的Hu剂量中的0.4μg PRAME。
结果：
肿瘤生长
如通过表面（mm2）（+SD）测量的，随着时间过去的平均肿瘤生长/组呈现于图9中。PRAME配制的ASA（150mM NaCl）+CpG诱导比PRAME ASA（山梨醇）+ CpG更低的肿瘤保护（更大的肿瘤生长）。对于在ASA液体制剂+ CpG）中的PRAME ASA（山梨醇）+ CpG和PRAME观察到相似保护。
样品分析：体液应答：
如下所述，在4次免疫接种的最后一次后14天，对于PRAME特异性抗体的存在通过ELISA测试小鼠血清（n=12）。使用纯化的重组PRAME蛋白质作为包被抗原，通过ELISA评估抗体应答（总Ig）。对于PRAME特异性抗体的存在分析来自免疫接种动物的血清。在4次免疫接种后获得的标准滴度（n=12只小鼠）的几何平均值 +/- 95％置信区间显示于图7中。含有标准ASA（150mM NaCl）的PRAME/ASA +CpG诱导极小的抗体应答，而含有ASA（山梨醇）的PRAME/ASA +CpG诱导极高的抗体滴度。这种应答类似于通过液体制剂ASA诱导的那种。
细胞应答（第4次免疫接种后14天– n=4组的3只小鼠/组处理）：
在用PRAME ASA-CpG肿瘤抗原免疫接种小鼠后能够产生细胞因子如IFNγ和TNFα的CD4和CD8 T细胞频率用于反映不同制剂诱导功能细胞应答的能力。第四次免疫接种后14天，通过在免疫接种小鼠的脾细胞上的细胞内细胞因子染色（ICS）测量产生细胞因子（IFNγ和TNFα）的CD4和CD8 T细胞百分率。
产生IFNγ和TNFα的CD4％（平均值+/-标准差）显示于图8中。p值在很大程度上次于0.05，证实在组2以及组3和4之间的显著差异。
在这个实验中未发现可测量的CD8应答。
与在ASA（山梨醇）+ CpG中配制的PRAME比较，在ASA（150mM NaCl）+CpG中配制的PRAME蛋白质显示为沉淀且诱导统计上更低的特异性T细胞应答。相比之下，当PRAME蛋白质在ASA（山梨醇）+ CpG和ASA“液体”制剂+ CpG中配制时，获得相似地良好的PRAME特异性CD4应答。
方法
CT26-PRAME肿瘤模型和肿瘤生长
通过用编码关于PRAME的cDNA的哺乳动物表达质粒pCDNA3（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染CT26结肠癌细胞系，生成CT26-PRAME细胞系。如通过定量实时PCR测定的，用G418（200 μg/ml）选择和有限稀释克隆获得表达PRAME（CT26-PRAME）的克隆（10e-3 PRAME mRNA拷贝/小鼠β肌动蛋白的拷贝，这在通过人肿瘤的PRAME表达水平的范围中）。
CT26 PRAME细胞在体外在37℃伴随5％CO2在RPMI培养基中生长，所述RPMI培养基具有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和0.1％β-巯基乙醇。如上所述在用PRAME的最后一次免疫接种后14天，将细胞受胰蛋白酶作用，在无血清培养基中洗涤2次，并且在200μl RPMI培养基中皮下注射在4个组的CB6F1小鼠的右胁腹中。个体肿瘤生长每周测量2次。随着时间过去记录每个肿瘤的2个主要直径的乘积，并且数据显示于每组动物中的平均肿瘤表面（mm2）。
样品分析：体液应答
在加入血清前，免疫板用PRAME抗原在4℃包被过夜。在37℃与血清反应90分钟后，在37℃加入针对小鼠免疫球蛋白的生物素化的兔全抗体90分钟。通过与链霉抗生物素蛋白-生物素化的过氧化物酶复合物一起在37℃孵育30分钟显现抗原-抗体复合物。随后通过加入四甲基联苯胺（TMB）在室温10分钟显现这种复合物，并且用0.2 M H2SO4停止反应。记录在450 nm的光密度。
样品分析法 ：细胞应答（IFNg/TNFa产生）
在用覆盖完整PRAME蛋白质序列的重叠15聚体肽的库刺激2小时后，使用在免疫接种的小鼠（每组3只小鼠的4个组）的脾细胞上的细胞内细胞因子染色（ICS），通过流式细胞术（来自Becton Dickinson的LSR2）测量通过CD4和CD8 T细胞的IFNg和TNFa产生。
T细胞的刺激：
- 用重叠11个氨基酸的123个15聚体肽的库再刺激免疫接种动物的脾细胞。在含有2μg/ml抗CD49d和以2μg/ml的抗CD28的200μl RPMI 5％FCS的最终体积中在96孔板（U）中，肽（1μg/ml/肽）与10e6 T细胞（脾细胞）在37℃混合2小时。
- 在孵育后，加入在RPMI 5％FCS中的50μl布雷菲尔得菌素（1/1000）。
细胞内染色：
· CD4/CD8 染色:
- 细胞转移到96孔板中（圆锥形孔）
- 在4℃离心1000rpm 5秒
- 用250μl FACS缓冲液（PBS 1％FCS）洗涤
- 细胞的团块与50μl 2.4G2 1/50一起在FACS缓冲液中在10秒过程中在4℃孵育
- 在4℃在30秒过程中加入在FACS缓冲液中的50μl主要混合物CD4-PE（稀释物Mab：1/200）和CD8PerCP（稀释物Mab：1/200）
- 在FACS缓冲液中洗涤（1200RPM-10’）
· 细胞的渗透化：
- 团块与200μl cytoFix-cytoPerm溶液一起在20秒过程中在4℃孵育
- 用permWASH 1x（1200RPM-10’）洗涤 –permWASH溶液是10x浓缩的，在无菌水中稀释
· I IFNγ和TNFα细胞内染色：
- 团块与50μl Mix IFNγ APC（稀释物Mab：1/50）和TNFα FITC（稀释物Mab：1/50）一起在permWASH1x溶液中在4℃孵育2小时
- 用permWASH 1X（1200RPM-10’）洗涤
- 团块重悬浮于FACS缓冲液中
- FACS分析
布雷菲尔得菌素（Gologi Plug）：BD目录555029
Cytofix / cytoperm：Pharmingen（BD）目录号554722
Perm/洗涤缓冲液：Pharmingen（BD）目录号554723
大鼠抗小鼠CD49d纯化的NA LE ：BD目录号553154
大鼠抗小鼠CD28纯化的NA LE：BD目录号553295
大鼠抗小鼠CD8a perCp：BD目录号553036
大鼠抗小鼠CD4 PE：BD目录号556616
大鼠抗小鼠 IFNγ APC：BD目录号554413
大鼠抗小鼠TNFα FITC：BD目录号554418
抗小鼠CD16/CD32（2.4G2）Becton Dickinson目录号553142（0.5mg/ml）
序列表
<110> Lemoine, Dominique
Henderickx, Veronique
<120> 新型组合物
<130> VB63569
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
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tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
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tccatgacgt tcctgatgct 20
Claims (24)
1.一种水性佐剂组合物，其包含：（a）在脂质体制剂中的TLR-4激动剂和皂苷；和（b）非离子等渗剂，其中所述佐剂组合物中氯化钠的浓度或离子强度小于100mM。
2.如权利要求1中要求的水性佐剂组合物，其中所述氯化钠的浓度或离子强度小于80mM。
3.如权利要求2中要求的水性佐剂组合物，其中所述氯化钠的浓度或离子强度小于30mM。
4.如权利要求3中要求的水性佐剂组合物，其中所述氯化钠的浓度或离子强度小于10mM。
5.如权利要求4中要求的水性佐剂组合物，其中所述氯化钠的浓度或离子强度小于5mM。
6.如权利要求5中要求的水性佐剂组合物，其基本上不含氯化钠。
7.根据任一前述权利要求的水性佐剂组合物，其中所述非离子等渗剂是多元醇。
8.根据权利要求7的水性佐剂组合物，其中所述多元醇是山梨醇。
9.权利要求8的水性佐剂组合物，其中所述山梨醇的浓度是约3％- 约15％（w/v）。
10.权利要求9的水性佐剂组合物，其中所述山梨醇的浓度是约4％- 约10％（w/v）。
11.任一前述权利要求的水性佐剂组合物，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。
12.根据任一前述权利要求的水性佐剂组合物，其中所述皂苷是QuilA或其衍生物。
13.根据权利要求12的水性佐剂组合物，其中所述QuilA的衍生物是QS21。
14.根据任一前述权利要求的水性佐剂组合物，其包含约5mM氯化钠和5％- 6％w/v山梨醇。
15.一种免疫原性组合物，其包含抗原或抗原性制剂和权利要求1 – 14中任一项的水性佐剂组合物。
16.根据权利要求15的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂在其中所述离子强度高于5mM、10mM、20mm、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的盐浓度或溶液中是不可溶的。
17.权利要求15或16的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂衍生自HIV、脑膜炎奈瑟球菌或是肿瘤相关抗原。
18.根据权利要求17的免疫原性组合物，其中所述抗原选自PRAME或NY-ESO-1或其片段或衍生物。
19.根据权利要求15 – 18中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含CpG寡核苷酸。
20.一种用于制备权利要求15 – 19中任一项的免疫原性组合物的方法，其包括用如权利要求1 – 14中任一项定义的水性佐剂组合物重构包含至少一种抗原或抗原性制剂的冻干组合物的步骤。
21.一种试剂盒，其包含（i）包含抗原或抗原性制剂的冻干组合物，和（ii）权利要求1 – 14中任一项的水性佐剂组合物。
22.权利要求18的方法或权利要求19的试剂盒，其中所述冻干组合物进一步包含TLR9激动剂。
23.权利要求22的方法或试剂盒，其中所述TLR9激动剂是CpG免疫刺激性寡核苷酸。
24.权利要求20 – 23的方法或试剂盒，其中所述抗原或抗原性制剂在其中所述离子强度高于10mM、20mm、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的盐浓度或溶液中是不可溶的。
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