KR101363225B1

KR101363225B1 - 유전자 도입 벼 세포 배양액으로부터 재조합 인간 키모트립시노겐 ｂ２의 정제방법

Info

Publication number: KR101363225B1
Application number: KR1020120008771A
Authority: KR
Inventors: 엄태붕; 권태호; 임성근; 김용상
Original assignee: (주)엔비엠; 전북대학교산학협력단
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2014-02-17
Also published as: KR20130087709A

Abstract

본 발명은 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 인간 키모트립시노겐(Chymotrypsinogen) B2를 정제하는 방법으로서, (a) 벼 세포 배양 현탁액 내에서 가장 많이 존재하는 단백질인 a-아밀라아제(amylase)를 제거하기 위하여 세포 배양액을 강산으로써 pH 3으로 떨어뜨린 다음 12시간 동안 4℃로 냉장한 후에 원심 분리하는 단계; (b) 상기 원심분리단계에서 pH 조절된 배양액을 분자량 10,000Da 이상의 크기를 배제하는 한외여과에 의한 농축단계; 및 (c) 상기 농축단계에서 얻어진 농축액으로부터 강산성 양이온교환제(strongly acidic cation exchanger)인 Sulphopropyl-Sepharose에 흡착된 인간 유래 키모트립신노겐 B2를 단일 피크로 용출시키는 단계를 포함하고 있다.
본 발명에 의한 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 인간 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법은 단지 3단계만으로 이루어지므로 단순화된 경제적인 정제 공정으로서, 대량 배양액으로부터 정제가 용이하며, 평균 90% 순도로 재현성 있게 정제할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

유전자 도입 벼 세포 배양액으로부터 재조합 인간 키모트립시노겐 Ｂ２의 정제방법{Process for Purification of Recombinant Human Chymotrypsinogen Ｂ２ in Transgenic Rice Cell Suspension Culture}

본 발명은 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현되는 단백질 가수 분해 효소를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 인간 유래 키모트립시노겐(Chymotrypsinogen) B2를 정제하는 방법에 관한 것이다.

면역 특성 및 바이러스 등의 감염 관점에서 고려했을 때 의료 및 치료용 키모트립신(Chymotrypsin) 제제는 인간 췌장 유래의 키모트립시노겐을 사용하는 것이 소, 돼지, 양, 말 등 타(他) 동물 췌장으로부터 얻은 것보다 인체 친화적이다.

인간 키모트립시노겐 B2(hCTRB2)는 소화를 위해 췌장으로부터 비활성 형태로 분비되는 효소로서, 아미노산 서열 차이에 의해 같은 췌장으로부터 분비되는 키모트립시노겐 B(hCTRB1)와 구별된다. 이 효소는 그 자체로서 활성을 나타내지는 않지만, 트립신에 의해 활성화된 형태인 키모트립신으로 전환되며 그 용도는 단백질체 연구(proteomics), 분자 및 세포 생물학 연구, 또한 인체의 부종, 염증치료 등 의학 용도에 광범위하게 사용되는 고가의 효소이다. 현재 몇몇 회사들이 인간 세포 배양 또는 Chinese Hamster Ovary 세포 배양으로부터 생산된 95% 정제도의 인간 췌장 유래 재조합 키모트립시노겐 B를 생산하고 있으며, 이들 중 인간 세포 배양으로 생산하는 Novoprotein사(Shanghai, China)의 경우 판매가격은 $105/10㎍(2011년 12월 현재) 수준으로 고가이다.

한편, 동물 췌장으로부터 키모트립시노겐의 정제방법은 Kunitz 등(J. Gen. Physiol., 18:43, 1935)에 의해 최초로 개발된 이래 현재까지도 상업적인 용도로 사용되고 있다. 상기 방법은 황산암모늄 침전분획법을 사용하여 30~60% 사이에서 얻어지는 황산암모늄 분획 침전물을 녹인 후에 일정 농도의 황산암모늄과 에탄올을 이용하여 반복적으로 4차례 재결정하는 것이다. 그러나 이 방법은 일련의 재결정화 공정이 반복되므로 수율이 낮다는 단점과 함께 재결정 공정에 약 20일 정도의 너무 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 키모트립시노겐이 트립신 등에 의하여 키모트립신으로 변성되거나 다른 단백질 분해효소 등에 의하여 분해되는 등의 까다로운 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.

Curvers 등(Human chymotrypsinogen B production with Pichia pastoris by integrated development of fermentation and downstream processing. Part 1. Fermentation, Biotechnol . Prog . 17, 495-502, 2001)은 연속 배양법을 통해 효모 Pichia pastoris에서 인간 유래 키모트립시노겐 B를 과량 발현시켰다. Thmmes 등(Human chymotrypsinogen B production from Pichia pastoris by integrated development of fermentation and downstream processing. Part 2. Protein recovery, Biotechnol. Prog . 17, 503-512, 2001)은 이 효모 배양액으로부터 수용성 2상 분리법(aqueous two phase system)을 이용 키모트립시노겐 B를 정제하였으나, 사용했던 Pichia pastoris 균주 및 관련 단백질 발현시스템은 Research Corporation Technologies사(Tucson, Arizona, USA)가 다수의 특허를 보유하고 있어 상업적 사용 시에는 특허 사용료를 지불하여야 하며, 현재까지 이 효모를 이용한 정제 인간 유래 키모트립시노겐 B는 제품화되어 있지 않고 있는 실정이다.

또한 식물 세포에서 인간 유용 단백질 발현은 동물 유래 효소 추출 시 문제되는 광우병과 동물 바이러스 감염 문제, 세균이나 효모 등에서 재조합 효소 추출 시에 생길 수 있는 엔도톡신(endotoxin) 존재나 단백질 수식 문제를 극복할 수 있으며, 배지 성분의 단순화에 의한 정제 단순화와 배지 가격의 경제성 등 장점이 많다. 따라서 고가의 인간 유래 단백질을 식물세포에서 발현하려는 시도가 증가하고 있는 실정이며, M. S. Yang 등은 최근에 당 농도 결핍 시 고발현 promoter로 작용하는 벼의 RAmy 3D를 이용하여 인간 유래 재조합 단백질들을 벼 세포 배양 현탁액으로부터 고농도로 생산한 바 있다(Reduced protease activity in transformed rice cell suspension cultures expressing a proteinase inhibitor, Protein Expr . Purif . 53, 270-274, 2007. 등 다수).

본 발명자들은 대량의 식물 배양액으로부터 인간 유래 키모트립시노겐 B2를 경제적으로 얻기 위한 연구를 거듭한 결과, 최소한의 단순 공정을 유지하면서도 의료용으로 쓸 수 있을 정도의 순도를 얻는 방법을 개발하고자 하였다.

발현 벡터로서 RAmy 3D promoter를 사용한 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에는 당 결핍 시에 발현된 다량의 a-아밀라아제를 함유하고 있기 때문에 목적 단백질의 순수 정제를 어렵게 만들었다. 따라서 정제의 첫 단계는 배양액 내에 가장 많이 발현된 a-아밀라아제를 간단한 공정을 통해 1차적으로 제거하는 방법의 개발이 절실히 필요했다.

세포 배양액을 낮은 pH에서 일정시간 정치한 후에 침전시키면, 주로 a-아밀라아제가 제거되었고, 한외여과를 통해 상등액을 농축한 다음 같은 pH 하에서 설포프로필(Sulphopropyl)기를 가지는 강산성 양이온교환 크로마토그래피를 실시한 결과 대량 생산이 용이한 방식으로 고순도의 효소를 재현성 있게 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 유전자도입 벼 세포 배양 현탁액으로부터 재조합 인간 췌장 유래 키모트립시노겐 B2의 정제방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적과 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 특허청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유전자 도입 벼세포 배양 현탁액으로부터 인간 유래 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다:

(a) 벼 세포 배양액을 강산(强酸)으로써 pH 3으로 조정한 후에 4℃에서 12시간 정치하여 원심분리하는 단계;
(b) 상기 원심분리단계에서 얻어진 상기 벼 세포 배양액을 한외여과막을 사용하여 염 및 불순물을 제거하고 농축하는 단계;
(c) 상기 농축단계에서 얻어진 상기 벼 세포 배양액을 강산성 양이온교환체를 사용하여 키모트립시노겐 B2를 흡착시키는 단계.

또한 본 발명은 상기 강산이 염산, 황산, 질산 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 키모트립시노겐 B2가 인간으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 한외여과막의 재질이 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 또는 재생셀룰로오스(regenerated cellulose)인 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 강산성 양이온교환체가 설포프로필(Sulphopropyl)기를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 농축단계가 분자량 10,000Da 이상의 크기를 배제하는 한외여과막을 사용하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 흡착단계가 1M NaCl을 포함하는 완충액으로 이온세기 구배를 이용하여 실시함으로써 인간 유래 키모트립시노겐 B2가 단일 피크로 용출되는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

삭제

또한 본 발명은 상기 흡착단계가 pH 2.5~3.5에서 실시하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법을 제공한다.

삭제

유전자 도입 벼 세포 배양액으로부터 재조합 인간 유래 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법인 본 발명은 단지 3단계만으로 이루어지므로 단순화된 경제적인 정제 공정으로서, 대량 배양액으로부터 정제가 용이하며, 평균 90% 순도로 재현성 있게 정제할 수 있는 우수한 효과가 있다.

[도 1]은 인간 키모트립시노겐 B2 유전자가 도입된 벼 세포주 F105-10b의 배양 상등액을 pH 3(◆), pH 7(■), pH 10(▲)으로 조정한 뒤 시간에 따른 단백질 농도의 상대적 변화를 관찰한 그림이다.
[도 2]는 인간 키모트립시노겐 B2 유전자가 도입된 벼 세포주 F105-10b의 배양 상등액을 pH 3(◆), pH 7(■), pH 10(▲)으로 조정한 뒤 시간에 따른 아밀라아제의 효소 활성의 상대적 변화를 관찰한 그림이다.
[도 3]은 인간 키모트립시노겐 B2 유전자가 도입된 벼 세포주 F105-10b의 배양 상등액을 pH 3(◆), pH 7(■), pH 10(▲)으로 조정한 뒤 시간에 따른 키모트립신 활성의 상대적 변화를 관찰한 그림이다.
[도 4]는 pH 3으로 조정한 후 농축한 시료를 SP-Sepharose HP 칼럼에 주입했을 때 분리되는 단백질들의 크로마토그램이다. 점선은 전도도 세기를 나타내며, 키모트립시노겐 B2활성을 보이는 분획 범위는 화살표로 표시되어 있는바, 이는 다른 피크들로부터 독립된 피크로서 키모트립시노겐 B2 활성이 있음을 알 수 있다.
[도 5]는 본 발명의 방법에 따라 SP-Sepharose 칼럼에서 정제된 분획을 SDS-PAGE한 결과이다. Lane 1, 6, 10은 단백질 마커이고, lane 2는 pH 조절 후 세포 배양 농축액(10 x)이며, lane 3, 4, 5는 SP-Sepharose HP 크로마토그래피에서 키모트립시노겐 B2 활성 분획을 7㎍, 14㎍, 21㎍ 씩 각각 주입했을 때의 단백질의 순도를 나타내고, lane 6, 7, 8은 각 7㎍, 14㎍, 21㎍의 키모트립시노겐 B2 분획을 트립신으로 가수분해한 후에 활성화된 키모트립신 B2를 보이고 있다.

본 발명은 벼 세포 배양 현탁액에서 인간 유래 키모트립시노겐 B2를 고순도로 정제하는 방법에 관한 것으로서, 특히 재현성이 뛰어나고, 단순화된 공정으로 대량 정제가 용이할 뿐만 아니라 고순도로 정제할 수 있는 3단계로 이루어진 정제방법에 관한 것이다.

본 발명의 정제방법 중 하나는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 당 결핍 시에 다량 발현된 a-아밀라아제를 단순하면서도 경제적으로 감소하는 방법을 찾는 일이다. 4℃에서 강산을 이용하여 pH를 2.5~3.5의 범위로 조절하게 되면, a-아밀라아제는 활성 감소와 함께 침전이 일어나는 반면에, 키모트립시노겐 B2는 활성 변화가 없다. 그러나 pH 7~8로 배양액을 조정한 경우에는 정치 시간에 따라 a-아밀라아제 활성 감소는 거의 없는 반면에, 키모트립시노겐 B2의 활성 감소는 지속된다. 전체적으로 배양액을 pH 2.5~3.5로 조정하면, 시간에 따라 단백질 함량은 a-아밀라아제 등의 침전으로 인해 절반으로 감소하게 되며, 키모트립시노겐 B2와 a-아밀라아제의 활성을 고려했을 때 가장 바람직한 범위는 pH 3이다. 이때 pH를 조절하기 위해 사용되는 강산으로서는 염산, 황산, 질산 등에서 선택된 어느 하나의 산이 사용될 수 있으나, 그 중 바람직한 것은 염산이며, 이는 값싸고 사용이 용이하여 일반적으로 대부분의 완충액으로 가장 널리 이용되고 있다.

pH 3에서 12시간 정치한 이후에는 키모트립시노겐 B2의 활성은 변화가 없지만, a-아밀라아제의 활성 감소나 전체 단백질 감소는 더 이상 일어나지 않는다. 따라서 벼 세포 배양 현탁액을 pH 3으로 조정한 다음 12시간 이후에는 침전을 제거하고 다음 농축 단계로 들어갈 수 있다.

pH 조절로 a-아밀라아제를 포함한 단백질들을 제거한 벼 세포 배양액은 대량 정제의 경우 처리 양이 많고 염을 포함하고 있기 때문에 직접적으로 컬럼 크로마토그래피에 투입할 수 없다. 배양액량을 줄이고 염 농도를 낮추기 위해서는 동결 건조방법보다 한외여과가 유리하다. 동결 건조 농축 시에는 염의 농도가 더 높아져 다음 단계인 크로마토그래피에 적용할 수 없으므로 탈염공정이 새롭게 첨가되어야 하고, 대량 처리가 어려우며, 농축시간이 길고, 에너지 비용도 높아진다. 따라서 본 발명에서는 대량의 시료를 짧은 시간 안에 처리할 수 있고 농축과 탈염이 동시에 일어나며, 에너지 비용이 낮은 한외여과 방식을 사용해 농축과 탈염을 실시한다.

발현된 재조합 키모트립시노겐 B2는 263개의 아미노산으로 구성되며 예상 분자량은 27,930Da이다. 식물 세포 배양액 농축과 탈염에 상업적으로 이용할 수 있는 여러 분자량 크기를 배제하는 한외여과막들 중에서, 분자량 10,000Da 이상의 크기를 배제하는 한외여과막을 사용하는 것이 키모트립시노겐 B2 회수(회수율 약 92%)에 가장 적당하다. 한외여과막의 재질로서는 상업적으로 널리 시판되고 있는 폴리에테르설폰(polyethersulfone)과 재생셀룰로오스(regenerated cellulose)가 있으나, 이들은 단백질의 회수율 면에서 서로 차이는 없다.

탈염된 효소 농축액은 전기영동 결과 다수의 단백질 불순물들을 함유하고 있으므로 키모트립시노겐만을 선택적으로 분리할 수 있는 컬럼 크로마토그래피용 수지(resin)의 선정이 필요하다. 키모트립시노겐 B2의 정제를 위한 최적 수지를 찾기 위하여 강산성 양이온교환제인 S-Sepharose(GE), SP-Sepharose(GE), Capto S(GE), Capto SP(GE), 약산성 양이온교환제인 CM-Sepharose(GE), 분자 크기배제 수지인 HiPrep Sepharose S-200 HR (GE), P-40(Bio-Rad), 소수성 상호반응 수지인 Phenyl-Sepharose(GE), Octyl-Sepharose(GE), 강염기성 음이온교환제인 Q-Sepharose(GE), Capto Q, 약염기성 음이온교환제인 디에틸아미노에틸 셀룰로오스(Diethylaminoethyl cellulose, DEAE) Sepharose(GE)를 크로마토그래피용 수지로 각각 사용하였다. 수지 종류, 용출 완충액의 pH, 용출 완충액의 이온 강도 세기에 따라 달라지는 각 정제 크로마토그램의 형태, 분획 활성값과 그 활성 분획들의 SDS(sodium dodecyl sulfate) 전기영동 결과들을 비교하면서 정제 난이도를 비교하였으며, 이때 대량 정제를 위한 시료 처리의 용이성과 수지 가격의 경제성도 함께 고려하였다.

키모트립시노겐 B2의 정제를 위해 바람직한 수지는 설포프로필기를 함유하는 강산성 양이온교환제이며, 그 이유는 첫째, 컬럼 수지에 효소의 흡착을 위한 완충액 pH와 염 농도가 한외여과 후에 배양 농축액과 같아 따로 시료 pH나 농도를 조절할 필요 없이 바로 수지에 적용할 수 있으며, 둘째, 강산성 양이온교환제이므로 분자크기배제 수지와 달리 대용량 부피의 한외여과 농축액 성분들을 수지에 흡착시킬 수 있고, 셋째, 효소 활성 분획이 다른 단백질 피크들과 겹치지 않고 독립된 피크를 보일 뿐 아니라 SDS 전기영동 상에서 평균 90%의 정제 순도를 보이며, 넷째, 반복된 정제에서도 항상 재현성 있는 피크 모양을 나타내기 때문이다.

설포프로필기를 함유하는 강산성 양이온 교환제의 키모트립시노겐 B2의 흡착방식은 컬럼 크로마토그래피 방식이나 배치(batch) 방식으로 구현할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피 방식에 따르면, 수지를 충전(充塡)한 칼럼에 조 추출액을 통과시켜 흡착과정을 실시할 수 있고, 배치 방식에 따르면 수지와 조추출액을 용기 내에서 혼합함으로써 흡착 과정을 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현에 따르면 상기 흡착 단계는 칼럼 크로마토그래피 방식으로 실시한다.

단백질 흡착에 관여하는 설포프로필기 pKa 값은 2.3으로 넓은 pH 범위에서 이온화 특성을 유지하지만, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 pH 2.5~3.5의 단계에서 실시한다. 이때 pH가 2.5보다 낮아지면 키모트립시노겐 B2의 변성이 일어나 SP-Sepharose 안정성이 문제되고, pH가 3.5를 초과하게 되면 a-아밀라아제의 제거량이 감소하는 문제점이 발생한다.

설포프로필기 함유 강산성 양이온교환 크로마토그래피에는 소듐 시트르산(sodium citrate) 완충액 또는 글리신-HCl 완충액이 사용될 수 있으며 상기 pH 범위에서 완충능력을 가진다. 이들 중 키모트립시노겐 B2의 정제를 위해 상기 흡착단계는 소듐 시트르산 완충액이 가장 바람직하다.

상기 흡착단계의 용출(즉, 탈착)과정은 pH 변화, 이온 세기 변화, 또는 이 둘의 조합에 의해 실시할 수 있다. pH 변화 또는 이온 세기 변화를 이용하여 탈착과정을 실시하는 경우에는, 스텝(stepwise) 또는 연속적(continuous) pH 구배를 이용한다. 이온세기 변화를 주는 경우에는 소듐염(예컨대 NaCl)의 사용이 적합하다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면 키모트립시노겐 B2 용출은 이온 세기 구배를 이용하여 용출한다. 효소 용출을 위해 가장 바람직한 이온 세기 농도 구배는 0→1M NaCl이다.

키모트립시노겐 B2를 SP-양이온 수지로부터 용출시키는 상기 조건들은 제조회사에 따른 수지 형태나 용출 온도 등에 따라 달라질 수 있으므로 경험적으로 결정하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

키모트립시노겐 B2의 정제

<공정 1> : 벼 세포 배양 후 배양액의 pH 조정

인간 유래 키모트립시노겐 B2 유전자를 도입한 벼 세포주들 가운데 Nothern blot에서 mRNA 확인과 Western blot에서 단백질 발현을 확인한 다음, 키모트립신 활성이 가장 높았던 F105-10b 세포주를 배양하였다. 배양은 L 당 2mg 2,4-디클로로페녹시아세트산(dichlorophenoxyacetic acid), 0.02mg 키네틴(kinetin)과 3% 자당을 함유하는 N6 배지와 28℃, 110rpm 조건에서 암실 배양하였고 매 9일마다 계대배양을 하였다. 계대배양한 배지로부터 배양액만을 제거한 뒤에 자당을 함유하지 않은 새 N6 배지에 세포 농도가 10%(w/v) 되게 첨가함으로써 키모트립시노겐 B2 발현을 유도하였다. 배양액은 여과지(미국 3M사 제품)로 여과한 후에 분리정제에 각각 사용하였다.

pH 7.5의 각 배양액은 여과한 후에 염산을 첨가하여 pH 3으로 조정하였고 4℃에서 12시간 정치한 다음 16,000 x g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 대량으로 발현되어 키모트립시노겐 B2 효소 정제를 방해하는 a-아밀라아제의 제거 조건을 찾기 위해 배양액을 각 pH별로 조정한 다음 원심분리하고 배양 상등액의 총 단백질량, a-아밀라아제 활성, 키모트립신 활성을 시간에 따라 조사한 결과를 [도 1] 내지 [도 3]에 나타내었다.

배양액 중에서 총 단백질량과 a-아밀라아제 활성을 최대로 줄이면서 키모트립신 활성을 유지하기 위해서는 pH 3.0, 4℃에서 12시간 이상 정치하는 것이 최적 조건이었다.

<공정 2> : 한외여과막을 이용한 pH 조정액의 농축

원심분리 후에 얻어진 식물 배양액 5L를 폴리에테르설폰(PES) 재질의 한외여과막(분자량 10,000Da 이상은 배제)을 이용하여 수율 90~94% 수준에서 약 10배로 농축하였다. 분자량 30,000Da과 50,000Da 이상을 배제하는 한외여과막을 각각 농축에 사용한 경우 회수율은 각각 85~88%, 64~70% 수준으로 나타났으며, 키모트립시노겐 B2의 농축에는 분자량 10,000Da 이상을 배제하는 한외여과막이 가장 적합하였다. 그러나 분자량 10,000Da 이상을 배제하는 한외여과막의 경우에는 회수율이 재생셀룰로오스(RC) 91~93%, 폴리에테르설폰(PES) 90~94%로서 이들 간의 회수율 차이는 없었다.

<공정 3> : 이온교환 크로마토그래피를 이용한 키모트립시노겐의 정제

식물 세포 배양액 내의 키모트립시노겐 B2의 정제를 위한 최적 수지를 선정하기 위하여 여러 pH 값과 이온농도를 가지는 완충액의 조건에서 강산성 양이온교환제인 S-Sepharose(GE), SP-Sepharose(GE), Capto S(GE), Capto SP (GE), 약산성 양이온 교환제인 CM-Sepharose (GE), 분자크기 배제수지인 Sepharose S-200 HR(GE), P-40 (Bio-Rad), 소수성 상호 반응수지인 Phenyl-Sepharose(GE), Octyl-Sepharose(GE), 강염기성 음이온교환제인 Q-Sepharose(GE), Capto Q, 약 염기성 음이온 교환제인 DEAE Sepharose (GE)의 정제 특성을 SDS-전기영동, 피크 분해능, 효소 활성을 통하여 비교하였다.

사용한 완충액으로는 Quaternary Ammonium 및 디에틸아미노에틸(Diethylaminoethyl) 수지의 경우 완충액 A(0.1M Tris-HCl 완충액, pH 8.0)와 선형 농도 경사를 위한 완충액 B(완충액 A + 1M NaCl), S-수지와 SP-수지 계열의 경우 완충액 A(50mM 소듐 시트르산 완충액, pH 3.0)와 선형농도경사를 위한 완충액 B(완충액 A + 1M NaCl), Phenyl- 및 Octyl-수지의 경우 완충액 A(50mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0 + 1M (NH)₄SO₄)와 선형 농도 경사를 위한 완충액 B(50mM Tris-HCl 완충액, pH 8.0), 분자크기 배제 수지의 경우 완충액 A(50mM 소듐 시트르산 완충액, pH 3.0 + 0.2M NaCl)를 사용하였다.

상기 컬럼 수지들에서 크로마토그래피 결과, [도 4]에서와 같이 SP-Sepharose 및 SP-수지를 사용한 경우에만 다른 단백질 피크들과 분리된 키모트립시노겐 B2 함유 단백질 피크만을 얻을 수 있었다. 또한 분리된 피크는 트립신 처리 시(0.1U/ml) 효소 활성을 나타냈으며, 10% SDS-전기영동 겔 상에서 나타난 밴드들을 덴시토메터(Bio-Rad, USA)로 정량한 결과 분자량 약 26,000Da의 키모트립시노겐 B2 효소를 포함하는 정제 분획은 90% 순도를 보였음을 [도 5]로부터 알 수 있다.

키모트립시노겐 B2의 대량 분취를 위해 pH 조정 농축액을 SP-Sepharose High Performance 칼럼(5cm x 15cm)을 통해 분리하였다. pH 3.0의 50mM 소듐 시트르산 완충액(완충액 A)으로 칼럼을 평형화한 후 완충액 A에 1M NaCl을 첨가한 완충액 B를 사용하여 20㎖/분의 유속에서 50분 동안 시간에 따른 선형 농도 경사로 키모트립시노겐 B2를 용출하였다. 키모트립시노겐 B2 자체는 활성을 나타내지 않기 때문에 각 분획 ㎖ 당 0.1 unit의 트립신을 첨가하고 30℃에서 30분간 반응시킨 다음에 효소 반응을 측정하였다. 5L 벼 세포 배양액으로 부터 88~93% 순도로 정제된 키모트립시노겐 B2의 함량은 약 14mg(2.8mg/L)이었다.

<실험예 1> : 키모트립시노겐 B2 활성 측정

키모트립시노겐 B2의 역가 측정은 기질로 0.2M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 녹인 10mM N-succinyl-alanyl-alanyl-phenylalaninyl-p-nitroaniline 200㎕, 효소 시료 200㎕를 섞은 후에 37℃에서 30분간 반응시키고, 20% 초산 200㎕ 를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응액은 405nm의 흡광도에서 측정하였다. 별도로 0.2M Tris-HCl, pH 8.0 200㎕, 증류수 200㎕, 20% 초산액 200㎕에 녹인 농도별 p-nitroaniline의 발색도를 405nm에서 측정하여 표준 곡선을 만들었고 반응시료의 발색도를 비교함으로써 시료 중 키모트립시노겐 B2의 활성도를 측정하였다. 1 unit(U)는 37℃에서 분당 기질 1μmol을 가수분해하는 효소량으로 정의하였다. 상기 실시예에서 최종적으로 얻은 키모트립시노겐 B2의 역가는 36U/mg이었다.

<실험예 2> : a-아밀라아제의 활성 측정

a-아밀라아제 역가 분석은 기질로 0.05%(w/v) CaCl₂가 함유된 1%(w/v) soluble starch 1㎖에 시료 10㎕를 넣고 50℃에서 20분간 반응시켰다. 반응액 중 100㎕를 취해 900㎕ 48mM 3,5-dinitrosalicylic acid 용액 넣고 100℃에서 20분간 끓인 다음 식혀서 570nm에서 측정(Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal . Chem . 31, 426-428, 1959)하였다. 1 unit(U)는 반응 조건에서 1분간 0.01 Abs_570nm 변화를 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 상기 실시예에서 pH 3.0, 7.5, 10.0으로 조정된 벼세포 배양 상등액의 각 a-아밀라아제의 활성은 0.5U/㎖, 8.8U/㎖, 8.5U/㎖이었으며, 최종 정제된 키모트립시노겐 B2 용액 중 a-아밀라아제 활성은 0 U/㎖이었다.

<실험예 3> : 단백질 정량

단백질 정량은 Bradford 방법(Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram qualtities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal . Biochem . 72, 248-254, 1976.9)을 사용하여 595nm에서 측정하였고, 표준 정량곡선으로 소 혈청 알부민을 사용하였다. 상기 실시예에서 5L 배양액에서 최종 분획된 48의 정제 키모트립시노겐 B2의 단백질 농도는 0.29mg/㎖이었다.

<실험예 4> : 단백질 전기영동

단백질 전기영동은 10% SDS-gel을 사용하여 Laemmli 방법(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-685, 1970.10)에 따라 200V에서 수행하였다. 표준 곡선은 10종류 SDS-전기영동용 분자량 마커의 겔 이동 거리와 log(마커 분자량)로 작성하였고 정제 단백질의 상대적 이동 거리를 표준곡선에 대입하여 분자량을 계산하였다. 상기 실시예에서 최종 정제된 키모트립시노겐 B2의 추정 분자량은 약 26,000Da이었다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법:
(a) 벼 세포 배양액을 강산으로써 pH 3으로 조정한 후에 4℃에서 12시간 정치하여 원심분리하는 단계;
(b) 상기 원심분리단계에서 얻어진 상기 벼 세포 배양액을 한외여과막을 사용하여 염 및 불순물을 제거하고 농축하는 단계;
(c) 상기 농축단계에서 얻어진 상기 벼 세포 배양액을 강산성 양이온교환체를 사용하여 키모트립시노겐 B2를 흡착시키는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 키모트립시노겐 B2는 인간으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 강산은 염산, 황산, 질산 중에 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 한외여과막은 그 재질이 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 또는 재생셀루로오스(regenerated cellulose)인 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 강산성 양이온교환체는 설포프로필(Sulphopropyl)기를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 농축단계는 분자량 10,000Da 이상의 크기를 배제하는 한외여과막을 사용하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 흡착단계는 1M NaCl을 포함하는 완충액으로 이온세기 구배를 이용하여 실시함으로써 인간 유래 키모트립시노겐 B2가 단일 피크로 용출되는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 흡착단계는 pH 2.5~3.5에서 실시하는 것을 특징으로 하는 유전자 도입 벼 세포 배양 현탁액에서 발현된 재조합 키모트립시노겐 B2를 정제하는 방법.
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