KR101406829B1

KR101406829B1 - 형질전환 된 ｌ-아르기닌 생산균주

Info

Publication number: KR101406829B1
Application number: KR1020120070935A
Authority: KR
Inventors: 김해선; 김석수; 이영주; 윤선준; 박세조
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-06-20
Also published as: KR20140004285A

Abstract

본 발명은 L-아르기닌의 생산성 향상을 도모한 기술로서, 구체적으로는 cgR_2827 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 cgR_2827의 발현을 유도한 L-아르기닌 생산균주 및 이러한 균주를 이용한 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 발명이다.
본 발명을 통해, L-아르기닌 발효 수율이 향상되는 효과를 얻을 수 있으며, 최근 전 세계적으로 L-아르기닌 공급부족 현상을 겪고 있는 상황에서 실질적인 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대되며, 또한 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등 제품으로의 적용 확대로 수요 증대를 도모할 수 있으므로, 산업적으로 긍정적인 효과를 얻을 수 있을 것이다.

Description

형질전환 된 Ｌ-아르기닌 생산균주{Transformed L-arginine producing strains}

본 발명은 L-아르기닌(L-arginine)의 생산성 향상을 도모한 기술로서, 구체적으로는 CgR_2827 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 CgR_2827의 발현을 유도한 L-아르기닌 생산균주 및 이러한 균주를 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 기술이다. 본 발명에 따르면, L-아르기닌 발효 수율이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.

L-아르기닌은 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등에 널리 이용되는 천연 아미노산의 일종으로 의약용으로는 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품 용도로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가용, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광을 받고 있는 물질이다.

L-아르기닌은 C₆H₁₄N₄O₂의 화학식을 가지며, 흰색 결정 또는 결정성 가루로 약간 특이한 냄새와 쓴맛이 있다. 물에 잘 녹으며 에탄올에는 잘 녹지 않는다. 강 알칼리성이며 공기 중에 탄산가스를 흡수한다. 한편, 자연계에 널리 존재하며, 어류 등의 정자 단백질 내에 비교적 많이 함유되어 있으며, 또한 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있는 천연형 L-아미노산이다.

L-아르기닌은 동물 생체 내에서 합성되는 점에서 비필수 아미노산이지만 요소합성반응에서 중요한 역할을 하며 오르니틴 회로에 관여하고 있다. 또한 어린 동물의 성장에 필요한 충분량이 생합성 되지 않기 때문에 성장기 동물은 외부에서 섭취할 필요가 있다. 이로 인해 준필수 아미노산으로 되어 있다. 랫트의 경구투여 LD50(엘디50)은 약 16g/㎏이다.

종래에 알려져 있는 미생물 발효에 의한 L-아르기닌의 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로서 글루탐산 생산균주인 브레비박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본 공개 소화57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본 공개 소화59-158185), 재조합 유전자가 형질전환 된 균주를 이용하는 방법(일본 공개 소화63-79597, 미국특허 4,775,623) 등이 알려져 있으나, L-아르기닌에 대한 피드백 저해가 있어 L-아르기닌을 공업적으로 대량생산하는 데에는 한계가 있다.

최근에는 L-아르기닌 생합성 오페론에 관련된 유전자 조절과 관련한 기술이 있다.

이하 본 발명과 관련된 배경기술에 대해서 기재한다.

첫째, 특허문헌으로서 KR 10-2003-0009170이 존재한다. 이 발명은 본 발명의 출원인이 출원하여 특허등록 받은 발명으로 Ｌ-아르기닌을 대량으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 동 균주를 이용한 Ｌ-아르기닌의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 L-아르기닌 생산능이 있으며, 최종 산물인 L-아르기닌에 내성을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰으로서, 특히 생육에 특정 아미노산을 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이를 이용한 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것으로 본 발명과 차이가 있다.

둘째, 특허문헌으로서 US 2003-0153058 에 관한 것이다. 이 발명은 간장 기능 활성 작용제, 아미노산 수혈 등에 이용되는 L-아르기닌 생산균주에 관한 것으로, 세포 내 glutamate dehydrogenase 활성을 개선하는 것을 기술적 특징으로 하는 것으로, CgR_2827을 이용한 본 발명과는 기술적으로 상이하다.

셋째, 비특허 문헌으로서, Reengineering of a Corynebacterium glutamicum L-Arginine and L-Citrulline Producer(Appl Environ Microbiol. 2009 March; 75(6): 1635??1641)가 있다. 이 논문은 생합성 경로에 관련된 유전자 변이를 통해 L-아르기닌 생합성능을 향상시키고자 한 것으로서 특히, arg 오페론 생합성 유전자의 repressor로 작용하는 argR과 feedback inhibition에 관여하는 argB의 유전적 변이에 의해 L-아르기닌 생산을 증가시킨 것으로 외래 유전자인 cgR_2827 유전자를 도입한 것과는 차이가 존재한다.

최근까지도 L-아르기닌의 생산성을 향상시키기 위해 다양한 방법의 균주 개량이 이루어지고 있다. 돌연변이 유도법을 이용한 중간대사산물 및 최종산물의 내성주 선별, 염색체 변이를 통한 목적 산물 생산 관련 유전자의 활성 강화 및 감소 등이 있다. 하지만 이러한 경우 원치 않는 돌연변이가 생겨 생육 저하 및 feedback inhibition으로 목적 산물 생산이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에서는 이러한 문제점을 극복하는 방안의 일환으로 CgR_2827 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생산균주로 도입하여 CgR_2827의 발현을 유도한 L-아르기닌 생산균주 및 이러한 균주를 이용한 L-아르기닌 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 CgR_2827 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 CgR_2827의 발현을 유도한 L-아르기닌 생산균주를 제공한다.

바람직하게는 상기 cgR_2827은 코리네박테리움 글루타미쿰 R 균주(Corynebacterium glutamicum R, 이하 C. glutamicum R으로 약칭함)에서 유래한 것임을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1과 같은 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 상기 균주는 코리네박테리움 속인 것을 특징으로 하는 L-아르기닌 생산균주인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 균주 중 선택된 어느 하나의 균주를 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공한다.

상세하게는 상기 방법은 (1) C. glutamicum R 유래의 cgR_2827을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 cgR_2827을 포함하는 발현벡터 및 삽입벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 제작된 cgR_2827 발현벡터 및 삽입벡터를 L-아르기닌 생산균주에 형질전환 하는 단계; 및 (4) 상기 cgR_2827 로 형질전환된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

요컨대, 본 발명은 박테리아 변이 균주를 이용한 L-아르기닌 생산에 관한 것으로, 특히 본 특허에 사용된 L-아르기닌 생산균주인 ARG-1에는 존재하지 않으며 glutamate dehydrogenase의 기능을 가진다고 추정되는 C. glutamicum R 유래의 cgR_2827 유전자를 도입하여 과 발현함으로써 L-아르기닌의 생산성을 향상시키는 것을 주요 특징으로 하는 기술이다.

본 발명을 통해, L-아르기닌 발효 수율이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.(5L J/F 결과에서 Arg(％) 20％, Yp/s 11％ 증가, 구체적인 사항은 표 3 참조). 본 발명에서 제시하는 Arg(％)는 생산된 L-아르기닌의 농도를 나타내며, 발효수율(Yp/s)이란 소모한 당 대비 L-아르기닌의 생산량을 나타낸다. 본 발명을 통해 최근 전 세계적으로 L-아르기닌 공급부족 현상을 겪고 있는 상황에서 실질적인 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

나아가 본 발명을 통해 L-아르기닌의 용도 다양화가 가능하고, 또한 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등 제품으로서의 적용 확대로 수요 증대를 도모할 수 있을 것이므로, 산업적으로 긍정적인 효과를 얻을 수 있을 것이다.

도 1은 L-아르기닌이 생합성 되는 간략한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 Trc 프로모터를 이용한 Ptrc-cgR_2827-rrnB 발현벡터를 구축하는 과정에 관한 것이다.
도 3은 자체(native) 프로모터를 이용한 Pnat-cgR_2827-rrnB 발현벡터를 구축하는 과정에 관한 것이다.
도4는 cgR_2827의 삽입벡터를 구축하고, chromosome 상에서 재조합 하는 과정에 관한 것이다.
도 5는 cgR_2827이 chromosome 내에 삽입된 상태를 나타낸 것이다.

본 발명은 CgR_2827 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 CgR_2827의 발현을 유도한 L-아르기닌 생산균주에 관한 것이다.

CgR_2827의 발현을 유도하는 방법으로는 강력한 프로모터를 가진 재조합 벡터를 이용하는 것, C. glutamicum R의 자체(native) 프로모터를 가진 재조합 벡터를 이용하는 것, cgR_2827 유전자를 chromosome 상으로 삽입(insertion)하는 것 등이 포함되며 본 발명에서 이러한 발현벡터 및 삽입벡터를 제작하여 L-아르기닌 생산균주인 ARG-1에 도입하였다.

CgR_2827로 명명한 것은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 등의 명명에 따른 것이다.

cgR_2827은 통상의 코리네형 type strain인 C. glutamicum ATCC 13032에는 존재하지 않으며, C. glutamicum ATCC 21831을 모주로 한 L-아르기닌 생산균주인 ARG-1에도 존재하지 않는 외래의 유전자이다.

한편, 아르기닌이 생합성되는 경로는 TCA cycle의 α-ketoglutarate에서 glutamate dehydrogenase(gdhA)에 의해 glutamate를 거친 후, 아르기닌 생합성 오페론인 argCJBDFRGH에 의한 8단계의 효소반응에 의해 합성된다(도1).

CgR_2827은 GdhA와 26％의 아미노산 상동성을 가지는 별개의 단백질이지만, GdhA와 동일한 도메인 구조인 Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenase, dimerisation domain과 NAD(P) binding domain을 가지고 있어, glutamate dehydrogenase와 유사한 기능을 할 것이라고 추정하며, cgR_2827을 과 발현 하였을 때, α-ketoglutarate에서 glutamate로 flux를 증가시킬 것이라고 예상하였다.

바람직하게는 상기 cgR_2827은 C. glutamicum R에서 유래한 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1과 같은 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 균주는 코리네박테리움 속인 것을 특징으로 하는 L-아르기닌 생산균주인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 균주 중 선택된 어느 하나의 균주를 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 상기 방법은 (1) C. glutamicum R 유래의 cgR_2827을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 cgR_2827을 포함하는 발현벡터 및 삽입벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 제작된 cgR_2827 발현벡터 및 삽입벡터를 L-아르기닌 생산균주에 형질전환하는 단계; 및 (4) 상기 cgR_2827 로 형질 전환된 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하에서 L-아르기닌을 생산하는 방법에 대해 단계별로 보다 상세하게 개시한다.

(1) C. glutamicum R 유래의 cgR_2827을 분리하는 단계

(1)-1 Trc 프로모터를 이용하여 발현을 유도하는 경우

Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, USA)를 이용하여 C. glutamicum R 균주의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 이 게놈 DNA를 주형(template)으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 cgR_2827 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 DNA 절편 1125bp를 증폭하였다. cgR_2827 ORF 증폭에 사용된 프라이머는 5'-GAATTCatgttcgagctaatcgacg-3'과 5'- GGATCCttatcggcgaaccatacct-3'이며 사전 변성(denaturation) 단계 94℃에서 5분, 변성 단계 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계 72℃에서 1분간 실시하였고, 30주기를 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8％ 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후 약 1.1kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다. 이 PCR 결과물을 우선적으로 pGEMT-easy vector(T-vector, Promega, USA)에 cloning 하였다(도 2).

(1)-2 native 프로모터를 이용하여 발현을 유도한 경우

(1)-1과 같이 C. glutamicum R 균주의 genomic DNA를 주형으로 위와 같은 조건으로 PCR 하여 cgR_2827 1266 bp를 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 5'-gcaaGAATTCAGATCTgctccgactcctggaagtcc-3'과 5'- atgcCTGCAGttatcggcgaaccatacctc-3'이다. 이 PCR 결과물을 0.8％ 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후 약 1.3kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다(도 3).

(1)-3 chromosome 내 도입으로 발현을 유도한 경우

ARG-1 생산균주의 chromosome내 cgR_2827을 도입하고자 하는 부분을 설정하고 ARG-1 생산균주의 chromosome을 주형으로 5'-atgcGAATTCccaacaggcagaaataagc-3'과 5'-atgcGAATTCgacaaggacggagacaac-3'을 이용하여 915bp를 증폭하였다.

한편, (1)-1과 같이 C. glutamicum R 균주의 genomic DNA를 주형으로 cgR_2827의 프로모터와 터미네이터를 포함하는 부분을 위와 같은 조건으로 PCR 하여 1563bp를 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 5'-atgcCATATGgctccgactcctggaagtcc-3'과 5'-atgcCATATGccgcttggtgagtaatga-3'이다. 이 PCR 결과물을 0.8％ 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후 약 1.6kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다(도 4).

(2) 상기 분리된 cgR_2827을 포함하는 발현벡터 및 삽입벡터를 제작하는 단계

(2)-1 Trc 프로모터를 이용하여 발현을 유도하는 경우

T-vector에 포함된 cgR_2827을 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 처리하였으며, 강력한 발현을 유도하는 Trc 프로모터 및 rrnB 터미네이터를 포함하는 재조합 벡터인 pTrc99a 역시 같은 제한효소를 처리하고 난 후 이를 연결(ligation)하였다. Ligation 반응은 Ligation kit Ver 2.1(Takara, 일본)을 사용하였다. pTrc99a에 포함된 cgR_2827을 주형으로 중합효소 연쇄반응을 이용하여 Trc-cgR_2827-rrnB를 포함하는 DNA 절편 1987bp를 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 5'-gaAGATCTggcacgacaggtttcccgac-3'과 5'- gtAGATCTcagcgtttctgggtgagc-3'이며 사전 변성 단계 94℃에서 5분, 변성 단계 94℃에서 30초, 어닐링 단계 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 4분간 실시하였고, 30주기를 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8％ 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후 약 2.0kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다. 이 PCR 결과물과 코리네형(Coryneform) 세균의 발현벡터인 pα를 제한효소 BglII로 처리하고 연결하여 최종 재조합 벡터인 pα-trc-cgR_2827-rrnB를 제작하였다(도 2).

(2)-2 native 프로모터를 이용하여 발현을 유도하는 경우

용출한cgR_2827 절편을 제한효소 EcoRI과 PstI으로 처리하였으며, rrnB 터미네이터를 포함하는 재조합 벡터인 pTrc99a 역시 같은 제한효소를 처리하고 난 후 이를 연결(ligation)하였다. Ligation 반응은 (2)-1과 동일하다. pTrc99a에 포함된 cgR_2827을 주형으로 중합효소 연쇄반응을 이용하여 cgR_2827-rrnB를 포함하는 DNA 절편 1688bp를 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 5'-gcaaGAATTCAGATCTgctccgactcctggaagtcc-3'과5'-ccttGGATCCaaaaggccatccgtcaggat-3' 이며 PCR 결과물을 0.8％ 아가로즈 겔에서 전기영동 한 후 약 1.7kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다. 이 PCR 결과물과 코리네형(Coryneform) 세균의 발현벡터인 pα를 제한효소 BglII와 BamHI으로 처리하여 연결하여 최종 재조합 벡터 인 pα-Pnat-cgR_2827-rrnB를 제작하였다(도 3).

(2)-3 chromosome 내 도입으로 발현을 유도한 경우

도입부분인 915bp를 제한효소 EcoRI으로 처리하고, 삽입벡터인 pK19mobsacB 역시 같은 효소로 처리한 후, 이를 연결하였다. 이후 제한효소 NdeI으로 처리하였고, 자체 프로모터와 터미네이터를 포함하는 cgR_2827 절편 역시 NdeI으로 절단하여 pK19mobsacB에 연결하였다(도 4).

(3) 상기 제작된 CgR_2827 발현벡터 및 삽입벡터를 L-아르기닌 생산균주에 형질전환하는 단계

재조합 벡터인 pα-trc-cgR_2827-rrnB와 pα-Pnat-cgR_2827-rrnB, pK19mobsacB::cgR_2827을 L-아르기닌 생산균주에 전기충격요법 (electroporation)으로 도입하여 카나마이신(Kanamycin) 30ug/ml이 포함된 고체배지(Brain heart infusion 40g/L, D-Sorbitol 30g/L, Beef extract 10g/L, Agar 20g/L)에 도말 한 후 3∼4일 배양하였다.

발현벡터를 도입하여 선별된 콜로니에 대하여 플라스크 및 5L 발효조(J/F)에서 역가 확인 실험을 수행하였다.

삽입벡터를 도입한 경우 카나마이신이 포함된 고체배지에서 성장한 1차 재조합주 콜로니를 대상으로 2차 재조합을 유도하고, 카나마이신에 저항성을 가지며 10％ sucrose 배지에서 생육이 가능한 콜로니를 후보군으로 PCR 하여 cgR_2827이 chromosome 내에 삽입되었는지 최종 확인하였다(도 5). cgR_2827이 chromosome 내에 삽입된 콜로니에 대하여 플라스크 및 5L 발효조에서 역가 확인 실험을 수행하였다.

(4) 상기 cgR_2827 발현벡터로 형질 전환된 균주를 배양하는 단계

1) 플라스크 실험

플라스크 종배지(/L) : Glucose 30g, MgSO₄ 1g, FeSO₄ 10mg, MnSO₄ 10mg, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 1g, Yeast peptone 20g, Urea 1.5g, Biotin 100㎍, Thiamine 100㎍, CPN 100mg, Cystein 50mg

2) 플라스크 역가배지(/L) : Glucose 100g, MgSO₄ 1g, FeSO₄ 20mg, MnSO₄ 20mg, KH₂PO₄ 2g, Yeast peptone 10g, Urea 2g, (NH₄)₂SO₄ 45g, Biotin 100㎍, Thiamine 100㎍, Arginine 20g

3) cgR_2827 발현벡터를 도입한 경우 카나마이신이 30ug/ml이 함유된 10ml의 종배지에서, cgR_2827이 chromosome 내에 삽입한 경우는 카나마이신이 함유되지 않은 종배지에서 30℃, 160rpm으로 17시간 배양한 배양액 1ml을 10ml의 역가배지에 접종하여 30℃, 160rpm으로 43시간 동안 배양하였다. 배양종료 후 배양액에 있는 L-아르기닌을 분석하기 위하여 배양액을 증류수로 100배 희석하고 0.45um 여과막으로 여과한 다음 컬럼(Universal Cation HR 3u, 100mm, Part No. 23100)과 자외선 검출기(195nm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하였다.

4) 플라스크 역가 실험 결과(％)는 하기 표 1과 같다.

Flask	Arg(％)	Yp/s
ARG-1	1.45	18.2
ARG-1/Ptrc cgR_2827	1.49	19.6
ARG-1/Pnat cgR_2827	1.52	19.5
ARG-1::cgR_2827	1.46	19.0

ARG-1: 모주

ARG-1/Ptrc cgR_2827: Trc 프로모터로 발현을 유도한 균주

ARG-1/Pnat cgR_2827: 자체 프로모터로 발현을 유도한 균주

ARG-1::cgR_2827:chromosome 내에 cgR_2827을 삽입하여 발현을 유도한 균주

5) 5L 발효조 실험

5L 발효조 1차 종배지(/L) : 포도당 20g, Urea 2g, Yeast peptone 10g, Peptone 10g, CSL 5ml, Biotin 100㎍, NaCl 2.5g

6) 5L 발효조 2차 종배지(/L) : 포도당 26.7g, KH₂PO₄ 1g, K₂HPO₄ 1g, Urea 2g, Yeastpeptone 20g, CSL 16.7g, Biotin 100㎍, Thiamine 200ug, MgSO₄ 1g, MnSO₄ 10mg, FeSO₄ 10mg

7) 5L 발효조 역가배지(/L) 조성은 하기 표 2와 같다.

성분	최초 배지 농도	추가 배지 농도
포도당	8％	45％
MgSO₄	0.34％	-
FeSO₄	10mg	-
MnSO₄	10mg	-
CuSO₄	0.4mg	-
ZnSO₄	20mg	-
Biotin	100㎍	-
Thiamine	200㎍	-
MSG	0.2％	-
HVP (Acid hydrolyzed vegetable protein)	0.3％	-
KH₂PO₄	0.1％	0.3％
K₂HPO₄	0.1％	0.3％
CSL (Corn steep liquid)	2.11％	1.1％
(NH₄)₂SO₄	-	3.78％
NH₄Cl	0.02％	1.155％
소포제	0.02％	-

8) 1차 종배지 300mL를 2L 진탕 플라스크에 분주하여 121.5℃에서 20분간 가압 멸균한 후 코리네형(Coryneform) 세균을 접종하고 30℃에서 진탕 배양하여 1차 종균 배양액으로 하였다. 2차 종배지 250mL를 2L 진탕 플라스크에 분주하여 121.5℃에서 20분간 가압 멸균한 후 1차 종균 배양액 40mL를 접종하고 30℃에서 진탕 배양하여 2차 종균 배양액으로 하였다. 역가배지 1.6L를 5L 발효조에 넣고, 2차 종균 배양액 275mL를 접종하였다. 배양조건으로는 온도 30℃, 교반속도 500rpm, 통기량 1vvm의 조건으로 배지 중 포도당을 15g/L 농도로 유지하면서 추가배지를 첨가하여 배양하였다. 배양 중 pH는 암모니아수를 사용하여 6.4로 조절하였다. 배양종료 후 배양액에 있는 L-아르기닌을 분석하기 위하여 배양액을 증류수로 400배 희석하고 0.45㎛ 여과막으로 여과한 다음 컬럼(Universal Cation HR 3u, 100mm, Part No 23100)과 자외선 검출기(195nm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 이에 5L 발효조 역가 실험 결과(％)는 하기 표 3과 같다.

5L 발효조	Arg(％)	Yp/s (총 당 18％ 기준)
ARG-1	5.1	30
ARG-1/Ptrc cgR_2827	6.4	34
ARG-1/Pnat cgR_2827	6.3	34
ARG-1::cgR_2827	6.2	33

ARG-1: 모주

ARG-1/Ptrc cgR_2827: Trc 프로모터로 발현을 유도한 균주

ARG-1/Pnat cgR_2827: 자체 프로모터로 발현을 유도한 균주

상기 표 3에서 알 수 있듯이, cgR_2827 과 발현주는 ARG-1 모주 대비 5L J/F 결과에서 Arg(％) 20％[(6.4-5.1)/6.4X100], Yp/s 11％[(34-30)/34X100]가 증가하였음을 실험적으로 확인할 수 있었다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 통상의 지식을 가진 자인 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

본 발명은 L-아르기닌 생산균주 및 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공할 수 있어 L-아르기닌 생산 관련 산업에 이용할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Transformed L-arginine producing strains <130> 8823 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> C. glutamicum R nucleotide <400> 1 atgttcgagc taatcgacga ctggggtccc gaaaagatcg tcatcgtcag cgatcaaaaa 60 accgggatgc gtggcgtact tgtcatcgac aacaccgccc gcggcatggg caagggtggc 120 acgcgcatgc agcccaccgt ttcagtcgca gaaatagcca ggttggctcg cgtcatgacc 180 tggaaatggg ctggtgtaga cctcttttat ggtggtgcaa aagccggaat ccaagcagac 240 cccacctccc cagataaaga agcaatcctt cggtcattcg tcagaaaact ctccaacgaa 300 gtacctaaag aatatgtctt cggcctggac atggggctga ctgaaaatga cgccgccatc 360 atcgtcgacg agctcggctg gggcaccagt atgggaacac cctacgagct cggtggagtg 420 ccctatgaca agcttggtat caccggcttt ggtgttgcag aagtggtgga tcaagtagca 480 caaatgcaaa aactcaaagg tgcatcggta gcagtccaag gcttcggtgc cgttggacat 540 gccacagctt cccgcctggc agaacttggc tatcctgttg tggctatctc cacagcaaag 600 ggagcaatcg cagaccccaa cgggctcaac atccccgagc tcatggaact acgcgatcag 660 gtgggtgact cacttgtgga ccactaccca gcacttcgca tcaacccagg tgacgaactt 720 ttcaccgaag ccgaaatcct cgtaccggca gcgctccagg acgtcatcga tgaagacgca 780 gccaatcgac tacaagcaca actcgtcgtc gaaggagcaa accttcccac taatgaagcc 840 gcacaaaaag tcctaagtaa ccgtggcatc actgtggttc cagactttgt cgccaacgcc 900 ggaggagtag tcgccgcagc attcgccatg gataaccgca tgtctgcatt ccgtgcagag 960 actgccaaca tcttcacgag cgtttccgac aaactccgat ccaatgccga aactgtcctg 1020 aatttcacct ctgaatctga cctgaccagc cacgaagcgg caaggcaact ttcacaggaa 1080 cgagttcttg cagctatgcg cgccagaggt atggttcgcc gataa 1125 <210> 2 <211> 374 <212> PRT <213> C. glutamicum R Amino Acid <400> 2 Met Phe Glu Leu Ile Asp Asp Trp Gly Pro Glu Lys Ile Val Ile Val 1 5 10 15 Ser Asp Gln Lys Thr Gly Met Arg Gly Val Leu Val Ile Asp Asn Thr 20 25 30 Ala Arg Gly Met Gly Lys Gly Gly Thr Arg Met Gln Pro Thr Val Ser 35 40 45 Val Ala Glu Ile Ala Arg Leu Ala Arg Val Met Thr Trp Lys Trp Ala 50 55 60 Gly Val Asp Leu Phe Tyr Gly Gly Ala Lys Ala Gly Ile Gln Ala Asp 65 70 75 80 Pro Thr Ser Pro Asp Lys Glu Ala Ile Leu Arg Ser Phe Val Arg Lys 85 90 95 Leu Ser Asn Glu Val Pro Lys Glu Tyr Val Phe Gly Leu Asp Met Gly 100 105 110 Leu Thr Glu Asn Asp Ala Ala Ile Ile Val Asp Glu Leu Gly Trp Gly 115 120 125 Thr Ser Met Gly Thr Pro Tyr Glu Leu Gly Gly Val Pro Tyr Asp Lys 130 135 140 Leu Gly Ile Thr Gly Phe Gly Val Ala Glu Val Val Asp Gln Val Ala 145 150 155 160 Gln Met Gln Lys Leu Lys Gly Ala Ser Val Ala Val Gln Gly Phe Gly 165 170 175 Ala Val Gly His Ala Thr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Leu Gly Tyr Pro 180 185 190 Val Val Ala Ile Ser Thr Ala Lys Gly Ala Ile Ala Asp Pro Asn Gly 195 200 205 Leu Asn Ile Pro Glu Leu Met Glu Leu Arg Asp Gln Val Gly Asp Ser 210 215 220 Leu Val Asp His Tyr Pro Ala Leu Arg Ile Asn Pro Gly Asp Glu Leu 225 230 235 240 Phe Thr Glu Ala Glu Ile Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asp Val Ile 245 250 255 Asp Glu Asp Ala Ala Asn Arg Leu Gln Ala Gln Leu Val Val Glu Gly 260 265 270 Ala Asn Leu Pro Thr Asn Glu Ala Ala Gln Lys Val Leu Ser Asn Arg 275 280 285 Gly Ile Thr Val Val Pro Asp Phe Val Ala Asn Ala Gly Gly Val Val 290 295 300 Ala Ala Ala Phe Ala Met Asp Asn Arg Met Ser Ala Phe Arg Ala Glu 305 310 315 320 Thr Ala Asn Ile Phe Thr Ser Val Ser Asp Lys Leu Arg Ser Asn Ala 325 330 335 Glu Thr Val Leu Asn Phe Thr Ser Glu Ser Asp Leu Thr Ser His Glu 340 345 350 Ala Ala Arg Gln Leu Ser Gln Glu Arg Val Leu Ala Ala Met Arg Ala 355 360 365 Arg Gly Met Val Arg Arg 370

Claims

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(1) C. glutamicum R 유래의 cgR_2827을 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 cgR_2827을 포함하는 발현벡터 및 삽입벡터를 제작하는 단계;
(3) 상기 제작된 cgR_2827 발현벡터 및 삽입벡터를 Corynebacterium glutamicum ATCC 21831에 형질전환하는 단계; 및
(4) 상기 cgR_2827로 형질전환된 Corynebacterium glutamicum 균주를 배양하는 단계를 포함하는 L-아르기닌을 생산하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 형질전환된 Corynebacterium glutamicum 균주는 상기 모균주에 대하여 L-아르기닌의 생산성이 17~21% 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.