KR101361355B1 - Ｒａｇｅ 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진행성 당화 최종 생성물 수용체 (RAGE)의 활성화와 관련된 질환을 위한 신규 치료제 및 치료 방법을 제공한다.
Description
본 출원은 특허 번호 60/943,994 (2007년 6월 14일 출원)에 대한 미국 가출원을 우선권으로 청구하고, 이의 전체적인 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
본 발명은 일반적으로 진행성 당화 최종 생성물(advanced glycation end product) ("AGE")에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체 ("RAGE")를 포함하는 특정 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 AGE 및 기타 RAGE 리간드 (예를 들어, S100 및 HMGB1)에 결합하고, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 조성물은 질환의 치료에 사용될 수 있다.
진행성 당화 최종 생성물 (AGE)은 단백질의 비-효소적 당화 및 산화의 결과이다. 이는 자가면역 결합 조직 질환에서의 상황을 비롯한 스트레스 관련 상황 하에서 나타나고, 염증 조직에서 산화 또는 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 경로로 인해 형성될 수 있다. AGE는 다수의 당뇨병 관련 합병증에 연루되었다. 예를 들어, 당뇨성 신병증의 특징적인 구조적 변화인 두꺼워진 사구체 기저막 및 간질 확장에 AGE의 축적이 동반되어, 사구체경화증 및 사이질 섬유증에 이른다. 당뇨병이 아닌 래트에 AGE를 장기간 주입하면 유사한 형태학적 변화 및 상당한 단백뇨가 발생되었다. AGE 억제제 예컨대 아미노구아니딘은 당뇨병 동물 모델에서 당뇨성 신병증을 방지하는 것으로 나타났고, 이는 최근에 당뇨병 환자에 대한 한 임상 시험에서도 나타났다. 또한, AGE는 당뇨성 망막병증에 대한 잘 입증된 치료 표적이다. 광범위한 당뇨병 뮤린(murine) 및 래트 연구에서 이러한 질환을 치료하는데 있어서 AGE 형성을 억제하는 것의 이점이 실연되었다.
죽상경화증은 당뇨병 환자에서 상당히 가속화되고, 심혈관 및 뇌혈관 사망률의 더 큰 위험과 관련된다. 동물 및 인간 연구에서 AGE가 죽상경화 병변의 형성 및 진행에서 상당한 역할을 한다는 것이 제안되었다. 당뇨성 혈관 조직에서의 증가된 AGE 축적이 내피 세포, 대식세포, 및 평활근 세포 기능에서의 변화와 관련되었다.
AGE는 단핵구, 대식세포, 미세혈관계의 내피 세포, 평활근 세포, 간질 세포, 및 뉴런 상의 세포 표면 수용체와 상호작용한다. 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체 (RAGE)는 세포 표면 수용체의 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이다. RAGE는 3개의 세포외 면역글로불린-유사 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달에 수반되는 세포질 도메인으로 구성된다. RAGE는 AGE에 더하여 S100/칼그라눌린, 암포테린/HMGB1, 및 아밀로이드 원섬유가 포함되는 다중 리간드에 결합한다. RAGE는 NF-κB를 수반하는 신호 케스케이드를 통해 작용한다. RAGE 발현이 RAGE 리간드의 존재 하에 상향-조절되고, 류머티스성 관절염 (RA) 환자의 관절에서 상승된다.
RAGE에는 가용성 RAGE (sRAGE)로 칭해지는, 막횡단 도메인이 없는 분비형 이소형(isoform)이 있다. sRAGE의 투여는 상처 치유를 복원시키고 ([Goova, et al. (2001) Am. J. Pathol. 159, 513-525]), 당뇨성 죽상경화증을 억제하는 것으로 나타났다 ([Park, et al. (1998) Nat Med. 4(9):1025-31). RAGE 리간드 결합 요소 및 면역글로불린 요소로 구성된 융합 단백질이 WO 2004/016229 A2 (Wyeth (Madison, NJ)) 및 미국 특허 출원 공개 2006/0057679 A1 (O'Keefe, T. 등)에 논의되어 있다.
AGE-매개 질환, 예컨대 상승된 양의 AGE와 관련된 질환의 신규 치료 방법이 요구된다. 이러한 요구 및 기타 요구가 본 발명에 의해 충족된다.
발명의 개요
본 발명은 상승된 양의 AGE와 관련된 질환의 치료를 위한 물질 및 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유류의 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체 (RAGE) 리간드 결합 도메인에 대해 95％ 이상 동일하고, RAGE 리간드에 결합할 수 있는 제1 아미노산 서열; 및 (b) 인간 중쇄 면역글로불린 IgG4 불변 도메인에 대해 95％ 이상 동일한 제2 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 하나 이상 포함하고, 이때 제1 아미노산 서열이 야생형 RAGE 리간드 결합 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이에 링커(linker)를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RAGE 리간드 결합 도메인은 포유류 RAGE, 예를 들어, 인간 RAGE로부터 유래된 것일 수 있다. 적절한 포유류 RAGE 리간드 결합 도메인은 서열 6의 아미노산 1-344 또는 서열 6의 아미노산 24-344를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6 및 서열 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은 서열 6 또는 서열 8을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은 서열 6 또는 서열 8로 구성된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 RAGE 아미노산 서열과 IgG4 아미노산 서열 사이에 링커를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자), 뿐만 아니라 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포가 본 발명에서 또한 구현된다.
본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 AGE에 의해 매개되는 질환의 치료 방법을 제공한다. 이같은 질환에는 대상, 예를 들어, 포유류 예컨대 인간에서의 증가된 양의 AGE를 특징으로 하는 모든 질환이 포함된다. AGE-매개 질환의 치료 방법은 AGE-매개 질환에 걸린 대상에게 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 치료상 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 질환의 예로는 당뇨성 신병증, 류머티스성 관절염, 및 자가면역 질환 예컨대 피부염, 사구체신염, 다발성 경화증, 포도막염 안염, 자가면역 폐 염증, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 자가면역 눈 염증, 전신성 홍반 루푸스, 인슐린 내성, 류머티스성 관절염, 당뇨성 망막병증 및 피부경화증이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 임의의 본 발명의 융합 단백질이 본 발명의 방법의 실행에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 서열 6 또는 서열 8을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 본 발명의 방법이 실행될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 서열 6 또는 서열 8로 구성된 융합 단백질을 사용하여 본 발명의 방법이 실행될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명은 RAGE에 결합된 리간드의 수준을 저하시키는 것을 필요로 하는 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 RAGE에 결합된 리간드의 수준을 저하시키는 방법을 제공한다. 이같은 방법은 포유동물에게 RAGE 리간드를 저하시키는 양의 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 이러한 벡터로 형질전환되었거나, 이러한 벡터가 형질도입되었거나, 또는 이러한 벡터로 형질감염된 숙주 세포; 및 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질감염되었거나, 이러한 핵산이 형질도입되었거나, 또는 이러한 핵산으로 형질감염된 숙주 세포를 융합 단백질의 발현을 초래하는데 적절한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
추가로 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방사성동위원소, 킬레이터, 독소, 플루오로크롬, 바이오틴, 펩티드 에피토프 예컨대 his-태그(tag), myc-태그, 또는 당이 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 본 발명의 융합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 또다른 실시양태에는 생물학적 반감기 또는 기능을 변경하기 위한 목적으로 또다른 단백질과 융합된 본 발명의 융합 단백질, 및 융합 단백질의 글리코실화 변이체가 포함된다.
본 발명의 이러한 양상 및 기타 양상이 하기의 상세한 설명을 참조로 명백해질 것이다.
도 1은 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 백혈구울혈에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 2a-2d는 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 다양한 망막층에서의 망막 혈관 투과성에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 망막 단백질의 질화에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 ICAM의 망막 발현에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a는 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 망막 조직 1 ㎟ 당 관찰된 무세포 모세혈관의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 5b는 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 관찰된 모세혈관 세포 1000개 당 유령 혈관주위세포의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 접촉 역치에 대한 50％ 응답에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 실시예 3의 실험 프로토콜을 나타내는 순서도를 제공한다.
도 8은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 테스트 동물 중량에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 9는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절염의 발생률에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절염의 발병에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관절염의 발생률에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 12는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관절염의 중증도에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 13은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관찰된 관절염 발의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 14A-14D는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 증가되는 양의 융합 단백질의 함수로서 관절 형태학에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 현미경사진이다.
도 15는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 윤활막염 (흑색 막대) 및 판누스 (회색 막대)에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 가장자리 미란 (흑색 막대) 및 구조적 변화 (회색 막대)에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 17은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 전체적인 조직학적 관절염 점수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 18은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절 매트릭스 단백질 손실에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 19A-19D는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절 매트릭스 단백질 손실에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 톨루이딘 블루 염색 절편의 현미경사진이다.
도 2a-2d는 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 다양한 망막층에서의 망막 혈관 투과성에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 망막 단백질의 질화에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델에서 ICAM의 망막 발현에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a는 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 망막 조직 1 ㎟ 당 관찰된 무세포 모세혈관의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 5b는 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 관찰된 모세혈관 세포 1000개 당 유령 혈관주위세포의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 10개월의 당뇨병 후 당뇨병 마우스에서 접촉 역치에 대한 50％ 응답에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 실시예 3의 실험 프로토콜을 나타내는 순서도를 제공한다.
도 8은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 테스트 동물 중량에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 9는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절염의 발생률에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절염의 발병에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관절염의 발생률에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 12는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관절염의 중증도에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 13은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 시간의 함수로서 관찰된 관절염 발의 수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 선 그래프이다.
도 14A-14D는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 증가되는 양의 융합 단백질의 함수로서 관절 형태학에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 현미경사진이다.
도 15는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 윤활막염 (흑색 막대) 및 판누스 (회색 막대)에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 가장자리 미란 (흑색 막대) 및 구조적 변화 (회색 막대)에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 17은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 전체적인 조직학적 관절염 점수에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 18은 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절 매트릭스 단백질 손실에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 19A-19D는 제II형 콜라겐 유도 관절염 마우스 모델에서 관절 매트릭스 단백질 손실에 대한 예시적인 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 나타내는 톨루이딘 블루 염색 절편의 현미경사진이다.
정의
본원에서 사용된 용어 "진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체" 또는 RAGE는 아미노산 서열이 천연 포유류 RAGE 아미노산 서열과 실질적으로 유사하고 리간드-수용체 특이적 방식으로 하나 이상의 RAGE 리간드에 결합하는 기능을 하는 단백질을 지칭한다. 용어 "진행성 당화 최종 생성물" 및 "AGE"는 하기 기술되는 바와 같은 단백질, 지질 및 핵산의 유리 아미노기와 환원당의 비-효소적 반응으로부터 형성된 분자들의 이종성 군을 지칭한다.
본원에서 사용된 "RAGE 리간드 결합 도메인" 또는 "RAGE-LBD"는 리간드-수용체 특이적 방식으로 RAGE 리간드에 결합하는 능력이 유지된, 임의의 포유류 RAGE 단백질 또는 포유류 RAGE 단백질의 임의의 일부분을 지칭한다. 구체적으로, RAGE 리간드 결합 도메인에는 막횡단 RAGE 단백질의 하나 이상의 세포외 도메인이 있는 폴리펩티드가 비제한적으로 포함된다. 표 6을 참조로, 적절한 RAGE-LBD는 적어도 서열 6의 아미노산 1-99, 또는 아미노산 24-99, 또는 아미노산 1-208, 또는 아미노산 24-208, 또는 아미노산 1-301, 또는 아미노산 24-301, 또는 아미노산 1-344 또는 아미노산 24-344를 포함할 수 있다.
융합 단백질의 순도를 정의하기 위해 본 명세서의 문맥에서 사용된 용어 "단리된"은 세포 배양 배지에서의 융합 단백질의 발현 동안 존재하는 다른 단백질이 실질적으로 없는 것을 비제한적으로 포함하여, 단백질에 생산 동안 이와 회합되는 다른 단백질이 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 단리된 단백질은 생산 공정의 잔류물인 단백질 오염물을 1-25 질량％, 20-25 질량％, 15-20 질량％, 10-15 질량％, 5-10 질량％, 1-5 질량％ 또는 약 2 질량％ 미만으로 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 단리된 단백질을 포함하는 조성물은 안정화제, 담체, 부형제 또는 공동-치료제로서 첨가된 다른 단백질을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하다.
본원에서 사용된, 질환 또는 장애를 "치료하는 것"은 대상의 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상을 개선하는 것을 지칭한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적합한 경우의 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 이 용어는, 등가물로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체, 및 기술될 실시양태에 적용가능한 경우의 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다.
용어 "또는"은, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "동일성 백분율"은 2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 뉴클레오티드 서열들 간의 서열 동일성을 지칭한다. 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 동일성 백분율로서의 표현은 비교되는 서열들이 공유하는 위치에서의 동일한 아미노산 또는 핵산의 개수의 함수를 지칭한다. FASTA, BLAST, 또는 ENTREZ를 포함하여 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램을 사용할 수 있다. FASTA 및 BLAST는 GCG 서열 분석 패키지 (University of Wisconsin (Madison, Wis.))의 일부로서 입수가능하고, 예를 들어, 디폴트 셋팅과 함께 사용될 수 있다. ENTREZ는 <National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health (Bethesda, Md)>를 통해 입수가능하다. 한 실시양태에서, 갭(gap) 가중치를 1로 하여 GCG 프로그램에 의해 2개의 서열의 동일성 백분율을 결정할 수 있고, 예를 들어, 각각의 아미노산 갭이 2개의 서열 간의 단일 아미노산 또는 뉴클레오티드 미스매치인 것처럼 가중치를 받는다.
기준 서열 또는 기준 서열의 하위서열(subsequence)을 테스트 서열 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 등)과 비교함으로써 서열 동일성을 결정할 수 있다. 비교 창으로 칭해지는 임의의 개수의 잔기에 걸쳐 기준 서열 및 테스트 서열이 최적으로 정렬된다. 최적의 정렬을 수득하기 위해, 부가 또는 결실, 예컨대 갭이 테스트 서열 내로 도입될 수 있다. 양쪽 서열에 동일한 잔기가 존재하는 위치의 개수를 결정하고, 매칭되는 위치들의 개수를 비교 창 내의 서열의 전체 길이로 나누고, 100을 곱하여 백분율을 제공함으로써 서열 동일성 백분율이 결정된다. 매칭되는 위치들의 개수에 더하여, 갭의 개수 및 크기가 서열 동일성 백분율을 계산하는데 또한 고려된다.
컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 동일성이 전형적으로 결정된다. 대표적인 프로그램은 <National Center for Biotechnology Information> (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공개적으로 접근가능한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램이다. 이러한 프로그램은 테스트 서열 내의 절편들을 데이터베이스 내의 서열들과 비교하여 매치의 통계적 유의성을 결정한 후, 역치 수준보다 더 유의한 매치들만을 확인하여 보고한다. BLAST 프로그램의 적절한 버젼은 갭을 허용하는 버젼, 예를 들어, 버젼 2.X ([Altschul, et al., Nucleic Acids Res 25(17):3389-402, 1997])이다. 본 발명의 단백질에 대한 서열 동일성이 있는 단백질을 확인하기 위한 추가적인 적절한 프로그램에는 PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST, [Zhang, et al., Nucleic Acids Res 26(17):3986-90, 1998]) 및 PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST, [Altschul, et al., Nucleic Acids Res 25(17):3389-402, 1997])가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 프로그램들은 상기 열거된 NCBI 웹사이트에서 공개적으로 입수가능하고, 본 발명에 따라 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 셋팅과 함께 사용될 수 있다.
융합 단백질
본 발명은 (a) 포유류의 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체 (RAGE) 리간드 결합 도메인에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 동일하고, RAGE 리간드에 결합할 수 있는 제1 아미노산 서열; 및 (b) 인간 중쇄 면역글로불린 IgG4 불변 도메인에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 동일한 제2 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 하나 이상 포함하고, 이때 제1 아미노산 서열이 야생형 RAGE 리간드 결합 도메인과 비교하여 하나 이상의 돌연변이, 또는 2개 이상의 돌연변이 또는 3개 이상의 돌연변이, 또는 1-4개의 돌연변이, 또는 1-10개의 돌연변이를 포함하는 단리된 융합 단백질을 제공한다. 제1 아미노산 서열에서 일어날 수 있는 돌연변이의 예는, 예를 들어, RAGE 리간드 결합 도메인을 단백질분해성 분해에 대해 더욱 저항성이게 하는 것에 의해, 융합 단백질의 안정성을 증가시키는 돌연변이, 예컨대 융합 단백질을 퓨린(furin)-유사 프로테아제(protease)에 대해 더욱 저항성이게 하는 돌연변이이다. 제2 아미노산 서열의 적절한 단편에는 자신이 일부를 이루는 융합 단백질의 혈청 반감기를 동일한 제1 아미노산 서열 단독의 혈청 반감기에 비해 증가시키는 능력이 유지된 단편이 포함된다. 바람직하게는, 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열은 인간 RAGE 리간드 결합 도메인 및 인간 IgG4로부터 유래된다.
본 발명의 융합 단백질은 RAGE 리간드 결합 도메인 및 IgG4 불변 도메인 또는 이의 단편에 더하여 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 RAGE 리간드 결합 도메인과 IgG 서열 사이에 삽입될 수 있는 링커 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 태그 서열, 예를 들어, 정제 태그 서열 예컨대 6-히스티딘을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 시판되는 항체가 인식하는 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, c-myc (EQKLISEEDL, 서열 9) 및 헤마글루티닌 (YPYDVPDYA, 서열 10) (인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 에피토프 태그로부터 유래됨)을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 포유류 RAGE 단백질이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이될 수 있고 융합 단백질의 제1 아미노산 서열로서 사용될 수 있는 리간드 결합 도메인을 확인하기 위해 RAGE 단백질의 세포외 도메인이 사용될 것이다. 포유류 RAGE 단백질의 적절한 예로는 영장류, 인간 (예를 들어, GenBank 접속 번호 NP_001127 및 NP_751947), 뮤린 (예를 들어, GenBank 접속 번호 NP 031451), 개 (예를 들어, GenBank 접속 번호 AAQ81297), 래트 (예를 들어, GenBank 접속 번호 NP 445788), 고양이, 소 (예를 들어, GenBank 접속 번호 AAI20128), 양, 말 및 돼지 (예를 들어, GenBank 접속 번호 AAQ73283) RAGE 도메인이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
야생형 서열에 관하여 하나 이상의 변화 또는 변형을 포함하는 RAGE 아미노산 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이같은 변화 또는 변형에는 점 돌연변이, N-말단으로부터의 결실, C-말단으로부터의 결실, 내부 결실, 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 생성된 단백질이 생물학적 활성, 예를 들어, 하나 이상의 RAGE 리간드에 결합하는 능력을 유지하는 한, 임의의 변화 또는 변형이 본 발명에서 사용하기 위한 RAGE 서열 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에는 제1 아미노산 서열이 결합 도메인의 관련된 천연-패턴 글리코실화가 있거나 없는 포유류 RAGE 리간드 결합 도메인으로부터 유래된 융합 단백질이 비제한적으로 포함되는, 내인성 글리코실화 패턴이 있거나 없는 것들이 또한 포함된다.
임의의 적절한 IgG Fc 영역, 바람직하게는, IgG4 분자로부터의 영역, 예를 들어, GenBank 접속 번호 AAH25985의 아미노산 잔기 149-473이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 IgG 영역은 IgG4 Fc 영역일 수 있고, IgG4 분자의 CH2 및 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
적절한 융합 단백질들의 예가 하기의 표들에서 제공된다.
표 1은 인간 RAGE-IgG4 Fc 융합 단백질 유전자 서열의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 코딩 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE에 대한 코딩 서열이며, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 코딩 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 아미노산 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열이며, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 아미노산 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 코딩 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE에 대한 코딩 서열이며, 이중으로 밑줄이 그어진 문자는 펩티드 링커에 대한 코딩 서열이고, 단일 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 코딩 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 아미노산 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE에 대한 아미노산 서열이며, 이중으로 밑줄이 그어진 문자는 펩티드 링커에 대한 아미노산 서열이고, 단일 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 아미노산 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 코딩 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE 변이체에 대한 코딩 서열이며, 물결 모양의 밑줄이 그어진 볼드체 문자는 변이체 hRAGE 서열 내로 도입된 점 돌연변이의 부위이고, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 코딩 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 아미노산 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE 변이체에 대한 아미노산 서열이며, 물결 모양의 밑줄이 그어진 볼드체 문자는 변이체 hRAGE 내로 도입된 점 돌연변이의 부위이고, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 아미노산 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 코딩 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE 변이체에 대한 코딩 서열이며, 물결 모양의 밑줄이 그어진 볼드체 문자는 변이체 hRAGE 서열 내로 도입된 점 돌연변이의 부위이고, 이중으로 밑줄이 그어진 문자는 펩티드 링커를 코딩하는 서열이고, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 코딩 서열이다.
볼드체 문자는 RAGE 신호 서열에 대한 아미노산 서열이고, 일반 문자는 인간 RAGE 변이체에 대한 아미노산 서열이며, 물결 모양의 밑줄이 그어진 볼드체 문자는 변이체 hRAGE 내로 도입된 점 돌연변이의 부위이고, 이중으로 밑줄이 그어진 문자는 펩티드 링커에 대한 아미노산 서열이고, 밑줄이 그어진 문자는 IgG4 Fc 영역에 대한 아미노산 서열이다.
RAGE 융합 단백질의 발현
당업자에게 공지된 임의의 단백질 발현 시스템, 예를 들어, 진핵생물 발현 시스템, 박테리아 발현 시스템, 및 바이러스 발현 시스템에서 본 발명의 융합 단백질이 생산될 수 있다. 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 융합 단백질을 발현하는데 활용될 수 있다. 이같은 숙주 시스템은 본 발명의 융합 단백질이 생산될 수 있는 비히클을 나타내고, 이어서 이로부터 본 발명의 융합 단백질이 정제될 수 있다. 이같은 시스템에는 미생물 예컨대 박테리아, 효모, 곤충 세포 또는 식물 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 효모 또는 포유류 발현 시스템, 예를 들어, COS-7 세포에서 발현된 RAGE는 발현 시스템에 따라 분자량 및 글리코실화 패턴이 천연 분자와 유사하거나 약간 상이할 수 있다. 박테리아 예컨대 대장균에서의 RAGE DNA의 발현은 비-글리코실화 분자를 제공한다. 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 상이한 글리코실화 패턴이 수득될 수 있다. N-글리코실화 부위가 불활성화된 포유류 RAGE의 기능성 돌연변이체 유사체가 올리고뉴클레오티드 합성 및 결찰에 의해 또는 부위-특이적 돌연변이유발 기술에 의해 생산될 수 있다. 효모 발현 시스템을 사용하여 양호한 수율로 이러한 유사체 단백질들이 균질한, 환원된 탄수화물 형태로 생산될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 수득할 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 본원에서의 교시 및 공지된 RAGE 폴리펩티드 서열 및 이의 확인된 또는 확인가능한 리간드 결합 요소, 및 중쇄 IgG 불변 도메인에 대한 공지된 서열의 견지에서, 이러한 폴리펩티드들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 당업계에 주지된 방법을 사용하여 결정할 수 있고, 즉, 특정 아미노산을 코딩하는 것으로 공지된 뉴클레오티드 코돈들을 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 생성되는 방식으로 조립할 수 있다. 사용된 발현 시스템을 기초로 뉴클레오티드 코돈이 선택될 수 있고, 예를 들어, 발현 시스템 내에 존재하는 더욱 풍부한 tRNA 분자에 상응하는 코돈을 선택함으로써, 더 높은 수준의 융합 단백질이 발현될 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 이같은 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드들로부터 조립될 수 있고 (예를 들어, [Kutmeier et. al., Biotechniques 17:242(1994)]에 기술된 바와 같이), 간략하게, 이는 융합 단백질을 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드들의 합성, 이러한 올리고뉴클레오티드들의 어닐링(annealing) 및 결찰에 이은, 결찰된 올리고뉴클레오티드들의 중합효소 연쇄 반응(들) (PCR)에 의한 증폭을 수반한다.
본 발명의 융합 단백질 (융합 단백질 단편 또는 이의 변이체를 포함하거나 별법적으로 이들로 구성되는 또다른 분자 포함)의 재조합 발현은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터(들)의 구축을 필요로 할 수 있다. 일단 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 당업계에 주지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 융합 단백질의 생산을 위한 벡터(들)이 생산될 수 있다. RAGE-Fc 코딩 서열들을 함유하는 이같은 발현 벡터들은 적합한 전사 및 번역 제어 신호/서열, 예를 들어, 리보솜 결합 부위 (즉, 코작(Kozak) 서열), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 폴리아데닐화 부위 등을 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 복제-결함 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 또는 HIV로부터 유래된 벡터)를 이용하여 포유류 세포에 전달할 수 있고, 수포성 구내염 바이러스 G 단백질 (VSV-G)로 슈도타이핑(pseudotyping)하여, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 단일 카피들을 분열 중인 세포 내로 안정적으로 삽입할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 RNA로 코딩된 유전자를 전달하고, 이는 세포 내로의 진입 후, DNA로 역전사되어 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 단일 세포에서의 다중 유전자 삽입은 융합 단백질의 발현 및 분비를 증가시킬 수 있다. 다중 라운드의 감염 또한 통합되는 유전자 카피의 수를 증가시킬 수 있고, 따라서 발현되는 융합 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 통합된 유전자(들)은 게놈 내에 존재하는 덕분에 세포 분할을 통과하여 세포에서 유지된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 제공한다. 안정적이고, 단백질을 고도로 발현하는 포유류 세포주의 신속한 생성을 위한 한 적절한 방법은 GPEx™ 발현 시스템 (Catalent Pharma Solutions (Middleton, WI)의 사업부인 Gala Biotech, Bleck, Gregory T., Bioprocessingjournal.com September/October 2005 p1-7)을 사용하는 것이다. 이같은 방법은 MMLV를 기초로 하는, 복제 결함이 있는 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터를 생산하는 것 및 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포)에 이러한 벡터를 형질도입하는 것을 수반할 수 있다. 벡터가 세포의 게놈 내로 통합됨으로써 안정적인 세포주가 생산될 수 있다.
단리된
융합 단백질의 정제
적절한 숙주/벡터 시스템을 배양하여 본 발명의 DNA 서열의 재조합 번역 생성물을 발현시킨 후, 이를 당업계에 주지된 기술을 사용하여 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제함으로써, 단리된 본 발명의 융합 단백질을 제조할 수 있다.
예를 들어, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초여과 유닛을 사용하여 우선 농축시킬 수 있다. 농축 단계에 이어서, 농축물을 적절한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 예를 들어, 적절한 친화력 매트릭스는 적절한 지지체에 결합된 AGE 또는 렉틴 또는 단백질 A 또는 단백질 G 또는 항체 분자를 예를 들어 포함할 수 있다. 별법적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트(pendant) 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기가 있는 매트릭스 또는 기판을 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 단백질 정제에서 통상적으로 사용되는 기타 유형일 수 있다. 별법적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적절한 양이온 교환체에는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 술포프로필 기가 바람직하다.
박테리아 배양에서 생산된 재조합 단백질은 세포 펠렛으로부터의 최초의 추출에 이은 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배재 크로마토그래피 단계에 의해 일반적으로 단리된다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 최종 정제 단계를 위해 사용할 수 있다. 재조합 포유류 RAGE의 발현에서 사용된 미생물 세포를 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용이 포함되는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴시킬 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 분비 단백질로서 발현하는 효모의 발효는 정제를 크게 단순화시킨다. 대규모 발효로부터 초래된 분비된 재조합 단백질을 [Urdal et al. J. Chromatog. 296:171, 1984]에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 정제할 수 있다. 이러한 참고문헌에는 예비 HPLC 컬럼 상에서의 재조합 인간 GMCSF의 정제를 위한 2개의 순차적인 역상 HPLC 단계가 기술되어 있다.
제약 조성물
본 발명의 융합 단백질은 이를 필요로 하는 대상에게의 투여에 적절한 방식으로 제형될 수 있고, 예를 들어, 제약 조성물로서 제형될 수 있다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "제약상 허용되는 담체"에는 생리학적으로 혼화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 담체는 비경구 투여에 적절하다. 담체는 중추 신경계로의 투여 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌내 투여)에 적절할 수 있다. 별법적으로, 담체는 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 투여에 적절할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 담체는 경구 투여에 적절할 수 있다. 제약상 허용되는 담체에는 무균성 수성 용액 또는 분산액, 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말이 포함된다. 제약상 활성인 물질에 대한 이같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 본 발명의 융합 단백질과 비-혼화성이지 않는 한, 본 발명의 제약 조성물에서의 이의 사용이 구현된다. 보조 활성 화합물이 조성물 내로 또한 혼입될 수 있다.
전형적으로, 적절한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이다. 통상적으로, 본 발명의 제약 조성물의 제조는 본 발명의 융합 단백질을 완충제, 항산화제 예컨대 아스코르브산, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 트레할로스, 수크로스 또는 덱스트린이 포함되는 탄수화물, 킬레이팅제 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제 중 하나 이상과 조합하는 것을 수반한다. 중성 완충 염수 또는 동종 혈청 알부민과 혼합된 염수가 예시적인 적합한 희석제이다.
본 발명의 융합 단백질의
치료적
투여
본 발명의 융합 단백질을 본 발명의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물의 형태로 이를 필요로 하는 대상 (예를 들어, 포유동물, 특히 인간)에게 투여하는 것이 본 발명에서 구현된다. 본 발명은 이같은 조성물로 인간 질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 제약상 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함할 것이다. 사용된 제약상 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 제약상 유효량은 약 1 ㎍ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 10 ㎍ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 100 ㎍ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 1 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 100 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 500 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 100 ㎍ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 25 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 1 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 25 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 25 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 25 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 15 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 25 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 100 ㎍ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 1 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 2.5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 약 7.5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏ 내지 약 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 제약상 유효량은 0.5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 1 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 2 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 3 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 4 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 5 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 6 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 7 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 8 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 9 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏, 또는 10 ㎎ 융합 단백질/대상의 체중 1 ㎏일 수 있다.
단위 투약 형태는 치료될 포유류 대상에 대한 단위형 투여량으로서 맞춰진 물리학적으로 분리된 단위를 지칭하고, 이때 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 결정된 양의 본 발명의 융합 단백질을 함유한다. 본 발명의 융합 단백질의 단위 투약 형태는 약 1 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 25 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 50 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 100 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 250 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 500 ㎎ 내지 약 1000 ㎎, 약 100 ㎎ 내지 약 500 ㎎, 약 200 ㎎ 내지 약 500 ㎎, 약 300 내지 약 500 ㎎, 또는 약 400 ㎎ 내지 약 500 ㎎일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 단위 용량은 약 100 ㎎, 200 ㎎, 300 ㎎, 400 ㎎, 500 ㎎, 600 ㎎, 또는 700 ㎎일 수 있다.
본 발명의 조성물은 조성물의 전체 중량의 약 0.1 중량％ 내지 약 20 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 18 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 16 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 14 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 12 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 10 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 8 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 6 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 4 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 2 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 1 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.9 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.8 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.7 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.6 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.5 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.4 중량％, 약 0.1 중량％ 내지 약 0.3 중량％, 또는 약 0.1 중량％ 내지 약 0.2 중량％의 수준으로 본 발명의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 조성물의 전체 중량의 약 1 중량％ 내지 약 20 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 18 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 16 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 14 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 12 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 10 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 9 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 8 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 7 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 6 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 5 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 4 중량％, 약 1 중량％ 내지 약 3 중량％, 또는 약 1 중량％ 내지 약 2 중량％의 수준으로 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 조성물의 전체 중량을 기초로 약 0.1 중량％, 약 0.2 중량％, 약 0.3 중량％, 약 0.4 중량％, 약 0.5 중량％, 약 0.6 중량％, 약 0.7 중량％, 약 0.8 중량％, 약 0.9 중량％, 약 1 중량％, 약 2 중량％, 약 3 중량％, 약 4 중량％, 약 5 중량％, 약 6 중량％, 약 7 중량％, 약 8 중량％, 또는 약 9 중량％의 수준으로 포함할 수 있다.
최적의 치료 응답을 제공하도록 투여량 처방계획이 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 요건에 의해 지시되는 바에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투약 형태로 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본 발명의 조성물이 제형되어 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물이 피하 또는 근육내 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여량 처방계획은 반복 용량을 투여하는 것, 예를 들어, 주1회 용량을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 치료 처방계획은 한 기간 (예를 들어, 4주) 동안의 주1회 용량에 이은 덜 빈번한 "유지" 투여량 처방계획 (예를 들어, 월1회 또는 2개월에 1회)을 수반할 수 있다. 원하는 치료 결과를 달성하도록 투여량 처방계획이 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 AGE-의존적 염증성 응답을 억제하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, AGE-매개 생물학적 활성을 억제하는 방법을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, AGE는 다양한 질환 또는 용태 예컨대 자가면역 질환에서 연루되었다. 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 치료, 경감, 검출, 진단, 예측 또는 모니터링될 수 있는 자가면역 장애, 질환 또는 용태에는 피부염, 사구체신염, 다발성 경화증, 포도막염 안염, 자가면역 폐 염증, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 자가면역 눈 염증, 전신성 홍반 루푸스, 인슐린 내성, 류머티스성 관절염, 당뇨성 망막병증 및 피부경화증이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법으로 치료 또는 예방될 수 있는 기타 장애는 병에 걸린 세포가 RAGE 또는 하나 이상의 RAGE 리간드의 상승된 발현을 나타내는 임의의 장애, 또는 RAGE 기능에서의 감소에 의해 치료가능 (즉, 하나 이상의 증상이 제거 또는 경감될 수 있음)한 임의의 장애를 포함하는 것으로 일반적으로 특징지워질 수 있다. 예를 들어, RAGE와 RAGE 리간드 간의 상호작용을 파괴하는 작용제의 투여에 의해 RAGE 기능이 감소될 수 있다.
RAGE의 증가된 발현은 여러 병리학적 상태, 예컨대 당뇨성 혈관병증, 신병증, 망막병증, 신경병증, 및 알츠하이머병 및 혈관벽의 면역/염증성 반응이 포함되는 기타 장애와 관련된다. 관절염 (예컨대 류머티스성 관절염)이 포함되는 다수의 염증성 장애에 걸린 조직에서 RAGE 리간드가 생산된다. 조직 내의 아밀로이드의 침착은 세포에 대한 다양한 독성 효과를 야기하고, 아밀로이드증으로 칭해지는 질환의 특징이다. RAGE는 베타-시트 섬유형 물질, 예컨대 아밀로이드-베타 펩티드, 아베타(Abeta), 아밀린, 혈청 아밀로이드 A 및 프리온-유래 펩티드에서 발견되는 물질에 결합한다. RAGE는 아밀로이드 구조가 있는 조직에서 상승된 수준으로 또한 발현된다. 따라서, RAGE가 아밀로이드 장애에서 수반된다. RAGE-아밀로이드 상호작용은 뉴런 변성에 이르는 산화 스트레스를 초래하는 것으로 생각된다.
다양한 RAGE 리간드, 특히 S100/칼그라눌린 및 암포테린 (HMGB) 패밀리의 것이 염증 조직에서 생산된다. 이러한 관찰은 급성 염증, 예컨대 지질다당류 챌린지(challenge)에 응답하여 나타나는 것 (패혈증에서와 같은 경우), 및 만성 염증, 예컨대 다양한 형태의 관절염, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환 등에서 나타내는 것 양쪽 모두에 대해 사실이다. 심혈관 질환, 특히 죽상경화판으로부터 발생하는 질환이 실질적인 염증성 성분이 있는 것으로 또한 생각된다. 이같은 질환에는 폐색성, 혈전성 및 색전성 질환, 예컨대 각각 협심증, 취약성 판 장애 및 색전성 뇌졸중이 포함된다. 종양 세포가 RAGE 리간드, 특히 앰포테린의 증가된 발현을 또한 나타냈고, 이는 암이 또한 RAGE-관련 장애임을 가리킨다. 또한, 만성 염증의 산화 효과 및 기타 양상이 특정 종양의 발생에 대한 기여 효과가 있을 수 있다.
AGE는 류머티스성 관절염 및 기타 염증성 질환에 대한 치료 표적이다.
따라서, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 RAGE-관련 장애에는, 상기 논의된 자가면역 장애에 더하여, 아밀로이드증 (예컨대 알츠하이머병), 크론병, 급성 염증성 질환 (예컨대 패혈증), 쇼크 (예를 들어, 패혈성 쇼크, 출혈성 쇼크), 심혈관 질환 (예를 들어, 죽상경화증, 뇌졸중, 취약성 판 장애, 협심증 및 재협착), 당뇨병 (특히, 당뇨병에서의 심혈관 질환), 당뇨병의 합병증, 프리온-관련 장애, 암, 혈관염 및 기타 혈관염 증후군 예컨대 괴사성 혈관염, 신병증, 망막병증 및 신경병증이 포함된다.
하기의 실시예는 예시적인 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
<실시예>
하기의 실시예들에서, 마우스 IgG2a 중쇄 Fc 영역의 힌지(hinge), CH2 및 CH3 도메인에 융합된 마우스 RAGE의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-342)을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 마우스에서의 실험이 수행되었다. GPEx™ 발현 시스템을 사용하여 CHO 세포에서 구축물이 발현되었다. 사용된 마우스 RAGE 서열의 서열이 하기 표에서 제공된다.
상기 표에서, RAGE 신호 펩티드 = 일반적인 밑줄, RAGE 세포외 도메인 = 밑줄 없음, 마우스 IgG2a 힌지 영역 = 이중 밑줄, 마우스 IgG2a CH2 영역 = 점선형 밑줄, 및 마우스 IgG2a CH3 영역 = 물결형 밑줄.
실시예
1
마우스에서의 스트렙토조토신-유도 당뇨병에 대한 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 효과.
마우스에서의 스트렙토조토신-유도 당뇨병은 당노병-유도 망막 변화에 대한 당업계에 인지되어 있는 모델이다 ([Obrosova IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, Stevens MJ. Early diabetes-induced biochemical changes in the retina: comparison of rat and mouse models. Diabetologia. 2006 Oct:49(10):2525-33] 참조).
본 실험에서는 군 당 15마리의 C57BL/6 마우스를 함유하는 5개의 처리군이 수반되었다: 1) 비-당뇨병 대조군; 2) 당뇨병을 유도하기 위해 연구를 시작하기 전에 연속 5일 동안 45 ㎎/㎏의 스트렙토조토신으로 처리된 마우스를 함유하는 당뇨병 대조군; 3) 3회의 주사/주로 10 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스; 4) 3회의 주사/주로 100 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스; 및 5) 3회의 주사/주로 300 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스.
연구 동안, 마우스를 체중, 혈당, 글리코헤모글로빈 (GHb), 알부민뇨증, 및 감각 신경 기능의 측정으로서의 촉각 민감도에 대해 평가하였다. 연구 말기에 마우스를 희생시키고, 망막 혈관 투과성 (형광 프로브 사용), 망막 모세혈관에의 백혈구 부착, 및 NF-κB-조절 단백질 발현 (COX-2, ICAM, iNOS)에 대해 평가하였다.
2개월 연구로부터의 결과
C57B1/6J 마우스에서 망막 생리학 및 대사에서의 당뇨병에 의해 유도된 변경이 발생되는 것에 대한 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과를 연구하였다. 융합 단백질을 주 당 3회로 3가지 상이한 농도 (10 ㎍, 100 ㎍, 및 300 ㎍)로 복강내 투여하였다. 당뇨병 마우스의 체중 증가 또는 전체적인 건강에 대해 약물의 어떠한 용량에서도 역효과가 보이지 않았다. 비-금식 혈당 수준은 비-당뇨병 대조군, 당뇨병 대조군, 당뇨병 + 10 ㎍ RAGE-Ig 융합 단백질, 당뇨병 + 100 ㎍ RAGE-Ig 융합 단백질, 및 당뇨병 + 300 ㎍ RAGE-Ig 융합 단백질 군에서 각각 155±24 ㎎/㎗ (평균±SD), 358±38, 417±36, 376±36, 및 370±55였다.
단기 연구에서 측정된 망막병증과 관련된 파라메터들은 (1) 백혈구울혈, (2) 망막 혈관으로부터의 내인성 알부민의 투과성, (3) 망막 단백질의 질화, 및 (4) 망막 ICAM 및 COX-2의 발현이었다.
1. 백혈구울혈.
방법: 당뇨병 2개월에, 마취된 동물의 혈관계로부터 심장 카테터를 통한 PBS의 완전 관류에 의해 혈액을 제거하였다. 그후, 동물에게 플루오레세인-커플링 콘카나발린(Concanavalin) A 렉틴 (PBS 내의 20 ㎍/㎖; Vector Laboratories (Burlingame, CA))을 기존에 기술된 바와 같이 관류시켰다 ([Joussen et al., FASEB J. 2004 Sep;18(12):1450-2 참조). 편평하게 마운팅된 망막을 형광 현미경으로 영상화하고, 혈관벽에 부착된 백혈구의 수를 계수하였다.
결과: 비-당뇨병에 비교하여 2개월 동안 당뇨병이었던 마우스에서 백혈구울혈에서의 유의한 증가가 실연되었다 (P < 0.05). RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 어떠한 군에서도 백혈구울혈이 억제되지 않았다 (도 1 참조).
2. 혈관 투과성
방법: 당뇨병 2개월에, 눈을 냉동절편화시키고 (10 ㎛), 메탄올에 10분 동안 고정시키고, PBS에서 4× 세정하였다. 각각의 절편을 양 항-마우스 혈청 알부민 (Abcam (Cambridge MA); AB8940; 1:2000 희석)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 절편을 FTIC-표지 2차 항체 (AB 6743; 1:1000 희석)에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 형광 현미경 하에, 평균 형광량을 4개의 망막층 (내망상층, 내핵층, 외망상층, 외핵층) 각각에 대해 3개의 상이한 부위에서 결정하였다. 각각의 부위에서의 형광량은 10회의 무작위 측정의 평균값이었고, 각각의 망막층에서의 형광량은 이러한 층 내의 3개의 상이한 부위 각각에서의 형광의 평균이었다.
결과:
당뇨병은 연구된 4개의 망막층 각각에서 비-혈관 망막 내의 형광의 유의한 증가 (즉, 혈관에서 누출된 알부민으로 인한 것)를 초래하였다. 결과가 도 2에서 제공된다 (2A 내망상층, 2B 내핵층, 2C 외망상층, 2D 외핵층). 내핵층 및 외핵층 내의 알부민을 평가하기 위해, 본 발명가들은 핵들 사이의 가느다란 공간에서 의도적으로 측정하였고, 따라서 이러한 값들은 본 발명가들의 측정을 손상시킬 핵이 없는 망상층들로부터의 값만큼 강하지 않을 수 있었다.
3. 망막 단백질의 질화
방법: 당뇨병 2개월에, 망막을 단리하고, 균질화시켰다. 니트로셀룰로스 막 상에 각각의 동물로부터의 단백질 균질화물 50 ㎍을 블롯팅하여 도트-블롯을 만들었다. 막을 밀크 (5％)로 차단하고, 세정하고, 항-니트로타이로신 (Upstate Biotechnology, Inc. #05-233; 1:500 희석)을 사용하여 2시간 동안 면역염색한 후, 2차 항체 (Bio-Rad 염소 항-마우스 IgG-HRP 접합체; 1:1000 희석)로 1시간 동안 염색하였다. 광범위한 세정 후, 항체에 의해 검출되는 면역염색을 강화 화학발광 (ECL, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA))에 의해 가시화하였다. 면역염색-의존적 화학발광이 필름 상에 기록되었고, 면역염색 도트의 밀도를 정량하였다. 결과는 비-당뇨병 대조군에서 검출된 값의 백분율로 표현된다.
결과:
결과가 도 3에 제시된다. 당뇨병 마우스로부터의 망막 균질화물은 단백질의 질화에서 예상된 증가를 나타냈다. 치료법은 이러한 번역후 변형을 용량-의존적 방식으로 억제하였다. 단백질의 질화는 산화 스트레스 및 질화 스트레스 양쪽 모두의 파라메터인 것으로 간주된다.
4. 망막 ICAM 및 COX-2의 발현
방법: 망막을 단리하고, 초음파처리하고, 상등액을 전체 망막 추출물로서 사용하였다. 샘플 (50 ㎍)을 SDS-PAGE에 의해 단편화하고, 니트로셀룰로스 막에 전기-블롯팅(electroblotting)시키고, 0.02％ 트윈(Tween) 20 및 5％ 탈지유를 함유하는 트리스(Tris)-완충 염수에서 막을 차단하였다. ICAM-1에 대한 항체 (1:200 희석; Santa Cruz Biotechnology) 및 COX-2에 대한 항체를 적용한 후, 2차 항체를 1시간 동안 적용하였다. 세정 후, 강화 화학발광에 의해 결과가 가시화되었다.
결과:
결과가 도 4에서 제시된다. 내피 세포 상에서의 ICAM-1 발현은 혈관벽에 대한 백혈구의 부착 (백혈구울혈)에서 결정적인 역할을 하기 때문에, 본 발명가들은 망막에서의 ICAM-1의 발현에 대한 당뇨병 및 치료법의 효과를 측정하였다. 2개월의 당뇨병은 망막 ICAM-1의 발현에서 유의한 증가를 초래하였다. RAGE-Ig 융합 단백질의 투여는 ICAM의 발현에서 용량-의존적인 감소를 초래하였고, 최고 용량은 이러한 발현을 유의하게 억제하였다.
COX-2에 대한 분자량과 일치하는 면역염색 밴드의 발현은 당뇨병에서 증가하지 않았고, 치료법이 제공된 동물에서 변화하지 않았다 (제시되지 않음).
RAGE-Ig 융합 단백질의 효과의 이러한 단기 연구에서 사용된 종점들은 이들 모두가 당뇨성 망막병증의 초기 (변성) 단계의 발달과 관련되는 것으로 발견되었기 때문에, 즉, 망막 모세혈관의 당뇨병-유도 변성을 억제하는 것으로 발견된 다양한 치료법들이 이러한 결함들을 또한 억제하였기 때문에 선택되었다.
RAGE의 억제는 망막에서의 혈관 투과성 및 질화 스트레스와 관련된 이상을 억제하였다. 질화 스트레스는 산화 스트레스의 마커로 또한 간주된다. 그러나, RAGE 억제제는 백혈구울혈과 관련된 이상을 억제하지 않았다.
실시예
2
마우스에서 장기 스트렙토조토신-유도 당뇨병에 대한 본 발명의 RAGE 융합 단백질의 효과.
마우스에서의 스트렙토조토신-유도 당뇨병은 당노병-유도 망막 변화에 대한 당업계에 인지되어 있는 모델이다 ([Obrosova IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, Stevens MJ. Early diabetes-induced biochemical changes in the retina: comparison of rat and mouse models. Diabetologia. 2006 Oct:49(10):2525-33] 참조).
장기 연구에서는 군 당 25마리의 C57BL/6 마우스를 함유하는 5개의 처리군이 수반되었다: 1) 비-당뇨병 대조군; 2) 당뇨병을 유도하기 위해 연구를 시작하기 전에 연속 5일 동안 45 ㎎/㎏의 스트렙토조토신으로 처리된 마우스를 함유하는 당뇨병 대조군; 3) 3회의 주사/주로 10 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스; 4) 3회의 주사/주로 100 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스; 및 5) 3회의 주사/주로 300 ㎍/일의 mRAGE-IgG2aFc가 또한 복강내 주사된 스트렙토조토신 처리 마우스.
연구 동안, 마우스를 체중, 혈당, 글리코헤모글로빈 (GHb), 알부민뇨증, 및 감각 신경 기능의 측정으로서의 촉각 민감도에 대해 평가하였다. 연구 말기에 마우스를 희생시키고, 망막에서의 정량적인 조직병리학 및 신경변성에 대해 평가하였다.
장기 연구에서 측정된 망막병증에 관련된 파라메터는 (1) 무세포 모세혈관, (2) 유령 혈관주위세포, 및 (3) 신경절 세포였다. 말초 신경병증에 대한 마커로서, 가벼운 접촉에 대한 발의 민감도가 장기 연구에서 또한 측정되었다.
당뇨병-유도 망막 조직 조직병리학
10개월의 당뇨병 후, 눈을 포르말린에 고정시키고, 각각의 동물로부터의 1개의 망막을 단리하고, 흐르는 물에서 하룻밤 동안 세정하고, 본 발명가들이 기존에 보고한 바와 같은 미정제 트립신 용액에서 2시간 동안 소화시켰다. 단일 모발로부터 제조된 "브러시"로 신경 세포를 부드럽게 제거함으로써 망막 혈관계를 단리하였다. 신경 세포가 완전히 제거되었을 때, 단리된 혈관계를 현미경용 유리 슬라이드 상에 놓고, 하룻밤 동안 건조시키고, 헤마톡실린 및 과요오드산-쉬프(Schiff)로 염색하고, 탈수시키고, 커버슬립을 덮었다. 변성 (무세포) 모세혈관을 마스크(masked) 방식의 중앙-망막 (200× 확대)에 상응하는 6-7개의 구역에서 정량하였다. 무세포 모세혈관은 이의 길이를 따라 어떠한 핵도 없는 모세혈관 크기의 혈관 튜브로서 확인되었고, 1 ㎟의 망막 면적 당 값으로 보고되었다. 혈관주위세포가 사라진 모세혈관 기저막 내의 돌출 "범프(bump)"의 만연으로부터 유령 혈관주위세포가 추정되었다. 마스크 방식의 중앙-망막 (400× 확대) 내의 5개의 구역 내의 1,000개 이상의 모세혈관 세포 (내피 세포 및 혈관주위세포)를 시험하였다. 이미 무세포성인 혈관 상의 유령 세포는 배제하였다.
망막 신경변성에 대한 당뇨병의 효과를 연구하기 위해, 신경절세포층 내의 세포를 계수하였다. 포르말린에 고정된 눈을 파라핀에 매립하고, 시각 신경을 지나도록 망막을 통과하여 시상으로 절편화하고, 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 신경절세포층 내의 세포의 수를 시각 신경의 양쪽 측면 상에서 2개의 영역 (중앙 망막 및 시각 신경에 인접한 후방 망막)에서 계수하였다. 시각 신경의 양쪽 측면으로부터의 필적하는 영역들이 평균화되었고, 단위 길이 당 값으로 표현되었다.
결과. 기존의 연구를 기초로 예상된 바와 같이, 장기 당뇨병은 망막 내의 변성, 무세포 모세혈관의 수에서의 유의한 증가를 초래하였다 (도 5a). RAGE-Ig 융합 단백질의 모든 용량이, 고혈당증의 중증도에 대한 어떠한 효과도 없으면서, 이러한 모세혈관 변성을 유의하게 억제하였다. 또한 당뇨병은 혈관주위세포 변성 (유령 혈관주위세포)을 증가시키는 경향이 있었지만, 결과가 통계적 유의성을 달성하지 않았다 (도 5b). 기존에 본 발명가들은 혈관주위세포 손실이 당뇨병 래트 또는 더 큰 종과 비교하여 당뇨병 C57B1/6 마우스에서 검출하기가 더욱 더 어렵다는 것을 발견하였고, 현재 이를 이러한 모델에서의 혈관 질환의 신뢰할 수 없는 파라메터로 간주한다. 아마도, 대조군 당뇨병에서 유의한 혈관주위세포 손실을 검출하지 못한 결과로, 본 발명가들은 이러한 마우스에서의 혈관주위세포 손실에 대한 RAGE-Ig 융합 단백질의 어떠한 효과도 검출하지 못했다.
당뇨병은 이러한 C57B1/6 마우스에서 망막 신경절세포층 내의 세포의 수에서의 감소 (즉, 신경변성)을 유도하지 않았다. 이러한 발견은 이러한 마우스 모델의 기존의 연구와 일치하였다. 망막 신경변성에 대한 당뇨병의 효과의 부재 하에, 본 발명가들은 억제제가 신경변성에 대한 효과가 있었는지 여부를 평가할 수 없었다.
가벼운 접촉에 대한 민감도 (말초 신경병증의 마커)
당뇨성 신경병증이 있는 환자는 자발적인 통증, 가벼운 접촉에 의해 유발되는 통증 및 통각과민을 포함하는 다양한 비정상적인 감각을 나타낼 수 있다. 당뇨병 설치류에서 이러한 통각과민이 재현되고 촉각 이질통이 발달된다는 데이터가 누적되어 있다. 설치류에서, 이는 발 접촉 응답 역치로 측정된다.
방법: 마우스 (8개월 당뇨병)을 바닥이 철사 그물인 테스트 우리로 옮기고, 10 내지 15분 동안 적응시켰다. 폰 프레이(Von Frey) 필라멘트를 사용하여, 발 움츠림(withdrawal)에 대한 50％ 기계적 움츠림 역치를 결정하였다. 좌굴(buckling) 중량이 0.6 g인 필라멘트에서 시작하여 강도가 대수적으로 증가되는 일련의 필라멘트들을 필라멘트가 좌굴되도록 하는 압력으로 오른쪽 뒷발의 발바닥 표면에 순차적으로 적용하였다. 발을 들어올리는 것을 양성 응답으로 기록하였고, 다음 측정에는 더 가벼운 필라멘트를 선택하였다. 5초 후에 응답이 없으면, 다음으로 가장 무거운 필라멘트를 이후에 사용하였다. 행동에서의 최초의 변화 후 4회의 측정이 이루어질 때까지 또는 5회의 연속적인 음성 (6 g) 또는 4회의 연속적인 양성 (0.4 g) 응답이 일어날 때까지 이러한 방법을 계속하였다. 결과적인 양성 및 음성 점수의 순서를 사용하여, 50％ 움츠림 응답 역치를 계산하였다.
결과: 당뇨병은 가벼운 접촉에 대한 발의 민감도를 유의하게 증가시켰고, 이는 당뇨병 동물이 발을 움츠리는데 비-당뇨병 동물보다 더 낮은 압력을 필요로 하였음을 의미한다 (도 6). 이러한 당뇨병-유도 결함이 sRAGE-Ig 융합 단백질의 각각의 용량에서 유의하게 억제되었다.
망막병증: RAGE-Ig 융합 단백질을 사용하는 연구를 2가지 기간의 당뇨병에 대해 수행하였다: (1) 마우스에서 발달되는 당뇨성 망막병증의 장기 조직병리학에 대한 치료법의 효과를 평가하기 위한 장기 (10개월) 연구, 및 (2) 아마도 장기 조직병리학에 대한 효과의 기초가 될 치료법의 생리학적 및 분자적 효과를 평가하기 위한 2-3개월 연구. RAGE-Ig 융합 단백질의 효과와 관련하여 연구된 생리학적 및 분자적 종점들은 이들 모두가 당뇨성 망막병증의 초기 (변성) 단계의 발달과 관련되는 것으로 (그리고, 아마도 이러한 발달에 인과적으로 관계되는 것으로) 다른 연구에서 발견되었기 때문에 선택되었다. 치료법의 3가지 용량 모두 망막 혈관계의 당뇨병-유도 변성을 명확하게 및 유의하게 억제하였다. 마찬가지로, 약물의 3가지 용량 모두 이러한 마우스들에서 망막 투과성에서의 당뇨병-유도 증가를 또한 억제하는 것으로 보였다. 당뇨성 망막병증의 초기 (비-증식성) 단계가 여전히 혈관 병리학 (혈관 비관류 및 변성, 및 증가된 투과성)을 기초로 정의되기 때문에, 이러한 발견들은 임상적으로 주요한 의미가 있다
당뇨병 마우스로부터의 망막에서의 측정된 분자적 및 생리학적 종점에 대한 치료법의 효과가 혼합되었다. RAGE의 억제는 망막에서의 산화 스트레스의 마커인 질화 스트레스와 관련된 이상을 억제하였다. 그러나, RAGE 억제제는 백혈구울혈과 관련된 이상을 억제하지 않았다. 최근 또다른 그룹이 그들의 sRAGE가 당뇨병에서 백혈구울혈 증가를 억제하였음을 보고하였기 때문에 백혈구울혈에 대한 치료법의 효과의 결여는 뜻밖이었다. 그러나, RAGE-Ig 융합 단백질을 사용하는 본 발명가들의 연구를 시작한 이래로 본 발명가들에 의해 생성된 증거 ([Diabetes 57:1387-93, 2008])는 당뇨병에서의 망막 백혈구울혈에 대한 약물 치료법의 효과가 당뇨병에서의 망막 모세혈관의 변성에 대한 치료법의 효과를 예보하지 않는다는 것을 가리킨다. 따라서, 망막 백혈구울혈에 대한 치료법의 결여는 약물의 관찰된 효과의 유의성을 어떠한 방식으로도 감소시키지 않는다.
놀랍게도, 당뇨병 동물로부터의 망막에서 ICAM-1의 발현 및 단백질의 질화와 관련하여 약물의 용량 효과가 있는 것으로 나타난 반면, 이러한 용량 효과가 망막 모세혈관 투과성 및 변성에 대해서는 명백하지 않았다. 이는 당뇨병에서의 망막 혈관 결함에서 ICAM 또는 질화가 수반되지 않는다는 것을 시사하는 것으로 보일 수 있지만, 본 발명가들에게는 이러한 결론에 반대되는 ICAM-1 녹아웃(knockout) 동물을 사용한 데이터가 있다.
약물이 망막에 도달하였고, 생물학적 효과를 발휘하였으며, 적어도 당뇨성 망막병증의 초기 혈관 병변을 억제하는 약물의 유의한 능력을 실연하였음이 명백하다.
감각 신경병증: 진행성 당화 최종 생성물 (AGE) 및 이러한 AGE와 RAGE의 상호작용이 산화 스트레스를 유도하고, 신경에서 NF-κB 및 다양한 NF-κB-매개 전-염증성 유전자들을 상향조절하며, 변경된 통증 감각을 포함하는 신경 기능장애를 악화시키는 것으로 다른 연구자들에 의해 추정되었다. 본 데이터는 RAGE-매개 신호전달이 당뇨성 신경병증의 적어도 일부 양상의 발달에 기여한다는 증거와 일치하고, 장기 연구에서 sRAGE-Ig 융합 단백질이 이러한 프로세스를 억제한다는 증거를 제공한다.
실시예
3
제II형 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델을 사용한 RAGE-Ig 융합 단백질의 평가
감수성 계통의 마우스를 관절 연골의 주요 성분인 제II형 콜라겐으로 면역화시키면 진행성의 염증성 관절염이 유도된다 ([Wooley et al. Journal of Experimental Medicine 1981; 154:688-700]). 임상적으로 콜라겐-유도 관절염 (CIA)은 병에 걸린 발의 폭이 전형적으로 100％ 증가하면서 홍반 및 부종을 특징으로 한다. 관절 뒤틀림 및 척추염으로의 질환 진행을 평가하기 위해 임상 채점 지수가 개발되었다 ([Wooley, Methods In Enzymology 1988; 162:361-373]). 병에 걸린 관절의 조직병리학은 윤활막염, 판누스 형성, 및 연골 및 골 미란을 나타내고, 이들 또한 지수로 표현될 수 있다. 면역학적인 실험실 결과에는 제II형 콜라겐에 대한 높은 항체 수준, 및 고감마불린혈증이 포함된다. 이러한 모델은 현재 관절 질환에 대한 면역치료적 접근법의 테스트용으로 잘 확립되어 있고 ([Staines et al. British Journal of Rheumatology 1994; 33(9):798-807]), 류머티스성 관절염 (RA)의 치료를 위한 생물학적 및 약리학적 작용제 양쪽 모두의 연구에 대해 성공적으로 사용되었다 ([Wooley et al. Arthritis Rheum 1993; 36:1305-1314], 및 [Wooley et al. Journal of Immunology 1993; 151:6602-6607]).
RAGE 수용체의 길항작용은 RA에서의 잠재적인 치료 표적으로 인지된다. 콜라겐-유도 관절염에 걸린 마우스에서의 RAGE의 차단은 관절염의 임상적 및 조직학적 증거의 억제를 초래하였고, 질환 경감이 관절염 발 조직에서의 TNFα, IL-6, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(metalloproteinase) MMP-3, MMP-9 및 MMP-13의 수준 감소와 관련되었다 ([Hofmann et al. Genes Immun 2002; 3(3):123-135]). 이는 콜라겐-유도 관절염이 RAGE 표적화 치료법에 대해 민감성이라는 것을 가리킨다.
본 실험에서는 제II형 콜라겐으로의 면역화 시점부터 투여된 3가지 용량에서 CIA에 대한 RAGE-Ig 융합 단백질의 효과가 평가될 것이다. 연구 디자인이 도 7에 제시된다.
40마리의 8-10주령 DBA/1 LacJ 마우스를 Jackson Labs로부터 수득하고, 실험 전에 최소 10일 동안 설비에 적응시켰다. 실험을 시작할 때 모든 동물은 체중이 16 그람을 초과하였다. 마우스를 4개의 처리 군 중 하나로 나누었다: 1) 100 ㎕ 무균성 PBS, 매일 복강내 주사; 2) 10 ㎍의 RAGE-Ig 융합 단백질을 함유하는 100 ㎕ 무균성 PBS, 매일 복강내 주사; 3) 100 ㎍의 RAGE-Ig 융합 단백질을 함유하는 100 ㎕ 무균성 PBS, 매일 복강내 주사; 및 4) 300 ㎍의 RAGE-Ig 융합 단백질을 함유하는 100 ㎕ 무균성 PBS, 매일 복강내 주사.
최초의 투약 3일 후, 모든 마우스에게 프로인트 완전 애쥬번트 (FCA) 내의 100 ㎍의 소 제II형 콜라겐을 꼬리의 기부에서 피내 주사하였다. 질환의 발병에 대해 매일 검사에 의해 마우스를 모니터링하고, 이를 기록하였다. 마우스를 매주 칭량하였고, 전반적인 건강 상태를 주목하였다. 관절염에 걸린 동물을 면역화 후 10주까지 매주 5회 임상적으로 평가하였고, 매주 3회 발을 측정하였다. 면역화 10주 후 관절염의 징후가 없는 마우스는 질환 음성으로 간주하였다.
결과
전체적인 건강 및 독성. 실험 동안 급성 독성 에피소드가 발생하지 않았고, 실험 기간에 모든 동물이 생존하였다. 처리가 잘 허용되었고, 유해 징후 예컨대 털 매팅(matting) 또는 자극이 관찰되지 않았다. 마우스 중량 (도 8)은 실험 과정에 걸쳐 중량에서의 미량의 변화를 가리켰고, 전형적으로 이는 질환의 발병에 상응하는 개별적인 동물들에서의 일시적인 체중 감소로 인한 것이다. 군들 간의 이러한 변동 중 어떤 것도 통계적 유의성에 도달하지 않았다.
관절염의 발생률 및 발병. 실험에서의 콜라겐 관절염의 최종 발생률이 도 9에서 제시된다. 대조군 마우스는 100％ 발병에 도달하였고, 이는 발생률이 전형적으로 80％-100％ 범위인 고전적인 콜라겐 관절염 모델에서 비일상적이지 않다. 10 ㎍/일 RAGE로 처리된 마우스는 80％의 발생률에 도달하였고, 이는 발생률에서의 유의한 감소가 아니였다. 100 ㎍/일 RAGE로 처리된 마우스는 60％의 관절염 발생률을 나타냈고, 이는 대조군보다 유의하게 낮았다 (p<0.05). 놀랍게도, 300 ㎍ RAGE로 처리된 마우스에서의 관절염의 발생률이 100％였고, 따라서 대조군 발생률과 유사하였다.
질환 발병일의 평균 (및 SEM)이 도 10에서 제시된다. 대조군에서는 질환 발병이 전형적이었고, 이때 관절염이 최초로 나타난 평균 발병일은 38.6일이었다. 10 ㎍ 또는 100 ㎍ RAGE로 처리된 마우스에서의 질환 발병은 명목상 42.5일로 지연되었지만, 이는 통계적 유의성을 달성하지 않았다. 그러나, 300 ㎍의 RAGE로 처리된 마우스에서 질환 발병이 유의하게 지연되었다 (p<0.05). 따라서, 고용량으로 처리된 마우스가 질환 발생률에서의 감소를 나타내지 않았지만, 임상적으로 명백한 관절염의 발달까지의 시간이 두드러지게 증가되었다.
RAGE 치료에 의한 질환 발병의 조정을 시간에 따른 질환 발생률의 도면에 의해 쉽게 평가할 수 있다 (도 11). CIA의 전형적인 급속한 질환 발병 특성이 대조군에서 관찰된 반면, 10 ㎍ 또는 100 ㎍의 RAGE로 처리된 마우스에서는 질환 발병의 지연 및 관절염의 더 낮은 최종 발생률이 초래되었다. 약 8주 동안, 300 ㎍ RAGE로 처리된 마우스에서 유사한 패턴으로 질환이 발달되었지만, 일련의 후기 관절염 동물들에서는 높은 질환 발생률, 그러나 지연된 질환 발병이 초래되었다.
질환 중증도 및 진행. 처리 동물 및 대조군 동물에서의 누적 관절 점수의 분석은 콜라겐-유도 관절염의 중증도에 대한 RAGE 치료법의 유의한 효과를 드러냈다 (도 12). 대조군 마우스에서는 누적 관절염 지수가 두드러지게 증가하면서 전형적인 만성 진행성 질환이 발달되었다. 반면에, 임의 용량의 RAGE로 처리된 마우스는 관절염 점수에서 두드러진 감소를 나타냈다. 대조군과 처리군 간의 차이는 면역화후 제43일부터 높은 수준의 통계적 유의성 (p<0.001)을 달성하였고, 이러한 차이가 실험 전반에 걸쳐 유지되었다. 100 ㎍/일의 RAGE 치료법에서 가장 낮은 관절염 누적 점수가 달성되었지만, 관절염 점수와 관련하여 RAGE 군들 간에 유의한 차이는 없었고, 이는 고전적인 용량 의존적 효과보다는 '역치' 효과가 달성되었음을 시사한다.
관절염 발의 수에 대한 RAGE 치료법의 영향에 대한 분석 (도 13)은 질환의 진행에 대한 유의한 효과를 나타낸다. 또다시, 침범된 발의 수에 대해 유의한 영향이 제43일부터 계속 관찰되었다. 유의성 수준은 p<0.001 내지 p<0.025로 변하였고, 이는 RAGE의 영향이 관절염 진행보다는 질환 중증도에 대해 더욱 확연하였음을 반영할 수 있다; 그러나, 침범된 발의 최대 개수 (40)가 최대 누적 질환 점수 (120)보다 더 제한된다. 또다시, RAGE 처리군들 간에 유의한 변동이 없었지만, 100 ㎍ RAGE 군이 가장 높은 수준의 관절염 지연을 나타냈다.
결과는 예방적 프로토콜을 사용하여 투여된 경우 RAGE 단백질의 투여가 콜라겐-유도 관절염에 대해 두드러진 효과를 발휘하였음을 시사한다. 어떠한 용량에서도 RAGE 주사의 명백한 독성 효과가 없었고, 처리가 매우 잘 허용되는 것으로 나타났다. 전체적인 질환 발생률이 100 ㎍이 매일 제공된 마우스에서 유의하게 감소되었고, 질환 발병의 지연이 300 ㎍/일로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 그러나, 질환 점수 및 관절염 발 수의 감소에서 임상 활성의 가장 분명한 조짐이 관찰되었고, 이때 면역화 후 제43일부터 RAGE로 처리된 마우스와 대조군 마우스 간에 광범위한 분리가 검출되었다. 이러한 시점에, 대조군 동물은 전형적인 중증 관절염 진행을 경험한 반면, 모든 용량에서의 RAGE 처리는 질환 진행을 지연시켰다.
조직병리학적 평가: 임상 평가 연구의 완료 시에 모든 마우스로부터의 사지를 제거하고, 중성 완충 포르말린 용액에서 보관하였다. 18일 동안 10％ 포름산에서 관절에서 석회질을 제거하고, 탈수시키고, 파라핀 블록 내에 매립하였다. 세로축을 따라 절편을 절개하고, 마운팅(mounting)하고, 헤마톡실린 및 에오신 또는 톨루이딘 블루(Toluidine Blue)로 염색하였다. 대략 정중선으로 표본들을 절단한 후, 시상 중앙 샘플들을 평가용으로 마운팅하였다. 이는 일관된 지리학적 평가를 허용하였다. 5개 내지 10개의 샘플을 마운팅하였다 (일반적으로 슬라이드 당 4-6개의 샘플). 염색 후, 슬라이드들을 커버슬립과 영구적으로 결합시켰다. 표본 당 최소 3개의 별도의 절편들을 평가자가 군 할당을 모르게 하면서 맹검 방식으로 평가하였다. 앞다리에서, 모든 팔꿈치, 손목, 및 손허리 관절을 채점하였고, 뒷발에서 모든 무릎, 발목, 및 발허리 관절을 채점하였다. 절편화 절차에서 대부분의 PIP 관절이 제거되었기 때문에, 손발가락은 평가하지 않았다. 슬라이드들을 윤활막염, 판누스 형성, 가장자리 미란, 구조적 변화 (주로 부분탈구), 및 파괴의 존재에 대해 평가하였다. 그후, 이러한 집단적인 포인트들을 기초로, 전체적인 점수를 각각의 절편에 할당하였다. 채점 시스템은 하기와 같았다:
윤활막의 두께에 의해 윤활막염을 평가하였고, 하기와 같이 채점하였다: 0점 - 세포 3개 미만의 두께; 1점 - 세포 3-5개의 두께; 2점 - 세포 6-10개의 두께; 3점 - 세포 10-20개의 두께; 및 4점 - 세포 20-30개의 두께.
판누스 형성을 하기와 같이 채점하였다: 0점 - 판누스 형성 없음; 1점 - 미세융모 존재; 2점 - 뚜렷한 판누스 부착; 3점 - 두드러진 판누스 부착; 및 4점 - 판누스로 채워진 관절강.
가장자리 미란을 하기와 같이 채점하였다: 0점 - 가시적인 미란 없음; 1점 - 관절낭 부착 영역에서의 약간의 만입; 2점 - 뚜렷한 연골 미란; 3점 - 미란이 연골하 골 내로 확장됨; 및 4점 - 골 및 연골의 대량 미란.
구조적 변화를 하기와 같이 채점하였다: 0점 - 정상적인 관절 구조; 1점 - 부종성 변화; 2점 - 관절을 잇는 표면들의 미량의 부분탈구; 3점 - 관절을 잇는 표면들의 대량 부분탈구; 4 점 - 완전한 섬유증 및 콜라겐 연결(bridging).
전체적인 점수는 하기를 반영한다: 0점 - 고전적인 정상 관절 외양; 1점 - 미량의 변화, 완화와 일치, 임상적으로 정상일 수 있음; 2점 - 명확한 염증성 관절염; 3점 - 대량의 염증성, 미란성 질환; 및 4점 - 파괴적인 미란성 관절염.
연골 및 골 매트릭스 분해. 일련의 절편들을 조직화학적 염색제 톨루이딘 블루를 사용하여 연골 매트릭스 성분들에 대해 염색하였다. 톨루이딘 블루 절편들을 프로테오글리칸 손실에 대해 평가하였다. 관절 표면에서의 염색을 성장판에서의 염색과 비교하였고, 하기와 같이 채점하였다: 0점 - 프로테오글리칸 손실 없음, 정상적인 톨루이딘 블루 염색; 1점 - 미량의 프로테오글리칸 손실, 표면 연골로부터의 약간의 염색 손실; 2점 - 중등도의 프로테오글리칸 손실, 약한 표면 연골 염색; 3점 - 유의한 프로테오글리칸 손실, 표면 연골의 톨루이딘 블루 염색 없음; 및 4점 - 대량의 프로테오글리칸 손실; 심부 연골의 톨루이딘 블루 염색 없음.
결과
콜라겐-유도 관절염의 조직학적 결과. 절편들을 질환의 염증성 및 미란성 파라메터에 대해 평가하였다. 관절염의 외양 (도 14)은 대조군 (PBS 처리) 군에서 이러한 시점에 두드러진 판누스 부착 및 가장자리 미란과 함께, 윤활막 비대 및 과다형성의 전형적인 관절염 양상이 있는 전형적인 염증성 미란성 질환 병리학을 나타냈다.
10 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로의 처리 (도 14B)로 미란 및 파괴된 연골 표면의 외양에서의 전체적인 개선과 함께 염증성 및 미란성 파라메터에서의 중등도의 변화가 초래되었다. 100 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로의 처리 (도 14C)로는 대조군과 비교하여 판누스 형성 및 미란에서의 감소가 초래되었고, 전체적인 차이가 꽤 두드러졌다. 그러나, 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질의 투여 (도 14D)로는 두드러진 판누스 부착 및 가장자리 미란과 함께, 윤활막 비대 및 과다형성이 있는, 염수 대조군에서 보이는 병리학보다는 다소 덜 심각한 것으로 나타나긴 했지만 꽤 심각한 관절염이 초래되었다.
염증 점수의 분석 (도 15)은 대조군 (염수-처리) 동물과 비교하여 모든 용량의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 마우스에서 염증에서의 감소를 드러냈다. 그러나, 윤활막염이 100 ㎍/㎖ 군에서만 유의하게 감소되었고 (p<0.05), 판누스 형성이 유사한 점수 감소를 나타냈다 (p<0.03). 10 ㎍/㎖ 또는 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질을 사용하여 관찰된 염증성 질환 파라메터의 감소는 통계적 유의성에 도달하지 못했다.
콜라겐-유도 관절염의 미란성 양상에서의 변화 (미란, 및 관절 구조에서의 변화)의 평가는 유사한 패턴의 효과들을 나타냈다. 관절 미란에서의 유의한 감소 (p<0.01)가 대조군 (염수-처리) 동물과 비교하여 100 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 군에서 관찰된 한편 (도 16), 10 ㎍/㎖ 및 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 마우스에서 관찰된 감소는 유의성에 도달하지 않았다.
조직병리학적 파라메터들의 전체적인 조직학적 관절염 점수 (도 17)로의 조합은 개별적인 병리학 파라메터들의 결과를 반영하였다. 대조군 (염수) 처리 동물과 100 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 마우스 간의 유의한 차이 (p<0.02)가 관찰되었고, 10 ㎍/㎖으로 처리된 마우스에서의 전체적인 점수는 겨우 유의성에 도달한 한편 (p=0.05), 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질에서는 전체적인 질환 점수에서의 유의한 감소가 관찰되지 않았다.
톨루이딘 블루로 염색된 절편들을 시험하여, RAGE-Ig 융합 단백질이 관절염 관절로부터의 매트릭스 단백질의 손실에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하였다. 데이터 (도 18 및 19에서 제시됨)는 RAGE-Ig 융합 단백질이 프로테오글리칸 손실에 대해 보호하였음을 시사하지만, 이러한 효과는 100 ㎍/㎖ 용량에서만 통계적으로 유의하였다 (p<0.05). PBS 대조군은 연골 매트릭스 (프로테오글리칸 및 콜라겐)의 대량 손실을 나타냈고, 근위부 연골에서의 염색의 두드러진 손실이 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 마우스에서 나타났다. 반면에, 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질의 투여로 매트릭스 단백질이 양호하게 보존되었다.
RAGE-Ig 융합 단백질로의 콜라겐-유도 관절염의 치료가 질환의 발생률 및 중증도에 대한 효과를 초래하였다는 임상 데이터가 조직학적 결과에 의해 확증되었다. 조직학적 파라메터가 100 ㎍/㎖로 처리된 마우스에서 높은 수준의 통계적 유의성에 도달하였고, 10 ㎍/㎖로 처리된 마우스에서 전체적인 병리학에 대한 통계적 유의성을 달성하였다. 100 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질은 관절 구조의 양호한 보존, 및 평가된 모든 관절염 파라메터의 유의한 감소를 달성하였다. 염증성 변화의 정도가 2차 질환 파라메터들보다 덜 영향을 받았기 때문에, 전체적인 효과는 RAGE-Ig 융합 단백질이 미란성 단계의 관절염을 차단한 것이었다. 300 ㎍/㎖의 RAGE-Ig 융합 단백질로 처리된 마우스는 더 낮은 용량과 동일한 정도로 보호되지 않아서, 또다시 이러한 수준의 단백질 투여에 대한 억제성 응답의 가능성을 일으켰다. 전체적으로, 이러한 결과는 연구에서 이루어진 임상 관찰과 일치하였고, RAGE-Ig 융합 단백질이 항-관절염 효과를 발휘할 수 있음을 실연하였다.
본 발명이 상세하게, 그리고 이의 특정 실시양태들을 참조로 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명에서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 이같은 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에서의 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별적인 간행물이 전체적으로 거명에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 거명에 의해 포함된다.
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Claims (27)
- (a) 서열 6의 아미노산 1-301, 아미노산 24-301, 아미노산 1-344, 또는 아미노산 24-344로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 아미노산 서열; 및
(b) 인간 중쇄 면역글로불린 IgG4 불변 도메인에 대해 95% 이상 동일한 제2 아미노산 서열 또는 이의 단편
을 포함하는 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 단리된 융합 단백질. - 제1항에 있어서, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이에 링커(linker)를 더 포함하는 단리된 융합 단백질.
- 제1항의 단리된 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 당뇨성 신병증, 류머티스성 관절염, 자가면역 질환, 피부염, 사구체신염, 다발성 경화증, 포도막염 안염, 자가면역 폐 염증, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 자가면역 눈 염증, 전신성 홍반 루푸스, 인슐린 내성, 류머티스성 관절염, 당뇨성 망막병증, 피부경화증, 당뇨성 신경병증, 알츠하이머병, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 제약 조성물.
- (a) 서열 6의 아미노산 1-344를 포함하는 제1 아미노산 서열; 및
(b) 인간 중쇄 면역글로불린 IgG4 불변 도메인에 대해 95% 이상 동일한 제2 아미노산 서열 또는 이의 단편
을 포함하는 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 단리된 융합 단백질. - 제4항에 있어서, 서열 6 및 서열 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 융합 단백질.
- 제5항에 있어서, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 융합 단백질.
- 제5항에 있어서, 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 융합 단백질.
- 제4항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 6으로 구성되는 것인 단리된 융합 단백질.
- 제4항의 단리된 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 당뇨성 신병증, 류머티스성 관절염, 자가면역 질환, 피부염, 사구체신염, 다발성 경화증, 포도막염 안염, 자가면역 폐 염증, 인슐린 의존적 진성 당뇨병, 자가면역 눈 염증, 전신성 홍반 루푸스, 인슐린 내성, 류머티스성 관절염, 당뇨성 망막병증, 피부경화증, 당뇨성 신경병증, 알츠하이머병, 또는 염증성 질환의 치료를 위한 제약 조성물.
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