KR101400346B1 - ＮｅｃｒｏＸ를 함유하는 암 전이 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 NecroX는 Rac1과 Cdc42 활성화를 억제시키거나, 세포내 칼슘 농도를 감소시킴으로서, 암의 조직내 침투 능력을 감소시켜 암 전이를 억제하는 것으로, 상기 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물은 암 전이 억제용 약학 조성물 또는 식품 조성물로 활용할 수 있다.

Description

ＮｅｃｒｏＸ를 함유하는 암 전이 억제용 조성물{Composition for suppression of cancer metastasis containing NecroX}

본 발명의 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

암 전이는 원발성 암에서 암 세포가 타 장기로 퍼져 새로운 암을 형성하는 것이다. 전이는 다양한 암 환자에서 목숨을 위협하는 주요 현상이기에 전이를 예방하거나 조절하는 것은 암 연구분야의 중요 목표이다. 전이가 되지 않은 초기에 진단이 된 경우에는 수술, 항암치료, 또는 방사선 치료가 효과적이나 진단시에 전이가 되어 있는 경우에는 이들 치료의 효과는 감소된다. 이뿐 아니라 진단시 전이를 확인하지 못하였으나 전이가 치료 중이나 후에 확인되는 경우도 종종 있다. 임상적으로 암의 전이의 중요성이 높지만 전이 과정은 아직 완벽히 이해되고 있지 못한 상태이다.

전이는 침투 (invasion), 혈관내 유입 (intravasation), 멈춤 (arrest), 혈관외 배출 (extravasation), 그리고, 집락화 (colonization) 등의 연속적인 단계로 구성되어 있으며 이 과정을 통하여 원발성 장기에서 시작하여 최종적으로 다른 장기에 암을 형성하게 된다. 첫 번째 단계인 침투는 전이의 시작 단계로 암 세포의 세포간 또는 세포외 기질과의 상호작용 변화, 주변 조직의 분해, 그리고 조직내로의 암 세포의 이동 등을 포함한다. 두 번째 단계인 혈관내 유입은 암 세포가 혈관이나 림프관의 내피세포를 통과하여 전신적인 순환에 포함되는 것이다. 유입된 암 세포 중 극히 일부분만이 순환과정에서 살아남는 것으로 확인되고 있다. 살아 남은 일부분의 암 세포는 다른 부위의 모세관 내피세포를 투과하는 혈관외 배출에 성공하고 새로운 환경에 적응하여 증식하여 전이 암을 형성한다.

상피 중배엽 이행 (Epithelial-Mesenchymal Transsition, EMT)의 개념은 조직 수복과정에 있어 상피세포의 변화능력으로부터 유래되었다. 전이성 암 세포에서 관찰되는 중배엽성 세포 표지의 발현 증가가 관찰됨에 따라 EMT 개념은 암의 전이에 있어도 중요한 개념으로 인지되고 있다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물을 제공하고자 한다.

한편, 본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 약학 조성물 및 식품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 NecroX는 NecroX-1, NecroX-2, NecroX-5, NecroX-7, 및 NecroX-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 NecroX는 암의 조직내 침투 능력을 감소시킴으로 암 전이를 억제할 수 있다.

상기 암의 조직내 침투 능력의 억제는 Cdc42나 Rac1 발현을 억제하거나, 세포내 칼슘 농도를 감소시킴으로서 이루어질수 있다.

상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 결장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 혈액암, 두경부암, 악성흑색종 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 NecroX는 Cdc42나 Rac1의 활성화를 억제하거나, 세포내 칼슘농도를 감소시켜 암의 전이 능력을 감소시키므로, 본 발명의 조성물을 암 전이 억제용 약학 조성물 및 암 전이 억제용 식품 조성물로 활용가능할 것이다.

도 1은 생체 내 NecroX-5의 항암 효과에 관한 것으로, 도 1A는 암 성장곡선을 나타낸 것이고, 도 1B는 쥐의 생존 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 생체외 증식을 분석한 것으로, TUBO-P2J 세포 (1 x 10³ cells/well) (도 2A), 4T1 세포 (1 x 10³ cells/well) (도 2B)를 96 well 세포배양기에 접종하고 다양한 농도의 NecroX를 처리하여 세포의 증식을 확인한 것이다.
도 3은 생체외 이동을 분석한 것으로, TUBO-P2J 세포 (1 x 10⁵ cells/well) (도 3A), 4T1 세포 (1 x 10⁵ cells/well) (도 3B)를 transwell insert의 상층부에 접종하고 다양한 농도의 NecroX를 처리하여 transwell을 통과한 세포를 회수하여 세포수를 측정하여 이동 정도를 분석한 것이다.
도 4는 생체외 침투를 분석한 것으로, TUBO-P2J 세포 (1 x 10⁵ cells/well) (도 4A), 4T1 세포 (1 x 10⁵ cells/well) (도 4B)을 2 mg/ml 마트리겔로 코팅된 transwell inserts의 상층부에 접종하고 다양한 농도의 NecroX로 처리하여 세포외 기질은 마트리겔을 분해하고 아래 챔버로 이동한 세포수를 확인한 것이다.
도 5는 NecroX-5가 Rac-1, Cdc-42, 그리고 RhoA의 발현과 활성화에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 6은 NecroX-5가 종양 세포내 칼슘농도에 미치는 영향을 확인한 것이다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물 및 이를 이용한 암 전이 억제용 약학 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 NecroX 는 하기 화학식 1과 같이, 인돌 구조를 가진 화합물로 멜라토닌과 같은 항산화 활성을 가지며 특히 미토콘드리아 ROS (reactive oxygen species)와 RNS (reactive nitrogen species)를 제거하는 작용기전을 가지고 있다.

[화학식 1]

상기 NecroX는 암의 조직내 침투 능력을 감소시킴으로 암 전이를 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 NecroX는 암 증식을 억제하며, 암 세포의 전이에 의한 사망을 지연시킬 수 있다.

상기 NecroX는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 NecroX-1, NecroX-2, NecroX-5, NecroX-7, 및 NecroX-18로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 암의 조직내 침투 능력의 억제는 Cdc42나 Rac1의 활성화를 억제하거나 세포내 칼슘농도를 감소시킴으로 이루어질 수 있다.

NecroX가 조직 침투 능력을 감소시키는 것을 기반으로 세포의 이동에 작용하는 단백질인 Rac1, Cdc42, 그리고 RhoA의 활성 변화를 확인하니 Rac1과 Cdc42의 활성을 감소시켰으며, 또한 세포의 이동에 중요한 이온인 칼슘의 세포내 농도를 감소시켜 암 세포의 조직내 침투능력을 억제할 수 있다.

일 실시예에 따르면, RhoA/Rac1/Cdc42 활성화를 측정한 결과 활성화되어 있던 Rac1과 Cdc42가 NecroX 처리 1시간 후에 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.

세포이동에 필수적인 칼슘의 세포내 농도를 Fluo-4AM으로 측정하니 NecroX 처리 후부터 세포내 칼슘 농도가 감소하기 시작하여 20분 경과후 처리전에 비하여 50% 정도로 감소하였음을 확인할 수 있었다.

상기 암은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니며, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 결장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 혈액암, 두경부암, 악성흑색종 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 유방암일 수 있으나, 이에 한정하는 것이 아니다.

일례로, 유방암 조직에서 분리된 TUBO 세포주의 변형 세포주로써 피부에 이식하면 자연적으로 폐로 전이되는 전이성 세포주인 TUBO-P2J 세포와, 전이성이 강한 유방암 세포주로써 피부에 이식하면 뇌, 간, 폐, 등으로 전이가 일어나는 4T1 세포에서 NecroX-5는 암 세포의 조직 침투 능력을 억제할 수 있으며, 암세포의 전이에 의한 사망을 지연시킬 수 있다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 약학 조성물은 인간 등을 포함한 포유동물에게 섭취하게 함으로써 암 전이를 예방할 수 있고, 이미 발생한 암의 전이를 억제할 수 있다.

본 발명의 NecroX는, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA).

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 일례로, 경구, 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 암 전이 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법 등과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 NecroX를 함유하는 암 전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 NecroX를 첨가할 수 있는 식품으로는, 일례로 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

식품 또는 음료 중의 상기 NecroX의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.01 내지 50g의 비율로 가할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 NecroX를 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

상기 식품 조성물에는 인간이 섭취하는 식품뿐 아니라, 동물의 사료 조성물을 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물은 인간, 가금류, 가축 등에게 섭취하게 함으로써 암 전이를 예방할 수 있고, 이미 발생한 암의 전이를 억제할 수 있다.

상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.

본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 마우스, 암 세포주 및 NecroX 준비

마우스는 5-6주령 암컷 Balb/c 마우스를 오리엔트바이오에서 구입하여 사용하였다. 구입한 마우스는 온도 20-25℃, 습도 60%, 조도 200-300 Lux 의 실내 환경에서 고형사료와 물을 충분히 공급하여 1 주일간 순화를 진행하였다. TUBO-P2J 세포주는 인제의대 미생물학 교실에서 분양받아 사용하였다. TUBO-P2J 세포는 HER2/neu가 과 발현된 Balb/c 마우스에서 자연적으로 발생한 유방암 조직에서 분리된 TUBO 세포주의 변형 세포주로, 피부에 이식하면 자연적으로 폐로 전이되는 전이성 세포주이다. 4T1 세포는 전이성이 강한 유방암 세포주로, 피부에 이식하면 뇌, 간, 폐 등으로 전이가 일어나며, 전이성 유방암 실험에 일반적으로 이용된다.

세포의 배양은 5% CO₂ 배양기에서 10% 열에 불활성화된 소태아혈청 (heat-inactivated fetal bovine serum, Sigma), 10% NCTC 109 배지, 2 mmol/l L-글루타민, 0.1 mmol/l MEM 비필수 아미노산, 100 units/ml 페니실린, 및 100 mg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 하였다. NecroX-5는 LG 생명과학(서울, 대한민국)에서 합성된 것을 구매하여 사용하였다.

실시예 2: NecroX -5가 암 증식 및 전이에 미치는 영향

NecroX-5의 항-암 효과를 확인하기 위하여 전이성 유방암 세포주인 TUBO-P2J를 마우스의 등에 피하로 주사하여 암을 형성하였다. 암이 형성된 후 전이가 시작되는 11일째에 NecroX-5를 50 ㎍과 500 ㎍을 복강으로 각각 주사하였다. NecroX-5의 처치는 3일간 지속하였으며 15일째에 원발성 암을 제거하였다. 암의 크기는 NecroX-5의 처치 때부터 수술 전까지 시행하였으며, 수술 후 전이에 의한 마우스 사망을 관찰하였다.

도 1에서 나타난 바와 같이, 암의 증식은 NecroX-5의 처치에 따라 약간의 감소가 있었으나 통계학적 유의성은 없었다 (도 1A). TUBO-P2J의 폐 전이에 의한 마우스의 사망을 확인한 결과 대조군은 암 이식 50일 이내에 모두 사망하였으나 50 ㎍ 처치 군은 60일, 500 ㎍ 처치군은 62일에 모두 사망하였다 (도 1B). 평균 생존일 (Median survivals)은 대조군이 40.5일, 50 ㎍ 처치 군은 40일, 500 ㎍ 처치군은 54 일이었다. NecroX-5는 암의 증식에는 크게 영향을 미치지는 않았으나 마우스의 생존을 연장하는 효과를 보여 주었다 (p = 0.0399).

실시예 3: NecroX -5가 암 세포 증식에 미치는 영향

NecroX-5의 전이 예방 효과의 기전을 확인하기 위하여 먼저 암 세포의 증식에 미치는 효과를 in vitro 증식분석 (proliferation assay)으로 분석하였다.

암 세포의 증식 정도는 흡광도로 측정이 가능한 2-(4-아이오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸리엄 모노소디엄 살트 [2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (WST-1)] 용액(Roche, USA)을 사용하여 측정하였다. TUBO-P2J, 4T1 세포를 96 well 세포 배양기에 well 당 2 x 10³ 세포를 분주하고 세포가 바닥에 부착하도록 6시간을 배양하였다. 다양한 농도의 NecroX-5를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. WST-1 용액을 20 ㎕를 첨가한 후 1시간 동안 정치하여 발색하였다. 흡광도 측정은 마이크로플레이트 리더 (microplate reader, EL800, Bio-Tek. USA)을 사용하여 450 nm 파장에서 실시하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 96 well 세포 배양기에 TUBO-P2J, 4T1 세포를 접종하고 세포가 부착되도록 한 다음 NecroX-5를 첨가하여 세포의 증식을 확인한 결과, NecroX-5에 의해 세포의 증식의 일부 억제는 관찰되었으나 10 μM 이상에서 90%의 세포 증식을 확인할 수 있어 전이 억제가 세포 증식에 의한 것만은 아님을 확인할 수 있었다.

실시예 4: NecroX -5가 암 세포 이동에 미치는 영향

암 세포의 이동능력은 8.0 ㎛ 크기의 구멍으로 구성된 transwell용 24 well insert system (BD Falcon)을 사용하였다. TUBO P2J, 4T1 세포를 1 x 10⁵ 으로 insert의 위에 접종한 후 세포 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 후 insert의 아래로 통과된 세포는 트립신 (trypsin)을 처리하여 회수한 후 세포수를 측정하였다.

NecroX-5가 암 세포의 이동 능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 8 ㎛ 크기의 포어 (pore)를 가진 transwell insert의 상층부에 TUBO-P2J, 4T1 세포를 1 x 10⁵ 으로 접종하고 NecroX-5를 농도별로 처리하였다. 48 시간 동안 transwell을 통과한 세포를 회수하여 세포수를 측정하여 이동 정도를 분석하였다 (도 3).

도 3에 나타난 바와 같이, TUBO-P2J 세포의 경우 48시간 대조군에서 이동한 세포 수는 1.2 ±0.3 x 10⁵ 이였으며, NecroX-5가 처리된 군의 이동 세포수는 0.76 x 10⁵에서 0.53 x 10⁵으로 확인되었다. 4T1 세포의 경우 48시간 대조군에서 이동한 세포 수는 1.0 ± 0.3 x 10⁵ 이였으며, NecroX-5가 처리된 군의 이동 세포수는 0.9 x 10⁵에서 0.43 x 10⁵으로 확인되었다. TUBO-P2J 세포에서 NecroX-5 처리 시 0.25 μM이상 농도에서 세포의 이동이 감소되었으며, 4T1 세포에서 NecroX-5 처리 2.5 μM 이상에서는 세포의 이동이 감소되었으며, 1 μM 이하에서는 세포의 이동이 증가 되어 있었다. TUBO-P2J, 4T1 세포에 NecroX-5의 이동능력 영향 감수성이 다른 것을 확인하였다.

실시예 5: NecroX -5가 암 세포 침투에 미치는 영향

NecroX-5가 암 세포의 조직 내 침투 능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 8 ㎛ 크기의 포어 (pore)를 가진 transwell insert에 마트리겔 (matrigel)을 2㎎/㎖로 코팅하고 상층부에 1 x 10⁵의 TUBO-P2J, 4T1 세포를 접종하고 NecroX-5를 농도별로 처리하였다. 배양 72시간 후 세포외 기질은 마트리겔을 분해하고 아래 챔버로 이동한 세포수를 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, TUBO-P2J 세포를 72시간 배양 후 대조군에서 1.6 x 10³개의 세포이동이 확인되었으며, 0.25 μM 군에는 1.4 x 10³개, 1 μM 군에서는 0.9 x 10³개, 2.5 μM 군에는 0.6 x 10³개, 10 μM 군에는 세포의 이동이 확인되지 않았다. 4T1 세포를 72시간 배양 후 세포수를 세어본 결과 대조군에서는 1.74 x 10³개의 세포이동이 확인되었으며, 0.25 μM 군에는 1.2 x 10³개, 1 μM 군에서는 세포의 이동이 일어나지 않았다. TUBO-P2J 세포에서는 10 μM 이상, 4T1 세포에서는 1 μM 이상의 NecroX-5는 암 세포의 조직 침투 능력을 억제하고 있었다.

실시예 6: Rac1 / Cdc42 / RhoA 의 활성 변화

NecroX-5에 의한 암 세포의 조직내 침투 능력의 감소가 세포의 이동에 작용하는 단백질의 활성 변화에 기인한 것인가를 확인하기 위하여 40 μM의 NecroX-5를 처리하고 1시간, 1시간 30분 후의 Rac1/Cdc42/RhoA 단백질의 활성화를 protein pull down assay와 western blot으로 확인하였다.

상기 pull down assay는 Cell Biolabs사의 RhoA/Rac1/Cdc42 activation assay combo kit (STA-405)를 사용하여 확인하였다. NecroX-5를 1시간 처리한 세포와 처리하지 않은 세포 1 x 10⁶ 이상의 세포를 PBS로 세척 후 RhoA/Rac1/Cdc42 activation assay combo kit (Cell Biolabs, STA-405)에 포함된 lysis buffer에 protein inhibition cocktail을 섞어 현탁하였다. 실온에서 1시간 둔 다음 14000rpm, 15분간 원심분리 하여 단백질을 분리하였다. BCA protein assay kit (Pierce, 23225)를 이용해 정량하여 동일 양의 단백질 (40ug)로 sample buffer을 첨가하고 100℃에서 10분간 끊여 시료를 준비하였다. 정량한 단백질 (700ug)로 small GTPase pull-down assay를 수행하였다. RhoA는 Rho-binding domain agarose bead, Rac1과 Cdc42는 p21-binding domain agarose bead에 단백질을 반응시켜 분리하였다. 분리된 단백질에 SDS sample buffer를 첨가하여 100℃에서 10분간 끊여 시료를 준비하였다. 12% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 20ul씩 로딩하였고, 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)로 단백질을 전사시켰다. kit에 제공되는 1차와 2차 항체를 반응시켜 ECL western blotting substrate (pierce, 32209)를 이용해 확인하였다.

도 5에서 나타난 바와 같이, NecroX 처리 후 1시간에 Rac1과 Cdc42의 활성이 감소되었다. NecroX에 의한 Rac1의 활성억제는 1시간 30분 후 없어졌으나 Cdc42의 활성억제는 1시간 30분 후에도 지속되었다.

실시예 7: 세포내 칼슘 농도의 변화

세포의 이동에 중요한 역할을 하는 세포내 칼슘이온 농도의 변화를 확인하기 위하여 Fluo-4AM을 사용하여 형광현미경으로 확인하였다. 4T1 세포에 칼슘이온 특이적 탐침자인 fluo-4 AM을 5μM 처리하고 37°C에 40분간 배양하였다. 형광으로 염색된 세포에 NecroX-5를 10uM 농도로 관류액으로 주입하여 실온에서 형광현미경(LSM 700, Carl-Zeiss, Germany)을 이용하여 fluo-4 AM(excitation/emission: 494/506 nm) 형광 파장으로 칼슘이온 변화를 관찰 하였다. 프로그램은 ZEN 2009를 이용하였다. NecroX-5를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 비교하였고, 처리하지 않은 세포의 형광 값을 (F0)으로 설정하고 NecroX-5를 처리한 세포의 형광 값을 (F1)으로 설정하여 F1값을 F0값으로 나누어 결과를 도출하였다.

도 6에서 나타난 바와 같이, NecroX-5의 처리에 따라 세포내 칼슘 농도가 감소하기 시작하였으며, 처리 20분 경과 후에는 처리 전에 비하여 세포내 칼슘 농도가 50% 이하로 감소함을 확인하였다.

Claims (7)

1. NecroX-5를 함유하는 유방암 전이 억제용 약학 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 NecroX-5는 암의 조직내 침투 능력을 감소시킴으로 암 전이를 억제하는, 유방암 전이 억제용 약학 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 암의 조직내 침투 능력의 감소는 Rac1과 Cdc42 발현을 억제시키거나, 세포내 칼슘 농도를 감소시킴으로서 이루어지는, 유방암 전이 억제용 약학 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. NecroX-5를 함유하는 유방암 전이 억제용 식품 조성물.

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