CN113840916A - 用于发酵生产γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸的微生物菌株和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用在发酵培养基中培养的微生物菌株用于发酵生产物质γ‑谷氨酰酪氨酸和γ‑谷氨酰苯丙氨酸的方法，该发酵培养基在发酵后去除微生物，并且从发酵培养基中分离γ‑谷氨酰酪氨酸和γ‑谷氨酰苯丙氨酸。该微生物菌株含有至少一种编码谷氨酸酯‑半胱氨酸连接酶的其他基因并且缺乏谷胱甘肽合成酶。该发酵培养基优选与L‑酪氨酸和L‑苯丙氨酸混合用于培养。

Description

用于发酵生产γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸的微生 物菌株和方法
技术领域
本发明涉及一种用于发酵生产物质γ-谷氨酰酪氨酸(γ-Glu-Tyr)和γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-Glu-Phe)的方法。
背景技术
术语厚味(Kokumi)来自日语，并且不是描述味道本身，如甜、酸、苦、咸或鲜味(umami)(可口(savory)/辛辣味(piquant))，而是具有强烈口感和持久丰富味道的味觉体验。当在各种汤中感官评价大蒜提取物时，厚味效应最初由Ueda et al.在1990年(Agri.Biol.Chem.54,pages 163-169)描述。
在分子方面，献Ohsu et al.(2010,J.Biol.Chem.285,pages 1016-1022)能够证实厚味效应是基于γ-谷氨酰基肽如谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)或γ-Glu-Val-Gly对钙感应受体(CaSR)的调制。
然而，有趣的是，不仅是γ-谷氨酰三肽负责厚味味觉体验，还有相应的二肽。例如，Shibata et al.在2017年(Biosci.Biotechnol.Biochem.81,pages 2168-2177)还揭示了热处理的大豆连同谷氨酸盐、盐和肌苷单磷酸酯会产生特别强烈的厚味味觉体验。有趣的是，二肽γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe负责产生强烈的厚味效应。因此，不出乎意料的是Roudot-Algaron et al.早在1994年(J.Dairy Sci.77,pages 1161-1166)在辛辣考姆特芝士(Comté cheese)中检测到γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生产γ-谷氨酰酪氨酸(γ-Glu-Tyr)和γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-Glu-Phe)的发酵方法。
该目的通过一种用于发酵生产γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸的方法实现，其特征在于，在发酵培养基中培养微生物菌株，所述发酵培养基在发酵后去除细胞，并从发酵培养基中分离且γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸，其中该微生物菌株含有至少一种编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的基因，并且缺乏谷胱甘肽合成酶。
在原理上，合适的起始菌株是所有对重组方法开放且能够通过发酵培养的微生物菌株。这种微生物菌株可以是真菌、酵母或细菌。微生物菌株优选是细菌菌株，特别优选是真细菌类的系统发生群的细菌菌株。肠杆菌科的微生物菌株是特别优选的，并且细菌菌株特别优选是大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)种的菌株。
优选的是适用于生产γ-谷氨酰半胱氨酸的大肠杆菌菌株。此类菌株的构建描述于专利文献US 2014/0342399中。
特别优选的是如US 2014/0342399 A中公开的大肠杆菌菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306。
开放阅读框(ORF)是指从起始密码子开始直到终止密码子并编码蛋白质的氨基酸序列的DNA或RNA区。ORF也同义地称为编码序列。
ORF被非编码区包围。基因是指包含产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA片段。基因包含通过转录产生单链RNA拷贝的DNA片段和参与该复制过程的调节作用的表达信号。表达信号包括例如至少一个启动子、转录起始位点、翻译起始位点和核糖体结合位点。此外，终止子和一个或多个操作子有可能作为表达信号。
在功能性启动子的情况下，在启动子调控下的ORF被转录成RNA。
根据本发明，微生物菌株含有至少一种编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的ORF。术语“另外的ORF”是指编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF已经存在于野生型基因组中，并且其并不是所指的染色体ORF。
在本发明的上下文中，术语“另外的ORF”相反是指：
a)存在关于谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶ORF的野生型微生物菌株，即所述菌株包含编码于编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的野生型基因组中的ORF，和另外至少一个编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的ORF，
b)或者根据本发明的微生物菌株在野生型基因组中没有编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF，但至少有一个编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的ORF，即根据本发明的微生物菌株仅表达另外的ORF的酶。
谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是在消耗一分子ATP的情况下从反应物L-半胱氨酸和L-谷氨酸代谢生成γ-谷氨酰半胱氨酸的酶。酶由例如在大肠杆菌中命名为gshA和在酿酒酵母(S.cerevisiae)中命名为GSH1的基因编码。谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶优选是由gshA基因(gshA ORF)的编码区编码的基因产物GshA或GshA蛋白。编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的ORF优选是SEQ ID NO.1或该序列的同源物，其中起始密码子优选是ATG；特别优选SEQ ID NO.1。
在本发明的上下文中，DNA水平的同源物是相对于特定微生物中以其编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的野生型形式存在的ORF序列，特别优选相对于大肠杆菌中的SEQ IDNO.1，具有大于30％，特别优选大于70％的序列同一性的那些ORF，并且其中由该DNA序列表达的蛋白质具有谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶功能(参见下文关于功能性谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的定义和检测，即具有谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶功能的蛋白质的存在的定义和检测)。
DNA序列的序列同一性通过程序“nucleotide blast”确定，该程序可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/页面上找到，并且基于blastn算法。用于比对两个或更多个核苷酸序列的算法参数是默认参数。默认的通用参数为：
最大靶序列＝100；
短查询＝“自动调整短输入序列的参数”；
期望阈值＝10；
字长＝28；
自动调整短输入序列的参数＝0。
对应的默认评分参数为：
匹配/失配得分＝1,-2；
空位罚分＝线性。
GshA蛋白优选是具有SEQ ID NO.2和该序列的同源物的蛋白，特别优选是具有SEQID NO.2的蛋白质。
蛋白质水平的同源物是相对于以其野生型形式存在于特定微生物中的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的蛋白质序列，特别优选相对于大肠杆菌中的SEQ ID NO.2，具有大于30％，特别优选大于70％的序列同一性的蛋白质，并且其中蛋白质具有谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶功能(参见下文关于功能性谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的定义和检测，即，具有谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶功能的蛋白质的存在的定义和检测)。
为了确定蛋白质序列的序列同一性，使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/页面上的程序“protein blast”。
该程序基于blastp算法。用于两个或更多个蛋白质序列比对的算法参数是默认参数。默认的通用参数为：
最大靶序列＝100；
短查询＝“自动调整短输入序列的参数”；
期望阈值＝10；
字长＝3；
自动调整短输入序列的参数＝0。
默认评分参数为：
矩阵＝BLOSUM62；
空位罚分＝存在：11扩展：1；
组成调整＝条件组成得分矩阵调整。
根据本发明的微生物菌株中谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶蛋白的功能可以如下表征：
a)通过产物γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的存在间接检测微生物菌株中功能性谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的存在。为了检测γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe，可以使用实施例4中描述的HPLC-MS方法。
b)或者通过体外试验中的酶功能直接检测微生物菌株中功能性谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的存在。专利文献US 2014/342399的实施例9中描述了用于检测谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶活性的酶试验。
本发明的目的是提高谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的细胞活性。根据本发明，这通过增加谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的表达，进而通过增加编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的拷贝数而实现。
此外，编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的表达优选通过使用合适的启动子增加。
导致蛋白质表达增加的启动子称为强启动子。强启动子可以克隆到相关野生型基因中，用于表达野生型染色体中存在的ORF并编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶和/或可以调节编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的额外或另外的ORF的表达。
导致微生物中强表达的启动子(强启动子)的实例是本领域技术人员已知的。
在优选的实施方式中，根据本发明的微生物菌株是关于谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶ORF的野生型微生物菌株，即其包含编码于编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的野生型基因组中的ORF，并且其另外包含至少一个在强启动子控制下编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的质粒编码ORF。
蛋白质表达增加应该理解为以增加的产量生成蛋白质，这意味着与相应野生型菌株相比，使用本发明的微生物菌株生成的产量优选至少为110％，特别优选至少150％，且尤其优选至少200％的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的量。这意味着谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶蛋白的产率优选是使用不含编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的开放阅读框的相应菌株可以实现的产率的至少1.1倍，特别优选至少1.5倍，且尤其优选至少2倍。相应野生型微生物菌株的特征在于其与使用菌株在遗传上相同，但不包含编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的开放阅读框。
根据本发明的微生物菌株可以包含编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的一个或多个另外的功能拷贝。其优选包含编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的1-700个另外的功能拷贝，特别优选包含编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的1-20个另外的功能拷贝。每个另外或额外的ORF可以整合到染色体中；然而，其也可以存在于一个或多个质粒上。
根据本发明，该微生物菌株缺乏谷胱甘肽合成酶，即相应基因不产生功能性谷胱甘肽合成酶。谷胱甘肽合成酶优选是由大肠杆菌中的gshB基因和酿酒酵母中的GSH2基因编码的基因产物。谷胱甘肽合成酶特别优选是由大肠杆菌中的gshB基因编码的基因产物。
在优选的实施方式中，该微生物菌株含有至少一种质粒，该质粒含有至少一种，特别优选恰好一种在功能启动子控制下编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF。在该实施方式中，编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF在质粒上表达。这种生产质粒允许在微生物菌株中生产γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe。
优选的是该微生物菌株具有编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的染色体基因。特别优选的是，该微生物菌株具有染色体基因和至少一个位于质粒上编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的ORF。这意味着除了染色体基因产生的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶外，细胞还会产生质粒编码的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶。
在可替代的优选实施方式中，使用了一种微生物菌株，其中存在于野生型中编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的染色体基因已被删除，并且一个或多个编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的额外ORF被染色体整合或通过一个或多个质粒引入。
编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的表达通过同源或异源启动子实现。
在本发明的上下文中，同源启动子是指选择的启动子也调节对应于选择的ORF的野生型基因中的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的表达。相反，异源启动子是指选择的是不调节相应野生型基因中的谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶表达的启动子。
在优选的情况下，ORF处于用于表达GshA蛋白的gshA启动子的控制下，即使用同源启动子。异源启动子是例如来自大肠杆菌的gapA基因的启动子，来自大肠杆菌的catB基因的启动子，来自大肠杆菌的tufB基因的启动子，来自大肠杆菌的mppA基因的启动子，来自大肠杆菌的lpp基因的启动子，和来自大肠杆菌的proC基因的启动子。此外，异源lac、tac、trc、λ、ara或tet启动子是本领域技术人员已知的，并且可以用于编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的异源表达。
编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF在微生物菌株中的表达优选通过gapA基因的启动子、catB基因的启动子、tufB基因的启动子、mppA基因的启动子、大肠杆菌的lpp基因的启动子或大肠杆菌的proC基因的启动子实现。
特别优选的是，编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF在大肠杆菌质粒上的表达通过大肠杆菌的tufB基因的启动子实现。
因此，微生物菌株优选包含至少一种质粒，该质粒包含上述启动子中的一种，该启动子以它/它们控制编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF的表达的方式位于该质粒上。
优选的是，可以使用的质粒是所有可用于基因工程的DNA分子，它们在选定的微生物菌株，优选大肠杆菌中进行染色体外复制，并且包含选择型标记。例如，可以使用在大肠杆菌中具有高细胞拷贝数的质粒(例如，pUC系列的质粒，pQE系列的质粒，pBluescript系列的质粒)、在大肠杆菌中具有中等拷贝数的质粒(例如，pBR系列的质粒、pACYC系列的质粒)或在大肠杆菌中具有低拷贝数的质粒(例如，pSC101或pBeloBAC11)。
在酿酒酵母的情况下，可以使用源自2μm质粒的染色体外复制质粒。这些可以是例如包含可选择的标记基因并且每个细胞具有约50个质粒的YEp载体(酵母附加型质粒)。此外，也可以使用另外具有用于将染色体分离成子核的着丝粒序列的YCp载体。此外，也可以使用正如其称谓的包含自主复制序列(ARS序列)的YRp载体(酵母复制质粒)或ARS载体。由于真核复制起点的存在，这些质粒自主复制，即独立于染色体DNA。
此外，行为类似于独立染色体的YAC载体(酵母人工染色体)也可以用于酿酒酵母中。
也可以用作质粒的是具有多个不同复制起点的所谓穿梭载体，它们各自在不同物种中具有活性。因此，它们可以在不同的微生物中繁殖。例如，可以使用具有来自大肠杆菌的细菌复制起点和来自酿酒酵母的复制起点(ARS元件)并因此在两种生物体中都可以复制的穿梭载体。
优选的是使用在大肠杆菌中具有中等拷贝数的质粒(例如，pBR系列的质粒，pACYC系列的质粒)。
特别优选使用pACYC系列的质粒。
质粒通过例如常见的转化方法如电穿孔或CaCl2法引入。然后通过抗生素抗性选择带有质粒的克隆体。本领域技术人员已知的选择标记是，例如，介导对氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶基因，介导对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因，介导对四环素抗性的四环素外排基因，或介导对氨苄青霉素和羧苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
作为通过质粒表达的替代，编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF除了根据本发明的质粒或单独地也可以整合到微生物菌株的染色体中。本领域技术人员已知的采用温和噬菌体或整合质粒或通过同源重组的整合的系统优选用作整合方法。
该方法优选特征在于发酵培养基含有至少50-6000mg/L L-酪氨酸(L-Tyr)和50-6000mg/L L-苯丙氨酸(L-Phe)。
该方法特别优选特征在于发酵培养基含有至少50-3000mg/L L-酪氨酸(L-Tyr)和50-3000mg/L L-苯丙氨酸(L-Phe)。
根据本发明的微生物菌株通过本领域技术人员已知的常规方法在摇瓶或生物反应器(发酵器)培养。
根据本发明的微生物菌株在发酵器中的生长以连续培养、间歇式培养或优选补料间歇式培养的形式进行。
优选使用糖、糖醇或有机酸作为碳源。特别优选使用葡萄糖、乳糖、蔗糖或甘油，特别优选葡萄糖作为本发明方法中的碳源。
优选的是以确保发酵器中碳源含量在发酵期间保持于0.1g/L-50g/L范围内的形式计量加入碳源。特别优选0.1g/L-10g/L的范围。
优选使用氨、铵盐或蛋白质水解物作为本发明方法中的氮源。在使用氨作为pH控制的校正剂的情况下，这种氮源在发酵期间定期额外计量。
微量(即以μM浓度计)的元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙和铁的盐，元素钼、硼、钴、锰、锌、铜和镍的盐，可以作为另外的培养基添加剂添加。
此外，有机酸(例如，醋酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸)和维生素(例如，维生素B1、维生素B6、维生素B12)都可以添加到该培养基中。
例如，酵母提取物、胰蛋白胨、玉米浆、大豆粉或麦芽提取物可以用作复合营养源。
由大肠杆菌科生长根据本发明的菌株的培养温度优选为28-37℃；特别优选30-32℃的培养温度。
在发酵期间，发酵培养基的pH值优选范围为5.0-8.5；特别优选pH 7.0。
优选在需氧、厌氧或微需氧培养条件下，并在特定菌株的最佳生长温度范围内，对根据本发明的微生物菌株，优选来自肠杆菌科的菌株，特别优选大肠杆菌菌株，培养长达6-150小时的一段时间。特别优选培养时间为6-48小时。
发酵优选在需氧或微需氧生长条件下进行。
根据本发明，涉及一种用于发酵生产γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的方法，术语发酵生产是指每升培养基在48小时，优选至少40小时，特别优选至少24小时的培养时间后产生至少5mgγ-Glu-Tyr和5mgγ-Glu-Phe，优选至少10mgγ-Glu-Tyr和10mgγ-Glu-Phe，特别优选至少20mgγ-Glu-Tyr和20mgγ-Glu-Phe。
优选在移除发酵培养基后从发酵培养基中纯化γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe。
从培养物中去除γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe可以通过本领域技术人员已知的方法，如离心培养基去除细胞，随后从发酵上清液中回收γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe而实现。
经过后续的纯化、浓缩、干燥和可选的配制或络合后可以获得产物γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe。
在本发明的方法中产生的γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe通过例如HPLC-MS方法进行检测和定量。
原则上用于生产厚味产品的程序优选如下：
1.发酵器培养，
然后通过例如离心去除细胞
2.无细胞培养上清液，
随后无菌过滤和/或纳滤
3.无菌无细胞培养上清液
随后干燥，例如通过喷雾干燥和/或冷冻干燥
4.粗厚味产品
随后均化，例如通过研磨
5.厚味产品
具体实施方式
实施例
本发明将在以下参考示例性实施方式更详细描述，但并不限于此。
在实施例中，使用了如US 2014/0342399 A中公开的大肠杆菌菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306。菌株名称是指带有gshB基因缺失的大肠杆菌W3110菌株(ATCC 27325)，该细菌细胞携带US 2014/0342399中图10所示的质粒并包含：
-具有起始密码子ATG的gshA基因，其中该基因处于tufB启动子的控制下，
-serA基因(编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)，
-cysE基因(编码丝氨酸乙酰转移酶)，和
-ORF306(编码半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸输出子(exporter)EamA)。
实施例1：用于发酵的γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe生产菌株的摇瓶预培养
用5g/L D(+)-葡萄糖单水合物制备100mL无菌LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)，然后在无菌500mL锥形瓶中与四环素×HCl混合(摇瓶中四环素×HCl的最终浓度：0.01g/L，无菌过滤)。
使用接种环，从琼脂板中取出生产菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306的足够细胞并转移到补充的LB培养基中，直到最多可辨别出补充的LB培养基的微弱浊度。该预培养物在
Figure BDA0003361647810000141
IS培养摇床(Sartorius StediumBiotech，
Figure BDA0003361647810000142
Germany)上32℃和130rpm下培养5h。
实施例2：用于生产γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的预发酵器
预发酵在来自Eppendorf(Hamburg，Germany)的2L DASGIP发酵器中进行。
将来自实施例1的100mL LB预培养物用于接种900mL生产培养基，该培养基由30g/L D(+)-葡萄糖单水合物、0.03g/L吡哆醇×HCl、0.005g/L硫胺素×HCl、0.01g/L四环素×HCl、5g/L(NH4)2SO4、0.5g/L NaCl、0.9g/L L-异亮氨酸、0.6g/L D/L-蛋氨酸、5g/L玉米浸渍液(corn steep)固体(例如，来自Sigma-Aldrich)、0.225g/L CaCl2×2H2O、0.6g/L MgSO4×7H2O、0.15g/L Na2MO4×2H2O、0.3g/L H3BO3、0.2g/L CoCl2×6H2O、0.25g/L CuSO4×5H2O、1.6g/L MnCl2×4H2O、1.35g/L ZnSO4×7H2O、0.075g/L FeSO4×7H2O、1g/L柠檬酸钠×2H2O和1.71g/L KH2PO4组成。培养基组分最初在无菌条件下装入2L发酵器中，并使用无菌校正剂(25％氨水和6.8N H3PO4)调节至pH＝7.0。在培养48小时期间，温度保持恒定于32℃，pH值通过校正剂(25％氨)保持恒定于7.0。Struktol J673(Schill+Seilacher,Hamburg)在无菌水中的1:10稀释液用作消泡剂。培养物用无菌压缩空气以100L/h充气并以450rpm的搅拌速度搅拌。在氧饱和度下降到50％的值后，通过发酵器的控制单元将速度提高至1450rpm，以获得30％的氧饱和度。使用pO2探头测定氧饱和度，该探头在450rpm下校准至100％饱和度。一旦发酵器中的葡萄糖含量下降到约1-2g/L，计量加入56％(w/v)的D(+)-葡萄糖单水合物溶液。葡萄糖以10-15mL/h的流量进料，且葡萄糖浓度在发酵器中保持恒定于0.1-10g/L。葡萄糖的测定使用YSI 7100MBS分析仪(YSI，Yellow Springs，Ohio，USA)进行。
实施例3：γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的发酵生产
γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe在来自Eppendorf(Hamburg Germany)的2L DASGIP发酵器中的生产分两个独立的批次进行。
以下对实验方案的描述适用于两个批次1和2中的每个：
将来自实施例2的100mL预培养物用于接种900mL生产培养基，该培养基由30g/L D(+)-葡萄糖单水合物、0.03g/L吡哆醇×HCl、0.005g/L硫胺素×HCl、0.01g/L四环素×HCl、5g/L(NH4)2SO4、0.5g/L NaCl、0.9g/L L-异亮氨酸、0.6g/L D/L-蛋氨酸、5g/L玉米浸渍液固体、0.225g/L CaCl2×2H2O、0.6g/L MgSO4×7H2O、0.15g/L Na2MO4×2H2O、0.3g/L H3BO3、0.2g/L CoCl2×6H2O、0.25g/L CuSO4×5H2O、1.6g/L MnCl2×4H2O、1.35g/L ZnSO4×7H2O、0.075g/L FeSO4×7H2O、1g/L柠檬酸钠×2H2O和1.71g/L KH2PO4组成。培养基组分最初在无菌条件下装入2L发酵器中，并使用无菌校正剂(25％氨水和6.8N H3PO4)调节至pH＝6.9。在培养48小时期间，温度保持恒定于32℃，pH值通过校正剂(25％氨)保持恒定于7.0。Struktol J673(Schill+Seilacher,Hamburg)在无菌水中的1:10稀释液用作消泡剂。培养物用无菌压缩空气以100L/h充气并以450rpm的搅拌速度搅拌。在氧饱和度下降到50％的值后，通过发酵器的控制单元将速度提高至1450rpm，以获得30％的氧饱和度。使用pO2探头测定氧饱和度，该探头在450rpm下校准至100％饱和度。一旦发酵器中的葡萄糖含量下降到约1-2g/L，计量加入56％(w/v)的D(+)-葡萄糖单水合物溶液。葡萄糖以10-15mL/h的流量进料，且葡萄糖浓度在发酵器中保持恒定于0.1-10g/L。葡萄糖的测定使用YSI 7100MBS分析仪(YSI，Yellow Springs，Ohio，USA)进行。
为了有效生产产物γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe，L-Tyr和L-Phe通过葡萄糖进料计量加入。在培养开始后2小时以10-15mL/h的速率补充进料，其中进料溶液具有6g/L L-Tyr和6g/L L-Phe的浓度。
除了葡萄糖的进料之外，谷氨酸钾和硫代硫酸铵[(NH4)2S2O3]也通过组合进料计量加入。培养开始后2h补充进料，速度为4-4.5mL/h，进料液中的硫代硫酸铵浓度和谷氨酸钾浓度分别为73g/L和21g/L。
使用生产菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306的γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe发酵的结果综合于表1(第一批次)和2(第二批次)中。
表1：菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306发酵后第一批次的培养上清液中γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的含量
Figure BDA0003361647810000161
表2：菌株W3110ΔgshB/ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306发酵后第2批次的培养上清液中γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的含量
Figure BDA0003361647810000171
γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的检测
γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe的检测采用HPLC-MS方法。分析在Thermo FisherScientific(Dreieich，Germany)的Ultimate 3000HPLC系统上进行，该系统与BrukerDaltonik(Bremen,Germany)的Amazon SL质谱仪连接。使用的分离柱是Macherey Nagel(Düren,Germany)的
Figure BDA0003361647810000172
Bluebird RP 18柱，2.7μm(100mm×3.0mm)。在30℃和0.7mL/min的流速下对样品进行梯度洗脱(流动相A：含有0.1％(v/v)乙酸的水，流动相B：甲醇)。基于[M+H]+离子以ESI正模式进行质谱检测(γ-Glu-Tyr的m/z：311，γ-Glu-Phe的m/z：295)。
实施例5：厚味产品的生产
为了生产厚味产品，对1.5L实施例3中描述的发酵物进行后处理。离心去除细胞后，将上清液无菌过滤(Thermo ScientificTMNalgeneTMRapid-FlowTM90mm 0.2μFilterUnit，Dreieich，Germany)，然后在干燥箱(Binder ED115 E2，Tuttlingen，Germany)中干燥。对于均化，将干燥的粗产品在研磨机(
Figure BDA0003361647810000173
A11 basic,Staufen,Germany)中均化。
序列表
<110> 瓦克化学股份公司
<120> 用于发酵生产γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸的微生物菌株和方法
<130> Wa11859F
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1557
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgatcccgg acgtatcaca ggcgctggcc tggctggaaa aacatcctca ggcgttaaag 60
gggatacagc gtgggctgga gcgcgaaact ttgcgtgtta atgctgatgg cacactggca 120
acaacaggtc atcctgaagc attaggttcc gcactgacgc acaaatggat tactaccgat 180
tttgcggaag cattgctgga attcattaca ccagtggatg gtgatattga acatatgctg 240
acctttatgc gcgatctgca tcgttatacg gcgcgcaata tgggcgatga gcggatgtgg 300
ccgttaagta tgccatgcta catcgcagaa ggtcaggaca tcgaactggc acagtacggc 360
acttctaaca ccggacgctt taaaacgctg tatcgtgaag ggctgaaaaa tcgctacggc 420
gcgctgatgc aaaccatttc cggcgtgcac tacaatttct ctttgccaat ggcattctgg 480
caagcgaagt gcggtgatat ctcgggcgct gatgccaaag agaaaatttc tgcgggctat 540
ttccgcgtta tccgcaatta ctatcgtttc ggttgggtca ttccttatct gtttggtgca 600
tctccggcga tttgttcttc tttcctgcaa ggaaaaccaa cgtcgctgcc gtttgagaaa 660
accgagtgcg gtatgtatta cctgccgtat gcgacctctc ttcgtttgag cgatctcggc 720
tataccaata aatcgcaaag caatcttggt attaccttca acgatcttta cgagtacgta 780
gcgggcctta aacaggcaat caaaacgcca tcggaagagt acgcgaagat tggtattgag 840
aaagacggta agaggctgca aatcaacagc aacgtgttgc agattgaaaa cgaactgtac 900
gcgccgattc gtccaaaacg cgttacccgc agcggcgagt cgccttctga tgcgctgtta 960
cgtggcggca ttgaatatat tgaagtgcgt tcgctggaca tcaacccgtt ctcgccgatt 1020
ggtgtagatg aacagcaggt gcgattcctc gacctgttta tggtctggtg tgcgctggct 1080
gatgcaccgg aaatgagcag tagcgaactt gcctgtacac gcgttaactg gaaccgggtg 1140
atcctcgaag gtcgcaaacc gggtctgacg ctgggtatcg gctgcgaaac cgcacagttc 1200
ccgttaccgc aggtgggtaa agatctgttc cgcgatctga aacgcgtcgc gcaaacgctg 1260
gatagtatta acggcggcga agcgtatcag aaagtgtgtg atgaactggt tgcctgcttc 1320
gataatcccg atctgacttt ctctgcccgt atcttaaggt ctatgattga tactggtatt 1380
ggcggaacag gcaaagcatt tgcagaagcc taccgtaatc tgctgcgtga agagccgctg 1440
gaaattctgc gcgaagagga ttttgtagcc gagcgcgagg cgtctgaacg ccgtcagcag 1500
gaaatggaag ccgctgatac cgaaccgttt gcggtgtggc tggaaaaaca cgcctga 1557
<210> 2
<211> 518
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro
1 5 10 15
Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu
35 40 45
Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala
50 55 60
Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu
65 70 75 80
Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp
85 90 95
Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln
100 105 110
Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys
115 120 125
Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln
130 135 140
Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp
145 150 155 160
Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile
165 170 175
Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp
180 185 190
Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe
195 200 205
Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly
210 215 220
Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly
225 230 235 240
Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu
245 250 255
Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu
260 265 270
Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile
275 280 285
Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg
290 295 300
Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu
305 310 315 320
Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro
325 330 335
Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu
340 345 350
Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser
355 360 365
Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly
370 375 380
Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe
385 390 395 400
Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val
405 410 415
Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val
420 425 430
Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser
435 440 445
Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly
450 455 460
Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu
485 490 495
Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val
500 505 510
Trp Leu Glu Lys His Ala
515

Claims (7)

1.一种用于发酵生产γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸的方法，其特征在于，在发酵培养基中培养微生物菌株，所述发酵培养基在发酵后去除细胞，并且从所述发酵培养基中分离γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸，
其中所述微生物菌株包含至少一种编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的开放阅读框，并且
其中所述微生物菌株缺乏谷胱甘肽合成酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物菌株是细菌菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌菌株是大肠杆菌(Escherichiacoli)种的菌株。
4.根据权利要求1-3中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有至少50mg/L L-酪氨酸(L-Tyr)和50mg/L L-苯丙氨酸(L-Phe)。
5.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的另外的开放阅读框为SEQ ID NO.1或该序列的同源物。
6.根据权利要求1-5中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述微生物菌株含有至少一种质粒，所述质粒含有至少一种在功能性启动子控制下编码谷氨酸酯-半胱氨酸连接酶的ORF。
7.根据权利要求1-6中一项或多项所述的方法，其特征在于，在去除所述发酵培养基后从所述发酵培养基中纯化γ-谷氨酰酪氨酸和γ-谷氨酰苯丙氨酸。
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