KR101472599B1

KR101472599B1 - 마이크로채널 장치를 이용한 표적 분자의 검출 또는 단리

Info

Publication number: KR101472599B1
Application number: KR1020097003339A
Authority: KR
Inventors: 종리앙 탕; 램 에스 바트; 페이블 친버그
Original assignee: 바이오셉트 인코포레이티드
Priority date: 2006-07-19
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2014-12-15
Also published as: EP2052074A4; CN101535466A; CA2658336C; CA2658336A1; WO2008011486A2; CN101535466B; JP2009544043A; US20120258475A1; EP2052074A2; WO2008011486A3; IL196553A0; US20060252087A1; KR20090033899A; HK1135725A1

Abstract

본 발명의 체액 또는 다른 액체 샘플로부터 세포를 분리하거나 단리하기 위한 마이크로플로우 장치는 횡단 포스트의 패턴에 의해 직선 흐름이 방해받는 흐름로를 이용한다. 포스트는 상층면과 하층면 사이에서 연장된 흐름로 내 수집 영역의 너비에 걸쳐서 위치하고 있으며, 수직면을 가지고, 정확한 횡단면을 가지고 있으며, 무작위적으로 배치되어 층흐름을 방해한다. 격리제, 예컨대 Ab는 친수성 피복물, 바람직하게는 이소시아네이트 부위를 함유하는 히드로겔 또는 실질적인 길이의 PEG 또는 폴리글리신을 통해 수집 영역의 모든 면에 부착되어 있고, 층흐름 방해에 의해서 세포 또는 다른 표적 생체 분자를 포획하는데 매우 효과적이다.

Description

마이크로채널 장치를 이용한 표적 분자의 검출 또는 단리{DETECTION OR ISOLATION OF TARGET MOLECULES USING A MICROCHANNEL APPARATUS}

본 발명은 대체로 표적 분자의 검출 또는 단리에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 목적하는 표적 세포 또는 생물학적 분자를 검출하거나 또는 단리하는데 유용한 장치 또는 방법에 관한 것이다.

불균질한 세포 집단으로부터 희박 세포를 효과적으로 단리 및 수집하는 것은 기초 과학 연구를 위해서 뿐만 아니라, 질병 진단 및 치료, 예를 들어 유전자 치료법 등에서 사용하기 위한 단리된 세포 집단에 대한 수요의 증가로 인해 그 관심이 높다. 예를 들어, 병리학적으로 변화된 세포, 예컨대 암성 세포를 보다 많은 정상 세포 집단에서 분리할 수 있고, 이어서 순수해진 세포 집단을 환자에게 다시 이식할 수도 있다.

주요한 수요 중 하나는 초기 태아 진단, 예컨대 임신 중 가능한 염색체 질병의 초기 스크리닝 등을 가능하게 하는 태아 세포의 단리를 위한 것으로서, 태아 세포는 양수천자 또는 융모막 융모 채취법 등의 방법을 통해 얻고 있다. 이러한 방법의 사용으로 신뢰할만한 진단을 가능하게 할 정도로 충분한 양의 태아 세포를 얻을 수 있지만, 이들 방법은 자궁으로의 침입을 요구하며, 특히 임신 초기 3개월 이후 에만 수행할 수 있기 때문에, 특히 태아에 대한 위험성을 내포하고 있다.

태아 세포는 또한 매우 낮은 수로 이들 세포가 태아로부터 모체의 혈류를 통과하기 때문에 순환하는 모체 혈액에도 존재하지만, 모체 세포에 대한 태아 세포의 비율은 단지 대략 수 ppm 정도이다. 대체로, 정맥천자에 의해 얻은 모체 혈액 샘플을 태아 진단을 위해 사용할 수 있지만, 대다수의 모체 세포 집단에서 희박한 태아 세포를 단리 및 수집하기 위한 방법과 관련하여 일부 상당한 도전이 존재한다. 이러한 도전은 또한 자궁경부 점막에서 태아 세포를 분리하는 경우에도 존재하고, 또한 체액 등에서 다른 희박 세포를 회수하는 경우를 비롯하여 소량으로만 존재하는 다른 생체분자를 검출 및 단리하는 경우에서도 공통적일 수 있다.

세포 검출 및 분리법은 생체의학 및 임상 개발 분야에서 빠르게 성장하고 있는 분야이고, 복합 집단으로부터 목적하는 세포 서브셋을 분리하는 개선된 방법은 보다 광범위한 연구를 가능하게하며, 비교적 균일하고 명백한 특징을 갖는 세포를 사용할 수 있게 한다. 세포 분리는 또한 예를 들어, 표적 세포 집단에 대한 약물 또는 치료법의 효능을 측정하거나, 생물학적 경로를 연구하거나, 또는 형질전환되거나 아니면 변형된 세포 집단을 단리 및 연구하기 위한 연구 분야에서 널리 사용된다. 현재의 임상 용도에는 예를 들어, 특히 제거적 화학요법 및 방사선 요법과 병용하여, 혈액 세포를 재구성하기 위한 조혈모세포의 단리가 포함된다.

세포 분리는 대체로 표적 세포 집단을 고체상에 선택적이고 가역적으로 부착시키기 위하여 특이적 친화성 리간드를 갖는 세포 표면 상의 분자를 표적화하여 수행한다. 후속 단계에서, 세정을 통해 비특이적으로 흡착된 세포를 제거한 후, 표적 세포를 방출시킨다. 이러한 특이적 친화성 리간드는 항체, 렉틴, 수용체 리간드 또는 단백질, 호르몬, 탄수화물류, 또는 다른 생물학적 활성을 갖는 기타 분자에 결합하는 다른 리간드일 수 있다.

대다수의 관련없는 집단으로부터 희박 세포를 회수하기 위해 사용되는 현행 방법 중 하나는 표적 세포 집단에 대해 선택적인 항체로 피복된 폴리스티렌 마크로비드를 사용하는 것이다. 이러한 특이적 항체로 피복된 마크로비드는 대체로 불균질한 세포 집단 현탁물을 중력에 의해 가라앉혀서 마크로비드가 차단에 의해 표적 세포를 포획하게 한다.

또한, 샘플 유체로부터 표적 세포를 분리하기 위하여 컬럼과 함께 사용되는 다른 기질이 존재하며, 일반적으로 분리를 수행하기 위해 선택되는 기질 유형은 궁극적으로 표적을 샘플 유체로부터 어떻게 분리할 것인지를 결정하게 한다. 기질은 일반적으로 목적하는 표적이 샘플에 남아있는 성분이 되는 기질과는 실질적으로 결합 경향이 다른 특징을 갖도록 제공된다. 세포 분리를 위한 컬럼형 장치의 예는 1993년 8월 31일에 공개된 미국 특허 제5,240,856호에서 확인할 수 있는데, 여기서 세포는 컬럼 내 메트릭스에 결합한다. 1997년 12월 9일에 공개된 미국 특허 제5,695,989호에서, 컬럼은 결합된 세포의 제거를 촉진하기 위하여 압착시킬 수 있는 연성 용기로서 제공되도록 설계되었다. 1997년 9월 30일 공개된 미국 특허 제5,672,481호는 수집, 농축 및 수송을 위해 강직한 단일 용기를 사용하는 밀폐된 멸균장에서 분리하기 위한 장치가 개시되어 있다. 미국 특허 제5,763,194호는 리간드가 내부 표면에 부착하는 반침투성 중공(hollow) 섬유 어레이로 구성된 세포 분리 장치가 개시되어 있다.

상기 언급한 접근법들과 또한 기본적으로 컬럼을 통해 안정화시킨 마이크로비드를 사용하기 때문에 컬럼 방법이라고도 하는 상당히 광범위하게 사용되는 마이크로비드 포획법은 다수의 문제점 및 기술적 어려움과 관련되어 있다. 컬럼 방법을 널리 실용화하기 위해 아직 해결해야하는 주요 장애물은 비특이적 결합과 관련된 어려움이다. 또한, 이러한 컬럼 분리 방법에서 표적 세포를 포획하기 위하여 마크로비드를 사용하는 것은 유체 스트림으로부터 비드를 회수한 후, 세정을 위한 일반적인 과정인 세척을 필요로 한다. 비드는 세정 동안 소실되거나, 붕괴되거나 응집되어 표적 세포의 회수를 덜 효과적으로 만들 수 있다.

포획 제제, 대체로 특정 표적 세포 집단에 선택적인 항체는 일반적으로 비드 표면에 물리적으로 또는 화학적으로 부착된다. 비드에 물리적으로 부착하는 포획 제제는 수송 및 취급으로 인해 떨어지거나 교체될 수 있다. 하지만, 포획된 세포가 세정 동안 비드 상에 확실하게 머무르게 되도록 공유 결합을 통해 강하게 부착되어 있으면, 이후 수집 동안 방출 및 회수할 수 없을 수 있다.

컬럼 분리법이외에도, 체액 등에서 발견될 수 있는 다양한 세포 집단으로부터 표적 세포를 분리하기 위한 다른 방법들도 현재 개발중에 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2004/0142463호는 특이적 결합 성분을 보유하는 컬럼을 포함하여, 플레이트 또는 다른 고체 지지체의 표면을 이용해 혈액 샘플로부터 목적하지 않은 성분을 우선 제거하고 이어서 전기영동 등을 이용하여 표적 세포의 분리를 완료하고 분석하는 모체 혈액 등으로부터 태아 세포를 분리하는 시스템을 교시하고 있다.

미국 공개 특허 출원 제2004/038315호는 모세관의 내강 표면에 방출가능한 링커를 부착하고, 이어서 목적하는 결합 세포를 절단 시약을 통해 방출시키고 회수한다. 미국 공개 특허 출원 제2002/132316호는 이동식 광학 구배장을 이용하여 세포 집단을 분리하기 위한 마이크로채널 장치를 이용한다. 미국 특허 제6,074,827호는 전기 영동을 사용하여 샘플로부터 특정 핵산을 분리 및 동정하는 "농축 채널"을 구비하도록 제작된 마이크로플로우 장치의 용도를 개시하고 있다. 또한, 목적하는 표적 생체물질을 유지하기 위한 항체 또는 다른 결합 단편의 선택적 용도가 언급되어 있다. 미국 특허 제6,432,630호는 선택적 편향을 적용한 채널을 통하여 생체입자를 함유하는 유체의 흐름을 안내하기 위한 마이크로플로우 시스템을 개시하고 있는데, 여기서는 이러한 시스템을 모체 혈액 샘플로부터 태아 세포를 분리하는데 사용할 수 있다고 나타내고 있다.

문헌 [K. Takahashi 외, J.Nanobiotechnology,2, 5(13 June 2004)(6 pp)]은 유리 플레이트로 폐쇄된 PDMS 플레이트(포토레지스트 에폭시 수지에 생성시킨 마스터 몰드에서 제조)에 형성시킨 중심 세포 분류 영역으로 복수의 마이크로플로우 입구 통로가 이어지는 온칩 세포 분류 시스템을 개시하고 있다. 합류의 짧은 세포 분류 영역을 통한 흐름 동안 세포들을 평행하고 연속적인 완충액 스트림으로 향하게 하는 정전기력을 적용하여 원치않는 세포의 분리를 촉진시키는 아가겔 전극을 PDMS 플레이트에 제공한다. 또한, 거대 크기의 먼지 입자를 물리적으로 트래핑하기 위한 포스트형 필터 배치물이 개시되어 있다.

미국 특허 제6,454,924호는 피분석물 함유 액체를 일반적으로 포획제가 부착된 직립 기둥위에 배치된 샘플 표면의 아래쪽을 지나 흐르게하는 마이크로플로우 장치를 개시하고 있는데, 상기 기둥의 측면은 소수성이 되도록하여 이들이 한정하는 채널내 흐름을 촉진하도록 하였다.

공개된 국제 공개 특허 제WO2004/029221호는 모체 혈액으로부터 태아의 적혈구 세포를 분리하는 등의 세포 분리를 위해 사용할 수 있는 마이크로플로우 장치를 개시하고 있다. 상기 세포를 포함하는 샘플을 다수의 장애물을 포함하는 마이크로플로우 채널에 도입하는데, 상기 장애물의 표면에는 이에 적절하게 결합되어 있는 결합 부위, 예를 들어 항체가 존재하며, 상기 부위들은 샘플 내 세포에 결합하게 된다. 미국 특허 제6,344,326호는 다수의 농축 채널을 구비한 마이크로플로우 장치를 개시하고 있는데, 여기서는 항체 등과 같은 결합 성분이 가교된 유리 필라멘트 등에 결합되어 목적하는 생체분자를 포획하게 된다. 미국 특허 제5,147,607호는 샌드위치 어세이 등의 면역분석을 수행하기 위한 장치의 용도를 교시하고 있는데, 여기서는 항체가 마이크로채널에 동원된다. 채널의 기저면으로부터 위를 향해 연장되어 있고 항체가 고정되어 있는 돌출부 그룹을 포함하는 오목면이 마이크로채널에 제공될 수 있다.

상기에서 간략하게 기술한 참조문헌들은 유체 등으로부터 세포 또는 다른 생체 물질을 단리하거나 검출하기 위한 개선된 방법을 위해 지속적인 연구가 이루어져야 한다는 증거를 제공하고 있다.

-본 발명의 요약-

무작위화된 흐름 패턴, 구체적으로 무작위화된 유체 다중채널 패턴에 의해 제공된 무작위화된 흐름 패턴을 표적 분자 또는 물질을 단리하거나 검출하기 위해 사용할 수 있다는 것을 본 발명에서 발견하였다. 따라서, 본 발명은 표적 분자, 특히 표적 세포 또는 생물학적 분자를 단리하거나 검출하는데 유용한 장치 및 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 무작위화된 흐름로를 구비하고 입구 수단, 출구 수단 및 상기 입구 및 출구 수단 사이에서 연장된 마이크로채널부를 포함하는 몸체를 포함하는 마이크로플로우 장치를 제공하며, 여기서 마이크로채널부는 마이크로채널의 베이스 표면과 일체화되고 이로부터 돌출된 복수의 횡단 분리기 포스트를 포함하며, 상기 포스트는 상기 무작위화된 흐름로를 제공할 수 있는 패턴으로 배치된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 장치 및 상기 장치의 마이크로채널 표면을 격리제로 피복하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 장치를 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 장치의 마이크로채널 표면은 격리제로 피복되어 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플을 함유하는 액체가 본 발명의 장치의 마이크로채널을 통해 흐르도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 마이크로채널의 표면은 표적 분자가 결합할 수 있는 격리제로 피복된 것인 샘플 내 표적 분자의 포획 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플을 함유하는 액체가 본 발명의 장치의 마이크로채널을 통해 흐르도록 하는 단계 및 표적 분자를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 마이크로채널의 표면은 표적 분자에 결합할 수 있는 격리제가 피복된 것인 샘플 내 표적 분자의 검출 방법을 제공한다.

도 1은 단순화시킨 마이크로채널에 포스트 포함 수집 영역을 제작한 마이크로플로우 장치용 기판의 투시도이다.

도 2는 패턴화된 포스트가 위치하는 도 1의 수집 영역의 일부를 도시한 확대 단면도이다.

도 3은 기저면에 부착된 커버 플레이트와 함께 선 3-3을 따라 취한 도 1의 기판의 전방 단면도이다.

도 4는 매개 플레이트의 도입을 통해 대체로 도 1에 도시한 바와 같은 기판을 갖는 두개의 밸브를 도입한 장치의 개략적인 투시도이다.

도 5는 도 4의 선 5-5에 따른 단면도이다.

도 6은 마이크로플로우 장치의 일부로서 펌프를 제작한 도 1에 도시한 유형의 기판을 도시한 계략적인 설계도이다.

도 7은 마이크로혼합기가 공급 영역에 도입된 기판 일부의 개략도이다.

도 8은 친수성 피복물을 도입하여 수집 영역 전체에 항체를 부착시킨 개략도이다.

도 9 및 도 10은 목적하는 표적 세포가 포획되는 설명과 함께, 친수성 피복물을 이용하여 수집 영역 전체에 격리제, 즉 선택한 항체를 공유 결합시키기 위해 사용할 수 있는 화학반응을 개략적으로 나타내는 도면이다.

도 11은 패턴화된 포스트, 세포 분리 장치를 이용한 세포 회수 작업 단계를 도시한 흐름도이다.

무작위화된 흐름 패턴, 구체적으로 무작위화된 흐름 다중채널 패턴에 의해 제공된 무작위화된 흐름 패턴을 표적 분자 또는 물질을 단리하거나 검출하기 위해 사용할 수 있다는 것을 본 발명에서 발견하였다. 따라서, 본 발명은 표적 분자, 특히 표적 세포 또는 생물학적 분자를 단리하거나 검출하는데 유용한 장치 및 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 입구 수단, 출구 수단, 및 입구와 출구 수단 사이에 연장된 마이크로채널부를 포함하는 장치를 제공한다. 본 발명의 마이크로채널부는 무작위화된 흐름로를 제공할 수 있는 임의 마이크로채널 패턴일 수 있다. 본 발명에 따르면, 무작위화된 흐름로는 층흐름 또는 반복 흐름 패턴을 최소로, 예를 들어 실질적이지 않은 양으로 함유하거나 또는 없는 임의 흐름로일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 무작위화된 흐름로는 층흐름 또는 반복 흐름 패턴이 없는 흐름로이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 무작위화된 흐름로는 직선 흐름을 방해하거나 억제하는 흐름로이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 무작위화된 흐름로는 당분야의 당업자에게 공지된 바와 같은 수학적으로 무작위적인 패턴에 상응하는 흐름로이다.

본 발명의 무작위화된 흐름로는 당 분야에서 공지되거나 이후 발견되는 임의 적절한 수단을 이용하여 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 무작위화된 흐름로는 마이크로채널의 베이스 표면과 일체화되고 이로부터 돌출된 다수의 횡단 분리기 포스트와 함께 마이크로채널부를 이용하여 생성될 수 있고 본 발명의 무작위화된 흐름로를 제공할 수 있는 패턴으로 배치될 수 있다. 일반적으로, 마이크로채널부, 예를 들어 단일 유닛 또는 영역 내 포스트는 예를 들어 횡단면 크기 등의 크기 및 형상 등이 다양할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 마이크로채널부는 예를 들어, 대형, 소형 및 중형 등 둘 또는 셋 이상의 상이한 횡단면 크기를 갖는 포스트를 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로채널부는 또한 단일 형상을 갖거나 또는 하나 이상의 형상을 갖는 포스트를 포함할 수도 있다. 보통, 상이한 크기 및/또는 형상을 갖는 본 발명의 포스트는 본 발명의 무작위 패턴에 따라서 연속적으로 또는 균일하게 분포한다.

일 구체예에서, 포스트의 평균 횡단면 크기는 마이크로채널부를 통해 흐르게 되는 표적 분자의 크기와 관련된다. 일반적으로 포스트의 평균 횡단면 크기와 표적 분자 크기간의 상대 비율은 약 0.5:5, 0.5:8, 1:5, 1:8, 2:5, 2:9, 3:5 또는 3:8이다. 다른 구체예에서, 포스트의 횡단면은 포스트를 포함하는 마이크로채널의 베이스 표면 횡단면의 약 20%∼약 75%를 차지한다. 또 다른 구체예에서, 상기 포스트의 총 용적(예를 들어, 고체 용적 분율)은 상기 마이크로채널 총 용적(예를 들어, 공극 용적 분율)의 약 15%∼약 25%이다. 또 다른 구체예에서, 두 포스트간 최소 거리는 포스트의 가장 작은 횡단면 크기와 관련되는데, 예를 들어, 포스트의 최소 횡단면 크기와 동일하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 포스트는 수학적 알고리즘, 예를 들어 컴퓨터 프로그램을 통해 생성된 무작위 패턴에 상응하는 패턴으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 일정한 사전 결정된 파라미터, 예컨대, 포스트의 총 개수 및 두 포스트간 최소 거리 등을 기초로 무작위 패턴을 형성하는 수학적 알고리즘을 사용할 수 있다. 구체적으로, 각 크기 그룹 내 포스트의 총 개수 및 두 포스트간의 최소 거리를 확인하여 수학적 알고리즘을 통해 생성된 무작위 패턴을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 마이크로채널부의 표면은 선택적으로 하나 이상의 격리제로 부분적으로 또는 전체적으로 피복될 수 있다. 일반적으로, 격리제는 표적 분자와 특이적 방식으로 상호작용할 수 있는 임의 물질, 예를 들어 표적을 물리적으로 격리시키는 생물학적 분자일 수 있다.

본 발명의 격리제는 핵산, 예를 들어 DNA, RNA, PNA 또는 올리고뉴클레오티드, 리간드, 단백질, 예를 들어 수용체, 펩티드, 효소, 효소 억제제, 효소 기질, 면역글로불린(특히 항체 또는 이의 단편), 항원, 렉틴, 개질 단백질, 개질 펩티드, 생물기원 아민 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 합성 분자, 예를 들어 일정한 특이적 결합 활성을 갖도록 설계된 약물 및 합성 리간드를 사용할 수도 있다. "개질된" 단백질 또는 폴리펩티드는 신규한 화학 부위를 부가하거나, 존재하는 화학 부위를 제거하거나 또는 제거와 부가 둘다를 일부 조합하여서 변경된 분자 내 하나 이상의 아미노산을 갖는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 이러한 변경은 천연 개질과 합성 개질 둘 모두를 포함할 수 있다. 천연 개질은 이에 제한되는 것은 아니나, 인산화, 황산화, 글리코실화, 뉴클레오티드 부가 및 지질화 등을 포함할 수 있다. 합성 개질은 이에 제한되는 것은 아니나, 히드로겔, 마이크로구조체, 나노구조체, 예를 들어 양자 도트 또는 다른 합성 물질에 대한 결합을 촉진시키기 위한 화학 링커를 포함할 수 있다. 또한, 개질은 존재하는 기능성 부위, 예를 들어 히드록실, 설프히드릴 또는 페닐기의 제거, 또는 천연 측쇄 또는 폴리펩티드 아미드 골격의 제거나 변경을 포함할 수 있다.

복합 탄수화물의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 천연 및 합성의 선형 및 분지형 올리고당류, 개질 다당류, 예를 들어 당지질류, 펩티도글리칸, 글리코사미노글리칸 또는 아세틸화된 종을 비롯하여 이종 올리고당류, 예를 들어 N-아세틸글루코사민 또는 황산화 종을 포함한다. 천연 발생된 복합 탄수화물의 예는 키틴, 히아룰론산, 케라틴 설페이트, 콘드로이탄 설페이트, 헤파린, 셀룰로스 및 개질 단백질 예컨대 알부민 및 IgG에서 발견되는 탄수화물 부위를 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 마이크로채널의 표면은 예를 들어 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상 또는 둘 이상의 격리제에 연결되거나 결합되어 피복될 수 있다. 일 구체예에서, 둘 이상의 이러한 제제의 조합물을 본 발명의 마이크로채널의 표면, 예를 들어 베이스 표면 및/또는 포스트의 표면상에 고정시키고, 이러한 조합물을 두 물질의 혼합물로서 부가하거나 또는 순차적으로 부가할 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 격리제는 하나 이상의 블로킹 제제로 처리한 본 발명의 마이크로채널의 표면에 결합된다. 예를 들어, 본 발명의 마이크로채널의 표면은 과량의 피콜 또는 다른 적절한 블로킹 제제로 처리하여 본 발명의 채널의 배경 신호를 줄일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 장치, 및 선택적으로 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 장치를 포함하고, 여기서 상기 장치의 마이크로채널의 표면은 격리제로 피복되지 않았으며, 키트는 선택적으로 격리제로 마이크로채널의 표면을 피복하기 위한 설명서를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 장치를 포함하고, 여기서 상기 장치의 마이크로채널의 표면은 격리제 및 선택적으로 블로킹 제제로 피복되어 있고, 선택적으로 키트는 이러한 장치를 사용하기 위한 설명서를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 표적 분자, 예를 들어 표적 생물학적 분자를 포획하거나 검출하기 위해 본 발명의 장치를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 표적 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 펩티드, 바이러스, 탄수화물 등을 비롯하여 광범위하게 다양한 세포 중 임의의 것일 수 있다. 그러나, 임의 범주에 제한하지 않고, 본 발명은 세포 분리 및 검출에서 특별한 효능을 나타내고 특별한 장점을 갖는 것으로 여겨진다. 비록 용어 "세포"가 본 발명의 전반에서 사용되고 있지만, 이는 격리제에 특이적인 표면 리간드를 보유하는 세포 단편 및/또는 잔존물을 포함하는 것으로 이해한다. 일 구체예에서, 본 발명의 표적 세포는 신생물, 예를 들어 암 또는 종양 세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 표적 세포는 예를 들어 태아를 보유한 피험체 유래의 혈액 또는 자궁경부 점액에 존재하는 태아 세포이다. 또 다른 구체예에서, 표적 세포는 샘플 중에 매우 적은 수로 존재하며, 예를 들어 샘플 중 표적 세포 대 총 세포 집단의 비율이 약 1:10⁷, 1:10⁸또는 1:10⁹보다 낮다.

본 발명의 장치로 포획되는 표적 분자는 발생부위에서(in situ) 또는 마이크로채널의 표면으로부터 방출시킨 후에 검출하거나 분석할 수 있다. 예를 들어, 세포는 FISH 또는 다른 임의의 적절한 방법을 통해 직접적으로 발생 부위에서 검출할 수 있다. 뉴클레오티드 및 단백질도 본 발명의 마이크로채널의 표면으로부터 방출시키기 전 또는 이후에 발생 부위에서 직접 분석할 수도 있다.

본 발명의 일 특정 구체예에 따르면, 수집 영역(17)을 구비하는 하나 이상의 마이크로채널(13)을 포함하는 기판 내에 한정된 흐름로를 갖는 기판(11)을 포함하는 장치를 제공하는데, 상기 흐름로는 샘플 입구(15) 및 액체 출구(19)에 연결된 것이다. 이하에 언급하는 바와 같이, 흐름로는 각각이 하나의 수집 영역을 갖는 직렬로 배치된 몇몇개의 마이크로채널을 포함할 수 있다. 다르게, 마이크로채널은 직렬로 배치된 하나 이상의 수집 영역을 가질 수 있고, 또한 하나 이상의 출구 및 하나 이상의 입구가 존재할 수 있으며, 이들 모두는 당분야에서 공지된 바와 같다. 또한, 칩, 디스크 등 상에 제작된 통합 마이크로플로우 장치의 일부일 수 있으며, 이러한 장치에는, 샘플로부터 단리된 생체분자의 진단 및/또는 세포 회수를 수행하기 위해 필요한 모든 MEMS(마이크로-전자-기계 시스템) 및 성분을 단일하고, 컴팩트하며, 취급이 용이한 유닛의 일부로서 도입시킬 수 있다.

도 1은 출구로서 제공되는 개방구(19) 및 진입구 또는 입구로서 제공되는 개방구 또는 웰(15)을 통해서 샘플 액체가 공급되는 마이크로채널(13)을 포함하는 흐름로가 형성된 기판(11)의 투시도이다. 수집 영역(17)의 횡단면은 입구 개방구(15)로부터 이어지는 입구부(18)의 횡단면보다 크다. 입구부는 수집 영역(17)으로 들어가도록 영역(18)의 말단에서 넓어지는 바로 위쪽에 축 방향으로 정렬된 분할기/지지체(21) 쌍을 포함한다. 이러한 중심 분할기는 흐름을 두 경로로 나누고, 수집 영역(17)의 진입구 말단으로 전달되면서 보다 균일하게 액체 흐름이 분배되도록 제공된다. 수집 영역은 다수의 직립 포스트(23)를 포함하는데 이는 액체 흐름로에 대해 횡단으로 배열되고 흐름 채널의 수집 영역 부분의 전체 너비를 가로질러 불규칙적으로, 대체로 무작위 패턴으로 배열된다. 포스트의 패턴은 수집 영역을 통해서 직선 흐름이 최소로만 존재하거나 또는 존재할 수 없게하고, 층흐름 스트림이 방해받거나 억제되어서, 흐름로를 따라 흐르게 되는 액체와 포스트의 표면간에양호한 접촉을 보장하도록 한다. 포스트는 수집 영역(17)의 평면 베이스(22)에 일체화되어 있고 이에 수직으로 연장되어 있으며, 기판(11)의 흐름 채널을 통해서 흐르게 되는 액체의 수평로에 대해서 수직인 표면을 나타낸다. 바람직하게, 이들은 이하에 구체적으로 설명하는 바와 같이, 흐름 채널을 폐쇄하고 베이스 표면(22)에 평행한 외장 평면 폐쇄 플레이트의 표면(27)에 결합되어서 자유 말단 표면으로 연장되어 고정된다. 입구 및 출구 홀(24a 및 24b)은 이와 같은 폐쇄 플레이트를 통해 구멍을 뚫을 수 있지만, 바람직하게는 기판(11)에 제공된다. 다른 흐름 분할기/지지체(21)는 수집 영역으로부터의 출구에 위치한다.

당 분야에서 공지된 바와 같이, 기판은 각각이 수집 영역을 구비하는 평행한 마이크로채널 쌍을 포함하는 흐름로를 갖도록 형성될 수 있다. 이는 직렬 흐름 배치물로 사용하거나, 병렬 흐름 작동으로 사용할 수 있다. 흐름은 예를 들어 시린지 펌프 등을 이용하여 펌핑하거나, 또는 거대 직경의 입구 홀(24a)에 의해 제공되는 입구 웰에서 저장부로부터 액체를 끌어들이는 진공을 통해 수행할 수 있다. 바람직하게, 이러한 웰은 액체 샘플 약 50 ㎕∼약 500 ㎕를 유지하는 용량을 갖도록 포함된다.

흐름 채널의 디자인은 타당한 범위 내에서 장치를 통과하는 유속으로, 예를 들어, 초당 약 0.01 내지 100 mm의 속도로 수집 영역에 흐름을 생성시키도록 표준 하버드 장치 주입 시린지 펌프를 이용하여 모체 혈액을 주입하도록 하고, 난류를 생성하지 않고 상기 영역을 통해 층흐름의 실질적인 파괴가 존재하도록 하는데, 이는 수집 영역을 통한 포스트의 상대적인 공간화 및 상이한 크기의 포스트의 무작위 배치에 의한 결과이다. 데드 스팟이 없는 비교적 평활한, 비층흐름은 약 0.3 내지 10 mm/sec의 바람직한 액체 유속에서 이루어지며, 보다 바람직하게 유속은 약 0.5 내지 5 mm/sec로 유지시키고, 한정된 크기의 입구 웰로부터의 흡입에 의해 수행한다.

일반적으로, 기판(11)은 임의 적절한 실험실에서 허용가능한 물질, 예컨대 실리콘, 용융 실리카, 유리 및 중합체 물질로 제조할 수 있다. 특히 진단 기능을 선택적으로 적용하는 것이 바람직한 경우에, 선택적으로 투명한 물질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 가장 단순한 구체예에서, 제작된 마이크로채널을 보유한 기판은 도 3에 도시한 바와 같이, 기판(11)의 외장 표면에 인접하게 되는 평면 표면을 갖는 플레이트(27)로 밀봉된다. 이러한 플레이트는 동일한 물질로 제작되거나 또는 단순하게 유리로 제조된 커버 플레이트일 수 있지만, 중간 흐름 조절 플레이트(25)가 이하에 설명하는 바와 같이 포함될 수 있다. 사용할 수 있는 적절한 플라스틱은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테라프탈레이트를 비롯하여, 허용가능한 실험실 물질 용도로 공지된 다른 중합체 수지를 포함한다. 이렇게 패턴화된 기판은 임의 통상적인 방법 예컨대 통상의 성형 및 주조 기법 중에서 선택된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.

기판은 문헌 [J. Nanobiotechnology]에 기술되고, 당분야에서 공지된, 광학 리소그라피를 이용하여, 두꺼운 음각 포토레지스트로 생성시킬 수 있는 마스터 또는 음각 성형 구조물을 이용하여 중합체 물질로부터 편리하게 제작할 수 있으며, 상기 문헌은 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 예를 들어, 필름 두께가 40 ㎛ 또는 50 ㎛인 포토레지스트를 제공하도록 2000 rpm에서 실리콘 웨이퍼 기판 상에서 회전시킬 수 있는, 시판되는 하드너(SU-8 2025) 및 표준 등급의 에폭시 수지(EPON SU-8) 포토레지스트의 혼합물로부터 상기 구성층을 형성시킬 수 있다. 상기의 두께는 수집 영역의 흐름로 높이를 결정한다. 상기 필름에 대해 전체적으로 균일한 두께를 보장하도록 정밀하게 수평인 가열 플레이트상에 60℃에서 3분간, 이어서 95℃에서 7분간 사전 노출 소성시키고, 얻어진 샘플은 실온으로 냉각시킨다. Karl Suss Contact Mask Aligner를 사용하여 최종 장치 내 흐름로에 대해 바람직한 패턴으로 필름을 노출시켰다. 이후 이 필름을 65℃에서 2분간 이어서 95℃에서 5분간 후소성시킨 다음 광 교반을 현상하는 동안 가하면서, 5분간 시판되는 SU-8 현상제에서 현상시켰다. 이를 통해서 PDMS 또는 다른 적절한 중합체 수지로 패턴화된 포스트 기판의 복제를 위한 성형 마스터로서 사용되는 에폭시 수지 포토레지스트의 음각 패턴 몰드를 생성시켰다.

일례로서, PDMS 조성물은 중량비가 10:1인 PDMS 예비중합체 및 경화제(Sylgard 184 kit, Dow Corning)의 혼합물로부터 제조한다. 이 혼합물에 대하여 혼합 동안 생성될 수 있는 기포를 진공을 가하여 제거하고, 목적하는 두께의 기판을 생성하기 위하여 원하는 두께의 공동으로 존재하는 에폭시 수지 마스터 몰드에 부었다. 선택적으로 이 마스터 몰드는 경화 이후 PDMS 복제물의 방출을 개선시키도록 적절한 금속(예를 들어, 금속)으로 제조된 박층(∼50 ㎚)으로 사전피복시킬 수 있다. PDMS 기판의 경화는 80℃에서 90분간 수행할 수 있지만, 초기에 PDMS를 불충분하게 경화하여, 이하에 기술하는 바와 같이 포스트 표면을 포함하는 수집 영역의 후속 작용기화를 촉진하는 것이 가능하다.

수집 영역(17)의 패턴화된 포스트(23) 및 마이크로채널(13)의 치수 및 레이아웃은 마스터 몰드 제작의 노출 단계에서 사용한 마스크를 통해 결정한다. 마이크로채널(13)의 깊이는 회전-피복 조건에 의해 결정되는, 마스터 몰드의 SU-8층 두께에 의해 제어된다. 도 2는 바람직한 전체적으로 무작위적인 배치물의 수집 영역(17) 내 포스트(23)의 확대도를 도시한 마이크로채널(13)의 평면도를 제공한다.

다른 구체예에서, 홀(24)은 방출시킨 PDMS 복제 기판의 평면이고, 손상되지 않은 표면 또는 커버 플레이트에 구멍을 뚫거나 아니면 생성시켜서 입구 및 출구 연결부를 제공할 수 있다. 앞의 예에서, 단순한 현미경 커버 슬립, 또는 기판에 구멍이 없는 커버 또는 베이스 플레이트를 제공할 수 있는, PDMS의 얇고 평평한 조각 등과 같은 다른 적절한 평면 플레이트를 사용하여 일치시킬 수 있다. 2분 동안 두 성분에 대해 플라즈마 세정을 수행한 후, 세정된 두 표면을 곧바로 외장 표면과의 접촉없이, 표면 접촉부에 위치시키고, 이후, 당분야에서 공지된 바와 같은 표면 반응을 통해 밀봉시켜 영구 밀봉부를 형성시키고 마이크로플로우 흐름로를 폐쇄한다.

이러한 장치에 온칩 흐름 메니지먼트를 일체화시키는 것이 바람직하다면, 흐름 조절 특징부를 위한 개별 SU-8 성형 마스터 도입 공동, 예컨대 공기압 밸브 등을 유사하게 제작할 수 있다. 이러한 마스터 몰드로부터 제조된 흐름 조절 플레이트 또는 층(25)은 우선 마이크로채널 기판(11)에 적층시키고(도 4 및 5 참조), 다음으로 평면 폐쇄 플레이트(27)에 적층시킨다. 마이크로플로우 장치에 이러한 흐름 조절 성분 및 다른 MEMS를 적용하는 것은 미국 특허 제6,074,827호 및 제6,454,924호에 도시되어 있으며, 이를 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 마이크로채널을 보유하는 기판(11)과 함께 이러한 흐름 조절 플레이트(25)를 조심스럽게 배열시킨 후 80℃에서 밤새 어닐링하여, 복합 구조체를 제작한다. 이후, 흐름 조절 플레이트(25)의 공동을 초기에 기술한 것과 동일한 방식을 사용하여 평면 플레이트 또는 유리 슬라이드(27)로 폐쇄한다. 추가 선택으로서, 보다 정교한 제어 및 추가 처리과정을 도입하는 것이 바람직하다면, 동일한 방식을 사용하여 제2 흐름 조절 플레이트를 제1 플레이트(25)에 적층시킬 수 있다.

예를 들어, 온칩 흐름 조절 기구를 기판에 밀봉시킨 흐름 조절층(25)에 배치시켜서 기판(11)에 형성된 다중채널 시스템에 제공할 수 있다. 통로(24a 및 24b)가 입구 및 출구로 이어진 간단한 시스템을 도 4 및 5에 도시하였다. 공기압 밸브(29)로의 공기 공급은 기판(11)을 통해서 플레이트(25)로 연장된 구멍을 뚫거나 아니면 적절하게 형성시킨 홀(30)을 통해 이루어질 수 있다. 흐름 조절 플레이트(25) 또는 기판(11)은 선택적으로 입구(15)로 액체를 전달할 수 있는 대안적인 공급 통로를 포함할 수 있고 또한 당분야에서 공지된 대안적인 출구 또는 제거 통로를 포함할 수 있다.

언급한 바와 같이, 두개의 직렬 연결된 수집 영역이 제공된 배치물은 그 자체가 상이한 작동법 및 사용법으로 제공된다. 예를 들어, 가능하게 2종의 상이한 하부집단의 목적하는 표적 생체분자 또는 세포를 포함하는 샘플 액체를 처리하려는 경우, 격리제 중 한 유형은 하나의 수집 영역 또는 챔버 내 포스트에 부착시키고, 다른 유형의 격리제는 하류의 수집 챔버 내 포스트에 부착시킬 수 있다. 다르게, 표적 세포가 상당하게 희박한 예에서는, 두 수집 챔버의 포스트에 동일한 격리제를 부착시켜서 액체 샘플 중 거의 100%의 세포를 포획할 수 있는 가능성을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.

패턴화된 포스트 영역의 중합체 표면을 다양하게 유도체화시켜서 목적하는 표적 세포 또는 다른 생체분자에 대해 특이적인 격리제의 모든 표면상에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 마이크로채널 보유 기판의 플라즈마 처리 및 폐쇄 이후에, 에탄올 중 아미노 작용성 실란 또는 티오 작용성 실란의 1 내지 50 부피% 용액(예를 들어, Dow Corning Z-6020의 10% 용액)을 마이크로채널에 주입하여 개방구(15 및 19) 사이의 영역(17)을 채울 수 있고, 이후 가득찬 마이크로채널(13)을 실온에서 30분간 항온반응하도록 방치시킬 수 있다. 유도체화는 플레이트로 마이크로채널 영역을 폐쇄하기 전에, 불완전하게 경화된 중합체, 예컨대 PDMS에 대해 수행할 수 있다. 이러한 경우, 초반부에 언급한 바와 같이, 대안적으로는, PDMS 기판을 약간 덜 경화시킨 후, 밀봉 플레이트를 고정시키고 치환된 실란 또는 다른 작용기화제를 처리한 후 경화를 완료한다. 예를 들어, 약 50 내지 90℃에서 약 90분간의 최종 가열 단계를 사용하여 Z-6020을 처리한 후 경화를 완료한다. 다르게는 실온에서 하루 또는 이틀로 경화를 완료할 수도 있다. 이러한 유도체화 처리는 또한 외장 평면 표면의 유도체화가 실제적인 결과가 아니기 때문에 마이크로채널 영역의 폐쇄전에 수행할 수도 있다. 흐름로를 에탄올로 퍼징하면, 이 마이크로채널은 생체분자 격리제를 부착시킬 준비가 된다.

격리제는 포스트 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정시킬 수 있고, 포스트는 부착이 촉진되도록 사전처리 및/또는 피복시킬 수 있다. 간접 고정화가 특히 바람직하며 포스트에 처음 결합된 매개 제제 또는 기질의 적용을 고려할 수 있는데, 매개 제제에 결합시키기 위하여 결합쌍을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘, 또는 다른 종의 항체에 대해 생성된 항체를 바이오틴화된 Ab 또는 상기의 다른 종의 Ab에 결합되는 매개 제제에 부착시킬 수 있다.

격리제로서 항체를 사용하는 것은 세포 분리를 위해 바람직할 수 있고, 이의 부착은 당분야 및 미국 특허 제646,404호 및 제4,675,286호에 기술되어 있다. 예를 들어, 비공유 결합을 위한 과정은 미국 특허 제4,528,267호에 기술되어 있다. 고체 지지체에 항체를 공유 결합시키는 과정도 문헌 [Ichiro Chibata in IMMOBILIZED ENZYMES; Halstead Press: New York (1978)] 및 [A. Cuatrecasas, J. Bio. Chem. 245:3059 (1970)]에 기술되어 있으며, 이 두 문헌의 내용을 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 항체는 바람직하게, 예를 들어 Ab가 부착되는 긴 링커의 피복물 또는 표면층을 사용하여, 고체 포스트 표면에 간접적으로 결합시킨다. 예를 들어, 우선 표면을 예컨대 단백질 등의 이작용성 또는 다작용성 제제로 피복시킬 수 있는데, 이 제제는 이후 결합제 예를 들어, 글루타르알데히드 등을 이용하여 항체와 결합된다. 항체는 또한 유리 이소시아네이트 또는 동등한 기, 예를 들어 폴리에테르 이소시아네이트를 갖는 층으로 피복된 표면에 수용액 중 항체를 적용하여 효과적으로 결합시키거나, 또는 항체를 시아노겐 브로마이드에 의해 히드록실화 물질에 결합시킬 수 있다. 특히 바람직하게는 이하 실시예에서 기술한 공계류중인 특허 출원서에 개시된, 유리 이소시아네이트 기를 갖는 친수성 폴리우레탄계 히드로겔 층을 이용하거나, 또는 실질적인 길이의 친수성 링커, 예컨대 PEG, 폴리글리신 중 하나를 사용하는 것이다.

항체(Ab)를 사용하는 경우, 항체는 당분야에서 공지된 임의 기전을 사용하여, 이러한 매개 제제를 통해 바람직하게, 적절하게 부착시킨다. 예를 들어, Ab는 티올화시키기 위하여 2-아미노티올란으로 처리하고, 얻어진 티올화 Ab는 PEG-말레이미드로 처리시킨 포스트에 접합시킨다. 다르게는, Ab를 반응성 이소시아네이트기 또는 티오시아네이트기를 갖는 적절한 친수성 피복물에 직접 공유 결합시킬 수 있다.

패턴화된 포스트 수집 영역에 걸쳐서 적절하게 항체 또는 다른 격리제를 위치시켜, 마이크로채널 장치를 사용할 수 있게 준비한다. 체액, 예컨대 혈액 또는 소변 샘플, 또는 표적 세포 집단을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 일부 다른 사전 처리된 액체를, 표준 시린지 펌프를 통해 조심스럽게 마이크로채널 장치의 입구(15)로 연결되는 입구 통로(24a)로 방출하거나, 또는 바람직한 부피로 시험용 샘플을 보유하도록 웰로서 기능하는 비교적 큰 직경의 입구 통로(24a)를 통해 제공되는 샘플 저장소로부터 진공 펌프 등을 통해 끌어당겨서, 수집 영역(17)을 통해 흐름로를 따라 흐르게 만든다. 개방구(24a)는 사용되는 경우 시린지 펌프 등에 연결된 배관과 맞추기 위해 피팅(도시하지 않음)을 포함할 수 있다. 펌프는 장치를 통해서 약 0.5∼10 ㎕/분의 흐름을 실시하도록 작동될 수 있다. 체액, 또는 처리 및/또는 분석하고자 하는 다른 세포 함유 액체에 따라서, 당분야에서 공지된 바와 같은 사전 처리 단계를 사용하여 부피를 줄이고/줄이거나 바람직하지 않은 생체분자를 격감시킬 수 있다.

세포 분리 방법의 전체적인 효율을 가능성있게 증가시키기 위해서, 출구(19)를 나가는 샘플을 수집하고 이를 1회 이상 마이크로채널 장치를 통해 흐르게 하는 것이 바람직할 수 있으며, 이러한 반복 처리는 세포가 특히 드물어서 샘플 중에 매우 소수만이 존재하는 경우에 특히 유용할 수 있다. 하지만, 장치에 의해 얻어지는 포획 효율이 매우 높기 때문에, 이러한 반복 흐름은 거의 필요하지 않을 것으로 예상된다. 다르게는, 직렬로 연결된 두 수집 챔버를 초기에 언급한 바와 같이 사용할 수 있다. 또한, 비교적 부피가 큰 체액 샘플을 처리하는 경우에는, 기판 상에 둘 이상의 마이크로채널을 병렬로 사용할 수 있다.

격리제(예를 들어, Ab)는 마이크로채널 내 수집 영역의 베이스, 외장 표면, 포스트 및 측벽에 부착시키지만, 상기 측벽 표면은 흐름을 방해하므로 베이스, 외장 표면 및 포스트처럼 세포를 포획하는데 특히 효과적이지 않다. 제한된 내강을 통하는 세포 또는 다른 생체 분자를 함유하는 액체의 흐름은 세포가 흐름 전단이 최소인 중심 스트림 영역에 주로 존재하게 만든다는 것을 확인하였고, 그 결과 격리제를 보유하는 측벽 상에서의 포획은 횡단 포스트가 층흐름을 방해하는 중간 영역의 표면상에서의 포획과 비교하여 상당히 드물다. 이러한 영역에서는, 적절한 결합에 의해 이들의 천연적인 3차원 형태를 추정할 수 있는 격리제가 놀랍도록 효과적이다.

장치를 통한 액체 샘플의 흐름을 완료한 후, 표적 세포를, 존재한다면, 수집 영역 내에서 포획하고, 우선 완충제를 이용하여 퍼징을 수행해서 샘플의 일부이고 수집 영역의 항체 또는 다른 격리제에 의해 강하게 포획되지 않은 이질적인 모든 생체 물질을 제거하였다. 유효한 완충제를 이용한 이러한 퍼징은 마이크로채널 장치내 수집 영역에 부착된 표적 세포만을 남기고, 비특이적으로 결합된 모든 세포는 제거시킬 것으로 예측된다.

완충제를 이용한 퍼징을 완료시, 처리 방법의 목적이 세포 수집만인 경우, 포획된 세포를 적절하게 방출시킨다. 이하에 언급하는 바와 같이, 일부 예에서, 발생 부위에서 일부 분석법을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 부착시킨 상태에서 세포를 계측하거나, 또는 세포를 용해시켜서 수집 챔버 또는 하류에서 PCR 등을 수행할 수 있다. 다르게, 세포를 포획 또는 부착시키면서, 예를 들어, FISH 또는 다른 임의 적절한 검출 방법을 통해 직접적으로 관찰하거나 검출할 수 있다.

방출을 실시하는 경우, 당 분야에서 공지된 임의 방법, 예컨대 기계적(예를 들어, 고속 유체 흐름), 화학적(예를 들어, pH 변화 등), 또는 효소적 절단 제제 등의 이용 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수집 영역으로부터 표적 세포를 방출하기 위해 시약을 사용하여 격리제를 절단하거나 또는 제제와 세포간의 결합을 절단할 수 있다. 예를 들어, 트립신 또는 특이적인 목적의 효소를 사용하여 Ab 및/또는 세포 표면 항원을 분해시킬 수 있다. Ab 등을 부착시키고 포획된 리간드를 효과적으로 제거하는 것 둘 모두에 대해 특이적인 방법은 미국 특허 제5,378,624호에 기술되어 있다. 예를 들어, 세포를 희박 세포의 표면 특징부에 특이적인 항체를 사용하여 격리시킨 경우, 방출은 트립신 또는 다른 적절한 프로테아제, 예컨대 프로테아제 K를 함유하는 용액으로 처리하여 실시할 수 있다. 다르게는, 콜라게나제를 사용하여 다른 격리제로부터 방출을 실시하거나, 또는 특이적으로 절단가능한 링커를 사용하여 격리제를 부착시킬 수 있다. 이러한 절단 동안, 마이크로채널로부터의 출구는 저장소 또는 다른 수집기에 연결시키고, 방출된 희박 세포를 보유하는 방출 스트림을 추가 분석을 위해 수집한다. 마이크로채널 장치는 출구에 하나 이상의 출구 통로 및 출구 개방을 조절하기 위한 밸브를 갖도록 제작할 수 있는데, 이는 하나의 출구 통로를 예비 단계 동안 폐기물 방출을 위해 사용하고, 다른 출구 통로는 표적 세포 스트림을 수집 용기로 향하도록 할 수 있다.

패턴화된 포스트 수집 영역(17) 내 포스트(23)의 배치 및 형상은 최적의 유체 역학 및 특이적 표면 특징부를 통한 표적 세포의 포획 강화를 위해 설계할 수 있다는 것을 확인하였다. 매우 일반적으로, 대부분의 경우에서, 횡단 고정된 포스트(23)의 수평 횡단면의 바람직한 형상은 포스트의 횡단면에 비특이적 결합을 촉진할 수도 있는 급각도는 피한다. 포스트(23)는 직선형 외부면을 가지며, 바람직하게는 대체로 원형 횡단 형상이거나 6개 이상의 면을 갖는 정다각형이다. 사용할 수 있는 다른 형상은 정점이 하류 말단에 위치하고 얕게 굽은 물방울 형상이거나, 또는 타원형이지만, 보다 영향력있는 것이 요구되는 경우에는 사각형을 사용할 수 있다. 포스트의 패턴은 포스트의 표면, 베이스 및 외장 표면에 부착된 격리제에 의한 표적 세포의 포획을 강화하는 액체 스트림의 흐름 패턴을 생성시켜야 한다. 이러한 목적을 이루기 위해서, 포스트는 상이한 크기여야 하고 정해진 무작위 패턴으로 배치되어야 한다. 놀랍게도, 상이한 횡단면 크기의 포스트(23)의 무작위 패턴, 예를 들어, 약 3 또는 4 이상의 상이한 크기, 직경 약 70 마이크론 내지 약 130 마이크론, 수집 영역에서 약 100 마이크론 높이 및 약 2 내지 4 mm 너비인 원형 횡단면 포스트가, 포스트간 최소 분리 공간이 50 내지 70 ㎛, 바람직하게는 약 60 ㎛일 때, 액체 샘플의 흐름으로부터 특히 효과적으로 세포 포획을 촉진하는 것으로 나타났다.

베이스에 수직인 평행한 선에 의해 형성된 측벽을 모두 갖고 있는 포스트의 횡단면은 수집 영역의 약 15 내지 25 용적%를 차지하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 포스트 패턴이 약 80%의 액체 흐름에 대한 공극 용적을 남기고, 수집 영역의 약 20 용적%를 차지하는 것이다. 특히 도 2에 도시한 포스트 위치의 무작위 패턴이 층흐름을 효과적으로 방해한 영역에서의 격리제에 의해 포획되는 세포의 경향을 증가시키는 것으로 나타났다. 포스트(23)는 실질적으로 예를 들어, 약 60 마이크론 이상 정도로, 상호 떨어져서 위치하고, 상이한 크기의 포스트는 바람직하게, 서로 상류 및 하류에 위치한다.

보다 작은 포스트는 보다 큰 포스트의 하류 와상 영역을 생성할 수 있고, 생성된 흐름 패턴에 의해서, 근접부 표면은 표적 세포를 포획하는데 특히 효과적인 것으로 나타날 수 있다. 도 2에 도시한 바와 같이, 측벽으로부터 약 100 마이크론 이상의 위치에서 흐름로에 세로로 연장된 임의 직선이 다수 포스트를 교차하게 된다. 이전에 언급한 바와 같이, 포스트는 기판의 베이스(20) 표면에 일체화되어 있고, 바람직하게는 외장 표면에 대한 반대면 또는 자유 말단, 즉 흐름 조절 플레이트(25) 또는 평면 폐쇄 플레이트(27)에서 고정되어 있다.

앞서 나타낸 바와 같이, 수집 영역에 걸친 격리제, 예컨대 항체의 부착을 촉진할 수 있고 특정한 친수성 히드로겔 물질 또는 친수성 링커의 박층, 예컨대 분자량 약 1,000 달톤 이상, 바람직하게는 MW가 약 2,000 내지 100,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 3,000 내지 50,000 달톤인 PEG, 폴리글리신 등의 박층을 이용하여 내부 표면을 피복하여 격리제가 보다 효과적으로 작용하도록 만들 수 있다. 특히 바람직한 것은 반응성 이소시아네이트 기를 포함하고 우레탄 결합에 의해 중합된 PEG, PPG 또는 이의 공중합체를 함유하는 이소시아네이트 작용성 중합체인 친수성 히드로겔 피복물을 사용하는 것이다. 이러한 피복 물질 배합물의 구체적인 설명은 본 출원인의 양수인에게 양도된, 2004년 12월 23일 출원된 공계류중인 미국 특허 출원 제11/021,304호에 개시되어 있다. 도 8에는 챔버를 통해서 층흐름을 방해하도록 무작위적으로 배치된 다양한 직경의 복수 포스트(61)가 존재하는 마이크로 채널 내 수집 영역을 개략적으로 나타낸 도면으로서, 여기서 각각의 포스트(61) 및 외장 평면은 외부 피복물(63)을 보유한다. 또한, 포스트 상의 친수성 히드로겔 피복물에 부착되어 있고, 그 결과 주로 물인 히드로겔에 부착되어 변경되지 않은 천연의 3차 구조를 유지하는 항체 형태의 격리제(65)가 도시되어 있다.

도 9는 도 8에 나타낸 바와 같은, 바람직한 특징의 히드로겔을 사용시 적용할 수 있는 개략적인 화학 반응을 제공한다. 격리제, 예컨대 항체를 표면에 친수성 히드로겔 중합체 피복물(49)을 적용한 수집 영역(17")에 걸쳐 모든 표면에 부착하는 대표적인 순서를 도시하고 있다. 도 9의 1 지점은 아미노실란 등으로 처리하여 아미노 유도체화가 후속된 표면을 나타내고 있다. 이 단계는 표면을 카세인으로 코팅하기 위하여 탈지유를 이용하는 것이 후속되며, 2 지점을 참조한다. 3 지점은 톨루엔디이소시아네이트로 말단 캡핑된 분자량이 약 3,400인 PEG를 함유하는 예비중합체를 이용하여 피복을 수행한 후의 피복된 표면을 나타낸다. 상기 예비중합체는 수혼화성의 유기 용매, 예컨대 NMP와 CH₃CN의 혼합물에 용해시킬 수 있다. 바람직하게 히드로겔 배합물은 삼작용성 또는 그 이상의 다작용성 폴리올, 예컨대 PEG 및 PPG를 함유하고, 삼작용성 이소시아네이트를 함유할 수 있다. 약 98.5 중량%의 물을 함유하는 수용액을 제조하는데, 이 용액은 마이크로채널을 통해 펌핑하여 포스트의 표면 및 수집 영역의 외장 표면이, 아민 유도화된 표면에서 말단 캡핑된 이소시아네이트 기의 반응에 의해 친수성 히드로겔 피복물로 피복되게 한다. 최종 결과는 도 9의 지점 3에 나타내었다.

지점 4는 표면 아미노기를 갖게되는 항체의 부가를 나타낸다. 이 항체는 친수성 피복물에 의해 운반되는 이소시아네이트 또는 티오시아네이트 기에 Ab 아민을 공유 결합시켜서, 지점 5에 도시한 바와 같이, 포스트의 친수성 히드로겔 피복물에 직접 부착시킬 수 있다. 다르게, 항체를 우선 도 9의 지점 6에 도시한 바와 같이 티올화시키고, 티올화된 항체를 수용액으로 수집 챔버에 공급하며, 여기서 이후 이들은 지점 7에 나타낸 바와 같이, 피복된 중합체의 이소시아네이트 기에 용이하게 공유 결합하게 된다.

도 9의 지점 8 및 9에 도시한 바와 같이, 방해된 층흐름에 의한 결과로서 수집 챔버를 통해 흐르게되는 액체 샘플 중의 세포가 포스트 및/또는 외장 표면과 접촉하면, 항체에 특이적인 세포 표면 상의 항원이 접합되어서, 효과적으로 세포를 포획하게 된다.

도 10은 수집 영역의 표면에 격리제, 특히 항체를 잡아두는데 연장된 PEG 또는 PPG 선형 중합체를 사용하는 경우 적용할 수 있는 화학 반응을 개략적으로 도시한 도면을 제공한다. 선형 중합체는 이의 길이가 포획을 수행하는 수성 환경에서 항체가 천연적인 3차원 구조를 유지할 수 있도록 선택한다. 도 10의 지점 1은 아미노실렌 등으로 처리하여 아미노 유도체화가 후속되는 표면을 도시하였다. 이 단계는 다시 상기 기술한 바와 같이, 표면을 카세인 피복하기 위해 탈지유 고형분을 사용하는 것이 후속된다. 세정 후, 모든 표면을 분자량이 약 2000 이상, 바람직하게는 약 3000 이상이고, 한쪽 말단에 NHS 부위를 갖고 반대쪽 말단에는 말레이미딜 부위를 갖는 선형 PEG 또는 PPG로 처리한다. N-히드록시-숙신이미딜 에스테르 부위는 표면 상의 아미노기와 용이하게 반응하여 약 1 마이크론 이상 두께인 피복물을 제공한다. 적절한 항온반응 이후, 마이크로채널을 배수시키고 적절한 완충제로 세정하여, 도 10의 지점 3에 나타낸 바와 같이 말레이미도-PEG-피복된 표면이 남게 한다. 지점 4는 영양아층에 특이적이고 고유하게 표면 아미노기를 갖는 항체를 나타낸다. 이 항체는 바람직하게, 적절한 시약 예컨대 트라우트 시약을 이용하여 티올화시켜서 도 10의 지점 5에 도시한 바와 같은 지점에 도달시킨다. 티올화된 항체를 이어 정제된 티올화 항체를 완충 용액 중 마이크로채널에 도입하고 적절하게 항온반응하도록 하여 말레이미도-PEG-피복된 포스트와 접합시킨다. 이어서 마이크로채널을 적절한 완충제로 세정하고, 도 6에 도시한 바와 같은 접합된 배치물을 얻는다.

도 10의 개략도의 지점 7은 선형 PEG 결합 제제에 의해 표면에 고정된 항체에 의한 영양아층의 포획을 도시한 것이다.

이하 실시예는 자궁경부 점막 추출물로부터 영양아층(trophoblast) 세포를 격리시키기 위한 유형의 원형 마이크로채널 장치를 효과적으로 사용하는 것에 대해 설명한다. 물론, 이 실시예들은 본 발명의 일정 구체예를 설명을 위한 것으로 이해해야하며, 상세한 설명의 종결부에 첨부된 청구항으로 한정되는 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1

생체분자를 분리하기 위한 마이크로플로우 장치를 실시예 1과 같은 원 형(prototype) 기판을 이용하여 제작하였다. 상기 기판은 PDMS로부터 형성시켰고 흐름 채널을 폐쇄하기 위하여 평면 유리 플레이트에 결합시켰다. 수집 영역 전체의 내부면은 Dow Corning Z-6020의 10 부피% 용액과 실온에서 30분간 항온반응시켜서 유도체화하였다. 에탄올로 세정한 후, 이들을 약 1시간 동안 실온에서 탈지유로 처리하여 얇은 카세인 피복물을 생성시켰다. 수중 10% 에탄올로 세정한 후, 평균 MW가 6,000인 이소시아네이트 캡핑된 PEG 트리올계 히드로겔을 이용하여 처리를 실시하였다. 사용된 배합물은 약 3% 중합체로 구성된 것이다. 히드로겔 예비중합체는 6 중량부 유기 용매, 즉 아세토니트릴 및 DMF에 대해 1 중량부의 중합체를 이용하여 제조하였고, BSA를 함유하는 pH가 8.0인 100 mM 나트륨 보레이트 중 1 mg/㎖ 항체 용액과 혼합하였다. 특이적 배합물은 Acn/DMF 중 100 mg 예비 중합체; 보레이트 완충액 중 0.25 mg/㎖ 항체 믹스 350 ㎕; 및 보레이트 완충액 중 1 mg/㎖ BSA 350 ㎕를 포함하고, 약 2 중량%의 중합체를 함유하였다.

이 실험을 위해서, 자궁경부 점막 샘플로부터 영양아층을 단리하는 것이 바람직하며, 문헌 [Kawata 외, J. Exp. Med., 160:653 (1984)]에 세포 특이적 Ab,예를 들어 인간 영양아층에 대한 단일클론 항체(항-Trop-1 및 항-Trop-2)를 이용하는 표적 세포 검출을 통하여 태반 세포 집단을 단리하는 방법이 개시되어 있다. '596 특허는 동일한 목적을 위해 다른 Ab를 사용하는 것에 대해 교시되어 있고, 미국 특허 제5,503,981호는 상기 목적을 위해 사용할 수 있는 3종의 상이한 단일클론 Ab를 동정하였다. Trop-1 및 Trop-2에 대한 항체는 태아 기원의 영양아층의 외부 표면이 보유하고 있는 리간드에 특이적이다. 우선 이들 항체에 대한 완충제 선택은 Amicon Centricon-20™ 멤브레인계 마이크론 농축기에서 반복적으로 농축시켜서, 항체의 안정성 및 계획한 개질에 대해 보다 상용성있는 완충액으로 교환시켰다. 이후 항체(0.1 mg)를 5 mM EDTA(pH 8.3)를 함유하는 0.2 M 나트륨 보레이트/0.15 M NaCl 100 ㎕에 용해시키고 티올화가 이루어지도록 1시간 동안 RT에서 40 mM 트라우트 시약 5 ㎕와 반응시켰다. 과량의 트라우트 시약을 100 mM 글리신 10 ㎕와 반웅시킨 후, Centricon-30™ 상에서 티올화된 항체를 정제하였다. 티올화는 표준 실험실 절차를 통해 검증하였다.

약 0.5 mg/㎖의 농도로, 수용액 중 티올화된 항-Trop-1 및 2를 총 약 5 마이크로그램을 사전처리한 마이크로플로우 장치에 공급하였고, 용액을 25℃에서 2시간 동안 항온반응하도록 두었다. 이러한 항온반응 기간 이후, 흐름 채널을 1% PBS/BSA로 플러싱하여 태아 영양아층 세포를 단리하는 시험에 사용하는 항체-피복된 표면을 제공하였다.

임신한 모체(임신 8주 내지 12주)로부터의 자궁경부 점막을 HAM 배지(InVitrogen)를 이용하여 10 ㎖로 희석하고 10분간 37℃에서 DANse(120 유닛)를 처리하였다. 100 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과시킨 후, 세포를 30분간 1500 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 HAM 배지(100 ㎕)에 재현탁시키고, 자궁경부 점막 추출물의 상기 세포 현탁물 약 50 마이크로리터가 채워진 Harvard Apparatus 시린지 펌프로부터 출구 배관까지 마이크로플로우 분리 장치를 걸어서(hook) Trop-1 및 Trop-2로 피복된 마이크로채널을 통과시켰다. 시린지 펌프는 실온에 약 10 ㎕/분의 유속에서 마이크로플로우 장치를 통해 샘플 액체의 연속적인 서행 흐름이 이루어지 도록 작동시킨다. 이 기간 동안, 횡단 포스트의 무작위 패턴이 위치하는 수집 영역의 표면에 부착시킨 Trop-1 및 Trop-2 Ab가 샘플에 존재하는 영양아층을 포획한다. 전체 샘플을 시린지 펌프를 통해 전달한 후에, 1% PBS/BSA 수성 완충액으로 서행 플러싱을 수행하였다. 이 수성 완충액 약 100 ㎕는 약 10분의 기간 동안 장치를 통해 공급하였고, 이는 장치 내 흐름 채널로부터 비특이적으로 결합된 모든 생체 물질을 효과적으로 제거하였다. 각각 약 10분의 기간 동안 1% PBS + 1% BSA 약 100 ㎕로 2회의 추가 세정을 수행하였다.

이때, 장치가 광학적으로 투명한 물질로 제조되었기 때문에, 광학현미경을 이용하여 포획 효율을 현미경 검사를 통해 얻을 수 있다. 결합된 세포는 영양아층 기원인 포획 세포에 특이적인 사이토케라틴 7 및 사이토케라틴 17을 이용하여 염색하였다. 이러한 현미경 사진으로 세포를 계측하였는데, 샘플에 존재하는 것으로 추정되는 영양아층의 실질적으로 97%가 패턴화된 포스트 수집 영역에서 포획된 것으로 판단되며, 이는 매우 우수한 결과라고 할 수 있다.

이러한 포획 및 세정 단계의 반복에서, 포획된 영양아층은 0.25 % 트립신 용액 100 ㎕ 용액을 서서히 20분 기간 동안 27℃에서 흐름 채널을 통해 흘려주어 방출시켰다. 이 시약은 Ab의 분해를 일으켜서, 영양아층을 수성 흐름으로 방출시키게되고 여기서 이들은 출구를 통과하여 수집된다. PCR 및 FISH 기반 방법을 통해 수집된 세포를 분석한 결과 실제로 이들이 사용된 Ab에 의해 표적화된 영양아층임을 확인하였다.

실시예 2

생체 분자를 분리하기 위한 마이크로플로우 장치를 실시예 1과 같은 원형 기판을 이용하여 제작하였다. 이 기판은 PDMS로부터 형성시켰고 평면 유리 플레이트를 결합시켜 흐름 채널을 폐쇄하였다. 수집 영역 전체의 내면은 Dow Corning Z-6020의 10 부피% 용액과 실온에서 30분간 항온반응시켜 유도체화시켰다. 에탄올로 세정한 후, 약 1시간 동안 실온에서 탈지유로 처리하여 얇은 카세인 피복을 생성시켰다. 수중 10% 에탄올로 세정한 후, 평균 MW가 6000인 이소시아네이트 캡핑된 PEG 트리올계 히드로겔을 이용하여 처리를 실시하였다. 사용된 배합물은 약 3% 중합체로 구성되었다. 히드로겔 예비중합체는 유기 용매, 즉 아세토니트릴 및 DMF 6 중량부에 대해 1 중량부의 중합체를 이용하였고, 이를 BSA를 함유하는 pH 8.0인 100 mM 나트륨 보레이트 중 1 mg/㎖ 항체 용액과 혼합하였다. 얻어진 특이적 배합물은 Acn/DMF 중 100 mg 예비중합체; 보레이트 완충액 중 0.25 mg/㎖ 항체 믹스 350 ㎕; 및 보레이트 완충액 중 1 mg/㎖ BSA 350 ㎕를 포함하고, 약 2 중량%의 중합체를 함유한다. 영양아층의 외부 표면에 보유된 리간드에 특이적인 항체 Trop-1 및 Trop-2를 또한 사용하였다.

Trop-1 및 2 히드로겔 수용액 총 약 5 마이크로리터를 사전처리한 마이크로플로우 장치에 공급하였고, 이 용액을 약 30분간 25℃에서 항온반응하도록 방치하였다. 이러한 항온반응 기간 이후, 흐름 채널을 잉여의 히드로겔을 교체 및 밀어내기 위하여 흐름 채널로 서서히 밀려나가는 미네랄 오일로 플러싱하였다. 그 결과 PDMS 물질로부터 오일을 분리한 히드로겔 피복 박층을 갖는 오일이 채워진 흐름 채널이 만들어졌다. 3 시간 후, 히드로겔을 완전히 경화시키고, 1×PBS/0.1% Tween 용액으로 플러싱해 내었다. 이후 장치에 1×PBS 용액을 채워 Ab를 보존하였다.

임신 모체(임신 8주 내지 12주) 유래의 자궁경부 점막을 HAM 배지(InVitrogen)를 이용하여 10 ㎖로 희석하고, 30분 동안 37℃에서 DNAse(120 유닛)를 처리하였다. 100 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과한 후, 세포를 30분간 1500 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 HAM 배지(100 ㎕)에 재현탁하고, 자궁경부 점막 추출물의 세포 현탁물 약 50 마이크로리터가 채워진 Harvard Apparatus 시린지 펌프로부터 출구 배관까지 마이크로플로우 분리 장치를 걸어서 Trop-1 및 Trop-2 피복된 마이크로채널을 통과시켰다. 이 시린지 펌프는 수집 영역의 표면에 부착된 Trop-1 및 Trop-2 Ab가 샘플에 존재하는 영양아층을 포획하는 기간 동안, 실온 및 약 10 ㎕/분의 유속에서 마이크로플로우 장치를 통해 샘플 액체의 연속적인 서행 흐름을 생성하도록 작동시켰다. 전체 샘플이 시린지 펌프를 통해 전달된 후, 1% PBS/BSA 수성 완충액을 이용하여 서행 플러싱을 수행하였다. 이 수성 완충액 약 100 ㎕를 약 10 분간 장치를 통해 공급하였는데, 이를 통해 장치의 흐름 채널로부터 비특이적으로 결합된 모든 생체 물질이 효과적으로 제거되었다. 다음으로, 각각 약 10분 동안 1% PBS + 1% BSA 약 100 ㎕를 이용하여 2회의 추가 세정을 수행하였다.

사이토케라틴 7 및 사이토케라틴 17을 이용하여 결합된 세포를 염색한 후, 광학현미경을 이용하여 포획 효율을 현미경으로 검사하였다. 이 현미경 사진에서 세포를 계측하여, 샘플 내 존재하는 것으로 추정되는 영양아층이 우수하게 포획된 것을 확인하였다.

실시예 3

생체 분자를 분리하기 위한 다른 마이크로플로우 장치를 실시예 1에서와 동일한 원형 기판을 이용하여 제작하였다. 기판은 PDMS로부터 형성하였고 평면 플레이트에 결합시켜 흐름 채널을 폐쇄하였다. 수집 영역 전체의 내부면은 Dow Corning Z-6020의 10 부피% 용액과 실온에서 30분간 항온반응시켜 유도체화시켰다. 에탄올로 세정한 후, 약 1시간 동안 실온에서 탈지유를 사용하여 처리하여 얇은 카세인 피복물을 생성시켰다.

수중 10% 에탄올로 세정한 후, 0.2 MOPS/0.5 M NaCl, pH 7.0 중 2.5 mM NHS-폴리글리신(평균 MW 약 4500) 10 ㎕를 이용하고, 교반을 제공하기 위해 채널 중에서 앞뒤로 용액을 부드럽게 펌핑하면서 2시간 동안 RT에서 항온반응을 수행하여 처리를 실시하였다. 이 마이크로채널을 pH 7.0 MOPS 완충액 500 ㎕로 3회 세정하여 말레이미도-폴리Gly-피복된 채널을 얻었다.

영양아층의 외부면에 보유된 리간드에 특이적인 항체 Trop-1 및 Trop-2를 실시예 1에서와 같이 처리하여 티올화시켰다.

약 0.25 mg/㎖ 농도로, 수용액 중 티올화된 항-Trop-1 및 2를 총 약 5 마이크로그램을 사전처리된 마이크로플로우 장치에 공급하였고, 이 용액을 2시간 동안 25℃에서 항온반응하도록 두었다. 이러한 항온반응 기간 이후, 흐름 채널을 1% PBS/BSA를 이용하여 플러싱(3회)하여 태아 영양아층 세포를 단리하는 시험에 사용되는 항체-피복된 표면을 제공하였다.

임신 모체(임신 8주 내지 12주) 유래의 자궁경부 점막을 HAM 배 지(InVitrogen)를 이용하여 10 ㎖로 희석하고, 30분 동안 37℃에서 DNAse(120 유닛)를 처리하였다. 100 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과한 후, 세포를 30분간 1500 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 HAM 배지(100 ㎕)에 재현탁하고 자궁경부 점막 추출물의 세포 현탁물 약 50 마이크로리터가 채워진 Harvard Apparatus 시린지 펌프로부터 출구 배관까지 마이크로플로우 분리 장치를 걸어서 Trop-1 및 Trop-2 피복된 마이크로채널을 통과시켰다. 이 시린지 펌프는 수집 영역의 표면에 부착된 Trop-1 및 Trop-2 Ab가 샘플에 존재하는 영양아층을 포획하는 기간 동안, 실온 및 약 10 ㎕/분의 유속에서 마이크로플로우 장치를 통해 샘플 액체의 연속적인 서행 흐름을 생성하도록 작동시켰다. 전체 샘플이 시린지 펌프를 통해 전달된 후, 1% PBS/BSA 수성 완충액을 이용하여 서행 플러싱을 수행하였다. 이 수성 완충액 약 100 ㎕를 약 10 분간 장치를 통해 공급하였는데, 이를 통해 장치의 흐름 채널로부터 비특이적으로 결합된 모든 생체 물질이 효과적으로 제거되었다. 다음으로, 각각 약 10분 동안 1% PBS + 1% BSA 약 100 ㎕를 이용하여 2회의 추가 세정을 수행하였다.

비록 본 발명이 본 발명을 수행하기 위하여 발명자들에게 현재 공지된 최상의 모드를 구성하는 일정한 바람직한 구체예에 대하여 기술하고 있지만, 하기의 청 구항에서 정의하는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 다양한 변형 및 변경을 가할 수 있다는 것은 당분야의 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 마이크로채널을 한정하는 기판을 제작하기 위한 바람직한 물질을 기술하였지만, 이와 같은 실험실 장치에 적합한 것으로 당분야에서 공지된 사용가능한 다양한 범위의 구조 물질이 존재한다. 자궁경부 점막 추출물 유래의 영양아세포 또는 모체의 혈액 셈플로부터 태아 세포를 분리하는 것에 대하여 일반적으로 중점을 두었지만, 본 발명은 다양한 혈액 세포, 예를 들어 핵형성 적혈구, 림프구 등, 전이성 암 세포, 줄기세포 등을 분리하는데 유용할 뿐만 아니라, 다른 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 바이러스 등을 액체 샘플로부터 분리할 수도 있다. 샘플이 특이적인 세포 소집단을 함유하는 경우, 포획되는 표적 세포는 희박 세포 등과 분리되는 원치않는 세포 그룹일 수 있다. 또한, 표적 세포가 수집되면, 이들은 발생부위에서 용해시켜 세포 DNA를 제공할 수 있고, 이를 수집하여 이후에 분석하거나 또는 수집 챔버 내에서 PCR을 수행할 수 있다. 미국 공개 특허 출원 제2003/0153028호는 이러한 결합 세포를 용해하여 방출되는 핵산을 얻는 것에 대하여 교시하고 있다. 샘플 중에 2종의 상이한 표적 세포의 소집단이 존재하면, 상이한 격리제를 수집 챔버의 상류 및 하류의 포스트에 부착시킬 수 있다. 다른 경우에 있어서, 한 세포속의 세포를 수집 챔버 상류에서 우선 수집, 방출시키고 챔버 하류에서 다시 스크리닝하여 아속의 세포를 단리한다.

구조적 관점에서, 이러한 장치에 선택적으로 도입할 수 있는 일부 추가적인 성분을 도 6 및 7에 도시하였다. 도 6은 도 1에 도시한 바와 유사한 마이크로채널 을 나타내는데 여기서 연동형 펌프 설비를 수집 영역에 측접해 있는 입구 통로 영역 및 출구 통로 영역에 도입하였다. 입구(15'), 수집 챔버(17') 및 출구(19')를 포함하는 마이크로채널부(13')를 도시하였는데, 여기서 일체화된 펌핑 배치물(41)은 수집 챔버로 이어지는 진입 통로(18')에 위치하는 특별하게 설계된 3개의 멤브레인 밸브를 도입하여 제작하였다. 도 4 및 5에 도시한 것과 유사한 배치물을 개략적으로 도시하였는데, 여기서 흐름 조절층 또는 플레이트의 각 밸브 멤브레인의 압력면으로 이어지는 통로(30')에 공기 또는 다른 고압 가스를 도입하면 상기 멤브레인이 팽창되어 연합되어 있는 마이크로채널의 인접한 영역의 액체를 압착시킨다. 좌측에서 우측으로 순차적으로 3개의 밸브가 작동되도록 제어 유닛을 프로그램화하여서, 마이크로채널의 진입 영역(18')의 액체를 우측으로 수집 장치(17')를 통해서 펌핑되도록 흐름 이동을 설정한다. 바람직하다면, 유사한 연동형 펌핑 배치물(43)을 또한 수집 챔버(17')의 하류로 이어지는 출구 통로 영역(45)에 도입한다.

다른 가능한 별법으로서, 마이크로혼합 배치물을 도 7에 도시하였다. 마이크로혼합기(51)는 앞서 기술한 바와 같은 기판 중 수집 영역으로 이어지는 진입 통로일 수 있는 공급 통로(55)로 연결되는 원형로(53)를 포함하는 것으로 도시되어 있다. 입구 채널 쌍(57a 및 57b)을 제공하여 액체가 원형로(53)로 공급되고, 경로(55, 57a 및 57b)를 통하는 액체 흐름은 공기압 밸브(59)를 통해 제어한다. 3개의 추가적인 공기압 밸브(61)가 통로 자체에 위치하고 앞서 기술한 유형의 연동형 펌프(63)를 구성한다. 이 배치물은 수집 챔버 등에 전달하기에 앞서 기판 자체에서 두 액체를 미세혼합하는 효과적인 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 출구 채널(57a) 로부터의 일부 액체 및 입구 채널(57b)로부터의 일부 완충액으로 원형로(53)를 채운 후, 원형로에 제공된 고리 주변 액체를 펌핑시키기 위해 순차적으로 3개의 밸브(61)를 작동시켜서 혼합을 실시할 수 있으며, 그에 따라서 액체는 전달 통로(55)를 통해 배출되기 전에 완전하게 혼합될 수 있다.

실시예 4 : 혈액 샘플 중 태아 세포의 분리- MACS vs. CEE

기본적인 실험 방법:

. 공여자 당 6×10 ㎖ 혈액을 수집한다.

. 각 10 ㎖로부터 피콜 세포 펠렛을 제조한다(주로 혈액의 핵형성 백혈 세포 성분을 함유).

. 각 세포 펠렛으로 ∼50 JEG 세포를 스파이킹(spike)한다.

. MACS 상에서 3회, CEE에서 3회 실시한다. 즉 동일 공여자 유래 샘플에 대해 3회 반복 수행한다.

. 혈액 중 상피세포를 포획하기 위해 MACS에서 통상적으로 사용되는 EpCAM 항체로 MACS 및 CEE를 피복한다.

. MACS 및 CEE로부터 JEG 세포의 회수율을 계측한다.

. MACS 및 CEE 상에서 배경 DAPI 양성 세포를 계측한다.

. 상이한 6 공여자에 대해 반복한다(장치 당 총 18 샘플).

결과 :

	평균 포획률	95% CI	순도 (# JEG 세포: # 배경 세포)	농축 (∼35M 세포에서 유래)
CEE 포획률%	102%	88∼117%	1:138	∼250,000×
MACS 포획률%	57%	45∼69%	1:3219	∼10,000×
CEE 배경값 #	7,592	2,600∼12,500	n/a	n/a
MACS 배경값 #	99,800	65,000∼134,000	n/a	n/a

결론 :

. 축적된 CEE 포획률은 MACS에 비하여 ∼2×높았다(p<0.0001).

. 전체적인 MACS 비특이적 포획률은 CEE에 비하여 ∼13×높았다(p<0.0001).

. 피콜 유래의 특이적 및 비특이적 포획 변동률은 두 과정 모두 높았고 샘플 변동률에 의해서가 아닌 샘플 취급에 의해 큰 것으로 나타났다.

본 발명에서 특히 언급한 모든 미국 특허 및 출원의 개시 내용은 명백하게 참조하여 포함시킨다.

본 발명의 특징은 이하의 청구항에서 중점적으로 나타낸다.

Claims

입구 수단, 출구 수단, 및 상기 입구 수단과 상기 출구 수단 사이에서 연장되는 마이크로채널부를 포함하는 무작위화된 흐름로를 가지는 몸체를 포함하는 마이크로플로우 장치로서, 상기 마이크로채널부는 이 마이크로채널의 베이스 표면과 일체화되고 이로부터 돌출된 복수의 횡단 분리기 포스트를 포함하고, 상기 포스트는, 직선 흐름을 억제하고 액체 샘플의 층흐름을 방해하도록 하는 다양한 포스트 횡단면 크기 및 포스트의 무작위 배치를 포함하는 무작위의 불규칙한 패턴으로 배열되는 것인 마이크로플로우 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트는 상기 베이스 표면에 실질적으로 수직으로 정렬되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트는 수학적 알고리즘에 의해 생성시킨 무작위의 불규칙한 패턴으로 배열되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트는 포스트의 총 개수 및 두 포스트 간의 최소 거리를 이용한 수학적 알고리즘에 의해 생성시킨 무작위의 불규칙한 패턴으로 배열되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트의 평균 횡단면 크기는 상기 마이크로채널을 통해 흐르게 되는 표적 분자의 크기와 관련되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트의 횡단면은 상기 마이크로채널의 상기 베이스 표면 횡단면의 20%∼75%를 차지하는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 포스트의 총 용적은 상기 마이크로채널의 총 용적의 15%∼25%인 장치.
제1항에 있어서, 두 포스트 간의 최소 거리는 포스트의 최소 횡단면 크기와 관련되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널의 표면은 친수성층으로 피복되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널의 표면은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 또는 이들의 공중합체의 이소시아네이트 작용성 중합체를 포함하는 1 마이크론 이상의 두께의 친수성층으로 피복되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널의 표면은 격리제(sequestering agent)로 피복되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널의 표면은 항체, 항원, 수용체, 리간드, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 렉틴 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 격리제로 피복되는 것인 장치.
제11항에 있어서, 격리제가 링커에 의해 상기 마이크로채널의 표면에 결합되는 것인 장치.
제11항에 있어서, 격리제가 친수성 링커 또는 히드로겔층에 의해 상기 마이크로채널의 표면에 결합되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 입구 수단은 액체 샘플을 유지할 수 있는 웰을 포함하는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널은 상기 포스트의 자유 말단에 고정된 플레이트로 밀봉되는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널은 광투과성 베이스 표면을 포함하고, 광학 검출 수단을 통해 볼 수 있는 것인 장치.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널은 상기 포스트의 자유 말단에 고정된 플레이트로 밀봉되고 상기 마이크로채널의 상기 베이스 표면 및 상기 플레이트는 광투과성인 것인 장치.
제1항의 장치, 및 상기 마이크로채널의 표면을 격리제로 피복하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
제1항의 장치를 포함하는 키트로서, 상기 마이크로채널의 표면은 격리제로 피복되는 것인 키트.
샘플 중의 표적 분자 또는 표적 세포를 포획하는 방법으로서,

상기 샘플을 함유하는 액체를 제1항의 장치의 마이크로채널을 통해 흐르게 하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 마이크로채널의 표면은 표적 분자 또는 표적 세포에 결합할 수 있는 격리제로 피복된 것인 방법.
샘플 중의 표적 분자 또는 표적 세포를 검출하는 방법으로서,

상기 샘플을 함유하는 액체를 제1항의 장치의 마이크로채널을 통해 흐르게 하는 단계로서, 상기 마이크로채널의 표면은 표적 분자 또는 표적 세포에 결합할 수 있는 격리제로 피복된 것인 단계, 및

표적 분자 또는 표적 세포를 검출하는 단계

를 포함하는 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 표적 분자는 암 또는 종양 세포 상에 존재하거나, 상기 표적 세포는 암 또는 종양 세포인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 표적 분자는 태아 세포 상에 존재하거나, 상기 표적 세포는 태아 세포인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 샘플 중 표적 세포수 대 총 세포수의 비율이 적어도 1:10⁷, 1:10⁸, 또는 1:10⁹인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 샘플을 함유하는 액체는 초당 0.5 mm∼5 mm의 속도로 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 샘플을 함유하는 액체는 초당 0.01 mm∼100 mm의 속도로 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 샘플을 함유하는 액체는 초당 0.3 mm∼10 mm의 속도로 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 샘플을 함유하는 액체는 분당 0.5 ㎕∼분당 10 ㎕의 유량으로 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 샘플을 함유하는 액체는 분당 10 ㎕의 유량으로 상기 마이크로채널을 통해 흐르는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 격리제가 포스트 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정화되는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 표적 분자가 세포 표면 상에 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로채널의 표면이 스트렙타비딘으로 피복되는 것인 장치.