JP2002262896A - Ｏ−アセチル−ｌ−セリンを発酵法で製造する方法 - Google Patents
Ｏ−アセチル−ｌ−セリンを発酵法で製造する方法Info
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- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造す
る方法 【解決手段】 野生型から誘導され、野生型に比べて高
められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性及び
野生型に比べて増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−
流出性を有する微生物−菌株を発酵培地中で培養するこ
とによりＯ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造する
方法において、発酵培地中でｐＨ値を５.１〜６.５の範
囲内に調節する。
る方法 【解決手段】 野生型から誘導され、野生型に比べて高
められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性及び
野生型に比べて増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−
流出性を有する微生物−菌株を発酵培地中で培養するこ
とによりＯ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造する
方法において、発酵培地中でｐＨ値を５.１〜６.５の範
囲内に調節する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法を用いてＯ
−アセチル−Ｌ−セリンを製造する方法に関する。
−アセチル−Ｌ−セリンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸の製造のための発酵法は、今日
広く普及している。これは、殊に、経済的に著しく重要
な２０の蛋白質アミノ酸の代表、例えばＬ−グルタミン
酸、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニンの製法である。しかし
ながら、年間１０００〜１００００トンの範囲の小さい
市場での蛋白質アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−システインの製造のための方法に関する報告も
増大している。
広く普及している。これは、殊に、経済的に著しく重要
な２０の蛋白質アミノ酸の代表、例えばＬ−グルタミン
酸、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニンの製法である。しかし
ながら、年間１０００〜１００００トンの範囲の小さい
市場での蛋白質アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−システインの製造のための方法に関する報告も
増大している。
【０００３】これに反して、２０の蛋白質アミノ酸の生
合成前駆物質を製造するための相応する方法は全く知ら
れていない。しかしながら、これらの前駆物質は屡々キ
ラル中心を有し、薬剤有効物質の合成のための構成要素
として使用できるので、正にこの前駆物質は重要な生成
物でありうる。国際特許出願ＷＯ ００／４４９２３明
細書中には、例えばシキミ酸、芳香族アミノ酸の生合成
の中間体の製造が記載されている。もう一つの例は、欧
州特許出願ＥＰ ０９９４１９０Ａ２であり、ここに
は、発酵法によるＬ−ホモセリン、Ｌ−メチオニンの前
駆物質の製造が報告されている。
合成前駆物質を製造するための相応する方法は全く知ら
れていない。しかしながら、これらの前駆物質は屡々キ
ラル中心を有し、薬剤有効物質の合成のための構成要素
として使用できるので、正にこの前駆物質は重要な生成
物でありうる。国際特許出願ＷＯ ００／４４９２３明
細書中には、例えばシキミ酸、芳香族アミノ酸の生合成
の中間体の製造が記載されている。もう一つの例は、欧
州特許出願ＥＰ ０９９４１９０Ａ２であり、ここに
は、発酵法によるＬ−ホモセリン、Ｌ−メチオニンの前
駆物質の製造が報告されている。
【０００４】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、Ｌ−システ
インの生合成前駆物質である。これ自体はアミノ酸であ
り、細菌及び植物の物質代謝で、ヒドロキシル官能基の
所でのＬ−セリンのアセチル化により生じる。この反応
は、ｃｙｓＥ−遺伝子によりコードされる酵素セリン−
Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．
１．３０］により触媒作用される。Ｏ−アセチル−セリ
ンは、細胞中で更にＬ−システインまで変換される。こ
の場合には、チオール−官能基へのアセテート−官能基
の置換が行われる。
インの生合成前駆物質である。これ自体はアミノ酸であ
り、細菌及び植物の物質代謝で、ヒドロキシル官能基の
所でのＬ−セリンのアセチル化により生じる。この反応
は、ｃｙｓＥ−遺伝子によりコードされる酵素セリン−
Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．
１．３０］により触媒作用される。Ｏ−アセチル−セリ
ンは、細胞中で更にＬ−システインまで変換される。こ
の場合には、チオール−官能基へのアセテート−官能基
の置換が行われる。
【０００５】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による
製造の際の問題は、この物質が非常に不安定であり、
４.０より大きいｐＨ値で異性化してＮ−アセチル−Ｌ
−セリンになる事実から生じる。この反応の速度は、
７.６のｐＨ値で１％×ｍｉｎ- １の速度を有する（Tai
等、１９９５，Biochemistry ３４：１２３１１−１２
３２２）。このことは、このような条件下で、通常少な
くとも一日半かかる発酵法の後に、有意義な量のＯ−ア
セチル−セリンが検出されないことを意味する。この異
性化反応は、不可逆的であり、ｐＨ値の増加に伴いその
速度が更に上昇する。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとは反
対に、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンは、アミノ官能基のブ
ロッキングに基づき、もはやペプチド合成のためには使
用できない。
製造の際の問題は、この物質が非常に不安定であり、
４.０より大きいｐＨ値で異性化してＮ−アセチル−Ｌ
−セリンになる事実から生じる。この反応の速度は、
７.６のｐＨ値で１％×ｍｉｎ- １の速度を有する（Tai
等、１９９５，Biochemistry ３４：１２３１１−１２
３２２）。このことは、このような条件下で、通常少な
くとも一日半かかる発酵法の後に、有意義な量のＯ−ア
セチル−セリンが検出されないことを意味する。この異
性化反応は、不可逆的であり、ｐＨ値の増加に伴いその
速度が更に上昇する。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとは反
対に、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンは、アミノ官能基のブ
ロッキングに基づき、もはやペプチド合成のためには使
用できない。
【０００６】細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−濃度
は非常に低く、強力な調節（Regulation)が根底にある
ことがもう一つの問題である。一方で、セリン−アセチ
ル−トランスフェラーゼは、Ｌ−システインによりアロ
ステリックに抑制され、これに伴い、μＭ−濃度のＬ−
システインの存在時には、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの
合成は不可能である。他方、異性化生成物Ｎ−アセチル
−Ｌ−セリンは、硫黄レギュロン（Regulon）のインジ
ューサーとしての作用をし、これに伴い、Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリンと硫化物とが迅速に反応して、Ｌ−システ
インをもたらす。
は非常に低く、強力な調節（Regulation)が根底にある
ことがもう一つの問題である。一方で、セリン−アセチ
ル−トランスフェラーゼは、Ｌ−システインによりアロ
ステリックに抑制され、これに伴い、μＭ−濃度のＬ−
システインの存在時には、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの
合成は不可能である。他方、異性化生成物Ｎ−アセチル
−Ｌ−セリンは、硫黄レギュロン（Regulon）のインジ
ューサーとしての作用をし、これに伴い、Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリンと硫化物とが迅速に反応して、Ｌ−システ
インをもたらす。
【０００７】Dassler 等（２０００、Mol. Microbiol．
３６：１１０１−１１１２）により、膜蛋白質ＹｄｅＤ
（＝Ｏｒｆ２９９）を過剰生産する細胞は、培地中にＬ
−システイン、２−メチル−チアゾリジン−２，４−ジ
カルボン酸及び更にＯ−アセチル−Ｌ−セリンをも分泌
することが記載された。しかしながら、後者は０．１２
ｇ／ｌの非常に少量でのみ、かつ振動フラスコ実験にお
いてのみ検出できた。これに反して、より良好な栄養物
質供給に基づきより高い収率を可能とする発酵実験で
は、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンのみが得られた。Ｏ−ア
セチル−Ｌ−セリンは、４〜５のｐＨ範囲の場合にのみ
充分に安定であることが論じられた。しかしながら、こ
のｐＨ範囲は、好中球性細菌、例えばエセリキア・コリ
ーの悪い成長に基づき発酵法的製造のためには好適では
ない。
３６：１１０１−１１１２）により、膜蛋白質ＹｄｅＤ
（＝Ｏｒｆ２９９）を過剰生産する細胞は、培地中にＬ
−システイン、２−メチル−チアゾリジン−２，４−ジ
カルボン酸及び更にＯ−アセチル−Ｌ−セリンをも分泌
することが記載された。しかしながら、後者は０．１２
ｇ／ｌの非常に少量でのみ、かつ振動フラスコ実験にお
いてのみ検出できた。これに反して、より良好な栄養物
質供給に基づきより高い収率を可能とする発酵実験で
は、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンのみが得られた。Ｏ−ア
セチル−Ｌ−セリンは、４〜５のｐＨ範囲の場合にのみ
充分に安定であることが論じられた。しかしながら、こ
のｐＨ範囲は、好中球性細菌、例えばエセリキア・コリ
ーの悪い成長に基づき発酵法的製造のためには好適では
ない。
【０００８】ｐＨ７.０で、Ｏｒｆ２９９の使用下での
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による製造が、同様
に欧州特許出願ＥＰ ０８８５９６２Ａ１に記載され
た。ここでは，ｏｒｆ２９９−遺伝子（この出願中でＳ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３で示されている）が適当なｃｙｓ
Ｅ−アレルと組み合わされた。これは、Ｌ−システイン
による低下されたフィードバック−阻害の基礎になって
いるセリン−アセチル−トランスフェラーゼをコードし
ていた。これによって、細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セ
リンの増強された生産が達成され、最終的に迅速な異性
化に基づきＮ−アセチル−Ｌ−セリンが蓄積された。
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による製造が、同様
に欧州特許出願ＥＰ ０８８５９６２Ａ１に記載され
た。ここでは，ｏｒｆ２９９−遺伝子（この出願中でＳ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３で示されている）が適当なｃｙｓ
Ｅ−アレルと組み合わされた。これは、Ｌ−システイン
による低下されたフィードバック−阻害の基礎になって
いるセリン−アセチル−トランスフェラーゼをコードし
ていた。これによって、細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セ
リンの増強された生産が達成され、最終的に迅速な異性
化に基づきＮ−アセチル−Ｌ−セリンが蓄積された。
【０００９】国際特許出願ＷＯ ９７／１５６７３明細
書中に記載のような低下されたフィードバック阻害を有
するｃｙｓＥ−アレルの単独使用は、同様にＯ−アセチ
ル−Ｌ−セリンの蓄積をもたらさない。細胞内ではＯ−
アセチル−セリンの増大した形成が得られる。しかしな
がらこの処置法では、細胞外で−従って初めて生成物と
して補足可能である−Ｌ−システインが検出できただけ
である。
書中に記載のような低下されたフィードバック阻害を有
するｃｙｓＥ−アレルの単独使用は、同様にＯ−アセチ
ル−Ｌ−セリンの蓄積をもたらさない。細胞内ではＯ−
アセチル−セリンの増大した形成が得られる。しかしな
がらこの処置法では、細胞外で−従って初めて生成物と
して補足可能である−Ｌ−システインが検出できただけ
である。
【００１０】更に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの製造の
場合の大きな問題は、Dassler 等（２０００，Mol. Mic
robiol.３６：１１０１−１１１２）により記載された
事実、即ち、Ｏｒｆ２９９の過剰生産が、細菌成長の強
力な妨害をもたらす事実である。このことは、インジュ
ーサーであるＮ−アセチル−Ｌ−セリンの細胞内での不
足に基づく硫黄レギュロンの誘導不足に基づく。
場合の大きな問題は、Dassler 等（２０００，Mol. Mic
robiol.３６：１１０１−１１１２）により記載された
事実、即ち、Ｏｒｆ２９９の過剰生産が、細菌成長の強
力な妨害をもたらす事実である。このことは、インジュ
ーサーであるＮ−アセチル−Ｌ−セリンの細胞内での不
足に基づく硫黄レギュロンの誘導不足に基づく。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、Ｏ−
アセチル−Ｌ−セリンの不安定性及び細胞からの有効な
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−エクスポート（Exports)の
負の生理学的結果にも関わらず、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リンの高い収率を生じる発酵法を提供することであっ
た。
アセチル−Ｌ−セリンの不安定性及び細胞からの有効な
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−エクスポート（Exports)の
負の生理学的結果にも関わらず、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リンの高い収率を生じる発酵法を提供することであっ
た。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この課題は、１野生型か
ら誘導され、野生型に比べて高められた内因性Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−形成性及び野生型に比べて増強され
たＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性（Efflux)を有す
る微生物−菌株を、発酵培地中で培養することにより解
決され、この際、発酵培地中のｐＨ値を５.１〜６.５の
範囲内に調節することを特徴とする。
ら誘導され、野生型に比べて高められた内因性Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−形成性及び野生型に比べて増強され
たＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性（Efflux)を有す
る微生物−菌株を、発酵培地中で培養することにより解
決され、この際、発酵培地中のｐＨ値を５.１〜６.５の
範囲内に調節することを特徴とする。
【００１３】即ち、意外にも、次のことが判明した： - 前記のような特徴を有する微生物菌株は、多量のＯ
−アセチル−Ｌ−セリンを分泌する、 - Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは５.１〜６.５のｐＨ値
で発酵培地中で充分安定であり、かつ - 同時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの増加供給によ
るＯ−アセチル−Ｌ−セリン−分泌細胞の前記の生理学
的問題は、フィードバック抵抗性のｃｙｓＥ−アレルを
用いて充分に取り除くことができる。
−アセチル−Ｌ−セリンを分泌する、 - Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは５.１〜６.５のｐＨ値
で発酵培地中で充分安定であり、かつ - 同時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの増加供給によ
るＯ−アセチル−Ｌ−セリン−分泌細胞の前記の生理学
的問題は、フィードバック抵抗性のｃｙｓＥ−アレルを
用いて充分に取り除くことができる。
【００１４】この発酵の間の発酵培地のｐＨ値は、有利
に５.５〜６.５のｐＨ範囲、特に有利に５.５〜６.０の
ｐＨ範囲である。
に５.５〜６.５のｐＨ範囲、特に有利に５.５〜６.０の
ｐＨ範囲である。
【００１５】本発明の方法で使用できる微生物菌株は、
それらが、 - Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成性を有
し、かつ - 増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性を有
することで優れている。
それらが、 - Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成性を有
し、かつ - 増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性を有
することで優れている。
【００１６】このような菌株は、技術水準で公知であ
る。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成は、修
飾されたｃｙｓＥ−アレル（Allel)を、例えば - ＷＯ ９７／１５６７３（ここで、参照文献として
添付）又は - Nakamori S. 等の,1998, Appl. Env. Microbiol. 6
4: 1607-1611 (ここで、参照文献として添付）又は - Takagi H. 等の 1999, FEBES Lett. 452: 323-327に
記載のように、微生物菌株中に入れることにより達成す
ることができる。
る。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成は、修
飾されたｃｙｓＥ−アレル（Allel)を、例えば - ＷＯ ９７／１５６７３（ここで、参照文献として
添付）又は - Nakamori S. 等の,1998, Appl. Env. Microbiol. 6
4: 1607-1611 (ここで、参照文献として添付）又は - Takagi H. 等の 1999, FEBES Lett. 452: 323-327に
記載のように、微生物菌株中に入れることにより達成す
ることができる。
【００１７】ｃｙｓＥ−アレルは、システインによる低
下されたフィードバック-阻害の基礎となっているセリ
ン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。
これによって、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの形成は、充
分に細胞のシステイン−濃度により止められる。
下されたフィードバック-阻害の基礎となっているセリ
ン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。
これによって、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの形成は、充
分に細胞のシステイン−濃度により止められる。
【００１８】増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流
出性(Efflux)は、その遺伝子産生物がＯ−アセチル−Ｌ
−セリンのエクスポートに作用するエフラックス−遺伝
子（Efflux-Gen)の高められた発現によって得ることが
できる。
出性(Efflux)は、その遺伝子産生物がＯ−アセチル−Ｌ
−セリンのエクスポートに作用するエフラックス−遺伝
子（Efflux-Gen)の高められた発現によって得ることが
できる。
【００１９】特に有利なこのようなエフラックス−遺伝
子は、Dassler等により（２０００、Mol. Microbiol. 3
6: 1101-1112) 及びＥＰ０８８５９６２Ａ１（整理番号
ＳＮ０９／０９７７５９の米国特許出願に相当：ここ
で、参考文献として添付）に記載されたｙｄｅＤ−遺伝
子である。
子は、Dassler等により（２０００、Mol. Microbiol. 3
6: 1101-1112) 及びＥＰ０８８５９６２Ａ１（整理番号
ＳＮ０９／０９７７５９の米国特許出願に相当：ここ
で、参考文献として添付）に記載されたｙｄｅＤ−遺伝
子である。
【００２０】修飾されたｃｙｓＥ−アレル又はエフラッ
クス−遺伝子は、使用菌株中に単独コピー又は高いコピ
ー数で存在しうる。これらは染色体コードしているか又
は自己複製因子、例えばプラスミド上に局在することが
できる。
クス−遺伝子は、使用菌株中に単独コピー又は高いコピ
ー数で存在しうる。これらは染色体コードしているか又
は自己複製因子、例えばプラスミド上に局在することが
できる。
【００２１】この遺伝子の増強された発現は、例えば当
業者に公知である適当なプロモーター系の使用により行
うことができる。
業者に公知である適当なプロモーター系の使用により行
うことができる。
【００２２】本発明の有利な１実施形では、ｃｙｓＥ−
アレル又はｙｄｅＤ−遺伝子を、本来の又はｇａｐＤＨ
−プロモーターと共に含有する微生物をプラスミド上で
中程度のコピー数で使用する。このような構造は、例え
ばｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ
３０６であり、これはＥＰ０８８５９６２Ａ１中に詳細
に記載されている。
アレル又はｙｄｅＤ−遺伝子を、本来の又はｇａｐＤＨ
−プロモーターと共に含有する微生物をプラスミド上で
中程度のコピー数で使用する。このような構造は、例え
ばｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ
３０６であり、これはＥＰ０８８５９６２Ａ１中に詳細
に記載されている。
【００２３】このような菌株の製造のためには、原則的
に、遺伝学的方法に使用でき、発酵法で良好に培養でき
る全ての微生物菌株が好適である。腸内菌（Enterobakt
eriacee)類の細菌が有利に使用される。特に有利に大腸
菌（Escherichia coli)類の微生物が使用される。この
ような菌株の製造は、前記の文献中に記載されており、
本発明の部分ではない。
に、遺伝学的方法に使用でき、発酵法で良好に培養でき
る全ての微生物菌株が好適である。腸内菌（Enterobakt
eriacee)類の細菌が有利に使用される。特に有利に大腸
菌（Escherichia coli)類の微生物が使用される。この
ような菌株の製造は、前記の文献中に記載されており、
本発明の部分ではない。
【００２４】本発明の方法に好適な菌株は、ＥＰ ０８
８５９６２Ａ１（米国特許出願整理番号ＳＮ ０９／０
９７７５９に相当：ここで参考文献として添付）に記載
のように、システイン及びシステイン−誘導体の製造の
ためにも好適である。しかしながら、後者のためには、
Ｌ−システイン又はその誘導体の最適量を得るために、
無機硫黄源、例えば硫酸塩又はチオ硫酸塩の充分な供給
が必要である。
８５９６２Ａ１（米国特許出願整理番号ＳＮ ０９／０
９７７５９に相当：ここで参考文献として添付）に記載
のように、システイン及びシステイン−誘導体の製造の
ためにも好適である。しかしながら、後者のためには、
Ｌ−システイン又はその誘導体の最適量を得るために、
無機硫黄源、例えば硫酸塩又はチオ硫酸塩の充分な供給
が必要である。
【００２５】しかしながら、本発明の方法では、Ｏ−ア
セチル−Ｌ−セリンが更にシステインまで変換すること
は望ましくないので、この発酵の間に硫黄源は供給され
ない。単に、培地中に充分な量の硫黄源（例えば硫酸
塩、チオ硫酸塩）が存在して、細胞の蛋白質合成のため
のシステインの需要がカバーされることが確保されるべ
きであるだけである。栄養培地中の充分量は、有利に硫
黄５〜５０ｍＭである。
セチル−Ｌ−セリンが更にシステインまで変換すること
は望ましくないので、この発酵の間に硫黄源は供給され
ない。単に、培地中に充分な量の硫黄源（例えば硫酸
塩、チオ硫酸塩）が存在して、細胞の蛋白質合成のため
のシステインの需要がカバーされることが確保されるべ
きであるだけである。栄養培地中の充分量は、有利に硫
黄５〜５０ｍＭである。
【００２６】微生物菌株を用いるＯ−アセチル−Ｌ−セ
リンの製造のための本発明の方法は、発酵槽中で、公知
方法であるが、発酵の間の著しく低いｐＨ値の調節下に
実施される。
リンの製造のための本発明の方法は、発酵槽中で、公知
方法であるが、発酵の間の著しく低いｐＨ値の調節下に
実施される。
【００２７】発酵槽中での微生物菌株の培養は、連続的
培養法として、回分式培養法として又は有利には流加培
養法として行われる。この発酵の間にＣ−源を連続的に
供給することが特に有利である。
培養法として、回分式培養法として又は有利には流加培
養法として行われる。この発酵の間にＣ−源を連続的に
供給することが特に有利である。
【００２８】C−源としては、有利に糖、糖アルコール
又は有機酸が使用される。本発明の方法では特に有利に
Ｃ−源としてグルコース、ラクトース又はグリセリンが
使用される。
又は有機酸が使用される。本発明の方法では特に有利に
Ｃ−源としてグルコース、ラクトース又はグリセリンが
使用される。
【００２９】Ｃ−源の配量添加は、発酵の間の発酵槽中
の含分が０.１〜５０ｇ／ｌの範囲内に保持されること
を確保する形であるのが有利である。０.５〜１０ｇ／
ｌの範囲が特に有利である。
の含分が０.１〜５０ｇ／ｌの範囲内に保持されること
を確保する形であるのが有利である。０.５〜１０ｇ／
ｌの範囲が特に有利である。
【００３０】Ｎ−源として、本発明の方法では有利にア
ンモニア、アンモニウム塩又は蛋白質加水分解生成物が
使用される。ｐＨ安定化のための調整剤としてのアンモ
ニアの使用の際には、この発酵の間に、このＮ−源が定
期的に後供給される。
ンモニア、アンモニウム塩又は蛋白質加水分解生成物が
使用される。ｐＨ安定化のための調整剤としてのアンモ
ニアの使用の際には、この発酵の間に、このＮ−源が定
期的に後供給される。
【００３１】更なる培地添加物として、元素 リン、塩
素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カル
シウム、鉄の塩及び微量（即ちμＭ濃度で）の元素 モ
リブデン、硼素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケ
ルの塩を添加することができる。
素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カル
シウム、鉄の塩及び微量（即ちμＭ濃度で）の元素 モ
リブデン、硼素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケ
ルの塩を添加することができる。
【００３２】更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸
塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン
（例えばＢ１、Ｂ６）をこの培地に添加することができ
る。
塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン
（例えばＢ１、Ｂ６）をこの培地に添加することができ
る。
【００３３】複合栄養源として、例えば酵母エキス、コ
ーンステイープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを使用す
ることができる。
ーンステイープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを使用す
ることができる。
【００３４】インキュベーシヨン温度は、１５〜４５℃
である。３０〜３７℃の温度が有利である。
である。３０〜３７℃の温度が有利である。
【００３５】この発酵は、好気性成長条件下に実施する
のが有利である。発酵槽中への酸素導入は、圧搾空気又
は純粋酸素を用いて行われる。
のが有利である。発酵槽中への酸素導入は、圧搾空気又
は純粋酸素を用いて行われる。
【００３６】記載の方法で発酵される微生物は、１〜３
日の発酵時間内に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを高い効
率で培地中に分泌する。
日の発酵時間内に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを高い効
率で培地中に分泌する。
【００３７】
【実施例】本発明を更に詳述するために次の実施例を使
用する。例を実施するために使用されている細菌菌株エ
セリキア・コリーＷ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙ
ｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、ＤＳＭ(Deutsch
e Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen G
mbH、 D-38142 Braunschweig) にＤＳＭ１３４９５なる
番号で寄託された。
用する。例を実施するために使用されている細菌菌株エ
セリキア・コリーＷ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙ
ｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、ＤＳＭ(Deutsch
e Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen G
mbH、 D-38142 Braunschweig) にＤＳＭ１３４９５なる
番号で寄託された。
【００３８】例１：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンをＮ−ア
セチル−Ｌ−セリンにする異性化 発酵に近い条件下での異性化反応を介しての正確な印象
を得るために、発酵培地１００ｍｌ中でＯ−アセチル−
Ｌ−セリン（例３参照）０.９ｇを使用した。更に２５
％アンモニアを用いてｐＨ７.０にｐＨ値を調節し、３
２℃の反応温度で、種々異なる時点で試料を取り出し
た。これらを逆相ＨＰＬＣによりＬＵＮＡ５μＣ１８
（２）−カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, Deutsch
land ) で分析した。溶離液として、希リン酸（濃リン
酸０.１ｍｌ／ｌ）を、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで用い
た。結果は図１に示されている。
セチル−Ｌ−セリンにする異性化 発酵に近い条件下での異性化反応を介しての正確な印象
を得るために、発酵培地１００ｍｌ中でＯ−アセチル−
Ｌ−セリン（例３参照）０.９ｇを使用した。更に２５
％アンモニアを用いてｐＨ７.０にｐＨ値を調節し、３
２℃の反応温度で、種々異なる時点で試料を取り出し
た。これらを逆相ＨＰＬＣによりＬＵＮＡ５μＣ１８
（２）−カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, Deutsch
land ) で分析した。溶離液として、希リン酸（濃リン
酸０.１ｍｌ／ｌ）を、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで用い
た。結果は図１に示されている。
【００３９】例２：生産菌株の前培養液 この発酵のための前培養液として、付加的にテトラサイ
クリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ−培地（トリプトン
１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／
ｌ）２０ｍｌに、菌株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（米国特許出願
整理番号ＳＮ ０９／０９７７５９に相当するＥＰ ０
８８５９６２Ａ１（ここで参考文献として添付）に記載
されている）を接種し、３０℃及び１５０ｒｐｍで振動
装置中でインキュベートした。７時間後に、全内容物
を、グルコース ５ｇ／ｌ；ビタミンＢ１ ０.５ｍｇ
／ｌ及びテトラサイクリン １５ｍｇ／ｌが補充された
ＳＭ１−培地（Ｋ２ＨＰＯ４１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４
３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ
４×７Ｈ２Ｏ ０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ
０.０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.００２ｇ
／ｌ；Ｎａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ；ＮａＣ
ｌ ０.１ｇ／ｌ：微量元素溶液（Ｎａ２ＭｏＯ４×２
Ｈ２Ｏ０.１５ｇ／ｌ；Ｎａ３ＢＯ３２．５ｇ／ｌ；Ｃ
ｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ０.７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２
Ｏ０.２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ１.６ｇ／ｌ；
ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／
ｌ）１００ｍｌ中に移した。３０℃、１５０ｒｐｍで更
に１７時間インキュベートを行った。
クリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ−培地（トリプトン
１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／
ｌ）２０ｍｌに、菌株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−
ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（米国特許出願
整理番号ＳＮ ０９／０９７７５９に相当するＥＰ ０
８８５９６２Ａ１（ここで参考文献として添付）に記載
されている）を接種し、３０℃及び１５０ｒｐｍで振動
装置中でインキュベートした。７時間後に、全内容物
を、グルコース ５ｇ／ｌ；ビタミンＢ１ ０.５ｍｇ
／ｌ及びテトラサイクリン １５ｍｇ／ｌが補充された
ＳＭ１−培地（Ｋ２ＨＰＯ４１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４
３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ
４×７Ｈ２Ｏ ０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ
０.０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.００２ｇ
／ｌ；Ｎａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ；ＮａＣ
ｌ ０.１ｇ／ｌ：微量元素溶液（Ｎａ２ＭｏＯ４×２
Ｈ２Ｏ０.１５ｇ／ｌ；Ｎａ３ＢＯ３２．５ｇ／ｌ；Ｃ
ｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ０.７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２
Ｏ０.２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ１.６ｇ／ｌ；
ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／
ｌ）１００ｍｌ中に移した。３０℃、１５０ｒｐｍで更
に１７時間インキュベートを行った。
【００４０】例３：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法
による製造 発酵槽として、最大培養液量２リットルを有するFirma
Braun Biotech (Melsungen, D)社のＢｉｏｓｔａｔ Ｍ
−装置を用いた。例２に記載の前培養液（６００ｎｍで
の光学密度約３）を、発酵培地９００ｍｌ（グルコース
１５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母エキス５ｇ／
ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＫＨ ２ＰＯ４１.５
ｇ／ｌ；ＮａＣｌ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０.０１５ｇ／ｌ；
ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.０７５ｇ／ｌ；Ｎａ３クエン
酸塩×２Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ及び前記の微量元素溶液１ｍｌ
／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを２５％アンモニアでｐＨ６.０に調節）
を有する発酵槽に接種した。この発酵の間に、３２℃の
温度に調節し、ｐＨ値を２５％アンモニアの配量添加に
より６.０の値で一定に保持した。この培養液に除菌し
た圧搾空気を１.５ｖ／ｖ／ｍｉｎで通気し、２００ｒ
ｐｍの撹拌回転数で撹拌した。酸素飽和が５０％の値ま
で低下した後に、５０％酸素飽和を保持するために（ｐ
Ｏ２−ゾンデを用いて測定、９００ｒｐｍで１００％飽
和に対して較正）、コントロール装置を用いて回転数を
１２００ｒｐｍの値まで高めた。発酵槽中のグルコース
含分が当初の１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌまで低下
したら直ちに、５６％グルコール溶液の配量添加を行っ
た。この供給を６〜１２ｍｌ／ｈの流速で行い、この際
に、発酵槽中のグルコース濃度を０.５〜１０ｇ／ｌの
間に保持した。グルコース測定は Firma YSI (Yellow S
prings, Ohio, USA) 社のグルコース分析装置(Glukose-
Analysator)を用いて実施した。発酵時間は、２８時間
であった。この時間の後に、試料を取り出し、細胞を遠
心分離により培養培地から分離した。生じた培養上澄み
を逆相ＨＰＬＣにより例１に記載と同様に分析した。第
１表は、培養上澄み中の得られた主要物質代謝生成物の
含分を示している。
による製造 発酵槽として、最大培養液量２リットルを有するFirma
Braun Biotech (Melsungen, D)社のＢｉｏｓｔａｔ Ｍ
−装置を用いた。例２に記載の前培養液（６００ｎｍで
の光学密度約３）を、発酵培地９００ｍｌ（グルコース
１５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母エキス５ｇ／
ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＫＨ ２ＰＯ４１.５
ｇ／ｌ；ＮａＣｌ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０.０１５ｇ／ｌ；
ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.０７５ｇ／ｌ；Ｎａ３クエン
酸塩×２Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ及び前記の微量元素溶液１ｍｌ
／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン
１５ｍｇ／ｌを２５％アンモニアでｐＨ６.０に調節）
を有する発酵槽に接種した。この発酵の間に、３２℃の
温度に調節し、ｐＨ値を２５％アンモニアの配量添加に
より６.０の値で一定に保持した。この培養液に除菌し
た圧搾空気を１.５ｖ／ｖ／ｍｉｎで通気し、２００ｒ
ｐｍの撹拌回転数で撹拌した。酸素飽和が５０％の値ま
で低下した後に、５０％酸素飽和を保持するために（ｐ
Ｏ２−ゾンデを用いて測定、９００ｒｐｍで１００％飽
和に対して較正）、コントロール装置を用いて回転数を
１２００ｒｐｍの値まで高めた。発酵槽中のグルコース
含分が当初の１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌまで低下
したら直ちに、５６％グルコール溶液の配量添加を行っ
た。この供給を６〜１２ｍｌ／ｈの流速で行い、この際
に、発酵槽中のグルコース濃度を０.５〜１０ｇ／ｌの
間に保持した。グルコース測定は Firma YSI (Yellow S
prings, Ohio, USA) 社のグルコース分析装置(Glukose-
Analysator)を用いて実施した。発酵時間は、２８時間
であった。この時間の後に、試料を取り出し、細胞を遠
心分離により培養培地から分離した。生じた培養上澄み
を逆相ＨＰＬＣにより例１に記載と同様に分析した。第
１表は、培養上澄み中の得られた主要物質代謝生成物の
含分を示している。
【００４１】
【表１】
【００４２】ｐＨ５.５までの範囲で、類似の値が得ら
れた。
れた。
【図１】例１で取り出された試料の逆相ＨＰＬＣによる
分析結果を示す図
分析結果を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 390009003 Ｚｉｅｌｓｔａｔｔｓｔｒａβｅ 20，Ｄ −81379 Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｆ．Ｒ．Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 トビアス ダスラー ドイツ連邦共和国 ミュンヘン ヒマラヤ シュトラーセ 14 (72)発明者 アウグスト ベック ドイツ連邦共和国 ゲルテンドルフ リン デンシュトラーセ 10 Ｆターム(参考） 4B064 AE08 CA02 CC04 CC07 CC09 CC12
Claims (19)
- 【請求項１】 野生型から誘導され、野生型に比べて高
められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性及び
野生型に比べて増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−
流出性を有する微生物−菌株を発酵培地中で培養するこ
とによりＯ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造する
場合に、発酵培地中でｐＨ値を５.１〜６.５の範囲内に
調節することを特徴とする、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
を発酵法で製造する方法。 - 【請求項２】 発酵法による製造の間の発酵培地のｐＨ
値は、５.５〜６.５、特に有利に５.５〜６.０のｐＨ範
囲内にある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 野生型に比べて高められた内因性Ｏ−ア
セチル−Ｌ−セリン−形成性を低下されたフィードバッ
ク阻害を有するセリン−アセチル−トランスフェラーゼ
をコードするｃｙｓＥ−アレルにより達成させる、請求
項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 野生型に比べて高められたＯ−アセチル
−Ｌ−セリン−流出性をｙｄｅＤ−遺伝子により達成さ
せる、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項５】 微生物菌株はエセリキア・コリーであ
る、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 発酵槽中の微生物菌株を、連続的培養
法、回分培養法又は有利には流加培養法として培養す
る、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 栄養培地は、硫黄５〜５０ｍＭの濃度で
Ｓ−源を含有する、請求項１から６までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項８】 発酵法での製造の間に、Ｃ−源を連続的
に供給する、請求項１から７までのいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項９】 Ｃ−源を、糖、糖アルコール又は有機酸
の群から選択する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 Ｃ−源を、グルコール、ラクトース又
はグリセリンの群から選択する、請求項８又は９に記載
の方法。 - 【請求項１１】 Ｃ−源を、発酵の間にそれが０.１〜
５０ｇ／ｌの範囲内で存在するように供給する、請求項
８から１０までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｎ−源として、アンモニア、アンモニ
ウム塩又は蛋白質加水分解生成物を添加する、請求項１
から１１までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 発酵培地に、元素 リン、塩素、ナト
リウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、
鉄の塩及び微量の（即ちμＭ濃度の）元素モリブデン、
硼素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を添
加する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１４】 有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸
塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン
（例えばＢ１、Ｂ６）を発酵培地に添加する、請求項１
から１３までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、大豆粉又は麦芽エキスを発酵培地に添加する、請求
項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 インキュベーシヨン温度は１５〜４５
℃、有利に３０〜３７℃である、請求項１から１５まで
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 好気性成長条件下に実施する、請求項
１から１６までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 圧搾空気及び純粋酸素を用いて発酵槽
中に酸素を導入することにより好気性成長条件を製造す
る、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 １〜３日の発酵時間を選択する、請求
項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE10107002A DE10107002A1 (de) | 2001-02-15 | 2001-02-15 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| DE10107002.0 | 2001-02-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002262896A true JP2002262896A (ja) | 2002-09-17 |
| JP3721136B2 JP3721136B2 (ja) | 2005-11-30 |
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|---|---|---|---|
| JP2002035690A Expired - Fee Related JP3721136B2 (ja) | 2001-02-15 | 2002-02-13 | Ｏ−アセチル−ｌ−セリンを発酵法で製造する方法 |
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| EP (1) | EP1233067B1 (ja) |
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| CN (1) | CN1304585C (ja) |
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| WO2009104731A1 (ja) | 2008-02-21 | 2009-08-27 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
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| KR100995652B1 (ko) | 2003-08-28 | 2010-11-22 | 주식회사 종우실업 | 예압식 저형상 미세 수동 분사펌프 |
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102012216527A1 (de) | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| BR112021013271B1 (pt) * | 2019-01-11 | 2024-02-20 | Cj Cheiljedang Corporation | Método de preparação de intermediário de l-glufosinato e de lglufosinato |
| CN114075523A (zh) * | 2020-07-27 | 2022-02-22 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种产甘精胰岛素融合蛋白的重组大肠杆菌发酵培养方法 |
| FR3114740B1 (fr) * | 2020-10-07 | 2022-11-04 | Institut National De Rech Pour Lagriculture Lalimentation Et Lenvironnement | O-acétylsérine pour son utilisation dans la prévention et le traitement de l’intolérance au glucose et les maladies associées |
| WO2023094011A1 (de) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur herstellung von l-cysteinsäure |
| WO2023094010A1 (de) | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur herstellung von taurin |
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|---|---|---|---|---|
| DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
| DE19726083A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Consortium Elektrochem Ind | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
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| US6613552B1 (en) | 1999-01-29 | 2003-09-02 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Biocatalytic synthesis of shikimic acid |
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2001
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