KR101473466B1 - 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염의 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 다발성 장막염 진단용 탐침 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 별도의 세균 분리 없이도 연쇄상구균을 정확하게 검출할 수 있으며, 세균 분리 없이 조직 내 연쇄상구균의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 돼지의 다발성 장막염 진단방법에 관한 것이다.

Description

연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염의 진단방법{Diagnostic method for diagnosing polyserositis by Streptococcus suis}

본 발명은 돼지의 다발성 장막염 진단용 탐침 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다발성 장막염(polyserositis) 진단에 사용할 수 있는 DNA 탐침 및 이를 적용하여 다발성 장막염 병원체의 감염여부와 분포상태를 진단할 수 있는 진단방법에 관한 것이다.

다발성 장막염(polyserositis)은 장막에 해당되는 심장의 심외막에서 관찰되는 심외막염(pericarditis), 폐장의 흉막에서 관찰되는 흉막염(pleuritis), 복강의 복막에서 관찰되는 복막염(peritonitis)을 총괄해서 부르는 용어이다. 돼지에서 다발성 장막염을 유발하는 균으로 연쇄상구균(Streptococcus suis), 헤모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis)가 있다. 복수의 원인체에 의하여 다발성 장막염이 유발되기 때문에 세균의 분리가 진단을 하는데 있어서 필수적이다. 하지만 대부분의 다발성 장막염의 경우 만성 질환으로 진행되기 때문에 다발성 장막염에 걸린 많은 개체들은 이미 항생제를 사용하였기 때문에 세균의 분리가 되지 않아서 진단에 많은 어려움이 있었다.

종래에 이러한 다발성 장막염을 진단하는 방법으로는 신선한 가검물을 채취하여 원인 병원체를 분리 및 동정하는 균분리 동정방법, 혈청학적 방법, 조직을 이용한 방법 및 유전자 수준의 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)을 이용한 방법 등이 있다. 이들 각각에 대하여 문제점을 살펴보면 다음과 같다:

(1) 균분리 동정방법은 균의 분리가 어렵고, 병원체의 특성상 배양조건이 까다로울 뿐만 아니라, 성장속도가 매우 느리기 때문에 균 분리 배양에 10일 내지 30일 이상이 걸려 병원체의 진단에 장기간이 소요되고, 따라서 이들의 감염에 대하여 즉시적으로 대처할 수 없는 문제점이 있어 왔다[Ross R.F.,Sel. Vet.,28, 43∼54(1987); Roske G. et al.,Curr. Microbiol.,15, 233∼239(1987)].

(2) 혈청학적 진단방법으로는 보체결합반응(complement-fixation test), 간접혈구 응집반응(indrect hemagglutination test), ELISA법(enzyme-linked immunosorbent assay) 등이 있다[Armstrong C.H. et al.,Can. J. Comp.Med.,47, 464∼470(1983); Ross R.F. & Whittlestone P.,Methods in Mycoplasmology, vol.2.(1983); PifferI.A. et al.,Am. J. Vet. Res.,45, 1122∼1126 (1984)]. 그러나, 이들 방법들은 민감도(Sensitivity)는 높으나, 교차반응이 일어난다는 문제점이 있다.

(3) 세포의 조직절편을 이용하는 방법 중에는 형광항체법(fluorescent antibody test)과 면역조직화학법(immunohistochemistry) 등이 있으며, 이들 중 형광항체법은 조직 절편 내에서 병원체를 확인할 수 있다는 장점이 있으나, 반드시 동결조직 절편을 이용해야 하는 문제점과 양성 슬라이드를 오랜 기간 보관할 수 없으며, 만성으로 진행된 조직에서는 그 민감도가 떨어지는 문제점이 있다[L'Ecuyer C. & Boulanger P.,Can. J. Comp. Med.,34, 38∼46(1970); Meyling A.,Acta. Vet. Scand.,12, 137∼141(1971); Amanfu W. et al.,Am. J. Vet. Res.,45, 1349∼1352(1984)]. 또한, 포르말린 고정후 파라핀 포매된 조직절편을 이용하는 면역조직화학법은 상기 형광항체법의 단점을 보완하여 민감도를 높인 방법이나, 상기 혈청학적 방법과 같이 교차반응이 있을 수 있는 문제점이 있다[Doster A.R. & Lin B. C.,Am. J. Vet. Res.,49, 1719∼1721(1988); White A.,K. et al.,J. Vet. Diagn. Invest.,10, 214∼217(1998)].

(4) 마지막으로, 유전자 수준에서 진단하는 DNA증폭에 의한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 방법은 돼지를 부검하지 않고도 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 원인 병원체의 분리배양 방법보다 훨씬 빠르고, 다른 병원체와의 교차반응이 거의 일어나지 않기 때문에 특이성이 매우 높은 장점이 있으나, 반드시 신선한 조직을 필요로 하고, 부패 방지를 위해서 조직을 포르말린에 고정할 경우 사용할 수 없어 진단에 있어 시간과 장소의 제약이 있다는 문제점과 조직 내에서 감염부위를 확진할 수 없다는 문제점이 있어 왔다[Harasawa R. et al.,Mol. Cell. Probes,5,103∼109(1991); Artiushin S.,Mol. Cell. Probes,7, 381∼385(1993); Stemke G. W. et al.,Am. J. Vet Res.,55, 81∼84(1994)].

따라서, 교차반응의 단점을 해소하고 신선시료의 채취, 세균의 분리 없이도 돼지의 다발성 장막염 병원체의 효과적인 검출 및 진단이 가능한 DNA탐침 및 이를 적용한 진단방법이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다발성 장막염의 병원체인 연쇄상구균을 별도의 세균 분리 없이도 정확히 검출하여 조직 내 감염상태와 병원체의 분포상황 등을 정확하게 파악할 수 있는 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염의 진단방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머(Reverse primer) 쌍으로 연쇄상구균의 특이적 유전자(DNA)를 증폭시켜 제조한 돼지의 다발성 장막염 진단용 연쇄상구균 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 다발성 장막염 진단용 연쇄상구균 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 탐침자는 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 DNA 탐침자를 포함하는 돼지의 다발성 장막염 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 조직 절편상에 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자(Probe)를 적용시키는 조직 내 교잡(in situ hybridization)공정 및 검출공정을 포함하는 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염 진단방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자는 서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머(Reverse primer) 쌍으로 연쇄상구균의 특이적 유전자(DNA)를 증폭시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 DNA탐침자는 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 조직 내 교잡공정은 ⅰ) 조직 절편상의 표적핵산 노출공정; ⅱ) 상기 표적핵산이 노출된 조직 절편 상에 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자를 적용시키는 교잡공정; ⅲ) 교잡된 하이브리드로부터 미교잡물을 제거하기 위한 세척공정;을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 표적핵산 노출공정은 ⅰ) 조직 절편상에 산 및 단백질 분해효소를 처리하여 단백질을 제거하는 단계; ⅱ) 고정제로 처리하여 조직을 고정하는 단계; 및 ⅲ) 고정된 조직을 아세틸화시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 교잡 공정은 100 내지 800ng/ml의 농도로 DNA탐침자를 함유한 교잡버퍼를 적용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출공정은 ⅰ) DNA탐침자에 표지된 표지물과 특이적으로 결합할 수 있으며, 효소가 부착된 상보성 물질을 조직 절편상에 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 발색제를 조직 절편상에 반응시켜 발색시키는 단계;를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.

본 명세서에 사용된 "증폭" 또는 "증폭된"이라는 용어는 하나 또는 소수의 복제물들로부터의 다량의 DNA 복제물들의 생산을 일컫는다.

본 명세서에서 "핵산"이라는 용어들은 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드들 또는 리보뉴클레오타이드들 또는 이들의 폴리머들을 일컫는다.

본 명세서에서 "PCR"은 일반적으로 열에 안정한 폴리머라아제 및 하나는 증폭될 서열의 한 말단에서 (+)-가닥과 상보적이며 다른 하나는 다른 말단에서 (-)-가닥과 상보적인 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 DNA 또는 RNA 염기서열을 증폭하는 방법이다. 새롭게 합성된 DNA 또는 cDNA 가닥들은 이어서 동일한 프라이머 서열들의 추가적인 주형들로 제공되기 때문에 연이은 프라이머 부착, 가닥 연장, 및 해리의 단계가 원하는 서열의 신속하고 매우 특이적인 증폭을 이루어낸다.

본 명세서에서 "탐침자"라는 용어는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다.

본 명세서에서 "프라이머"라는 용어는 일반적으로 50 이하, 바람직하게는 18-25bp 뉴클레오타이들(DNA가 통상이중 가닥이기 때문에 그 길이는 염기쌍들로 측정된다; 단일가닥 DNA는 염기들 또는 뉴클레오타이드들로 측정된다)이며, 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 짧은 인조 올리고뉴클레오타이드 가닥들을 일컫는다. 프라이머들은 DNA 폴리머라아제가 부착되어 새로운 DNA 가닥의 합성이 시작되는 DNA 주형의 시작점 및 종점에 단련(부착)된다. 전방향 서열분석 프라이머는 역방향 프라이머에 비해 5'에 부착되며, 역방향 서열분석 프라이머는 전방향 프라이머에 비해 3'에 부착된다. 프라이머들 및 기준 서열 사이의 관계는 사용되는 좌표계에 의존한다. 전방향 프라이머는 좌표계 내에서 역방향 프라이머의 이론상 우측에 있어야 하기 때문에 전방향 프라이머의 부착 위치는 역방향 프라이머들의 부착위치보다 일반적으로 적다.

본 발명의 돼지의 다발성 장막염 진단용 탐침 및 이를 이용한 진단방법은 동결조직만을 사용해야 하는 형광항체법의 문제점을 극복할 수 있으며, 연쇄상구균에만 특이적인 유전자를 검출 할 수 있기 때문에 교차반응으로 인하여 특이성이 다소 떨어지는 면역조직화학법의 문제점도 극복할 수 있다. 또한, 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 수준의 방법만큼 높은 민감도를 나타내면서도 반드시 신선한 조직을 필요로 하는 문제점을 해결하였을 뿐만 아니라 별도의 세균 분리 없이도 연쇄상구균을 정확하게 검출할 수 있으며, 세균 분리 없이 조직 내 연쇄상구균의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

도1은 본 발명의 바람직한 일구현예에 따라 중합효소 연쇄반응을 실시하여 얻은 연쇄상구균에 대한 특이적 DNA 탐침자(Probe)용 증폭 DNA의 전기영동 수행 사진이다.
도2는 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자(Probe)에 대한 염기서열(서열번호3)이다.
도3은 조직 내 교잡법을 실시하여 심장의 심외막 조직에서 검출된 연쇄상구균 유전자(DNA)의 사진이다.
도4는 도3과 동일한 조직에 DNaseⅠ으로 처치한 후 조직 내 교잡법을 실시한 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 종래의 다발성 장막염 진단 방법은 세균의 분리가 어려운 문제가 있었으며, 교차반응의 문제로 특이성이 떨어지며, 신선시료의 채취 어려움이 있는 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는 돼지 조직 절편상에 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자(Probe)를 적용시키는 조직 내 교잡(in situ hybridization)공정 및 검출공정을 포함하는 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염 진단방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 별도의 세균 분리 없이도 연쇄상구균을 정확하게 검출할 수 있으며, 세균 분리 없이 조직 내 연쇄상구균의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

먼저, 진단하고자 하는 돼지의 다발성 장막염(polyserositis)의 병원균인 연쇄상구균(Streptococcus suis)의 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 준비한다. 상기 DNA 탐침자는 연쇄상구균에만 특이하게 존재하여 연쇄상구균 검출에 특이적으로 사용될 수 있는 것으로서, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 DNA 탐침자의 타겟 서열은 연쇄상구균 16S ribosomal DNA의 뉴클레오타이드 중에서 일부를 사용할 수 있다. 바람직하게는 DNA 탐침자 제작을 위하여 전방향 프라이머(Forward primer) 5′-AAC GCT GAA GTC TGG TGC TT-3′(서열번호1, nucleotide 44-63)와 역방향 프라이머(Reverse primer) 5′-TGG TAA GAT ACCGTC AAG TGA GAA-3′(서열번호2, nucleotide 458-481)의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 교잡(hybridization)에 필요한 충분한 양의 타겟 서열을 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 상기 DNA 탐침자는 서열번호3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 DNA 탐침자는 임의 표지(random labeling)할 수 있으며, 표지로는 플루오로포어(fluorophores)(예컨대, 플루오레세인(fluorescein)), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine), Cy3 및 Cy5 (Pharmacia), 크로모포어(chromophores), 케미루미네서(chemiluminescers), 자성입자(magnetic particles), 방사성 동위원소(radioisotopes)(예컨대, P32 및 S35), 질량 라벨(mass labels), 전자 치밀 입자(electron dense particles), 효소들(예컨대, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase)), 보조인자(cofactors), 효소에 대한 기질(substrates for enzymes), 중금속(예컨대, 금) 및 대응물(partners)에 특이적 결합을 갖는 부착소(haptens) 예컨대, 항체, 스트렙토아비딘, 바이오틴, 다이곡시제닌(digoxigenin) 및 킬레이트기(chelating group)를 적용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 표지는 형광(fluorescence), 방사능(radioactivity), 발색 측정(measurement of color development), 질량 측정(mass measurement), X-레이 회절 또는 흡수, 자기장, 효소적 활성, 질량 분석, 결합 친화도(binding affinity), 고주파 혼성화(highfrequency hybridization) 또는 나노크리스탈(nanocrystal)에 의해 검출 가능한 신호를 발생할 수 있다.

다만, 방사성 동위원소로 표지된 탐침자의 경우 조직에 남아있는 수명이 짧기 때문에 지속적인 신호의 검출이 제한적이고, 발생되는 신호의 해상도가 낮으며, 암실에서 수행되어야 하는 제약이 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 탐침자를 디곡시제닌 또는 바이오틴과 같은 비방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 그러나 바이오틴의 경우 방사성 동위원소 및 디곡시제닌으로 표지한 경우보다 민감도가 떨어지며, 무엇보다 조직 내 내인성 바이오틴의 존재 때문에 바이오틴을 표지한 탐침자는 비특이 반응 가능성이 높을 수 있다. 따라서 방사성 동위원소의 제약을 극복할 수 있고, 높은 민감도, 재현성뿐만 아니라, 비특이 반응 가능성이 낮은 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지하는 것이 가장 바람직하다.

다음, 상기 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자를 적용한 조직 내 교잡법(in situ hybridization)을 설명한다.

조직 내 교잡법(in situ hybridization)은 ⅰ) 조직 절편상의 표적핵산 노출공정; ⅱ) 상기 표적핵산이 노출된 조직 절편 상에 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자를 적용시키는 교잡공정; ⅲ) 교잡된 하이브리드로부터 미교잡물을 제거하기 위한 세척공정;을 포함할 수 있다.

상기 표적핵산 노출공정은, 조직 절편상에 산 및 단백질 분해효소를 처리하여 단백질을 제거하는 단계; 고정제로 처리하여 조직을 고정하는 단계; 및 고정된 조직을 아세틸화시키는 단계;를 포함할 수 있다. 구체적으로, 단백질을 제거하기 위하여 바람직하게는 염산(HCl), 시트릭산 또는 포름산 등의 단독 또는 혼합 형태의 산과 프로테아제 K, 펩신 또는 트립신 등의 단독 또는 혼합 형태의 단백질 분해 효소를 처리할 수 있다. 상기 고정제는 조직 고정을 위하여 통상적으로 사용되는 고정제라면 특별한 제한은 없으나, 보다 바람직하게는 파라포름알데하이드 또는 포름알데하이드를 처리하여 고정시킬 수 있다. 고정된 조직 절편에 아세틸화제를 처리하여 아세틸화하는 단계를 거치는데, 아세틸화제로 보다 바람직하게는 아세틱 안하이드라이드를 처리하여 아세틸화시킬 수 있다.

상기 표적 핵산이 노출된 조직 절편 상에 교잡 반응을 수행하는데, 이 때 상기 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자를 100 내지 800ng/ml의 농도로 함유한 교잡버퍼를 적용할 수 있다. 상기 교잡버퍼를 적용시키고, 90 내지 98 ℃에서 5 내지 20분간 가열한 다음, 30 내지 55℃에서 10 내지 25시간 반응시킬 수 있다. 다음으로, 상기 공정에서 교잡된 하이브리드로부터 미교잡물을 제거하기 위한 세척공정을 수행하여 순수 하이브리드만이 포함되도록 할 수 있다.

마지막으로, 상기 공정에서 조직 내 교잡반응을 수행한 조직 절편에 검출공정을 수행한다.

상기 검출공정은 표지에 따라 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 탐침자가 효소로 라벨링되는 경우에, 혼성화의 발생은 효소에 대한 기질을 혼성화 결과물과 반응시킴으로서 측정될 수 있다. 바람직한 상기 효소/기질 쌍은 페록시다아제(peroxidase)(예컨대, 양고추냉이 페록시다아제)와 클로로나프톨(chloronaphtol)의 쌍, 아미노에틸카바졸(aminoethylcarbazol), 디아미노벤지딘(diaminobenzidine), D-루시페린(luciferin), 루시제닌(lucigenin) (bis-N-methylacridinium nitrate), 레소루핀 벤질 에테르(resorufin benzyl ether), 루미놀(luminol), 앰플렉스 레드 시약(Amplex Red reagent) (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (pphenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(phenylenediamine, OPD) 또는 나프톨(naphtol)/피로닌(pyronine); 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 브로모클로로인돌릴포스페이트(bromochloroindolylphosphate, BCIP)의 쌍, 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium, NBT), 나프톨(naphthol)-AS-B1-포스페이트(phosphate) 또는 ECF 기질; 글루코시다아제(glucosidase)와 t-NBT(nitrobluetetrazolium)의 쌍 또는 m-PMS(phenzaine methosulfate)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 프로브가 금 입자로 라벨링되는 경우에, 혼성화의 발생은 질산은(silver nitrate)을 이용하는 은 염색 방법으로 검출될 수 있다.

한편, DNA 탐침자에 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지한 경우 상기 검출공정은 보다 바람직하게는 ⅰ) DNA탐침자에 표지된 표지물과 특이적으로 결합할 수 있으며, 효소가 부착된 상보성 물질을 조직 절편상에 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 발색제를 조직 절편상에 반응시켜 발색시키는 단계를 포함할 수 있다.

디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지한 경우 이와 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 물질로 항디곡시제닌(anti-digoxigenin)을 반응시킬 수 있다. 상기 상보성 물질에 부착되는 효소로는 바람직하게는 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase), β -갈락토시다아제, 루시페라아제, 시토크롬P450 또는 양고추냉이 페록시다아제 등이 있을 수 있으며, 가장 바람직하게는 알카린 포스파테이즈(alkaline phosphatase)일 수 있다. 상기 효소 부착 상보성물질은 0.1 내지 10%로 희석하여 조직 절편상에 반응시킬 수 있다.

상기에서 수득된 조직 절편 상에 발색제를 반응시켜 발색시킬 수 있는데, 상보성 물질에 부착되는 효소로 알칼리 포스파타테이즈를 사용하는 경우에는 발색제로 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 사용하거나 또는 ECF기질이 사용될 수 있고, 양고추냉이 페록시다아제를 사용하는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시제닌(bis-N-methylacridinium nitrate), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 앰플렉스 레드 시약(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR(pphenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine(OPD) 또는 나프톨/피로닌이 발색제로서 사용될 수 있다.

다음으로, 메틸그린 등으로 대조 염색을 한 후 현미경을 통해 연쇄상구균 특이적 DAN 탐침자의 교잡여부를 확인함으로써 연쇄상구균의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명은 전방향 프라이머(Forward primer) 5′-AAC GCT GAA GTC TGG TGC TT-3′(서열번호1, nucleotide 44-63)와 역방향 프라이머(Reverse primer) 5′-TGG TAA GAT ACCGTC AAG TGA GAA-3′(서열번호2, nucleotide 458-481)의 프라이머쌍으로 연쇄상구균의 특이적 유전자(DNA)를 증폭시켜 제조한 돼지의 다발성 장막염 진단용 연쇄상구균 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 서열번호3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 연쇄상구균 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 제공한다.

상술한 DNA 탐침자는 임의 표지(random labeling)된 것일 수 있으며, 표지로는 플루오로포어(fluorophores)(예컨대, 플루오레세인(fluorescein)), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine), Cy3 및 Cy5 (Pharmacia), 크로모포어(chromophores), 케미루미네서(chemiluminescers), 자성입자(magnetic particles), 방사성 동위원소(radioisotopes)(예컨대, P32 및 S35), 질량 라벨(mass labels), 전자 치밀 입자(electron dense particles), 효소들(예컨대, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase)), 보조인자(cofactors), 효소에 대한 기질(substrates for enzymes), 중금속(예컨대, 금) 및 대응물(partners)에 특이적 결합을 갖는 부착소(haptens) 예컨대, 항체, 스트렙토아비딘, 바이오틴, 다이곡시제닌(digoxigenin) 및 킬레이트기(chelating group)를 적용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 표지는 형광(fluorescence), 방사능(radioactivity), 발색 측정(measurement of color development), 질량 측정(mass measurement), X-레이 회절 또는 흡수, 자기장, 효소적 활성, 질량 분석, 결합 친화도(binding affinity), 고주파 혼성화(highfrequency hybridization) 또는 나노크리스탈(nanocrystal)에 의해 검출 가능한 신호를 발생할 수 있다.

다만, 방사성 동위원소로 표지된 탐침자의 경우 조직에 남아있는 수명이 짧기 때문에 지속적인 신호의 검출이 제한적이고, 발생되는 신호의 해상도가 낮으며, 암실에서 수행되어야 하는 제약이 있다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 탐침자를 디곡시제닌 또는 바이오틴과 같은 비방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 그러나 바이오틴의 경우 방사성 동위원소 및 디곡시제닌으로 표지한 경우보다 민감도가 떨어지며, 무엇보다 조직 내 내인성 바이오틴의 존재 때문에 바이오틴을 표지한 탐침자는 비특이 반응 가능성이 높을 수 있다. 따라서 방사성 동위원소의 제약을 극복할 수 있고, 높은 민감도, 재현성뿐만 아니라, 비특이 반응 가능성이 낮은 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명은 상술한 프라이머 또는 DNN 탐침자를 포함하는 돼지의 다발성 장막염 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상술한 프라이머 또는 DNA 탐침자 이외에 다른 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 핵산 증폭에 사용될 수 있는 경우에는 버퍼, DNA 중합효소(써머스 아쿠아쿠스(Taq), 써머스 써모필러스(Tth), 써머스 필리포르미스, 써미스 플라부스, 써모코커스 리터랄리스, 및 피로코커스 푸리오수스(Pfu)에서 얻은 열에 안정한 DNA 중합효소, DNA 중합효소 보조인자, 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트와 같은 PCR 반응을 수행하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 키트는 대체로, 전술한 구성성분들을 개별 패키징(separate packaging)하거나 또는 구획화하여 포함하도록 개조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

<실시예1> 탐침자(Probe)의 제작

연쇄상구균의 특이적인 유전자(DNA)를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시 하였다. 탐침자의 타겟서열은 하기 프라이머를 이용하여 연쇄상구균 유전자에 특이적인 16S ribosomal RNA gene의 뉴클레오타이드 중에서 일부를 취하여 PCR을 수행하여 사용하였다. 첨가된 각각의 전방향 및 역방향 프라이머의 서열은 각각 다음과 같다.

전방향 프라이머(Forward primer)

5′-AAC GCT GAA GTC TGG TGC TT-3′(서열번호1, nucleotide 44-63)

역방향 프라이머(Reverse primer)

5′-TGG TAA GAT ACCGTC AAG TGA GAA-3′(서열번호2, nucleotide 458-481)

상기 두 프라이머는 (주)바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성 및 OPC 방법으로 정제하여 사용하였다. PCR을 위해서 1μl 전방향, 역방향 프라이머 (20pmol/μl), 10μl 10×반응 버퍼[100mM Tris-HCl(pH 8.3), 400mM 염화칼륨(KCl), 15mM 염화마그네슘(MgCl2), 5μg/ml 활성 소혈청 알부민(activated BSA)], 500μM 디옥시뉴클레오타이드, 1.5U Taq 중합효소를 각각 넣고, 100μl의 반응량이 되도록 멸균된 증류수를 첨가하여 섞은 후 써모사이클러(Thermocycler; Perkin Elmer사, Norwalk, USA)를 이용하여 95℃ 5분간 denaturation 후 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 40 주기로 시행한 후 72℃에서 elongation를 10분간 실시하는 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

중합효소 연쇄반응의 산물을 1% 아가로즈겔에 전기영동하였으며, 이를 도1에 나타내었다. 도면에서 M은 스탠다드 마커이며, 오른쪽 레인이 상기 프라이머 쌍을 사용하여 제조한 중합효소 연쇄반응의 산물로, 438bp의 밴드를 확인할 수 있다.

위저드 PCR액(Wizard PCR preps; Promega Biotech사, Madison, WI, USA)을 이용하여 증폭된 DNA를 정제하고, DIG DNA 라벨링 & 검출키트(DIG DNA labeling & detection kit; Boehringer Mannheim사, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지(random labeling) 한 후, 나일론 막(nylon membrane)으로 표지된 탐침자의 농도를 결정하였다. 이와 같이 제조된 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자는 서열번호3의 염기서열을 나타내었다.

<실시예2> 조직 내 교잡법(in situ hybridization)

돼지 연쇄상구균 핵산을 검출하기 위한 조직 내 교잡법을 실시하였다. 연쇄상구균에 감염된 돼지 심장의 심외막 조직을 적출하여 10% 중성 포르말린에 24시간 고정시킨 후 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 파라핀 포매 후 3μm 두께로 절편하여 슈퍼프로스트/플러스 슬라이드(Superfrost/Plus slide; Fisher Scientific사, Pittsburgh, PA, USA)에 부착시켜 상온에 보관하고, 조직절편을 크실렌(xylene)에 탈파라핀시키고 함수과정을 거친 후 인산 버퍼 식염수[phosphate-buffered saline; PBS, 0.01M, pH 7.4]에 5분간 두었다.

표적 핵산을 노출시키기 위해 0.2N 염산(HCl)에 20분간 처리하여 단백질을 제거한 후 200 μg/ml의 프로테아제 K(Gibco BRL사, Grand Island, NY, USA)를 37℃에서 25분간 처리하고, 4% 파라포름알데하이드로 상온에서 10분간 고정하였다. 인산 버퍼 식염수로 2회 세척한 후 0.1M 트리에탄올아민 버퍼(pH 8.0) 에 0.25% 아세틱 안하이드라이드를 넣고 5분간 아세틸화 시킨 후, 0.25% 아세틱 안하이드라이드를 한 번 더 넣고 5분간 아세틸화를 재차 진행시켰다. 2×소듐시트레이트 식염수[2×saline sodium citrate(1×SSC: 50mM NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)]로 2회 세척 후 교잡(hybridization)을 수행하였다.

탐침자를 첨가하지 않은 교잡버퍼[2×SSC, 50% deionized formamide, 10mg salmon sperm DNA(Oncor, Gaithersburg, MD, USA), 0.02% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1% Denhart's solution, 50% dextran sulfate solution]를 조직절편상에 떨어뜨린 후 45℃에서 60분간 교잡 전 반응을 수행하고 2×SSC로 2회 세척하였다. 디곡시제닌(Digoxigenin)으로 표지된 DNA 탐침자를 500 ng/ml의 농도가 되도록 표준 교잡 버퍼에 희석하여 30μl 정도를 슬라이드 조직 위에 떨어뜨린 후 커버슬라이드를 덮고 가장자리를 고무 시멘트(rubber cement)로 잘 봉한하고, 96℃에서 10분간 가열한 다음, 45℃ 에서 15시간 반응시켰다.

교잡반응 후 커버슬라이드를 제거하고 상온의 4×SSC에 5분간 2회, 45℃ 2×SSC와 상온의 2×SSC에서 각각 10분씩 2회, 그리고 0.2×SSC에서 5분간 2회 세척 후 말레익산 버퍼(100mM maleic acid, 150mM NaCl, pH 7.5)로 5분간 처리한 후 1×블로킹 버퍼(blocking buffer;Boehringer Manheim사, Indianapolis, IN, USA)에서 40분간 처리하였다.

<실시예3> 검출과정

양성반응 검출하기 위해 알카린 포스파테이즈 결합 항디곡시제닌(alkaline phosphatase conjugated anti-digoxigenin; Boehringer Manheim사, Indianapolis, IN, USA)을 블로킹 버퍼에 1 : 200으로 희석하여 조직절편 상에 떨어뜨린 후 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 말레익산 버퍼에서 2회, 블로킹 버퍼에서 2회 처리 후 검출버퍼 (Buffer3; 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.05M MgCl 2, pH9.5)로 5분간 처리하였다. 발색을 위하여 알카린 포스파테이즈의 기질인 니트로블루 테트라졸리움(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스파테이트 (BCIP)를 검출버퍼에 희석하여 조직절편 위에 떨어뜨린 후 상온에서 3시간 정도 반응시키고, 반응이 끝난 후 1mM EDTA에 여러번 침적하여 반응을 중지시킨 후 0.5% 메틸그린으로 대조염색한 후 증류수에 세척하여 완전히 말린 후 봉입(mounting)하여 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도2에서와 같이 연쇄상구균의 유전자가 검출되어 암갈색의 양성반응을 확인할 수 있었다. 이를 통해 심장 심외막 조직 내 연쇄상구균의 감염상태와 병원체의 분포상황을 육안으로 확인하여 연쇄상구균에 의한 다발성 장막염을 진단할 수 있다.

<비교예1>

조직 내 교잡법을 실시하기 전에 DNaseI으로 연쇄상구균에 감염된 조직을 처리하여 연쇄상구균의 유전자(DNA)를 모두 분해시킨 것을 제외하고는 실시예1 내지 3과 동일하게 실시하였다.

그 결과, 도3에서와 같이 암갈색의 양성반응이 나타나지 않았다.

동일한 부위의 연속 조직 절편에서, DNaseI으로 처리하지 않은 실시예에서는 연쇄상구균의 유전자가 검출되는 반면, DNaseI으로 처리한 비교예에서는 연쇄상구균의 유전자가 검출되지 않아 본 발명에 따른 연쇄상구균을 검출하기 위한 조직내 교잡법이 연쇄상구균의 유전자를 특이적으로 검출하여 돼지의 다발성 장막염 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

<110> Seoul national university R&DB foundation Dongbang co,.ltd <120> Probe for diagnosing polyserositis and diagnostic method using them <130> 1039379 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 1 aacgctgaag tctggtgctt 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 2 tggtaagata ccgtcaagtg agaa 24 <210> 3 <211> 438 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 3 aacgctgaag tctggtgctt tcactagacg gatgagttgc gaacgggtga gtaacgcgta 60 ggtaacctgc ctcatagcgg gggataacta ttggaaacga tagctaatac cgcataacag 120 tatttaccgc atggtagata cttgaaagga gcaattgctt cactatgaga tggacctgcg 180 ttgtattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca tcgatacata gccgacctga 240 gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300 agggaatctt cggcaatggg ggcaaccctg accgagcaac gccgcgtgag tgaagaaggt 360 tttcggatcg taaagctctg ttgtaagaga agaactgtga gaagagtgga aagtttctca 420 cttgacggta tcttacca 438

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 1로 표시되는 전방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머(Reverse primer) 쌍으로 연쇄상구균의 특이적 유전자(DNA)를 증폭시켜 제조한, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하며, 디곡시제닌(digoxigenin)으로 임의 표지한 연쇄상구균의 특이적 DNA 탐침자(Probe)를 돼지 조직 절편상에 적용시키는 조직 내 교잡(in situ hybridization)공정, 및 검출공정을 포함하는 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염의 진단방법으로서,
   상기 조직 내 교잡공정은
   ⅰ) 조직 절편상의 표적핵산 노출공정;
   ⅱ) 상기 표적핵산이 노출된 조직 절편 상에 연쇄상구균의 특이적 DNA탐침자를 적용시키는 교잡공정;
   ⅲ) 교잡된 하이브리드로부터 미교잡물을 제거하기 위한 세척공정;을 포함하고,
   상기 검출공정은
   1) DNA탐침자에 표지된 표지물과 특이적으로 결합할 수 있으며, 효소가 부착된 상보성 물질을 조직 절편상에 반응시키는 단계; 및
   2) 발색제를 조직 절편상에 반응시켜 발색시키는 단계;를 포함하며,
   상기 표적핵산 노출공정(ⅰ)은
   a) 조직 절편상에 산 및 단백질 분해효소를 처리하여 단백질을 제거하는 단계;
   b) 고정제로 처리하여 조직을 고정하는 단계; 및
   c) 고정된 조직을 아세틸화시키는 단계;를 포함하고,
   상기 교잡 공정(ⅱ)은 100 내지 800ng/ml의 농도로 DNA탐침자를 함유한 교잡버퍼를 적용하는 것을 특징으로 하는 연쇄상구균에 의한 돼지의 다발성 장막염의 진단방법.
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