KR101418597B1 - 고 함량의 (ｓ)-(+)-ｓ-아데노실-ｌ-메티오닌을 갖는건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애세포, 이들의 제조방법, 및 이들 세포를 함유하는 조성물 - Google Patents

고 함량의 (ｓ)-(+)-ｓ-아데노실-ｌ-메티오닌을 갖는건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애세포, 이들의 제조방법, 및 이들 세포를 함유하는 조성물 Download PDF

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Abstract

(S)-(+)-SAMe의 선택된 고 생산성 균주로부터 얻을 수 있는 유리 염기 형태의 고 함량의 (S)-(+)-S-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는 건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 세포가 기재되어 있다.
(S)-(+)-SAMe, 미세캡슐화, 사카로마이세스 세레비시아애

Description

고 함량의 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는 건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애 세포, 이들의 제조방법, 및 이들 세포를 함유하는 조성물{DRIED AND／OR MICROENCAPSULATED SACCHAROMYCES CEREVISIAE CELLS WITH A HIGH CONTENT OF （Ｓ）－（＋）－Ｓ－ADENOSYL－L－METHIONINE, PROCESS FOR THEIR PREPARATION, AND COMPOSITIONS CONTAINING SAID CELLS}
본 발명은 고 함량의 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는 건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 세포, 이들의 제조방법, 및 이들 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
특히 본 발명은 부분입체이성질체, 유리 염기인 (R)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌(이후 (R)-(+)-SAMe 이라 칭함)이 부분입체이성질체, 유리 염기인 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌(이후 (S)-(+)-SAMe 라 칭함)의 10% 이하의 양으로 존재하는 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 세포에 관한 것이다.
(S)-(+)-SAMe 이온은 굉장히 불안정하여서 생산 세포로부터 추출되면 즉각적으로 분해될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 실제로, SAMe의 발견(Cantoni et al. "Phosphorus metabolism", Baltimore 1952 2, 129; Cantoni et al. J. Biol. Chem, 1953, 204, 403)과 그 시판 사이에는 많은 해가 걸렸다. 안정성 문제는 염 화(salification)에 의해, 특히 설페이트 형태로 최초로 해결되었다. 그러나, SAMe의 설페이트 염은 그의 고유한 산성으로 인하여 특히 위 점막에서 부작용을 때때로 유발한다.
(R,S) SAMe는 모든 살아있는 생물에 존재하고 만성 간 질환, 비만증, 지질혈증 및 죽상동맥경화증에 치료 효과를 갖는, 트랜스메틸화(transmethylation)의 효소 반응에 관여되는 메틸 기의 생리학적 공여체로 공지되어 있다.
또한 (J.W. Cornforth, J.A.C.S., 1977, 99, 7292-7300; Stolowitz et al., J.A.C.S., 1981, 103, 6015-6019)에는 (R,S) SAMe를 함유하는 제품이 다음 분자 구조를 갖는 2개의 부분입체이성질체인 (R)-(+)-SAMe 및 (S)-(+)-SAMe로 구성되어 있음도 공지되어 있다:
Figure 112007088189218-pct00001
(De La Haba et al., J.A.C.S., 1959, 81, 3975-3980)에는 2개 부분입체 이성질체 중의 오직 하나, 즉 (S)-(+)-SAMe는 자발적인 트랜스메틸화 및 라세미화에 의해 효소적으로 활성화되어 불활성 부분입체이성질체인 (R)-(+)-SAMe를 약 20% 정도까지 생성하는 것도 공지되어 있다.
SAMe를 함유하는 시판중인 모든 제품에서, 불활성 부분입체이성질체 (R)- (+)-SAMe는 적어도 20%의 양으로 존재하는 것이 밝혀졌고; 상기 %는 시간 경과에 따라 자발적 라세미화로 인하여 40% 이상으로 증가할 수 있음도 관측되어 있다.
상기 세포는 약 100%에 가까운 (S)-(+)-SAMe의 천연 함량을 갖지만, 공업적 추출 및 정제 방법은 부분적으로 분해된 생성물, 즉 ≥ 20% (R)-(+)-SAMe 및 ≤ 80% (R)-(+)-SAMe의 혼합물을 생성한다.
상기 3개 인자는 부분입체이성질체의 혼합물이 시간 경과에 따라 불안정하고 이것은 용액 중의 생성물과 관련하여 이미 알려져 있다
Figure 112007088189218-pct00002
Figure 112007088189218-pct00003
.
(R,S) SAMe 및 그의 염화 형태는 약학적 용도로 승인되었고, 제조 및 정제 공정상 복잡성 이외에 불안정성 문제를 제공한다.
공지된 정제 공정은 강산 수지(JP 13680/1971)의 사용, 킬레이트 수지(JP 20998/1978)의 사용 또는 값비싼 특수한 시약, 예컨대 피크르산 또는 피콜린산의 사용(미국특허 3707536호 및 미국특허 3954726호)을 포함한다; 그러나, 이들은 SAMe 황의 부분적 라세미화를 초래하므로 불활성 부분입체이성질체를 20% 초과하는 양으로 함유하는 최종 생성물의 생성을 초래한다.
그러나, 약산 수지의 사용(JP 14299/1981, FR0-A-2531714, EP-A-0141914)을 포함하는 정제 공정은 얻어지는 활성 부분입체이성질체의 부분적 분리만을 허용하므로 순도 정도가 약학적 목적에 불충분하다.
상기 공정의 일부의 성능은 더 높은 순도를 얻을 수 있지만, 부분적 라세미화는 어떠한 경우에서 20% 이상의 불활성 부분입체이성질체가 존재한다; 더구나, 일부 경우(FR 2531714) 중탄산칼륨을 사용하여 세포로부터 상기 생성물을 추출하면, 나트륨 퍼클로레이트의 석출이 생겨서 상기 생성물의 분리 및 제거가 어렵게 된다. EP-A0-014194에서, SAMe를 함유하는 효모 세포의 용균은 유기 용매(에틸 아세테이트, 아세톤 등과 같은) 존재하에서 실시하며, 또 입자 크기 100-200 메쉬의 수지의 사용을 필요로 하는 크로마토그래피 칼럼을 사용하므로 설비 비용 및 재생 및 세척에 필요한 유지 비용을 필요로 한다.
SAMe 을 추출하기 위한 용매의 사용은 방염성 공장, 용매 회수 및 증류 계의 사용을 포함할 뿐만 아니라 잔류 용매와 함께 제거되는 것을 방지하기 위하여 사용된 바이오매스의 분리 및 건조를 필요로 한다. 이들 요소는 분명히 소모비용 증가 및 작업 비용 증가를 초래한다.
Morana et al., Biochemica Biohpysica Acta, 1573 (2002), 105-108은 SAMe는 동결건조된 효모 세포에서와 조금 못한 정도로 동결건조된 효모 추출물에서 트레할로오스에 의해 안정화될 수 있음을 개시한다. 그러나 동결건조는 세포가 스트레스를 경험하는 조건(-20℃에서 냉동한 다음 37℃에서 해동)을 거치기 때문에 불리하고 또 트레할로오스는 세포내 SAMe를 안정화하는데 필수적인 것으로 간주된다. 트레할로오스의 부가는 경제적 문제와 제어 문제를 내포한다.
따라서 활성 (S)-(+)-SAMe 이성질체의 %가 불활성 (R)-(+)-SAMe 부분입체이성질체보다 분명히 더 높고 또 상기 %는 시간 경과에 따라서 안정한 SAMe의 유도체 또는 투여 형태가 필요하다. 또한 중요한 목적은 효모 세포를 스트레스 조건에 거치지 않고도 염의 형성을 반복하지 않고 및/또는 물질을 안정화하는 유리 염기인 (S)-(+)-SAMe 의 안정한 투여 형태일 수 있다.
발명의 상세한 설명
SAMe 유리 염기는 안정화제의 부가 없이도 그 생성 세포 내부에서 안정하다는 것이 밝혀졌다. 효모의 완전한 세포벽에 의해 제공되는 보호는 주위 온도에서 시간이 경과하여도 더 큰 안정성을 제공한다.
따라서 본 발명은 20 내지 40℃ 범위의 온도, 경우에 따라 감압하에서 단순히 건조된 효모 세포로부터, 특히 고 함량의 (S)-(+)-SAMe를 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 얻을 수 있는 유리 염기 형태의 고 함량의 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는, 건조된 및/또는 미세캡슐화된 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포는 그대로, 적합한 약학적 형태로, 특히 캡슐, 정제, 위내성 정제 등으로 투여될 수 있다.
사카로마이세스 세레비시아애의 적합한 균주는 전-정지(pre-stationary) 단계에서 공업적 발효로부터 취한 배양액 육즙 샘플을 YM 한천 상에 플레이팅함으로써 생긴 콜로니를 스크리닝한 다음 (S)-(+)-SAMe를 생성하는 능력을 확인함으로써 선택할 수 있다.
선택한 균주, 즉 GNL 24/497의 SAMe 생산성은 발효 말기에 2.0 % 내지 6.0% w/건조 중량, 보다 특히 3%-4% w/건조 중량이고 또 농축 단계(enrichment stage)의 말기에 7%-20% w/건조 중량, 더욱 특히 10%-16% w/건조 중량이다.
효모 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) GNL24/497은 페루기아 대학 "Industrial Yeast Collection DBVPG" 에 의해 그의 형태학적 특징을 기준으로 또 DNA-DNA 재결합 수법에 의해 분류되었다. 이 사카로마이세스 세레비시아애 GNL 24/497은 2005년 4월 27일 부다페스트 조약에 따른 특허절차에 따라 DBVPG 콜렉션에 기탁번호 DBVPG 8P로 기탁되었고, 이는 본 발명의 주제를 구성한다.
이 효모는 공지 수법 및 조건에 따라 공업적 수준으로 성장시키고 제빵 바이오매스를 제조하기 위해 사용하며, 이때 0.5% 내지 4.0% w/v, 보다 특히 1.0%-3.0% w/v 양의 DL 메티오닌을 몰라세를 기본으로 한 보통의 배양 배지에 부가한다
Figure 112007088189218-pct00004
.
이 바이오매스를 원심분리하고, 세척하며, 재현탁하고 또 인산 칼륨; 암모늄 설페이트; 나트륨 시트레이트; 마그네슘, 망간, 아연 및 칼슘 염; 글루코오스 및 L-메티오닌 또는 DL-메티오닌을 함유하는 배지에서 활성화 방법에 처리함으로써 수집한다
Figure 112007088189218-pct00005
Figure 112007088189218-pct00006
활성화 과정은 멸균하 또는 비멸균하, 대기압 또는 약간의 압력하; 제어되는 pH 또는 자유 pH에서 0.1 내지 1.5 v/v/m, 보다 특히 0.2-1.0 v/v/m으로 통기되면서; 25℃ 내지 35℃, 보다 특히 28℃ 내지 32℃에서; 6-24시간 동안, 더욱 특히 8 내지 8시간 동안 2-5회, 더욱 특히 2-3회 반복할 수 있다.
활성화 매질 중의 바이오매스 농도는 2.5% 내지 18% 건조중량/부피, 보다 특히 5% 내지 15% 건조 중량/부피일 수 있다. 농축 후, 바이오매스는 원심분리 또는 마이크로여과에 의해 수집되여, 멸균 수 또는 인산염 완충액, pH 5.2 (± 0.2)으로 수회 세척한 다음 통상의 수법으로 건조 또는 미세과립화한다.
바람직한 요지에 따르면, 미세고라비화는 다음을 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다:
a) 배양육즙으로부터 효모 세포를 원심분리 또는 마이크로여과(mirofiltration)하고;
b) 효모 세포의 물로 세척하고 멸균수에 현탁하며;
c) 가능하게는, b)에서 얻은 현탁액에 벤토나이트, 카올린, 실리카, 미세셀룰로오스, 레시틴화 나트륨 및/또는 천연 또는 수소화된 식물유 또는 동물유를 부가하고;
d) c)에서 얻은 혼합물을 저압 및 20℃ 내지 40℃의 온도에서 H2O 함량이 0.5 내지 5% 함량으로 되도록 건조시키고;
e) 건조된 물질에 부형제를 부가하고 그 혼합물을 직접 압축하며; '
f) e) 단계에서 얻은 정제를 과립화하고;
g) f) 단계에서 얻은 과립을 용융 왁스로 코팅한다.
이 공정은 본 출원인에 의해 2005년 2월 18일 출원된 유럽 특허 출원 05425084.0호에 기재되어 있다.
건조된, 미세과립화된 효모의 바이오매스를 사용하여 1.0 내지 2.0 g 중량, 보다 특히 1.3-1.8 g이고, 활성성분 (S)-(+)-SAMe 의 함량이 100 내지 400 mg, 보다 특히 150 내지 300 mg인 정제를 제조한다. 이 정제는 고 함량의 (S)-(+)-SAMe 를 갖는 건조된 효모를 사용하여 또는 미세결정성 셀룰로오스, 실리카, 글리세롤 베헤네이트, 스테아르산 마그네슘(등)과 같은 부형제를 부가함으로써 공지 수법에 따라 제조한다. 이렇게 하여 얻은 정제에는 BIOGAPRESS®VEGETAL, Labrafac® CC, EUDRAGIT L30D-55, 이산화티탄, 활석, 콜로이드성 이산화 실리콘, 트리에틸 시트레이트, FD&C 옐로우 5 등과 같은 부형제로 코팅하여 위 내성으로 될 수 있다.
본 발명을 이하의 실시예를 들어 더욱 자세하게 설명한다.
효모 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) GNL-24/497 (DBVPG 8P)를 30 g/l의 DL-메티오닌이 부가된 제빵용 효모에 사용된 몰라세를 기본으로 하는 공업적 배지중, 28℃에서 24시간 동안 생장시켰다. 이 바이오매스는 원심분리에 의해 수집하고 수돗물로 2회 세척하였다: 20% ±2 g/건조 중량/v이고 또 총 SAMe 함량이 3% (±0.5) w/건조 중량인 크림을 얻었다. 10 리터의 발효기에서 다음을 함유하는 배지를 제조하였다:
글루코오스 82 g/l, DL-메티오닌 12 g/l, Na2NO3 10 g/l, KH2PO4 3.5 g/l, KOH 0.385 g/l, (NH4)SO4 7.0 g/l, MgSO4 0.5 g/l, 소포제 0.03 g/l. 이 배지를 28℃로 가열하고, 상기 크림을 100 g/l 건조 중량의 농도가 얻어질 때까지 부가하였다. 활성화 조건: 200 rpm에서 교반, 공기 0.25 v/v/분. 글루코오스 소비 말기에, 약 12시간 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하여, 11.5 %의 총 SAMe를 함유하는 바이오매스 100-102 g/l 건조 중량을 회수하며, 그의 4,5%는 (R)-(+)-SAMe 이성질체이고 95.5%는 (S)-(+)-SAMe 이다.
상기 바이오매스를 28℃에서 건조시켜 H2O 함량을 ≤ 0.5% w/w로 하였다.
분석결과 (R)-(+)-SAMe 이성질체 함량은 5% 미만이었고 또 (S)-(+)-SAMe 함량은 95%를 초과하였다.
실시예 2
바이오매스를 2회 활성화한 이외는 실시예 1과 동일하게 하였다. 14.2% w/건조 중량의 총 SAMe를 얻었고, 그 중 4.3% w/w는 (R)-(+)-SAMe 이성질체이고 또 95.7%는 (S)-(+)-SAMe 이었다.
실시예 3
바이오매스를 제3 농축 과정을 거치는 것을 제외하고는 실시예 1과 2에 따라 실시하여 15.1% w/건조 중량의 총 SAMe를 얻고, 그 중 4.4% w/w는 (R)-(+)-SAMe 이성질체이고 또 95.6%는 (S)-(+)-SAMe 이었다.
실시예 4
건조된 바이오매스는 벤토나이트를 부가함으로써 미세캡슐화하고 32℃(±2℃)에서 진공하 5 밀리바로 건조시키고 미분말로 분쇄하며 하기에 나타낸 바와 같이 과립에 부가하여 미세캡슐화하였다:
g%
● 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 분말 10
● 만니톨 50
● 미세결정성 셀룰로오스 10
● 콜로이드성 이산화 실리콘 2
● Mg 스테아레이트 3
● 글리세롤 베헤네이트 888 5
● 수소화된 식물 지방 (Biogapress Vegetal 8M 297, GATTEFOSSE) 20
수소화된 식물 지방을 제외하고는 모든 성분을 상기 분말과 함께 혼합하였다. 이 혼합물을 사용하여 20-25 mm 직경의 정제를 제조한 다음 진동 과립기에서 과립화하여 300-1500 마이크론 과립을 생산하였다. 이 과립은 재순환 스크류 혼합기기를 이용하여 용융 식물 지방을 코팅하고 주위 온도에서 냉각시켜 3.0 (±5%) x 109 CFU/g을 함유하는 500-1600 마이크론 미세캡슐을 생성하였다.
실시예 5
실시예 1에 기재된 바와 같이 효모 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) GNL-24/497 (DBVPG 8P)를 제조하고 건조하였다.
건조된 바이오매스를 주위 온도(T = 25±2℃ 및 RH = 60±5%)에서 안정성 프로그램에 처리하였다.
분석 목적을 위해, 세포를 +4℃에서 기계적으로 용균시켰다.
이하의 정제는 얻어진 결과를 나타낸다:
Figure 112007088189218-pct00007
실시예 6
하기 조성을 갖는 정제를 공지된 수법에 따라서 실시예 1,2,3,4에 지시된 바와 같이 건조 바이오매스로부터 제조하였다:
Figure 112007088189218-pct00008
실시예 7
하기 조성을 갖는 정제를 공지된 수법에 따라서 실시예 1,2,3,4에 지시된 바와 같이 건조 바이오매스로부터 제조하였다:
정제당 조성
Figure 112007088189218-pct00009
● * LABRAFAC (사슬 트리글리세리드)
● ** EUDRAGIT (메타크릴산의 공중합체)
● *** FD (타르트라진)
실시예 8
실시예 7에서 얻은 정제는 유럽 약전에 따라 PHARMATEST PTL-5 붕해 장치를 이용하여 위 내성 시험에 처리하였다. 1시간 후 상기 정제는 완전한 그대로였다.

Claims (11)

  1. a) 7%-20% w/건조 중량의 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는 DBVPG 콜렉션에 기탁번호 DBVPG 8P로 기탁된 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 건조된 및/또는 미세캡슐화된 세포와,
    b) 건조된 형태 또는 미세캡슐화된 형태로 있는 부형제를 포함하며,
    (R)-(+)-(S)-아데노실-Ｌ-메티오닌이 상기 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌의 10%이하 량이며, 상기 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌이 유리 염기 형태이며, 만성 간 질환, 비만증, 지질혈증 및 죽상동맥경화증에 치료 효과를 가지는, 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 정제, 위내성 정제 및 캡슐 형태중 어느 하나인 약학적 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 활성성분 (S)-(+)-아데노실-Ｌ-메티오닌의 함량이 100 내지 400 mg인 약학적 조성물.
  4. 7%-20% w/건조 중량의 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌을 갖는 DBVPG 콜렉션에 기탁번호 DBVPG 8P로 기탁된 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 건조된 및/또는 미세캡슐화된 세포로서,
    (R)-(+)-(S)-아데노실-Ｌ-메티오닌이 상기 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌의 10%이하 량이며, 상기 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌이 (Ｓ)-(+)-Ｓ-아데노실-Ｌ-메티오닌의 경구투여용 제형으로서 유리 염기 형태인 건조된 및/또는 미세캡슐화된 세포.
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