WO2023146341A1 - 난소의 항노화용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

난소의 항노화용 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023146341A1
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WO
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phenyl
indol
aging
pyran
tetrahydro
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김순하
이재호
김유진
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주식회사 미토이뮨테라퓨틱스
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for ovarian anti-aging comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases related to ovarian aging or dysfunction, and a method for ovarian anti-aging It is about.
  • follicles The development of follicles is a very complex process regulated by several factors in the phases independent and dependent on gonadotropins, and the quality of oocytes is related to the function of somatic cells in the ovary, such as granulosa cells and cumulus cells.
  • somatic cells in the ovary such as granulosa cells and cumulus cells.
  • IVF in vitro fertilization
  • women with a history of successful live births may show different patterns of granulosa cells and cumulus cells during follicular development than those who failed to conceive. Accordingly, in order to restore the function of the ovary, not only follicle development and oocytes, but also the function of cumulus cells and granulosa cells are important.
  • the present invention is intended to provide a substance for restoring the function of the aged ovary and suppressing the aging of the ovary.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for ovarian anti-aging, comprising the compound of formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a method for ovarian anti-aging using the component.
  • the inventors of the present invention have completed the present invention by confirming that the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof can restore the function of an aging ovary.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anti-aging of the ovary, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • n is an integer from 1 to 3;
  • n 0 or 1
  • A represents phenyl
  • R 1 is hydrogen or C 1 -C 6 -alkyl
  • R 2 represents hydrogen, halogen or C 1 -C 6 -alkoxy, or -C 1- C 6 -alkylene-OH, -(CH 2 ) p CO 2 R 7 , -NHR 8 , -N(H) S(O) 2 R 7 or -NHC(O)R 7 , where p is an integer from 0 to 3, R 7 represents hydrogen or C 1 -C 3 -alkyl, R 8 is C 1- C 3 -alkylpiperidinyl, or C 1- C 3 -alkylsulfonyl;
  • R 3 represents hydrogen, halogen, C 1 -C 6 -alkyl or phenyl, or -(CH 2 ) where the heterocycle is a 5- to 6-membered ring containing 1 or 2 heteroatoms selected from S, N and O atoms; Represents p -heterocycle, where p is an integer from 0 to 3, with the proviso that when m is 0, R 3 is phenyl;
  • R 4 is halogen, C 1 -C 6 -alkyl, -C 1- C 6 -alkylene-OH, -O-phenyl, -(CH 2 ) p CO 2 R 7 , heterocycle is S, N and O atoms -(CH 2 ) p -heterocycle, which is a 5- to 6-membered ring containing 1 or 2 heteroatoms selected from, or proline-N-carbonyl, where p is an integer from 0 to 3, and R 7 is As defined,
  • R 5 is hydrogen or C 1 -C 6 -alkyl
  • R 6 represents C 1 -C 6 -alkyl, C 3 -C 6 -cycloalkyl, heterocycle or -C 1 -C 6 -alkylene-heterocycle, wherein the heterocycle is selected from among the S, N and O atoms. 3 to 8 membered ring containing 1 to 3 selected heteroatoms, R 6 is C 1 -C 6 -alkylamine, -C 1- C 6 -alkylene-OH, or C 1 -C 6 -alkylsulfonyl group. may be substituted with phonyl.
  • the present invention also comprises the steps of administering the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof; It provides an anti-aging method of the ovary comprising a.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the compound of formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing or treating ovarian aging-related diseases.
  • the functional activity of the ovary such as the increase in oocytes and the development of follicles, and the increase in the expression of specific genes for ovarian aging recovery, etc., improve the function of the aged ovary. It can show the effect of restoring and inhibiting ovarian aging. Accordingly, the compound of Formula 1 of the present invention can be usefully used for diseases related to ovarian dysfunction due to aging.
  • 1a is a histological image of mouse ovarian tissue stained with hematoxylin and eosin after treatment with an example compound and stimulation with hormones according to Experimental Example 1;
  • Figures 1b and 1c are images and graphs showing the number of oocytes according to the presence or absence of treatment with the example compound in the backpack (GV) stage according to Experimental Example 1.
  • Figure 2 is a table image showing the effect of fertilized pronuclear cell (2PN) embryo development according to the presence or absence of Example compound treatment according to Experimental Example 2.
  • Figure 3a is a graph showing the results of performing next-generation sequencing (NGS) according to Experimental Example 3.
  • Figure 3b is a graph showing the expression levels of genes related to tumor necrosis factor superfamily cytokine production according to Experimental Example 3.
  • 4a and 4b are images and quantification graphs showing the results of RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) analysis for each gene according to Experimental Example 4;
  • the present invention provides a composition for anti-aging of the ovary, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • n is an integer from 1 to 3;
  • n 0 or 1
  • A represents phenyl
  • R 1 is hydrogen or C 1 -C 6 -alkyl
  • R 2 represents hydrogen, halogen or C 1 -C 6 -alkoxy, or -C 1- C 6 -alkylene-OH, -(CH 2 ) p CO 2 R 7 , -NHR 8 , -N(H) S(O) 2 R 7 or -NHC(O)R 7 , where p is an integer from 0 to 3, R 7 represents hydrogen or C 1 -C 3 -alkyl, R 8 is C 1- C 3 -alkylpiperidinyl, or C 1- C 3 -alkylsulfonyl;
  • R 3 represents hydrogen, halogen, C 1 -C 6 -alkyl or phenyl, or -(CH 2 ) where the heterocycle is a 5- to 6-membered ring containing 1 or 2 heteroatoms selected from S, N and O atoms; Represents p -heterocycle, where p is an integer from 0 to 3, with the proviso that when m is 0, R 3 is phenyl;
  • R 4 is halogen, C 1 -C 6 -alkyl, -C 1- C 6 -alkylene-OH, -O-phenyl, -(CH 2 ) p CO 2 R 7 , heterocycle is S, N and O atoms -(CH 2 ) p -heterocycle, which is a 5- to 6-membered ring containing 1 or 2 heteroatoms selected from, or proline-N-carbonyl, where p is an integer from 0 to 3, and R 7 is As defined,
  • R 5 is hydrogen or C 1 -C 6 -alkyl
  • R 6 represents C 1 -C 6 -alkyl, C 3 -C 6 -cycloalkyl, heterocycle or -C 1 -C 6 -alkylene-heterocycle, wherein the heterocycle is selected from among the S, N and O atoms. 3 to 8 membered ring containing 1 to 3 selected heteroatoms, R 6 is C 1 -C 6 -alkylamine, -C 1- C 6 -alkylene-OH, or C 1 -C 6 -alkylsulfonyl group. may be substituted with phonyl.
  • the present invention treated the aged ovary with the compound of Formula 1, and confirmed the effect of restoring the function of the aged ovary by recovering the ovary by the compound of Formula 1. It has identified a use.
  • the compound represented by Formula 1 of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed by a free acid.
  • acid addition salts are inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid, etc., aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and non-toxic organic acids such as alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, trifluoroacetic acid, acetate, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid, etc.
  • Types of such pharmaceutically acceptable salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, i. odides, fluorides, acetates, propionates, and the like.
  • composition of the present invention may include all salts, isomers, hydrates and/or solvates that can be prepared by conventional methods, as well as the compound of Formula 1 and its pharmaceutically acceptable salts.
  • isomers may mean a compound of the present invention or a salt thereof having the same chemical formula or molecular formula but structurally or sterically different.
  • isomers include structural isomers such as tautomers, R or S isomers having an asymmetric carbon center, isomers such as geometric isomers (trans, cis), and optical isomers (enantiomers). All these isomers and mixtures thereof are also included within the scope of the present invention.
  • hydrate refers to a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces. It may mean a compound of the invention or a salt thereof.
  • the hydrate of the compound represented by Formula 1 of the present invention may contain a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces.
  • the hydrate may contain at least 1 equivalent of water, preferably from 1 to 5 equivalents of water.
  • Such a hydrate may be prepared by crystallizing the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention from water or a solvent containing water.
  • solvate may refer to a compound of the present invention or a salt thereof containing a stoichiometric or non-stoichiometric amount of a solvent bound by non-covalent intermolecular forces.
  • Preferred solvents in this regard are those that are volatile, non-toxic, and/or suitable for administration to humans.
  • alkyl means an aliphatic hydrocarbon radical.
  • Alkyl may be "saturated alkyl” that does not contain an alkenyl or alkynyl moiety, or "unsaturated alkyl” that contains at least one alkenyl or alkynyl moiety, unless otherwise defined. It can have 1 to 20 carbon atoms.
  • Alkyl, alkenyl and alkynyl may refer to straight or branched chain acyclic hydrocarbons.
  • alkylene' refers to a divalent hydrocarbon group in which a radical is additionally formed from the alkyl, and examples thereof include, but are not limited to, methylene, ethylene, propylene, butylene, isobutylene, and the like. .
  • alkoxy' means an alkyl-oxy having from 1 to 10 carbon atoms.
  • 'cycloalkyl' refers to a saturated aliphatic 3-10 membered ring.
  • Typical cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like.
  • 'heterocycle' contains 1 to 3 heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S, and may be fused with benzo or C 3 -C 8 cycloalkyl, saturated or 1 or It means a 3-10 membered ring containing two double bonds, preferably a 4-8 membered ring, and more preferably a 5-6 membered ring. Also, it may be used interchangeably with the term 'heterocyclyl'.
  • heterocycle examples include pyrroline, pyrrolidine, imidazoline, imidazolidine, pyrazoline, pyrazolidine, pyran, piperidine, morpholine, thiomorpholine, piperazine, hydrofuran, and the like. However, it is not limited to only these.
  • R 3 represents hydrogen, halogen, or phenyl, or represents -(CH 2 ) p -heterocycle where the heterocycle is morpholino, piperazinonyl, where p is an integer from 0 to 1, provided that , when m is 0, R 3 may be phenyl.
  • R 4 is halogen, C 1 -C 3 -alkyl, -C 1- C 3 -alkylene-OH, -O-phenyl, -(CH 2 ) p CO 2 -ethyl, heterocycle is thiomorpholino, morpholino , piperazinonyl, or pyrrolidinyl, -(CH 2 ) p -heterocycle, or proline-N-carbonyl, where p may be an integer from 0 to 1.
  • R 5 is hydrogen or C 1 -C 3 -alkyl
  • R 6 represents C 1 -C 3 -alkyl, C 3 -C 6 -cycloalkyl, heterocycle or -C 1 -C 3 -alkylene-heterocycle, wherein the heterocycle is tetrahydro-2H-pyran; or piperidinyl, and if R 6 is a heterocycle or -C 1 -C 3 -alkylene-heterocycle, C 1 -C 6 -alkylamine, -C 1- C 6 -alkylene-OH, or C 1 -C 6 -alkylsulfonyl.
  • examples of the compound of Formula 1 include Compounds 1 to 32 listed in Table 1 below or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the compound of Formula 1 may be a compound of Formula 2 below.
  • the term "anti-aging of the ovary” may mean restoring an ovary that has lost its function due to ovarian aging to a normal ovary or a level similar thereto, or encompassing suppression of the aging process of the ovary. it can mean
  • the term "follicle” may refer to an aggregate of cells found in the ovary, which is a place where female hormones are produced and secreted and contains oocytes.
  • follicle formation refers to any stage of progression from a primordial follicle to a preovulatory follicle and/or from an immature oocyte to an egg, wherein an ovarian follicle containing an (immature) oocyte is refers to the process of maturation or any stage thereof.
  • oocyte refers to a cell capable of maturing into an egg by meiosis.
  • cumulus cell means a granule cell that surrounds an oocyte and supplies nutrients.
  • the term “age” or “senescence” means that a natural aging phenomenon in which function is deteriorated according to the passage of time or internal/external stimuli (eg, inflammation) is expressed.
  • the term “function of the ovary” includes, for example, production of reproductive hormones, maintenance of appropriate levels of follicle stimulating hormone or production of follicles, ovulation of follicles, formation of corpus luteum, maintenance of appropriate levels of follicles and oocytes, and histology of the ovaries. (eg, size and tissue health).
  • the term "loss of ovarian function” refers to loss or reduction of ovarian functions known in the art, such as loss of ovarian functions for pregnancy such as ovulation, implantation, fertilization, or reduction of reproductive hormones secreted from the ovaries. can mean doing
  • the term "restoration of ovarian function” may refer to restoring ovarian function damaged by external factors or internal factors (particularly, aging, etc.), and the degree of recovery may refer to the recovery of the ovary before it is damaged due to aging or other factors. It may be an ovarian or similar degree, or may indicate an improved degree than before administration of a therapeutic agent or treatment.
  • restoring a damaged ovarian function may mean restoring to 30% or more, 40% or more, or 50% or more of a normal ovary.
  • anti-aging of ovaries not only delays ovarian aging, but also restores the function of aged ovaries, extends reproductive potential or ovarian function, and alleviates ovarian inflammatory reactions, Treating ovarian aging can mean all of them collectively.
  • Aged ovaries exhibit several phenotypic defects, such as oxidative stress, development of ovarian inflammation, decreased steroidogenesis, folliculogenesis, etc., and may result in loss of fertility due to reduced number of follicles and poor egg quality.
  • the anti-aging of the ovary may be to improve or restore the function of the aging ovary having the above problems.
  • anti-aging of the ovary increases the number of follicles; increased number of oocytes; and an increase in the rate of preimplantation embryonic development; At least one selected from the group consisting of may be implemented.
  • the compound of formula 1 is a cell longevity-related genes (longevity-related genes), steroidogenesis-related genes (steroidogenesis-related genes), primordial follicle factors (primordial follicle factors) and ovarian function-related Expression of one or more genes selected from the group consisting of functional factors of ovary may be increased.
  • the primordial follicle-related factors can improve the survival of primordial follicles, regulate proliferation of stromal cells and differentiation of granulosa cells due to preantral follicle development, and are genes related to follicle development, such as Nanog, Oct3/4, and p63. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the longevity-related gene is a gene related to prolongation of survival of ovarian-related cells, and may be at least one selected from the group consisting of SOD2 and SIRT1.
  • the steroid formation-related gene may be at least one selected from the group consisting of Edn2, Tbxa2r, Oxtr, and Adra1d.
  • the ovarian function-related factor may be at least one selected from the group consisting of Lhcgr, AMH, GDF9, BMP15 and Kitl.
  • the compound represented by Formula 1 inhibits follicle formation and ovarian aging, or restores the function of an aged ovary, thereby preventing, improving, alleviating, or treating diseases related to ovarian aging or dysfunction.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases related to ovarian aging or dysfunction, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 to R 6 , A, n and m are each the same as defined above.
  • diseases associated with ovarian aging or dysfunction include premature ovarian failure, infertility, infertility, miscarriage, ovarian cyst, ovarian teratoma, endometrioma, polycystic ovarian syndrome, menopause, menopausal symptoms, ovarian cancer , And may be at least one selected from the group consisting of orchiditis, but is not limited thereto, and is not limited to any disease caused by aging or dysfunction of the ovary.
  • menopausal symptoms refer to symptoms and disorders that occur in women before, during, and after menopause due to ovarian aging, hormonal changes, and/or other biological processes.
  • the menopausal symptoms include, for example, hot flashes, sweating, sweating during sleep, sleep disturbance, skin dryness, vaginal dryness, vaginal atrophy, lower urethral atrophy, dyspareunia, vaginitis, cystitis, dysuria, urgency, difficulty concentrating, memory impairment, anxiety , depression, fatigue, nervousness, decreased libido, muscle pain, arthralgia, or osteoporosis, but are not limited thereto.
  • premature ovarian failure refers to the cessation of ovarian function before the age of 40.
  • causes of premature ovarian failure include chemotherapy, radiation therapy, autoimmune disease, thyroid disease, diabetes, and surgically induced menopause (eg, cervical cancer). enucleation or oophorectomy), but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for delaying menopause or preventing or inhibiting premature menopause, comprising the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention may also be used to protect the ovary.
  • “Ovarian protection” can also refer to protection against any injury or trauma to the ovaries (eg, engraftment or injury). “Ovarian protection” refers to protecting the function of the ovaries to an appropriate level. Since the possibility of injury or trauma increases as the ovary ages, the ovary can be protected from the injury or trauma by treatment with the compound of Formula 1.
  • the present invention also includes the steps of administering the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof; It provides an anti-aging method of the ovary comprising a.
  • R 1 to R 6 , A, n and m are each the same as defined above.
  • the ovary may mean an aged ovary, and may mean restoring the function of the aged ovary to a normal ovarian level by treating the aged ovary with the compound of Formula 1.
  • the present invention can provide a method for preventing or treating diseases related to ovarian aging or dysfunction, comprising administering the compound of Formula 1 to a subject in need thereof.
  • the content of the pharmaceutical composition for ovarian anti-aging may be applied mutatis mutandis unless otherwise defined.
  • the present invention relates to the use of the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in anti-aging of the ovary, and the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the prevention or treatment of diseases related to ovarian aging or dysfunction. Possible uses of salts can be provided.
  • the content of the pharmaceutical composition for anti-aging of the ovary may be applied mutatis mutandis.
  • treatment means stopping or delaying the progression of a disease when used in an object showing symptoms of disease
  • prevention means stopping signs of disease when used in an object at high risk but not showing symptoms of disease. or delay.
  • the “pharmaceutical composition” may include a pharmaceutically acceptable carrier together with the compound of the present invention, if necessary.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations at the time of clinical administration, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, diluents such as surfactants or It is prepared using excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, water, in one or more compounds of the present invention. It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, or syrups. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included. can
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, freeze-dried formulations, suppositories, and the like.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol, gelatin, and the like may be used.
  • the effective dosage of the compound of Formula 1 of the present invention for the human body may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, state of health and degree of disease, and is generally about 0.001-100 mg/kg/day. And, preferably 0.01-35 mg / kg / day. Based on an adult patient weighing 70 kg, it is generally 0.07-7000 mg/day, preferably 0.7-2500 mg/day, and once or twice a day at regular intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist. It may be divided into several doses.
  • subject of the present invention refers to vertebrate animals such as mammals, birds, and humans, including humans and livestock, whose inflammatory diseases can be improved, prevented, or treated by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, but is not limited thereto.
  • administration means introducing a predetermined substance into a human or animal by any appropriate method, and the administration route of the composition for prevention or treatment according to the present invention is any general route as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally or parenterally through.
  • a representative example of the compound of Formula 1 is (5-[(1,1-dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]-2-phenyl-N-(tetrahydro-2H-pyran-4- 1) -1H-indol-7-amine) (hereinafter referred to as 'Example Compound' or 'Compound 1') was used.
  • mice For in vivo hormone stimulation, old mice were treated with the example compounds, and 75 IU Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG: RP1782725000; BioVendor, Czech Republic) was injected 12 hours later.
  • the control group was a group administered with only 75 IU PMSG.
  • Female mice were superovulated by intraperitoneal hormone injection at 48-hour intervals.
  • the hormones administered were 7.5 IU of PMSG and 7.5 IU of Human chorionic gonadotropin (hCG: 668900221; LG Chem, Seoul, Korea).
  • female mice After the second hormone treatment, female mice were mated with male mice (2:1 or 1:1). Fertilized pronuclear cells (2PN) were obtained 24 h after hCG injection.
  • Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG; G4527, Sigma Aldrich; 7.5 IU) was intraperitoneally injected into female mice (young mice: 7-8 weeks old; old mice: 40 weeks or older) to superovulate.
  • GV oocytes were collected from the ovaries 48 hours after PMSG injection.
  • female mice were injected with hCG 48 hours after PMSG injection, and then left overnight with BDF1 stud male mice aged 10 to 12 weeks. The plugs of female mice were examined the next day, and zygotes and 2-cell embryos were collected from oviducts at 18-20 hours and 36 hours after hCG injection, respectively.
  • Experimental Example 1 evaluated the effect of treatment with the example compounds on mouse ovaries stimulated with PMSG in vivo. Light microscopy imaging was performed on the ovaries of young mice, old mice treated with and not treated with the example compounds.
  • Figure 1a confirms histological images of mouse ovarian tissue stained with hematoxylin and eosin after hormone stimulation with and without Example compound treatment. It can be seen that the total number of follicles including preantral follicles and anterior follicles (marked with arrows) is significantly higher in Example compound-treated ovaries than in control ovaries.
  • mice eggs from mice (the number of eggs of young mice: 15; the number of eggs of old mice: 30; the number of eggs of old mice treated with the example compounds: 30) were collected and physically chopped. After collecting the follicles by chopping, GV oocytes in the follicles were isolated and counted using a stereomicroscope to determine the number of cells.
  • Figure 1b is an image of an optical microscope
  • Figure 1c is a graph showing the number of GV oocytes
  • CTL in Figures 1b and 1c means a control group not treated with the example compound.
  • Figures 1b and 1c show that the number of total oocytes collected from aged ovaries treated with the example compounds had significantly higher values than from aged ovaries not treated with the example compounds as a control, at the GV stage.
  • the growth rate of the embryos of the example compounds was 20% higher than that of the conventional control embryos in morula, early blastocyst, and late blastocyst. Specifically, 55.56% of the embryos of the old mice treated with the Example compounds appeared in the morula ratio. However, the control group had a significantly lower ratio of 37.10%. The early blastocyst rate was higher in the embryos treated with the example compounds (51.85%) than in the control embryos (35.48%), and finally, the late blastocyst rate was also higher in the older embryos treated with the example compounds compared to the control embryos (35.48%). mouse embryos (51.85%) were significantly higher.
  • NGS next generation sequencing
  • RNA sequencing was performed according to references [1, 2]. RNA was extracted using a TRIZol (TRIzol® 15596026, Thermo Fisher) solution. A sequencing library was prepared using the TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina) according to the manufacturing method of the product company. Paired end 101 bp sequencing was performed using the Illumina platform (NovaSeq 6000, Illumina). Two experimental results were derived for each group.
  • TRIZol TRIzol® 15596026, Thermo Fisher
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • Figure 3a shows differentially expressed genes (DEGs) between groups in a Venn diagram format. There are 1,214 differentially expressed genes (DEGs) between the old group and the young group, and there are 1,021 DEGs between the old group and the old group treated with the example compound, and there are 267 DEGs common among these DEGs confirmed. It was confirmed that gene ontology (GO) related to immune system regulation was significantly enriched in common DEGs.
  • DEGs differentially expressed genes
  • Fcer1g, Slamf9, Clec4a3, Ptpn6, Tyrobp, Adipoq, Bcl3, Trem2 and Sash3 were identified as genes increased in the old age group and downregulated by the example compounds.
  • RT-qPCR Real-time quantitative PCR
  • CT comparative threshold cycle
  • PCR products were loaded on a 2% agarose gel, stained with SafeviewTM Biological Materials, Richmond, Canada) and visualized under UV illumination using a gel documentation system (WSE-6100 LuminoGraph; ATTO, Tokyo, Japan), ImageJ Bands of the product were analyzed by intensity ratio analysis using the software.
  • a gel documentation system WSE-6100 LuminoGraph; ATTO, Tokyo, Japan
  • mRNA was extracted from oocytes using TRIzol®RNA (15596026, Thermo Fisher) solution and reverse transcription-PCR (RT-PCR) was performed.
  • the PCR product was stained with SafeView TM (Applied Biological Materials, Richmond, Canada) and loaded on a 2% agarose gel. Additionally, gels were visualized under UV illumination using a gel documentation system (WSE-6100 LuminoGraph; ATTO, Tokyo, Japan). The intensity ratio of the product band was analyzed using ImageJ software.
  • Nanog, Oct3/4, and p63, which are primordial follicle factors, and AMH and BMP15, which are functional factors of ovary, in the ovary of the mouse treated with the Example compound was measured by RT-PCR as described above. was analyzed, and the results are shown in FIG. 4.
  • Figure 4a the upper left box is longevity-related genes
  • the lower left box is steroidogenesis-related genes
  • the upper right box is primordial follicle factors
  • the lower right box is It refers to functional factors of ovary.
  • Figure 4b is a quantification graph shown by normalizing the band image of each gene in Figure 4a with beta-actin.

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Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 항노화용 약학적 조성물, 이를 포함하는 난소의 항노화 방법, 및 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 화학식 1의 화합물은 노령 난소의 기능을 회복시키고 난소의 노화를 억제하는 효과를 나타낼 수 있고, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

난소의 항노화용 약학적 조성물 및 이의 용도
본 발명은 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 난소의 항노화용 약학적 조성물, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 난소의 항노화 방법에 관한 것이다.
현재, 여성의 가임기 연령층이 높아짐에 따라 여성의 불임율은 증가하고 있으며, 난소의 기능은 성공적인 임신 결과에 중요한 역할을 한다. 하지만, 난모세포와 배아의 능력이 감소하는 것으로 나타나는 노화된 난소 기능 장애와 관련된 불임에는 치료법이 없다고 알려져 있다 (Cimadomo et al. 2018).
난포의 발달은 성선자극호르몬의 비의존 및 의존 단계에서 여러 요인에 의해 조절되는 매우 복합한 과정을 거치고, 난모세포의 질은 과립막 세포와 난구 세포 등과 같은 난소에 있는 체세포의 기능과 관련이 있다. 체외 수정(IVF)을 시도하는 고령 여성 중 성공적인 정상 출산 이력이 있는 여성은 임신에 실패한 여성과 난포 발달 동안 다른 형태의 과립막 세포 및 난구 세포의 양상을 보이는 경우가 있다. 이에 따라 난소의 기능을 회복하기 위해 난포 발달, 난모세포 뿐만 아니라 난구 세포, 과립막 세포의 기능도 중요하다.
현재까지 난소의 노화 기전이나 산모의 고령화에 따른 불임의 결정적인 요인은 밝혀지지 않았으며, 최근, 노화의 진행으로 인해 텔로미어 감소, 게놈 불안정성, 자가 포식 감소, 줄기 세포 고갈 및 미토콘드리아 기능 장애와 같은 여러 세포적 분자적 특성이 확인되었다.
의학의 발달 및 경제 수준의 향상으로 고령화 사회에 접어 들었고, 산모의 고령화도 진행되어, 늦은 나이에 임신을 시도하는 여성들이 늘고 있다. 하지만, 노화에 따른 난소의 기능이 점차 감소하여, 불임이나 난임 케이스가 발생하고 있으며, 노화된 난소 관련 질환이 늘고 있는 추세이다.
노화의 진행 방지 및 회춘을 위하여 많은 종류의 항노화제가 개발되고 있다. 하지만, 노화된 난소를 회복시키거나 난소의 노화를 억제할 수 있는 치료제에 대한 개발은 미미한 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국제특허공개공보 WO2009/025478
본 발명은 노화된 난소의 기능을 회복시키고 난소의 노화를 억제하기 위한 물질을 제공하고자 한다.
이에, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 항노화용 약학적 조성물 및 상기 성분을 이용한 난소의 항노화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 성분을 포함하는 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물 및 상기 성분을 이용한 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 노화가 진행된 난소의 기능을 회복할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 항노화용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000001
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
A는 페닐을 나타내고,
R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 난소의 항노화 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 난소의 노화와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 화학식 1의 화합물을 처리하는 경우, 난모세포의 증가 및 난포 발달과 같은 난소의 기능적 활성, 난소의 노화 회복을 위한 특정 유전자 발현 증가 등에 의해 노령 난소의 기능을 회복시키고 난소의 노화를 억제하는 효과를 나타낼 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 노화로 인한 난소 기능 장애와 관련된 질환에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 실험예 1에 따라 실시예 화합물 처리 및 호르몬 자극 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 마우스 난소 조직의 조직학적 이미지를 확인한 것이다.
도 1b 및 1c는 실험예 1에 따라 배낭(GV) 단계에서, 실시예 화합물 처리 유무에 따른 난모세포 수를 나타낸 이미지 및 그래프이다.
도 2는 실험예 2에 따라 실시예 화합물 처리 유무에 따른 수정 전핵세포(2PN) 배아 발달의 영향을 나타낸 표 이미지이다.
도 3a는 실험예 3에 따라 차세대 시퀀싱(NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 실험예 3에 따라 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 사이토카인 생산 (Tumor necrosis factor superfamily cytokine production)과 관련된 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4a와 4b는 실험예 4에 따라 유전자별 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 분석 결과를 나타낸 이미지와 정량화 그래프이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 항노화용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000002
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
A는 페닐을 나타내고,
R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 노화된 난소에 처리하여, 난소가 화학식 1의 화합물에 의해 회복되어 노화된 난소의 기능을 회복하는 효과를 확인 하였는 바, 본 발명은 이러한 화학식 1의 화합물의 신규한 용도를 규명한 것이다.
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 특히, 약학적으로 허용가능한 염은, 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다. 여기서, 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 아이오딘화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 다이카복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸다이오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트라이플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및/또는 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성질체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서, "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1 당량 이상, 바람직하게는, 1 당량 내지 5 당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.
본 명세서에서, "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.
본 명세서에서, 용어 '알킬'은 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬은 알케닐이나 알키닐 부위를 포함하지 않는 “포화 알킬(saturated alkyl)”이거나, 적어도 하나의 알케닐 또는 알키닐 부위를 포함하는 “불포화 알킬(unsaturated alkyl)”일 수 있으며, 달리 정의하지 않는 한 1 내지 20 개의 탄소원자를 가질 수 있다. 알킬, 알케닐 및 알키닐은 직쇄, 또는 분지쇄의 비고리형 탄화수소를 의미할 수 있다.
용어 '알킬렌(alkylene)'은 상기 알킬에서 라디칼이 추가로 형성된 탄화수소 2가 기를 의미하고, 그 예로는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌 등을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 '알콕시'는 달리 정의하지 않는 한 1 내지 10 개의 탄소원자를 가지는 알킬-옥시를 의미한다.
용어 '사이클로알킬'은 달리 정의하지 않는 한 포화 지방족 3~10원 환을 의미한다. 전형적인 사이클로알킬 그룹에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 포함되지만, 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 '헤테로사이클' 은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하며, 벤조 또는 C3-C8사이클로알킬과 융합될 수 있고, 포화되거나 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 3~10원 환, 바람직하게는 4~8원 환, 더욱 바람직하게는 5~6원 환을 의미한다. 또한, 용어 '헤테로사이클릴'과 혼용되어 사용될 수 있다. 헤테로사이클의 예로는 피롤린, 피롤리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸린, 피라졸리딘, 피란, 피페리딘, 몰포린, 티오몰포린, 피페라진, 하이드로퓨란 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R3는 수소, 할로겐, 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 몰포리노, 피페라지논일(piperazinonyl)인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R4는 할로겐, C1-C3-알킬, -C1-C3-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2-에틸, 헤테로사이클이 티오몰포리노, 몰포리노, 피페라지논일(piperazinonyl), 또는 피롤리딘일인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R5는 수소, 또는 C1-C3-알킬이고,
R6은 C1-C3-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 테트라하이드로-2H-피란, 또는 피페리딘일이고, R6이 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클인 경우, C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 1의 화합물의 예로는 하기 표 1에 나열된 화합물 1 내지 32 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 들 수 있다.
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000003
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000004
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000005
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000006
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000007
본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000008
본 발명에 있어서, 용어 “난소의 항노화”는 난소의 노화로 인해 기능이 상실된 난소를 정상 난소 또는 이와 유사한 수준으로 회복하는 것을 의미할 수 있으며, 또는 난소의 노화 진행을 억제하는 것을 모두 포괄하는 의미일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "난포"는 여성 호르몬이 생성 및 분비되는 장소이면서 난모세포를 함유하는 난소에서 발견되는 세포의 응집체를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "난포 형성"은 원시 난포로부터 배란 전 난포로의 진행 및/또는 미성숙 난모세포로부터 난자로의 진행의 임의의 단계를 포함하여, (미성숙) 난모세포를 함유하는 난소 난포가 성숙하는 과정 또는 이의 임의의 단계를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "난모세포"는 감수분열에 의해 난자로 성숙할 수 있는 세포를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "난구세포(cumulus cell)"는 난모세포를 둘러싸고 영양을 공급하는 과립 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “노령” 또는 “노화”는 시간의 경과, 또는 내/외부 자극 요인(예를 들어 염증 발생)에 따라 기능이 저하되는 자연적 노화 현상이 발현되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “난소의 기능”은 예컨대, 생식 호르몬 생산, 적절한 수준의 여포 자극 호르몬 유지 또는 여포 생산, 난포의 배란, 황체의 형성, 적절한 수준의 난포 및 난모세포 유지, 및 난소의 조직학 (예컨대, 크기 및 조직 건강)을 총칭하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 “난소 기능 상실”은 배란, 착상, 수정, 등 임신을 위한 난소가 갖는 기능을 상실하거나 난소에서 분비되는 생식 호르몬의 저하 등과 같이 당업계에 알려진 난소의 기능을 상실 또는 감소하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “난소 기능 회복”은 외부 요인, 또는 내부 요인(특히, 노화 등)에 의해 손상된 난소 기능을 회복하는 것일 수 있으며, 회복 정도는 난소를 노화 또는 다른 요인으로 인해 손상되기 전의 난소 또는 이와 유사한 정도 일 수 있고, 또는 치료제 또는 치료의 투여 전보다 개선된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 여기서, 손상된 난소 기능을 회복하는 것은 정상 난소의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 정도로 회복하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, “난소의 항노화”는 난소의 노화를 지연시키는 것일 뿐만 아니라 노화된 난소의 기능을 회복시키거나, 생식 잠재력 또는 난소 기능을 연장하고, 난소의 염증 반응을 완화시킬 수 있으며, 난소의 노화를 치료하는 것 모두 총괄해서 의미할 수 있다.
노화된 난소는 산화 스트레스, 난소 염증 발생, 스테로이드 생성 감소, 모낭 생성 등과 같은 몇가지 표현형의 결함을 나타내고, 난포의 수가 감소하고 난자의 질이 좋지 않아 생식력을 상실할 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 난소의 항노화는 상기와 같은 문제를 갖는 노화가 진행된 난소의 기능을 개선 또는 회복시키는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 화학식 1의 화합물의 처리에 따라 전강 난포와 전측 난포를 포함한 총 난포의 수가 증가되며 난포 발달이 향상되고, 난모세포 수가 증가되었으며, 착상 전 배아 발달 속도가 증가됨을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명에서, 난소의 항노화는 난포 수 증가; 난모세포의 수 증가; 및 착상 전 배아 발달 속도의 증가; 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상이 구현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 화학식 1의 화합물은 세포 내 장수 관련 유전자 (longevity-related genes), 스테로이드 형성 관련 유전자 (steroidogenesis-related genes), 원시 난포 관련 인자 (primordial follicle factors) 및 난소 기능 관련 인자 (functional factors of ovary)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 원시 난포 관련 인자들은 원시 난포의 생존을 향상시킬 수 있고, stromal cells의 증식 및 전강 난포 발달로 인한 과립막 세포의 분화를 조절할 수 있으며, 난포 발달과 관련된 유전자로 Nanog, Oct3/4 및 p63로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 장수 관련 유전자는 난소 관련 세포들의 생존의 연장과 관련된 유전자로, SOD2 및SIRT1 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 스테로이드 형성 관련 유전자는, Edn2, Tbxa2r, Oxtr 및 Adra1d 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 난소 기능 관련 인자는, Lhcgr, AMH, GDF9, BMP15 및 Kitl로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
화학식 1의 화합물의 처리를 통해 해당 유전자들의 발현량이 증가함을 본 실시예를 통해 확인하였다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 난포 형성 및 난소 노화를 억제, 또는 노화된 난소의 기능을 회복함으로써, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환을 예방, 개선, 완화 또는 치료에 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000009
상기 식에서, R1 내지 R6, A, n 및 m은 각각 상기에서 정의한 것과 동일하다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환은 조기 난소 부전, 불임, 난임, 유산, 난소 낭종, 난소 기형종, 난소내막종, 다낭성 난소증후군, 폐경, 폐경기 증상, 난소암, 및 난소염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 난소의 노화나 기능 장애로 인해 발병하는 질환이라면 제한되지 않는다.
상기 "폐경기 증상"은 난소 노후화, 호르몬 변화 및/또는 기타 생물학적 과정에 의해 폐경기 전, 폐경기 동안 및 폐경기 후에 여성에서 발생하는 증상 및 질환을 지칭한다.
상기 폐경기 증상은 예를 들어, 안면홍조, 발한, 수면 중 발한, 수면 장애, 피부 건조, 질 건조증, 질 위축, 하부 요도 위축, 성교통, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중 장애, 기억력 장애, 불안, 우울, 피로, 신경 과민, 성욕 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증 등이 있으며 이에 한정되지 않는다.
상기 “조기 난소 부전"은 40 세 이전에 난소 기능의 중단을 지칭한다. 조기 난소 부전의 원인은 화학요법, 방사선요법, 자가면역 질환, 갑상선 질환, 당뇨병 및 외과적으로 유도된 폐경 (예컨대, 자궁적출술 또는 난소절제술)을 포함하나, 이에 제한되지 않다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 폐경기 지연 또는 조기 폐경 예방 또는 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한, 난소를 보호하는 데에 사용될 수 있다.
"난소 보호"는 또한 난소에 대한 임의의 상해 또는 외상 (예컨대, 생착 또는 부상)에 대한 보호를 지칭할 수 있다. "난소 보호"는 난소의 기능을 적절한 수준으로 보호하는 것을 지칭한다. 난소의 노화가 진행됨에 따라 상해 또는 외상이 발생할 가능성이 높아지므로, 화학식 1의 화합물 처리에 의해 상기 상해, 외상으로부터 난소를 보호할 수 있다.
본 발명은, 또한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 난소의 항노화 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023001264-appb-img-000010
상기 식에서, R1 내지 R6, A, n 및 m은 각각 상기에서 정의한 것과 동일하다.
상기 난소의 항노화 방법에서 난소는 노화된 난소를 의미할 수 있으며, 화학식 1의 화합물을 노화된 난소에 처리함으로써, 노화된 난소의 기능을 정상 난소 수준으로 회복하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환을 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
상기 난소의 항노화 방법, 및 예방 또는 치료 방법에서, 달리 정의하지 않는 한 상기 난소의 항노화용 약학적 조성물의 내용을 준용할 수 있다.
또한, 본 발명은 난소의 항노화에 있어 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도, 및 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환을 예방 또는 치료에 있어 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공할 수 있다.
상기 용도에서, 달리 정의하지 않는 한 상기 난소의 항노화용 약학적 조성물의 내용을 준용할 수 있다.
본 명세서에서, “치료”란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, “예방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환이 호전, 예방 또는 치료될 수 있는 인간 및 가축을 포함하는 포유류, 조류 등의 척추 동물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명을 하기 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이므로, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
재료 및 준비
본 실시예에서 화학식 1의 화합물의 대표 예로 (5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민)(이하, '실시예 화합물' 또는 'Compound 1'이라고 함)을 사용하였다.
본 실험에서, 대조군으로 젊은 마우스(7~9주, n=15)를, 실험군으로 노령 마우스(55~60주, n=30)를 준비하였다. 도면 내 젊은 마우스의 실험 결과인 경우 “Young”으로, 노령 마우스의 실험 결과인 경우 “Old”로 표시하였다.
<수정된 전핵세포 수집>
생체내 호르몬 자극을 위해 노령 마우스에 실시예 화합물 처리하고 75 IU Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG: RP1782725000; BioVendor, Czech Republic)를 12시간 후 주사하였다. 대조군은 75IU PMSG만 투여한 군이다. 48시간 간격으로 복강내 호르몬을 주사하여 암컷 마우스를 과배란 시켰다. 투여된 호르몬은 PMSG 7.5 IU와 Human chorionic gonadotropin (hCG: 668900221; LG Chem, Seoul, Korea) 7.5 IU였다. 2차 호르몬 처리 후 암컷 마우스를 수컷 마우스와 교배시켰다 (2:1 또는 1:1). 수정된 전핵세포(2PN)는 hCG 주입 후 24시간 후에 수득하였다.
<배낭(GV) 난모세포 및 배아 수집>
암컷 마우스 (젊은 마우스: 생후 7-8주; 노령 마우스: 40주 이상)에 Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG; G4527, Sigma Aldrich; 7.5 IU)을 복강 내 주사하여 과배란 시켰다. PMSG를 주입하고 48시간 후 난소에서 배낭(GV) 난모세포를 수집하였다. 수정란의 경우, 암컷 마우스에 PMSG 주입하고 48시간 후, hCG를 주사한 다음, 10-12주 정도 된 BDF1 stud 수컷 마우스와 함께 밤새 두었다. 그 다음날 암컷 마우스의 플러그를 검사하였고, hCG 주입 후 18-20 시간 및 36시간 후 각각에서 난관에서 접합체 및 2-세포 배아를 수집하였다.
실험예 1. 실시예 화합물 처리에 따른 난모세포 증가, 난포 발달 확인
실험예 1은 생체 내에서 PMSG로 자극된 마우스 난소에 대한 실시예 화합물 치료의 효과를 평가하였다. 젊은 마우스, 실시예 화합물의 처리 및 비처리 노령 마우스의 난소에 대해 광학 현미경 이미징을 수행하였다.
각 샘플은 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 고정된 조직을 PBS로 세척하였고, 단면 5um 두께의 파라핀으로 embedding 하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통한 조직학적 분석을 위하여 샘플을 자일렌으로 10분당 100%에서 75%로 탈파라핀화하였고, 실온에서 10분당 100%, 95%, 80% 및 75%의 EtOH을 사용하여 재수화 처리하였고, 여기에 헤마톡실린 및 에오신으로 면역 형광 염색하였다. 0.01M 시트르산 완충액(pH 6.0)과 함께 오토클레이브 용기(Nalgene Jars)에서 20분 동안 끓여 항원을 재생하였다.
도 1a는 실시예 화합물 처리 유무에 따른 호르몬 자극 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 마우스 난소 조직의 조직학적 이미지를 확인한 것이다. 전강 난포와 전측 난포를 포함한 총 난포의 수 (화살표로 표기함)는 대조군 난소보다 실시예 화합물 처리 난소에서 유의하게 더 높음을 알 수 있다.
과배란 유도 후 실시예 화합물을 처리한 노령 마우스와 젊은 마우스의 난소의 배낭(GV) 난모세포 수를 평가하였으며, 그 결과를 도 1b 및 1c에 나타내었다.
GV 난모세포 수 측정은 마우스의 난자 (젊은 마우스의 난자 수: 15개; 노령 마우스의 난자 수: 30개; 실시예 화합물을 처리한 늙은 마우스의 난자 수: 30개)를 각각 채취하고 물리적으로 잘게 쪼개어 (chopping) 난포를 수집한 후, 실체 현미경을 이용하여 난포 내 GV 난모세포를 분리하고 세어서 세포 수를 측정하였다.
도 1b 는 광학 현미경의 이미지이고, 도 1c는 GV 난모세포의 수를 그래프로 나타낸 것이며, 도 1b 및 1c에서 CTL은 실시예 화합물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 1b 및 1c는 배낭(GV) 단계에서, 대조군으로서 실시예 화합물이 처리되지 않은 노령 난소보다 실시예 화합물이 처리된 노령 난소에서 수집된 총 난모세포의 수가 유의하게 더 높은 수치를 갖는 것을 보여준다.
실험예 2. 실시예 화합물 처리에 따른 착상 전 배아 발달
실험예 2는 실시예 화합물을 처리한 노령 마우스의 난소에 대한 수정 전핵세포(2PN) 배아 발달의 영향을 평가하였다.
실시예 화합물이 처리된 노령 마우스(n=15)의 전핵세포 27개와 대조군으로 실시예 화합물이 처리되지 않은 노령 마우스(n=15)의 전핵세포 62개를 배양하였다. 그런 다음, 2-세포, 4-세포, 8-세포, 상실배, 초기 배반포 및 후기 배반포 각 단계에 해당하는 세포 수를 현미경으로 확인하여 측정하고, 비율로 표기하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 화합물 배아의 발육율은 상실배, 초기 배반포, 후기 배반포에 있어 기존 대조군 배아보다 20% 더 높은 것으로 나타났다. 구체적으로, 상실배 비율에서 실시예 화합물이 처리된 노령 마우스의 배아의 55.56%가 나타났다. 그러나 대조군은 비율이 37.10%로 상당히 낮았다. 초기 배반포 비율은 대조군 배아(35.48%)보다 실시예 화합물이 처리된 배아(51.85%)가 더 높게 나타났으며, 마지막으로 후기 배반포 비율도 대조군 배아(35.48%)에 비해 실시예 화합물이 처리된 노령 마우스 배아(51.85%)가 유의하게 더 높았다.
실험예 3. 난소 내 유전자 발현 양상 확인
<차세대 시퀀싱을 통한 유전자 발현 양상 확인>
실시예 화합물 처리에 의한 유전자 발현의 주요 변이를 차세대 시퀀싱 (Next generation sequencing, NGS)을 통해 확인하였다.
mRNA sequencing은 참고문헌 [1, 2]에 따라 진행하였다. 트리졸 (TRIzol®15596026, Thermo Fisher) 용액을 이용하여 RNA를 추출하였다. TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina)를 이용하여 제품 회사의 제조 방법에 따라 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. Illumina platform (NovaSeq 6000, Illumina)을 이용하여 paired end 101bp 시퀀싱을 진행하였다. 각 그룹당 두번의 실험결과를 도출하였다.
기준 (1st trimming: base quality < 3, window size = 4, mean quality = 15; 2nd trimming: min length = 36bp)에 따라 Trimmomatic (Bolger et al., 2014)를 이용하여 Paired end reads data를 트리밍(trimming) 하였다. HISAT2 프로그램 (Kim et al., 2019; Nat Biotechnol 37, 907-915, 2019)을 이용하여 UCSC 게놈 데이터베이스(genome database)에 Trimmed reads을 맵핑(mapping) 하였다. 그리고 StringTie (Pertea et al., 2015; Nat Biotechnol. 2015 Mar; 33(3): 290-295)와 gene/transcript-based (NCBI Annotation Release 108)를 이용하여 정량화하였다.
차등 발현 유전자 분석은 기준(baseMean counts > 14, false discover rate (FDR) < 0.1, and log2FoldChange > 1)에 따라 DESeq2를 이용하여 수행하였다. 유전자 세트 증폭 분석(Gene set enrichment analysis, GSEA)는 R/Bioconductor의 clusterProfiler packages(참고문헌 [3])를 이용하여 수행되었고, Gene Ontology (GO; biological process, cellular component, and molecular function)와 canonical pathways (REACTOME, WikiPathway(참고문헌 [4])를 분석하였다.
도 3a에는 젊은 그룹(Young, YNG; 10주; n=2), 노령 그룹(Old; 55주; n=2) 및 실시예 화합물을 주입한 노령 그룹(Old+compound1; 55주; n=2)의 난소로부터 정제된 RNA를 NGS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a에는 그룹간 차등 발현 유전자 (Differentially expressed genes, DEGs)를 벤다이어그램 형식으로 표현하였다. 노령 그룹과 젊은 그룹 사이에 1,214개의 차등 발현 유전자 (Differentially expressed genes, DEGs)가 있으며, 노령 그룹과 실시예 화합물을 처리한 노령 그룹 사이에 1,021개의 DEGs가 있으며, 이들 DEGs 중에서 공통된 267개의 DEGs가 있음을 확인하였다. 공통된 DEGs에서 면역 시스템 조절과 관련 있는 gene ontology (GO)가 상당히 있음 (enrich)을 확인하였다.
또한, 면역 시스템 조절 관련 GO 중 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 사이토카인 생산 (Tumor necrosis factor superfamily cytokine production)과 관련된 DEGs (n=38)를 확인하였다. 노령 그룹에서 증가하고 실시예 화합물에 의해 하향 조절되는 유전자로, Fcer1g, Slamf9, Clec4a3, Ptpn6, Tyrobp, Adipoq, Bcl3, Trem2 및 Sash3를 확인하였다.
<RT-qPCR 을 통해 면역 시스템 조절 유전자 발현 변화 확인>
본 실험에서는 노화 모델에서 실시예 화합물처리에 따라 면역 시스템 조절 유전자(종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 사이토카인 생산 (Tumor necrosis factor superfamily cytokine production)과 관련된 유전자)들의 발현 변화를 RT-qPCR (Real-time quantitative PCR)을 이용하여 정량적으로 평가하였다.
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 신호 경로를 기반으로, 상향 조절 유전자와 하향 조절 유전자에 대한 프라이머를 선택하였다.
각 난소를 트리졸 (Trizol) 프로토콜로 RT-qPCR을 수행하였으며, RNeasy Mini Kit(Qiagen Ltd.)를 사용하여 총 RNA를 lysate에서 추출하였고, 추출된 총 RNA는 무작위 (random) hexamer가 포함된 Superscript 키트(Invitrogen)를 사용하여 역전사로 cDNA를 합성하였다.
CFX96 Touch Real-Time PCR 검출 시스템(Bio Rad, US)에서 프라이머 및 SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad, US)를 사용하여 유전자 발현량을 확인하였다. 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다.
유전자 서열 (5’-3’)(F-정방향, R-역방향)
Ptpn6 Protein Tyrosine Phosphatase
Non-Receptor Type 6		 F GGA CTT CTA TGA CCT GTA CGG A
R CGA GCA GTT CAG TGG GTA CTT
Fcer1g Fc Epsilon Receptor 1g F ATC TCA GCC GTG ATC TTG TTC T
R ACC ATA CAA AAA CAG GAC AGC AT
Tyrobp Transmembrane Immune
Signaling Adaptor TYROBP		 F CCC AAG ATG CGA CTG TTC TTC
R GTC CCT TGA CCT CGG GAG A
Slamf9 SLAM family member 9 F AGA AAA GCT ATG AGA CGC C
R AGG ACC TCA AAA GCC AAT C
Clec4a3 C-type lectin domain family 4, member a3 F ACT TCA ACT GAC TTG GTG G
R AAA TCC TGT TCT TCC TGG C
검사한 각 유전자에 대해 축적된 PCR 산물을 참조 유전자 베타-액틴으로 정규화하는 비교 역치 주기(CT) 방법을 사용하였으며, 이를 3번 반복하였다.
PCR 산물은 2% 아가로스 겔에 로딩하였고 Safeview™Biological Materials, Richmond, Canada)로 염색하고 겔 문서화 시스템(WSE-6100 LuminoGraph; ATTO, Tokyo, Japan)을 사용하여 UV 조명 하에서 겔을 시각화 하였으며, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세기 비율 분석으로 생성물의 밴드를 분석하였다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 노령 대조군에서 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 사이토카인 생산 (Tumor necrosis factor superfamily cytokine production)과 관련된 유전자인 Ptpn6, Fcer1g, Tyrobp, Slamf9 및 Clec4a3의 mRNA 발현량이 유의적으로 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 그러나 실시예 화합물을 처리한 노령 실험군(Old)에서는 젊은 대조군 (Young) 과 유사한 수준으로 발현양이 낮아져 있음을 확인할 수 있다.
실험예 4. 난소 기능의 유전자 발현 양상 확인
실시예 화합물을 처리한 노령 마우스의 난소에서 난소 기능 관련 유전자의 발현을 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)로 확인하였다.
트리졸 (TRIzol®RNA, 15596026, Thermo Fisher) 용액을 이용하여 난모세포에서 mRNA를 추출하고 역전사-PCR (RT-PCR)을 수행하였다. PCR 생성물 (PCR product)을 SafeViewTM(Applied Biological Materials, Richmond, Canada)으로 염색한 후 2% 아가로스 젤 (agarose gel)에 로딩하였다. 추가적으로 gel documentation system (WSE-6100 LuminoGraph; ATTO, Tokyo, Japan)을 이용하여 UV 조명 하에 젤을 시각화 하였다. ImageJ software 프로그램을 이용하여 생성물 밴드 (product band)의 세기 비율(intensity ratio)을 분석하였다.
실시예 화합물 처리된 마우스의 난소에서 원시 난포 관련 인자 (primordial follicle factors)인 Nanog, Oct3/4 및 p63과 난소 기능 관련 인자 (functional factors of ovary)인 AMH 및 BMP15의 발현을 상기와 같은 RT-PCR로 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4a와 4b에서 “Young”은 젊은 마우스, “Old”는 노령 마우스, “Old+Compound 1”은 실시예 화합물을 처리한 노령 마우스를 의미한다.
도 4a에서 좌측 상단 박스는 장수 관련 유전자 (longevity-related genes), 좌측 하단 박스는 스테로이드 형성 관련 유전자 (steroidogenesis-related genes), 우측 상단 박스는 원시 난포 관련 인자 (primordial follicle factors) 및 우측 하단 박스는 난소 기능 관련 인자 (functional factors of ovary)를 뜻한다. 도 4b는 도 4a에 있는 각 유전자의 밴드 이미지를 베타-액틴으로 정규화 (normalization) 하여 나타낸 정량화 그래프이다.
도 4a와 4b에 나타낸 바와 같이, Oct3/4, Nanog, p63, Lhcgr, AMH, GDF9, BMP15 및 Kitl의 mRNA 발현은 노령 마우스에 실시예 화합물을 처리하지 않은 대조군보다 실시예 화합물을 처리한 실험군에서 유의하게 더 높았다.
또한, 도 4a와 4b에 나타낸 바와 같이, SOD2, SIRT1과 같은 장수 관련 유전자를 분석한 결과, 실시예 화합물 처리된 노령 마우스는 실시예 화합물이 처리되지 않은 노령 마우스에 비해 SOD2 및 SIRT1의 발현량이 높은 것으로 확인된다. 또한, 실시예 화합물을 처리한 노령 마우스는 Edn2, Tbxa2r, Oxtr 및 Adra1d와 같은 스테로이드 생성 관련 유전자 발현에서도 실시예 화합물이 처리되지 않은 대조군 노령 마우스에 비해 유의하게 증가하였다.
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Claims (10)

  1. 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 항노화용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001264-appb-img-000011
    상기 식에서,
    n은 1 내지 3의 정수이며,
    m은 0 또는 1이고,
    A는 페닐을 나타내고,
    R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
    R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
    R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
    R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
    R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
    R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    R3는 수소, 할로겐, 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 몰포리노, 피페라지논일(piperazinonyl)인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
    R4는 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C3-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2-에틸, 헤테로사이클이 티오몰포리노, 몰포리노, 피페라지논일(piperazinonyl), 또는 피롤리딘일인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며,
    R5는 수소, 또는 C1-C3-알킬이고,
    R6은 C1-C3-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 테트라하이드로-2H-피란, 또는 피페리딘일이고, R6이 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클인 경우, C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환되는, 난소의 항노화용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 난소의 항노화용 약학적 조성물.
    <1>5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <2>에틸 7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-카복실레이트; <3>(7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메탄올; <4>5-클로로-N,1-디메틸-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <5>4-((7-(사이클로펜틸아미노)-2-(3-플루오로페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)피페라진-2-온; <6>4-((2-페닐-7-(((테트라하이드로-2H-피란-4-일)메틸)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <7>5-클로로-N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민; <8>5-페녹시-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <9>5-클로로-3-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <10>2-(4-((5-플루오로-2-페닐-1H-인돌-7-일)아미노)피페리딘-1-일)에탄-1-올; <11>N-(4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄설폰아미드; <12>5-클로로-3-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <13>4-((2-(3-플루오로페닐)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <14>5-클로로-N-사이클로펜틸-2-(4-((1-메틸피페리딘-4-일)아미노)페닐)-1H-인돌-7-아민; <15>4-((7-(이소펜틸아미노)-2-(4-메톡시페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <16>N-(4-(7-(사이클로펜틸아미노)-5-((1,1-디옥시도티오몰포리노)메틸)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드; <17>4-((3-브로모-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <18>4-((5-클로로-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-3-일)메틸)피페라진-2-온; <19>4-((7-(메틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <20>5-메틸-N-(1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민; <21>N-(4-(5-(1,1-디옥시도티오몰포리노)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드; <22>4-((7-((1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <23>N1-(5-클로로-2-페닐-1H-인돌-7-일)-N4-메틸사이클로헥산-1,4-디아민; <24>메틸 2-(3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트; <25>(2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-카보닐)-D-프롤린; <26>(3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄올; <27>N-사이클로펜틸-2-페닐-5-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)-1H-인돌-7-아민; <28>메틸 2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트; <29>메틸 4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)벤조에이트; <30>2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)에탄-1-올; <31>3-브로모-5-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; 및 <32>4-((3-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드.
  4. 제1항에 있어서,
    화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물인, 난소의 항노화용 약학적 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2023001264-appb-img-000012
  5. 제1항에 있어서,
    상기 난소의 항노화는 노화가 진행된 난소의 기능을 회복시키는 것인, 난소의 항노화용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 난소의 항노화는 난포 수 증가; 난모세포의 수 증가; 및 착상 전 배아 발달 속도의 증가로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상이 구현되는 것인, 난소의 항노화용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 세포 내 장수 관련 유전자 (longevity-related genes)인 SOD2 및 SIRT1; 스테로이드 형성 관련 유전자 (steroidogenesis-related genes)인 Edn2, Tbxa2r, Oxtr 및 Adra1d; 원시 난포 관련 인자 (primordial follicle factors)인 Nanog, Oct3/4 및 p63; 및 난소 기능 관련 인자 (functional factors of ovary)인Lhcgr, AMH, GDF9, BMP15 및 Kitl; 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 난소의 항노화용 약학적 조성물.
  8. 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001264-appb-img-000013
    상기 식에서, R1 내지 R6, A, n 및 m은 각각 제1항에서 정의한 것과 동일하다.
  9. 제8항에 있어서,
    난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환은 조기 난소 부전, 불임, 난임, 유산, 난소 낭종, 난소 기형종, 난소내막종, 다낭성난소증후군, 폐경, 폐경기 증상, 난소암, 및 난소염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 난소의 노화 또는 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 난소의 항노화 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023001264-appb-img-000014
    상기 식에서, R1 내지 R6, A, n 및 m은 각각 제1항에서 정의한 것과 동일하다.
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