KR101406110B1 - 흑생강 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 탁월한 황산화 활성 및 우수한 티로시나제 저해활성을 나타내고, 항염증 및 면역 활성합성과 관련된 NO생성을 저해함을 나타내는 바, 본 발명의 추출물은 피부노화 방지 및 미백개선 효과를 갖는 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

흑생강 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백 개선용 조성물{A Composition comprising an extract of Kaempferia parviflora as an active ingredient for preventing skin aging and improving skin whitening}

본 발명은 흑생강 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백 개선용 조성물에 관한 것이다.

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오늘날 현대 사회는 경제성장과 더불어 삶의 질적 향상은 건강 및 웰빙에 대한 기대감은 향상되고 있으며 인간의 평균 수명은 점차 증가하고 하고 있는 추세이다(1. Lee SE, Seong NS, Bang JK (2003) Antionxidative activities of Korean medicial plants, Korean J Medicinal crop Sci, 11, 127-134.). 그러나 수질 등 환경오염과 사회생활에 따른 다양한 스트레스 및 과영양화 또는 영양 편증으로 인해 인체 내외의 많은 요인들을 건강을 인체내외의 많은 요인들을 건강을 위협하는 요소가 되고 있어 건강에 대한 관심은 더 고조되고 있다(2. Kim JP, Chon IJ, Cho HK, Ham IH, Whang WK (2004) The antionxidant and the antidiabetic effects of extract from biofunctional foods prescription, Korea J. Pharmacogn, 35, 98-103.).식품의 대표적인 기능성으로 알려져 있는 항산화 활성은 생체내에서 DNA 손상, 암유발, 노화 등 다양한 질병의 원인과 관련성이 있는 유리자유기에 의한 손상을 방지함으로써 생체를 보호하는 중요한 기능성으로 주목받고 있다 (3. Dean RT, Giesing Davies MJ (1993) Reactive species and their accumlation on radical damaged proteins. Trends Biochem Sci 18, 437-441; 4. Jung SJ, Lee JH, Song HN, Seong NS, Lee SE, Beak NI (2004) Screening for antioxidant activity of plant medicinal extracts. J Korean Soc Appl biol chem, 47, 135-140). 생리활성의 유효물질은 대부분이 식물류에 함유되어 있는 것으로 밝혀 지고 있으며 인체에 대한 안전성과 효능이 확인된 식물의 경우에는 그 유효물질을 함유한 기능성 제품으로써 개발 속도도 매우 빠르게 진행되고 있다(5. Hwan EY, Kim DH, Kim HJ, Hwang JY, Park TS, Lee IS, Som JH (2011) Antioxidant activities and nitric oxide production of medicine plants in Gyeongsangbukdo (Carthamus tinctorius seed, Cyperus rotundus, Schizonepeta tenuifolia, polygonatum odoratum var. pluriflorum, paeonia lactiflora). J. Appl. Biol. Chem., 54, 171-177). 이러한 천연물질로부터 얻은 유효성분의 이용도를 높이고 간편하게 이용할 수 있도록 식물류로부터 유효물질의 추출증대를 위한 공정의 개발과 함께 이들을 이용한 음료, 캡슐, 정제 등의 건강지향적 식품의 선호도도 더욱 높아지고 있는 추세이다(6. Lim TS, Do JR, Kwon OJ, Kim HK (2007) Monitoring on extraction yields and functional poperties of onion(Allium cepa) extracts by using reponse surface methodology, J Korean Soc Food Sci Nutr, 36, 105-110).

흑생강(Kaempferia parviflora)은 초본성 뿌리 줄기 식물로, 채집 후 바로 자랐을 때 안쪽이 토양환경에 따라 보라색, 혹은 검은색을 뛴다. 흑생강은 통풍, 알레르기 및 위장 장애뿐 아니라 최음제의 치료에 사용하며 태국인삼으로 잘 알려져 있으며 생강과의 속한다. (7.Pengcharoen O (2002) Technology chao barn. Bangkok: Matichon Press. pp. 4243.) 흑생강은 특유의 향과 약간의 매운맛이 있으며, 동남아시아에서는 그것이 혓바늘과, 구강건조, 위장장애, 냉, 세균성 이질같은 질병의 치료를 위해 식품재료와 함께 민속약으로 사용되어지고 있다.(8. Saralamp P, Chuakul W, Temsirirkkul R, Clayton T (1996) Medicinal plants in Thailand (Vol. 1). Bangkok: Department of Pharmaceutical Botany, Mahidol University. p. 49.) 흑생강은 최근 항 위궤양(10. Rujjanawate C, Kanjanapothi D, Amornlerdpison D, Pojanagaroon S (2005) Antigastric ulcer effect of Kaempferia parviflora. J Ethnopharmacol, 102, 120122.) 및 바이러스 단백 분해 효소(11. Sookkongwaree K, Geitmann M, Roengsumran S, Petsom A, Danielson UH (2006) Inhibition of viral proteases by Zingiberaceae extracts and flavonoids isolated from Kaempferia parviflora. Pharmazie, 61, 717721.)를 가지고 있는 것으로 보고되었다.

한편 천연물의 항산화 활성은 재료의 처리조건 및 추출방법 등에 따라 유효물질의 함량이나 생리적 활성이 다르게 나타난다. 현재 생강에 대한 연구는 많이 있으나 흑생강에 대한 연구는 미비한 실정이다.

그러나 상기 문헌의 어디에도 흑생강 추출물의 피부노화 방지 및 미백 개선효과에 대한 언급 또는 개시된 바는 없다.

따라서 본 연구에서는 흑생강을 재료로 하여 열수추출, 에탄올 추출, 메탄올 추출을 통하여 얻어진 흑생강 추출물의 페놀류 함량과 항산화활성 및 NO 생성저해능을 비교하여 최적의 흑생강 추출 조건을 확인하고 상기 추출물들의 피부노화 방지 및 미백 개선효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백개선용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 또는 에탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

상기 추출물은 피부외용 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

예를 들어, 건조한 흑생강(Kaempferia parviflora) 시료 중량의 약 1 내지 100배(v/w), 바람직하게는 약 5 내지 30배(w/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 물 및 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 또는 에탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매를 가하여 10 내지 110℃, 바람직하게는 40 내지 80℃에서 1시간 내지 25시간, 바람직하게는 2시간 내지 12시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각추출으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

따라서 본원 발명은 하기 제조방법 및 상기 제조방법으로 수득된 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 미백개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 미백 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 흑생강(Kaempferia parviflora) 추출물은 탁월한 황산화 활성 및 우수한 티로시나제 저해활성을 나타내고, 항염증 및 면역 활성합성과 관련된 NO생성을 저해함을 나타내는 바, 본 발명의 추출물은 피부노화 방지 및 미백개선 효과를 갖는 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 추출물의 Superoxide radical 소거 활성을 나타낸 도이며(서로 상이한 글자 수치는 유의성있게 상이함; p<0.05);
도 2은 본 발명의 추출물의 티로시나제 효소 억제활성을 나타낸 도이며(서로 상이한 글자 수치는 유의성있게 상이함; p<0.05);
도 3은 본 발명의 추출물의RAW 264.7 세포에서의 NO 생성저해능을 나타낸 도이다(통계적 유의성,*p < 0.05; **p < 0.01).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흑생강 추출물의 제조

흑생강(Kaempferia parviflora) 20g에 중량대비 20배의 50% Et-OH, 50% Me-OH, 80% Et-OH, 80% Me-OH, 및 H2O를 가해 60℃에서 4시간 동안 환류 냉각(CA-1112 Eyela., Japan) 추출하고 에탄올 증발을 최소화하였다. 추출물을 여과지(Filter paper; Whatman No2, Maidstone. England)로 여과 후 감압농축기(Rotary vaccum evaporator; Model N -1N, Eyela Co., Japan)로 최대한 감압농축한 후에, 동결건조(Labconcon Co., USA)한 흑생강 50% Et-OH 추출물 (이하, KP50E라 함), 50% Me-OH 추출물 (이하, KP50M라 함), 80% Et-OH 추출물 (이하, KP80E라 함), 80% Me-OH 추출물 (이하, KP80M라 함), 및 물 추출물 (이하, KPW라 함)을 각각 수득하고 -70℃이하의 암소에 보관하면서 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실험예 1. 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드함량 측정

상기 실시예 추출물들의 총 폴리페놀함량 및 총플라보노이드 함량을 측정하기 위하여 문헌에 기재된 방법들에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다. (Folin-Denis법; Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total phenolics with phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Viticult 16:144-158, Davis법 ; Davis WB. 1947. Determination of avonones in citrus fruits. Anal Chem 19:476)

1.1. 총폴리페놀 함량 측정

추출조건에 따른 실시예 추출액 0.5 mL에 2 N Folin-ciocalteau reagent(47641, Sigma-aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음에 8.4 mL의 멸균 증류수를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후에 20% Na₂CO₃ (S7795, Sigma-aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 첨가하고 실온에서 1시간 반응 시키고 분관기(spectrophotometer; Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Sweden)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 총 폴리페놀 함량은 탄닌산 (tannic acid; 16201, Sigma, St, Louis, MO, USA)를 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

1.2. 총플라보이드 함량 측정

총 플라보노이드함량 측정은 Davis법에 따라 추출액 100 uL에 1 mL diethyl glycol을 혼합하여 실온에서 5분간 반응 시킨 후에 1N NaOH 100 μL와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응 시킨 후 420 nm에서 분광기(spectrophotometer; Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Sweden)로 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 루틴(Rutin; Sigma, St, Louis, MO, USA)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

폴리페놀 화합물은 식물계에서 널리분포하는 2차 대사산물로서 caffeic acid, chlorogenic, ferulic acid, p-coumalic acid, syringic acid, canilic acid 등이 있으며, phenolic hydroxyl그룹 때문에 단백질 또는 효소 단백질, 기타 거대분자들과 결합하는 성질이 있다. 항암뿐 아니라, 항고혈압, 항염증, 항산화 및 항노화 등 여러 생리활성을 갖고 있다.

1.3. 실험 결과

조건별 흑생강 추출물의 총폴리페놀, 총플라보노이드의 함량은 표 1과 같다.

추출물에 따른 폴리페놀 함량은 72.89~135.39 mg/mL 범위를 나타냈다, 50% 에탄올에서 135.39mg/mL로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 50% 메탄올에서 129.14mg/mL의 함량보다 더높은 함량을 보여줬다. 80% 에탄올, 80% 메탄올, 열수 추출물의 순으로 폴리페놀 함량을 나타냈다. 추출물에 따른 플라보노이드 함량은 41.63~58.94 mg/mL 범위를 나타냈다. 50% 에탄올에서 58.94mg/mL로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 50% 메탄올에서 57.91mg/mL의 함량보다 더높은 함량을 보여줬다. 80% 에탄올, 80% 메탄올, 열수 추출물의 순으로 플라보노이드 함량을 나타냈다. 식물체로부터 추출조건을 달리한 추출물 중 페놀성 화합물의 함량은 물, 50% 에탄올 및 75% 에탄올 추출물 중 50% 에탄올 추출물에서 가장 높았다고 보고되어 있다(11. Sookkongwaree K, Geitmann M, Roengsumran S, Petsom A, Danielson UH (2006) Inhibition of viral proteases by Zingiberaceae extracts and flavonoids isolated from Kaempferia parviflora. Pharmazie, 61, 717721.). 홍삼 및 홍국 발효홍삼 추출물의 페놀 함량을 측정한 결과 70% 에탄올, 70% 메탄올, 열수추출물 순으로 보고되었다.(12.Na GM, Han HS, Ye SH, Kim HK (2004) Physiological activity of medicinal plant extracts. Korean J Food Preserv, 11, 388-393). 두릅순의 경우도 총폴리페놀 화합물이 열수 추출물보다는 70% 에탄올 및 70% 메탄올 추출물에서 높은 함량을 보여 본 실험 결과와 일치하는 경향을 보였다. (13. Park JC, Cha JY, Lee CH, Doh ES, Kang IH, Cho YS (2009) Biological Activities and chemical characteristics of Monascus-Fermented Koera Red Ginseng, J Life Sci, 11, 1553-1561.) 따라서 조건별 흑생강 추출물은 50% 에탄올 추출 조건이 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량이 우수함을 보였다.

흑생강 추출물중 폴리페놀 및 플라보이드 함량

Sample	Polyphenol(mg/ml)	Flavonoid(mg/ml)
Hot-water	72.89±7.24	41.63±2.14
50% Ethanol	135.39±2.52	58.94±1.30
80% Ethanol	122.06±1.87	57.22±1.70
50% Methanol	129.14±1.57	57.97±1.94
80% Methanol	98.93±3.30	50.02±2.09

참고예 1. 실험 준비

1-1. 시약 및 기기

(1) 실험에 사용된 시약

항산화 관련 실험에는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma chemical Co., USA), pyrogallol (Sigma chemical Co., USA), xanthine (Sigma chemical Co., USA), xanthine oxidase (Sigma chemical Co., USA), 등을 사용하였다. 미백활성실험에는 mushroom tyrosinase (Sigma chemical Co., USA), L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine (L-DOPA, Sigma chemical Co., USA), ascorbic acid (Sigma chemical Co., USA) 등을 사용하였다.

그 외의 기타 시약은 일급시약을 사용하였다.

(2) 실험에 사용된 기기

본 실험에 사용된 기기 및 기구는 다음과 같다. UV/vis spectrophotometer (Hitachi 200-10, Japan), microscope (Olympus, Japan) high performance liquid chromatography (HPLC, Shimadzu CBM-20A, Japan), ELISA reader (Bio rad, Co., Japan), pH meter (Metrohm. Switzerland), B.O.D incubator (Hanbaek Co., Korea), autoclave (Hanbaek Scientific Co., Korea)등을 사용하였다.

1-2. 통계 처리

통계처리는 SPSS 12.0 package로 통계처리 하였으며, 각 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.

실험예 2. 항산화 효과 측정

2-1. 전자공여능 측정

상기 실시예에서 얻는 시료들의 전자공여능 활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(Son JY, Kim TO. 2011. Antioxidative and physiological activities of traditional korean teas. Korean J Food Cookery Sci 27(5): 567-575).

전자공여능 (EDA: electron donating abilities)은 다음과 같이 측정하였다. 즉, 추출물 1 mL에 4×10^-4 M 1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액(99.9% ethyl alcohol에 용해) 1 mL을 가하여 총액의 부피가 2 mL가 되도록 하였다. 이 반응액을 약 10초간 혼합하고 실온에서 30분간 방치한 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Amersham Co., Sweden)를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여효과는 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 백분율로 나타내었다.(수학식 1 참조)

전자공여능은 활성 라디칼에 전자를 공여하고 식품 중의 지방질 산화를 억제하는 목적으로 사용되고 있다. 인체 내에서는 활성 라디칼에 의한 노화를 억제시키는 작용으로 이용 되어있다 (14). 전자공여능은 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화활성을 측정하는데, 이러한 방법은 식물추출물의 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 실제 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있다(15,Koh YJ, Cha DS, Choi HD, Park YK, Choi IW (2008) Hot water extraction optimization of Dandelion leaves to increase antioxidant activity. Korean J Food Sci Technol, 40, 283-289; 16. Blois MS (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature, 26, 1199-1204; 17. Cha JY, Cho YS (1999) Effect of potato polyphenolics on lipid peroxidation in rats. J Korean Soc Food Sci Nutr, 28, 1131-1136.).

조건별 흑생강 추출물의 전자공여능 측정 결과는 표 2에 나타내었다. 흑생강 추출물의 농도별 전자공여능 측정 결과는 표 2에 나타내었다. 50%에탄올 100μg/mL 농도의 전자공여능은 22.93%이었으며, 추출물의 농도가 증가할수록 전자공여능도 증가하여 1000μg/mL 농도에서는 57.62%를 나타내었다. 50% 메탄올 100μg/mL 농도의 전자공여능은 20.19%이었으며, 1000μg/mL농도에서는 56.68%를 나타내었다. 열수추출물, 80% 에탄올, 80% 메탄올는 1000μg/mL농도에서 각각 40.66, 47.72, 43.78%로 활성을 보여 활성의 차이가 크지 않았다. 이와 같이 흑생강 추출시 농도가 증가함에 따라 소거활성도 농도의존적으로 증가하고 있음을 알 수 있다. 대부분의 식물유래의 항산화능을 갖는 물질들은 phenol류 및 flavonoid계통의 화합물로 보고되어 있으며, 특히 식물계에는 대부분 phenol류의 화합물로 밝혀져 있다(18). 따라서 본 실험에서는 phenol류의 화합물이 흑생강 추출물에 포함되어 있다고 생각된다.

흑생강 추출물의 전자공여능 효과

Sample	Electron donating ability (%)
	100 (μg/mL)	250 (μg/mL)	500 (μg/mL)	1000 (μg/mL)
Hot water	17.38±0.13	22.28±0.87	28.70±0.18	40.66±1.16
50% Ethanol	22.93±0.98	35.22±0.71	47.87±1.19	57.62±0.80
80% Ethanol	16.20±0.53	24.26±1.25	34.55±0.98	47.72±0.75
50% Methanol	20.19±0.80	30.34±0.21	47.25±0.47	56.68±0.55
80% Methanol	14.17±0.46	16.79±2.03	33.37±0.44	43.78±0.44
Ascorbic acid	69.94±2.15	95.25±0.03	95.342±0.03	95.408±0.05
The values are means±SD of three experimental data. a-c Means with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05.

2-2. Superoxide radical 소거활성 측정

상기 실시예에서 얻는 시료들의 Superoxide radical 소거활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(Nishikimi M, Rao NA, Yagi K. 1972. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun, 46: 849-854).

희석한 시료 20 μL에 62 μM nitro blue tetrazolium (NBT) 와 98 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)를 함유한 20 mM Tris 용액 (pH 8.0) 800 μL를 혼합한 다음, 20 mM Tris 용액 80 μL와 33 μM phenazine methosulfate(PMS) 100 μL를 각각 첨가하였다. 즉, 비효소적으로 PMS/NADH로 유발된 superoxide radical은 formazan을 측정하기 위해 560 nm에서 10분 동안 반응물의 흡광도를 측정하였고 하시 수학식 2에 따라 계산하였다.

비효소적인 방법인 PMS/NADH로 유발된 superoxide radical 생성계인 경우 NBT는 자주색의 formazan으로 환원된다. 시료 내 Superoxide radical 소거 활성이 존재하는 경우, 시료첨가에 의해 Formazan의 생성이 억제되며 흡광도가 감소하게 된다(Rhim TJ, Jeong HS, Kim YJ, Kim DY, Han YJ, Kwon HY, Kwon KR (2009) A study on the comparison of antioxidant effects among cultivated ginseng, and cultivated wild ginseng extracts. -Using the measurement of superoxide and hydroxy radical scavenging activities. Journal Korean Institute Pharmacopuncture, 12, 7-12.).

흑생강 추출물의 농도별 Superoxide radical 소거 활성 측정 결과는 도 1(= Fig 1)에 나타내었다. 열수추출물의 Superoxide radical 소거활성은 14.21~36.66%이며, 50%에탄올추출물은 26.74~56.46%, 80%에탄올 추출물은 18.89~43.68%, 50% 메탄올 추출물은 24.01~54.18%, 80% 메탄올 추출물은 17.30~39.99%를 나타내었다. 추출물의 농도가 증가하면 할수록 Superoxide radical 소거활성도 점점 증가하고 있음을 알수 있다. 이와 같은 결과는 DPPH radical 소거 활성과 비슷한 양상을 보였으며, 폴리페놀 함량의 차이에 따라 항산화능이 높아지는 것이라고 생각될 수 있다.

2-3. ORAC ( Oxygen Radical Absorbancity Capacity ) 측정

상기 실시예에서 얻는 시료들의 ORAC (Oxygen Radical Absorbancity Capacity) 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(Talcott ST, Lee JH. 2002. Ellagic acid and flavonoid antioxidant content of mascadine wine and juice. J Agri Food Chem 50: 3186-3192)

본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시료의 제조에는 중성 phosphate buffer(61.6:38.9 v/v, 0.75 M K₂HPO₄ and 0.75 M NaH₂PO₄)를 사용하였다. 검량 곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성 비교 표준액으로 Trolox (Water soluble analogue of vitamin E, 6-hydroxy- 2,5,7,8-tetramethlychroman-2-carboxylic acid, Aldrich Chem, Inc., USA)를 인산완충액을 가해 각각 0.0, 1.65, 3.125, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 μM 농도로 희석하고 fluorescent stock (Sigma, St, Louis, MO, USA) 10 μL를 phosphate buffer 50 mL에 용해하여 제조하였고 측정기기는 fluorescent microplate reader (Infinite M200 PRO, Tecan Co., Austria)를 사용하여 485 nm에서 전자가 여기되고 538 nm에서 방출되게 조절하여 본 실험에 적용되었다.

ORAC Assay는 식물성 소재의 추출물, 순수 정제물 및 복합물에 대한 항산화능을 평가하기 위해 폭넓게 활용되고 있는 방법이다. AUC를 측정함으로써, 자유라디칼(Free radical) 손상에 대한 억제 시간과 억제율을 모두 반영하는 항산화능 측정 방법이다(20. Alarcon E, Campos AM, Edwards AM, Lissi E, Lopez-Alarcon C (2008) Antioxidant capacity of herbal infusions and tea extracts: A comparison of ORAC-fluorescein and ORAC-pyrogallol red methodologies. Food Chem, 107, 1114-1119. 21.Gang HM, Park HS, Kwon KR, Rhim TJ (2007) A study on the comparison of antioxidant effects between hot pepper extract and capsaicin. J Korean Institute Pharmacopuncture, 11, 109-118). AAPH(2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride)에 의해 생성된 자유라디칼에 대한 항산화 물질의 소거 능력, 즉 radical chain breaking antioxidant capacity를 측정함으로써 식품내에 존재하는 hydrophobic 성분과 hydrophilic 성분 모두에 반응하기 때문에 응용범위가 넓은 장점을 가지고 있다(Prior RL, Hoang H, Gu L, Wu X, Bacchiocca M, Howard L, Hampsch-Woodill M, Huang D, Ou B, Jacorb R, (2003) Assays for hydrophlic and lipophilic antioxidant capacity oxygen radical absorbance capacity (ORAC) of plasma and other biological and food samples. J Agri Food Chem, 51, 3273-3279).

흑생강 추출물의 ORAC 측정결과는 표 3에 나타내었다. 흑생강 추출물 100μg/mL ORAC는 모두 항산화 활성을 나타내었다. 열수추출물이 371.89μM TE/g, 50% 에탄올추출물이 715.23μM TE/g, 80%에탄올추출물이 626.49μM TE/g, 50% 메탄올추출물이 691.34μM TE/g, 80% 메탄올추출물이 484.02μM TE/g를 나타내었다. 50% 에탄올 추출물 투여군에서 보다 높은 항산화 활성을 나타내었으며 이와 같은 결과는 DPPH radical 소거 활성과 비슷한 양상을 보였다.

흑생강 추출물의 ORAC (oxygen radical absorbance capacity) 효과

ORAC (μmoles TE/g)
Hot water	50% Ethanol	80% Ethanol	50% Methanol	80% Methanol
371.89±93.17	715.23±60.01	626.49±89.78	691.34±87.78	483.02±80.36

실험예 3. 미백 효과 측정

상기 실시예에서 얻는 시료들의 티로시나제(Tyrosinase) 저해 활성 측정을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.( Yagi A, Kanbara T, Morinobu N. The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Planta Medica . 1986;3981:517-9.).

티로시나제(Tyrosinase)은 0.175M phosphate buffer용액 20μL, 5mM L-DOPA용액 20μL 및 시료 50μL, mushroom tyrosinase(Tyrosinase from mushroom, ≥2000, untis/mg solid, EC 1.14.18.1, Sigma, USA, 100 untis/mL) 10μL를 첨가하여 37℃에서 3분간 반응시킨후 475nm에서 흡광도를 측정하였고 아래 수학식 3으로 계산하였다.

Tyrosinase는 tyrosine으로부터 3,4-dihydroxyphenylalanine과 DOPA-quinone을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 melanin색소 생성에 관계하는 효소로써 야채나 과실류 특히 감자의 갈변현상과 피부에 암갈색의 색소 물질을 침착 시키는 원인이 되기도 한다(Cho YJ, An BJ, Kim JH (2011) Application of Isolated Tyrosinase Inhibitory Compounds from Persimmon Leaves. J Life SCi, 21, 976-984).

흑생강 추출물의 티로시나제(Tyrosinase) 측정 결과는 도 2(= Fig 2)에 나타내었다. 열수 추출물은 33.60~38.73%, 50% 에탄올 추출물은 39.12~52.40%, 80% 에탄올 추출물은 37.39~41.54%, 50% 메탄올 추출물은 37.48~46.91%, 80% 메탄올 추출물은 32.11~43.06%를 나타내었다. 추출물의 농도가 높아질수록 티로시나제 저해 활성이 높아짐을 알 수 있다.

실험예 4. NO(Nitric oxide)저해 활성 측정

상기 실시예에서 얻는 시료들의 NO(Nitric oxide)저해 활성 측정을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(Chung HT, Pae HO, Choi BM, Billiar TR, Kim YM (2001) Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis. Biochem. Biophys. Res Commun, 282, 1075-1079).

Raw 264.7 세포(Korean Cell Line Bank; 한국세포주은행)로부터 생성되는 Nitric oxide의 양을 Griess시약 (03553, Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 다음과 같이 측정한다. 96 well plate에 2 X 10 cell/well로 각각 100μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO Incubator에서 24시간 배양하였다. 배양한 후 다양한 농도의 흑생강 추출물 및 LPS(1μg/mL) 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 상등액 50μL에 동량의 Griess시약을 혼합하여 10시간 암반응 시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

Nitric Oxide (NO)는 free radical인 활성질소종(reactive nitrogen species ; RNS)의 일종으로 NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine이 citrulline으로 산화될 때 발생되는 반응성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 정상적인 농도로 존재하는 NO실혈관계와 신경계 및 면역계의 전달물질로서 신경전달물질의 운반하거나 종양을 억제하는 작용, 감염성 병원체에 대한 억제 등 매우 다양한 기능을 가지는 물질로 알려져 있다. 그러나 과도하게 발현된 NO는 독성 radical로 작용하여 인체에 유해한 영향을 준다(Hibbs JB, Taintor RR, Vavrin Z (1987) Macrophage cytotoxicity role for L-arginine deaminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. Science, 235, 473-476). 이와 같은 NO를 임의적으로 다량 생성시키기 위해 사용되는 LPS(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 독소로써 NO의 생성 억제나 소거 활성에 대한 검토는 필수적으로 수행되어 지고 있다(26. Chung HT, Pae HO, Choi BM, Billiar TR, Kim YM (2001) Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis. Biochem. Biophys. Res Commun, 282, 1075-1079).

NO 저해 활성은 Raw 264.7세포의 배양액 중에 NO의 함량을 측정하는 것으로 NO는 L-arginine에 NO Synthetase가 작용하여 생성되며, 생성된 NO는 암세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다(27. Kang TB, Yoon TJ (2011) Effect of herbal composition on alcohol degradation and anti-inflammatory activity in mice. Korean J Food Nutr, 24, 489-495).

LPS를 유발하여 NO의 저해 활성을 측정하였다. 흑생강 추출물의 NO저해 활성에 대한 측정결과는 도 3 (=Fig 3)에 나타내었다. 흑생강 추출물의 NO 저해활성결과, 흑생강 50% 에탄올 추출물은 100.3%로 가장 높은 저해효과를 나타내었다. NO 저해 활성은 시료의 첨가농도가 증가함에 따라 높아짐을 알 수 있었다, 이러한 결과로부터 흑생강 추출물이 NO생성을 저해하여 항염증 및 면역 활성에 도움이 될 것이라고 생각된다.

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (5)

1. 건조한 흑생강(Kaempferia parviflora) 시료 중량의 5 내지 30배(w/w)의 40 내지 60%(w/w)의 물 및 에탄올의 혼합용매를 가하여 40 내지 80℃에서 2시간 내지 12시간동안 환류냉각추출법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하여 수득되는 흑생강(Kaempferia parviflora) 40 내지 60%(w/w)의 물 및 에탄올의 혼합용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백개선용 피부외용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 건조한 흑생강(Kaempferia parviflora) 시료 중량의 5 내지 30배(w/w)의 40 내지 60%(w/w)의 물 및 에탄올의 혼합용매를 가하여 40 내지 80℃에서 2시간 내지 12시간동안 환류냉각추출법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하여 수득되는 흑생강(Kaempferia parviflora) 40 내지 60%(w/w)의 물 및 에탄올의 혼합용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백개선용 화장료 조성물.
   
5. 삭제

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