JP2005504732A - タニスと血清アミロイドａとの相互作用を変化させる方法及び該方法に有用な物質 - Google Patents
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Abstract
【課題】
【解決手段】
本発明は一般的に血清アミロイドＡ又はその誘導体、同族体、類似体、同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法に関する。より具体的にはタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の細胞内レベルを変化させることにより血清アミロイドＡの機能的活性を変化させる方法に関する。本発明の方法は、とりわけ異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する場合において特に有用である。本発明は更にタニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させ得る物質を同定及び／又は設計する方法に向けられる。
【解決手段】
本発明は一般的に血清アミロイドＡ又はその誘導体、同族体、類似体、同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法に関する。より具体的にはタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の細胞内レベルを変化させることにより血清アミロイドＡの機能的活性を変化させる方法に関する。本発明の方法は、とりわけ異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する場合において特に有用である。本発明は更にタニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させ得る物質を同定及び／又は設計する方法に向けられる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に血清アミロイドＡ又はその誘導体、同族体、類似体、同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法に関する。より具体的にはタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の細胞内レベルを変化させることにより血清アミロイドＡの機能的活性を変化させる方法に関する。本発明の方法は、とりわけ異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態の治療及び／又は予防において特に有用である。本発明は更にタニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させ得る物質を同定及び／又は設計する方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者により引用された刊行物の書誌的詳細は本明細書の末尾にアルファベット順にまとめてある。
【０００３】
本明細書におけるいずれの先行技術についての言及も、この先行技術がオーストラリアの一般的常識の一部をなすという認識又は如何なる形式の示唆でもなく且つそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
血清アミロイドＡ（本明細書中「ＳＡＡ」と呼ぶ）タンパク質は炎症に応答して高レベル調節される急性期タンパク質のファミリーである。ＳＡＡは多型でもあり且つ同義遺伝子によりコードされるこのファミリーに与えられる集合名である（非特許文献１，２，３を参照）。詳しい分析により、ＳＡＡスーパーファミリーがヒトの染色体の１１ｐ１５に局在する密接に関連した遺伝子のクラスターであることが明らかになった（非特許文献４を参照）。ワトソンら（1994）は更にＳＡＡスーパーファミリーの機能性遺伝子の全て（即ちＳＡＡ１、ＳＡＡ２及びＳＡＡ４）が１１ｐ１５．４〜ｐ１５．１の領域内に位置付けられることを証明した（非特許文献５を参照）。
【０００５】
ＳＡＡは急性期応答中に高比重リポタンパク質（ＨＤＬ３）の第三画分と急速に結び付く小さなアポリポタンパク質である。該画分上でそれらは圧倒的に多いアポリポタンパク質になる。ＳＡＡは炎症中にＨＤＬ３のマクロファージへの結合を増強すると同時にＨＤＬ３の肝細胞への結合能を低下させる（非特許文献６を参照）。これらの変化はＳＡＡがＨＤＬ３を再構築し、それを肝細胞からマクロファージへ振り向けるためのシグナルとして作用し、次いでマクロファージは壊死の部位でコレステロール及び脂質残骸を呑食することを示唆している。このようにして、過剰のコレステロールは組織の修復に使用するため再配分され又は分泌され得る。
【０００６】
ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は２型糖尿病で検出される。２型糖尿病におけるＳＡＡの増加は、組織の修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用しうる。この増大した異化は糖尿病患者で観察される低いＨＤＬ濃度に対する可能な理由であると考えられ、アテローム斑でのマクロファージによる取り込みは２型糖尿病における動脈疾患の危険性の増大に対する理由の一部であり得るであろう。
【０００７】
ＳＡＡのレベルは損傷、感染又は炎症に応答して１０００倍までも増大し得る。続発性又は反応性のアミロイドーシスは様々な慢性及び再発性の炎症疾患の一つの結果である。続発性アミロイド沈着は主にアミロイドＡから構成され、ＳＡＡ前駆体からタンパク質分解により誘導されると考えられる。親生産物からの切断される際、アミロイドＡは凝集して、アミロイドーシスとして知られる全身合併症を惹起する不溶性の逆平行β−プリーツシート原線維を形成できる（非特許文献７を参照）。定義上、アミロイド原線維はコンゴレッドで陽性に染まり、偏光を用いて観察すると緑色の複屈折を示す。
【０００８】
血清アミロイドＡタンパク質は進化の間中よく保存され、関節炎、多発性硬化症、強皮症、外傷、強直性脊椎炎、大腸炎、急性膵炎、移植拒絶、感染及び心臓病を含む様々な他の病的状態に関係してきた。
【０００９】
従って、血清アミロイドＡタンパク質の作用機構の解明は、異常な又は他の点で望ましくない血清アミロイドの機能的活性により特徴付けられる状態を治療することに向けられた治療戦略及び／又は予防戦略の開発に必要である。
【非特許文献１】
バウゼルマン，エルエル、ヘルベルト，ピイエヌ、マッカダム，ケイピイダブリュジェイ(1980)，J.Exp.Med. 152:641-656。
【非特許文献２】
クルヴェ−ベッカーマン，ビイ、ネイラー，エスエル、マルシャル，エイ、ガードネル，ジェイシイ、ショーズ，ティビイ、ベンソン，エムディ(1986)，Biochem. Ciophys. Res. Commun. 137:1196-1204。
【非特許文献３】
クルヴェ−ベッカーマン，ビイ、マレ，イー、ビット，エイチ、プフェイフェル，シイ、ベンソン，エム、ステインメルツ，エイ(1991)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:1097-1102。
【非特許文献４】
セーラー，ジイシイ、ジョルドン，エスエイ、ビックモア，ダブリュエイ、ファンテス，ジェイエイ、ヴァン，ヘイニンゲン，ブイ、ホワイトヘッド，エイエス(1994)，Genomics 19:221-227。
【非特許文献５】
ワトソン，ジイ、シー，シイジイ、ウォー，ピイ(1994)，Genomics 23:694-696。
【非特許文献６】
ジェンセン，アイイー、ホワイトヘッド，エイエス(1998)，Biochem J 334(pt3):489-503。
【非特許文献７】
フォーク，アールエイチ、コメンゾ，アールジェイ、スキナー，エム(1997)，N Engl J Med 25 337(13):898-909。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に至る研究において、本発明者らはタニス（Ｔａｎｉｓ）タンパク質が血清アミロイドＡタンパク質と相互作用することを確定した。タニスの発現は絶食及び給餌により本質的に調節されることにより体重及びエネルギー代謝の調節機構を提供するとこれまで考えられてきた。本発明を決して限定するものではないが、タニスは膜結合タンパク質として存在し、受容体として機能すると考えられる。タニスと血清アミロイドＡとの相互作用の同定は、タニスの機能的役割に関する現状理解を顕著に拡大し、血清アミロイドＡが媒介する機能的活性の変化に向けられた方法論の開発をここに促進した。更に、異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの機能的活性により特徴付けられる状態を治療するための治療計画及び／又は予防計画の設計が促進される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本明細書及び以下の請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む(comprise)」という単語、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、明記した完全体若しくは段階又は完全体若しくは段階の群の包含を意味するが、任意の他の完全体若しくは段階又は完全体若しくは段階の群の排除を意味するわけではないと理解されるであろう。
【００１２】
本明細書は、パテントイン3.0版のプログラムを用いて作成されたヌクレオチド及びアミノ酸の配列情報を明細書の参照文献の後に提示する。個々のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、数字表示＜２１０＞、続いて配列識別子（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２等）により配列表で同定される。個々のヌクレオチド又はアミノ酸の配列の長さ、配列の型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）等）及び生物の起源はそれぞれ数字表示場＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３で提示される情報により示される。本明細書で言及されるヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、数字表示フィールド＜４００＞、続いて配列識別子（例えば＜４００＞１、＜４００＞２等）で提示される情報により規定される。
【００１３】
本発明の一側面は、被験体においてアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該リポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
別の一側面では、被験体においてＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該ＳＡＡとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１５】
更に別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１６】
更なる別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の一側面は、哺乳動物における、異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられる状態の治療方法及び／又は予防方法であって、タニスと該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００１８】
本発明の更なる別の一側面は、哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における上に定義した物質の使用であって、、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なＳＡＡが媒介する細胞活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとＳＡＡとの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００１９】
別の一側面において、本発明は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、上で定義した物質の使用であって、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとＳＡＡとの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００２０】
更なる別の一側面において、本発明は上で定義した変化させる物質を一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤と共に含む医薬組成物を意図する。
【００２１】
本発明の更なる別の一側面は本発明の方法で用いられる場合の上で定義した物質に関する。
【００２２】
本発明の別の一側面は、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とタニスとの相互作用を変化させ得る物質を検出する方法であって、タニス及びＳＡＡを含むインビトロ系と推定された物質とを接触させる工程、及び該相互作用と関連して改変された発現の表現型を検出する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
本明細書を通して用いられる一文字及び三文字の略号は表１に定義される。
【００２４】
【表１】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明はタニスと血清アミロイドＡタンパク質との相互作用の関係の解明に一部基づいている。この測定により、望ましくない血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態を処理するための治療方法及び／又は予防方法の合理的な設計が可能になる。更に、タニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させる物質の同定及び／又は設計が促進される。
【００２６】
従って、本発明の一側面は、被験体におけるアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
より具体的には、被験体におけるＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体若しくは化学的同等物と該ＳＡＡとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００２８】
「ＳＡＡ」についての言及は、急性期タンパク質のＳＡＡスーパーファミリーの任意の構成員についての言及と理解されるべきである。本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に限定することなく、ＳＡＡは小さなアポリポタンパク質である。それらのレベルは感染中、炎症中又は損傷後に著しく高まり、そしてそれらは高比重リポタンパク質の第三画分と結び付き、それによりＨＤＬ３を再構築し感染中にＨＤＬ３のマクロファージへの結合を強化することが知られている。ＳＡＡファミリーの各構成員に関して、「ＳＡＡ」という用語は該構成員又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の全形態を包含することも理解されるべきである。ＳＡＡｍＲＮＡの代替的スプライシングから生じる任意のイソ型又はＳＡＡの突然変異体若しくは多型変異体についての言及が含まれることも理解されるべきである。この点について、タンパク質のＳＡＡファミリーは多型であり且つ同義遺伝子によりコードされることが知られている。「ＳＡＡ」は、少なくとも一つのＳＡＡの機能的活性を示す任意の他分子についての言及を含むことが更に理解されるべきである。
【００２９】
「ＳＡＡが媒介する機能的活性」についての言及は、ＳＡＡの作用により直接的又は間接的に誘発される生理的過程又は細胞活性など任意の一つ以上の機能的活性についての言及として理解されるべきである。「直接的に」誘発される機能的活性は、ＳＡＡシグナル（例えば肝細胞からマクロファージへのＨＤＬ３の振り向け）又はＳＡＡとの相互作用（例えばＳＡＡへの結合後のＨＤＬ３の再構築）の結果として最初に誘発される活性についての言及として理解されるべきである。「間接的に誘発される活性」は以上で定義したような直接作用の下流の結果である活性として理解されるべきである。例えば、ＳＡＡの誘導は、核因子−カッパＢ、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質及びＳＡＡ活性化因子という少なくとも３つの転写因子のＤＮＡ結合活性の増大と関連することが知られている（レイとレイ、1999）。これらの転写因子はＳＡＡに特異的なものではなく、幾つかの他の遺伝子の転写を改変することが知られている。これらの因子の活性化は従って上で同定した転写因子の結合活性を改変することによりこれらの遺伝子の発現を間接的に改変することがある。
【００３０】
「タニス」又は「タニスをコードするヌクレオチド配列」についての言及は、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の全ての形又はタニスの機能を有する他分子についての言及として理解されるべきである。これは例えばタニスのあらゆるタンパク質形若しくは核酸形又は例えばタニスｍＲＮＡの代替的スプライシングから生じる任意のイソ型若しくはタニスの突然変異体若しくは多型変異体を含むタニスの機能的同等物若しくは誘導体を含む。「タニスをコードするヌクレオチド配列」についての言及は、タニスの発現を調節する任意のタニス調節要素（プロモーター又はエンハンサーなど）への言及を含み、そしてタニス・ゲノムＤＮＡ転写の開始部位と終結部位との間以外の位置にある部位を含むと理解されるべきである。「タニス」とはタニスの機能的活性を示す任意の他分子についての言及を含むことも理解されるべきである。このような分子は例えばタニスの機能的活性を示す内生的に発現する分子又は体内に導入されタニスの機能の少なくとも一つを模倣する分子を含む。これらの分子は組換え体でも、合成体でも又は天然に存在するものであってもよい。特定されない限りは、タニスをコードする核酸分子の発現又はタニス発現産物の機能的活性を変化させることについての如何なる言及も、タニスの機能的同等物又は誘導体の発現又は機能的活性を変化させることについての言及を含むと理解されるべきである。本発明を決して限定することなく、タニスは「バンド５５」又は「Ｂ５５」としても知られ、その核酸のｃＤＮＡ配列及びゲノム配列は国際特許公開第ＷＯ０１／０２５６０号で提供される。これは参照により本明細書にインコーポレートされる。ヒトのタニスは＜４００＞１３で示される配列を含む。ゲノム配列はエキソン及びイントロンを含んでもよいことが理解されるべきである。ゲノム配列はプロモーター領域又は他の調節領域も含みうる。国際特許公開第ＷＯ０１／０２５６０号に開示されたゲノム配列は転写開始部位から転写終結部位までの配列部分にのみ対応すると理解されるべきである。従って、本発明により包含されるこの配列及び他のゲノム配列は転写開始部位から転写終結部位までを包含するより多くの配列又は少ない配列のいずれかを含んでもよい。例えばそれは転写の部位（単数又は複数）の上流又は下流に位置する調節配列などの付加的な非翻訳配列を含みうる。タニスをコードする核酸分子についての言及はタニスとして下線を引いた文字で本明細書中に示される。
【００３１】
本発明を任意の一理論又は作用様式に限定することなく、タニスはＳＡＡと相互作用すると決定された。タニスはＳＡＡの受容体として機能する膜結合分子として存在すると考えられる。従って、ＳＡＡはタニスとの相互作用を介して細胞にシグナル伝達すると考えられる。タニス−ＳＡＡ相互作用関係の存在の解明はＳＡＡが媒介する細胞活性及び／又は生理的過程を変化させる機構を提供する。「変化」とは上下への調節を意味する。タニスとＳＡＡの間の相互作用の変化は（高レベルへの調節又は低レベルへの調節のいずれかの意味において）部分的であっても完全であってもよいと理解されるべきである。
【００３２】
部分的な変化は所与の被験体に正常で起こるＳＡＡ−タニス相互作用の一部だけが本発明の方法により影響を受ける場合に生じ（例えば本発明の方法が該細胞がＳＡＡにより媒介性される能的活性を受ける時間の一部だけ被験体に適用されるか又はＳＡＡとタニスとの相互作用を変化させる物質が全てのタニス−ＳＡＡ相互作用を飽和するのに不十分な濃度で提供される）、一方、完全な変化はタニス−ＳＡＡ相互作用の全てが変化を受ける場合に生じる。
【００３３】
好ましい方法はＳＡＡ−タニス相互作用の変化を介してＳＡＡが媒介する機能的活性を変化させることであるが、特にタニスが非膜結合形態でも機能しうる限り、ＳＡＡとのその相互作用の変化を介してタニスが媒介する機能的活性を変化させることも可能である。
【００３４】
従って、別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３５】
より具体的には、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３６】
「タニスが媒介する機能的活性」についての言及は、タニスの作用を介して直接的又は間接的に誘発される細胞活性又は細胞シグナル機構などの任意の一つ以上の機能的活性についての言及として理解されるべきである。「直接的」及び「間接的」作用についての言及はＳＡＡが媒介する機能的活性に関して上に定義したものと同じ一般的な意味を有するべきである。
【００３７】
タニスとＳＡＡとの相互作用の変化は、
(i) 相互作用の目的に利用できるタニス又はＳＡＡの細胞内濃度を変化させるために、タニス又はＳＡＡ又はその誘導体、同族体若しくは類似体をコードする核酸分子を細胞に導入する工程又はタニス又はＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体のタンパク質形を被験体に導入する工程、
(ii) 遺伝子の転写調節及び／又は翻訳調節を変化させるタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程であって、該遺伝子がタニス遺伝子又はＳＡＡ遺伝子であってよい工程、
(iii) タニスとＳＡＡの間の相互作用に拮抗するタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程、
(iv) タニスとＳＡＡの間の相互作用を作動するタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程、
を含む幾つかの技術のいずれか一つにより達成されうるが、これらに限定されない。
【００３８】
「物質」についての言及は、タニスとＳＡＡとの相互作用を変化させる任意のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子についての言及として理解されるべきであり、例えば上記の(i)〜(iv)の項で詳述した分子を含む。当該物質は任意のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子と連結、結合又は他の方法で結び付きうる。例えばそれは、それを局在化された領域へ標的化することを可能にする分子と結び付きうる。
【００３９】
該タンパク質性分子は融合タンパク質又は例えば天然産物のスクリーニング後に得られるものを含む天然、組換え又は合成の供給源に由来しうる。該非タンパク質様分子は例えば天然産物のスクリーニングなどの天然起源に由来しても又は化学合成されてもよい。本発明はタニス−ＳＡＡ相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用できる該タニス又はＳＡＡの化学類似体を意図する。化学アゴニストは必ずしも該タニス又はＳＡＡに由来しうるものではないが、一定のコンフォメーションの類似性を共有しうる。或いは、化学アゴニストは該タニス又はＳＡＡの一定の生理化学的性質を模倣するよう特異的に設計されうる。アンタゴニストはタニスとＳＡＡの相互作用を遮断、阻害又は他の方法で防止できる任意の化合物であってよい。アンタゴニストは被験体の細胞において該タニス又はＳＡＡ又は該タニスの一部に特異的なモノクローナル抗体、及び遺伝子若しくはｍＲＮＡの転写若しくは翻訳を防止するアンチセンス核酸を含む。発現の変化は抗原、ＲＮＡ、リボソーム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡアプタマー（aptamers) 、抗体又は共抑制での使用に適した分子を利用しても達成されうる。このような分子を同定する際の使用に適したスクリーニング方法は以下でより詳細に記載する。
【００４０】
該タンパク質性分子又は非タンパク質性分子はＳＡＡとタニスの相互作用を変化させるために直接的又は間接的のいずれかで作用しうる。該分子はタニス又はＳＡＡ分子と結び付く場合は直接的に作用する。該分子はタニス又はＳＡＡ以外の分子と結び付く場合は間接的に作用する。該他の分子はＳＡＡとタニスの相互作用を直接的又は間接的のいずれかで変化させる。従って、本発明の方法は調節段階のカスケードの誘導を介したタニス−ＳＡＡ相互作用の調節を包含する。
【００４１】
「誘導体」とは融合タンパク質を含む天然、合成又は組換えの供給源から得られる断片、一部、部分、突然変異体、変異体及び擬似体を含む。一部又は断片は例えばタニス又はＳＡＡの活性領域を含む。誘導体はアミノ酸の挿入、欠失又は置換により誘導しうる。アミノ酸挿入誘導体はアミノ及び／又はカルボキシルの末端融合並びに１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。アミノ酸配列挿入変異体は一つ以上のアミノ酸残基が該タンパク質の所定部位に導入されたものであるが、得られる産物の適切なスクリーニングを行なえば無作為な挿入も可能である。欠失変異体は該配列からの一つ以上のアミノ酸の除去により特徴付けられる。置換アミノ酸変異体は該配列の少なくとも一つの残基が除去されその場所に異なる残基が挿入されたものである。置換アミノ酸変異体の１例は同類アミノ酸置換である。同類アミノ酸置換は典型的には下記の群内での置換を含む。即ち、グリシン及びアラニン、バリン，イソロイシン及びロイシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、リシン及びアルギニン、並びにフェニルアラニン及びチロシンである。アミノ酸配列への付加は他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合を含む。
【００４２】
「同族体」についての言及は、処置される種以外の種に由来する核酸分子又はタンパク質についての言及として理解されるべきである。
【００４３】
核酸分子又はタンパク質分子の化学的同等物及び機能的同等物とは、これら分子の任意の一つ以上の機能的活性を示す分子として理解されるべきであり、化学合成され又は天然産物のスクリーニングなどのスクリーニング工程を介して同定されるなどして任意の供給源から誘導してもよい。
【００４４】
誘導体は、ペプチド、ポリペプチド又は他のタンパク質性分子若しくは非タンパク質性分子と融合した全タンパク質の特定のエピトープ又は部分を有する断片を含む。
【００４５】
本明細書で意図される類似体は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成中の側鎖への修飾、非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み並びにタンパク質性分子若しくはそれらの類似体にコンフォメーション上の制約を課す架橋剤及び他の方法の使用を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
核酸配列の誘導体は同様に他の核酸分子との融合を含む１個又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加により誘導してもよい。本発明の核酸分子の誘導体はオリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制及び融合での使用に適した分子を含む。核酸配列の誘導体は縮重変異体も含む。
【００４７】
本発明により意図される側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応後ＮａＢＨ4 を用いた還元による還元アルキル化、メチルアセチミデートを用いたアミジン化、無水酢酸を用いたアシル化、シアン酸塩とアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、並びにピリドキサール−５−リン酸によるリシンのピリドキシル化後ＮａＢＨ4 を用いた還元などのアミノ基の修飾を含む。
【００４８】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬を用いた複素環縮合産物の形成により修飾されうる。
【００４９】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成を介したカルボジイミドの活性化の後続いて例えば対応するアミドへの誘導により修飾されうる。
【００５０】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセタミドを用いたカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸の酸化、他のチオール化合物を用いた混合ジスルフィドの形成、マレイミド，無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応、４−クロロメルクリベンゾエート，４−クロロメルクリフェニルスルホン酸，フェニルメルクリクロライド，２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでシアン酸塩を用いたカルバモイル化などの方法により修飾されうる。
【００５１】
トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド又はハロゲン化スルフェニルを用いたインドール環のアルキル化により修飾されうる。他方でチロシン残基はテトラニトロメタンを用いたニトロ化により改変され３−ニトロチロシン誘導体を形成しうる。
【００５２】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化又はジエチルピロカルボネートを用いたＮ−カルボエトキシル化により達成されうる。
【００５３】
タンパク質合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を組み込んだ例は、ノルロイシン、４−アミノブチル酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される非天然アミノ酸の一覧を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
【表２−１】
【００５６】
【表２−２】
【００５７】
架橋剤は、例えばｎ＝１からｎ＝６までの（ＣＨ2 ）n スペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分と他の基に特異的な反応性部分を通常含むへテロ二官能性試薬を用いて、３Ｄコンフォメーションを安定化させるために使用できる。
【００５８】
本発明の好ましい方法は被験体を治療することであるが、本発明の方法はインビトロでの適用に適応されうることを理解されるべきである。このような適応は当業者により機械的に実施されうるであろう。例えばタニス膜結合分子を介して媒介される細胞活性を変化させることを求める範囲で、ＳＡＡ又はこれまで定義した変化用物質との相互作用をインビトロで実施することが可能である。これは例えばＳＡＡ−タニス相互作用を変化させる分子についてのスクリーニングのインビトロ系を確立することが求められる場合に望まれることがある。或いは、被験体への導入前に本明細書で定義した方法に従って細胞のインビトロ集団を処理することが望まれることがある。これらの細胞は例えば初めに該被験体から単離され、そして次いで、適切な処理の後に戻されうる。
【００５９】
本発明の更なる側面は、病的状態の治療及び／又は予防についての本発明の使用に関する。本発明を如何なる一理論又は一作用様式に限定することも意図しないが、ＳＡＡの多面的活性は、これらの分子を健康状態及び病的状態の両方の生理的過程の多数の側面の不可欠な機能要素とならしめる。従って、本発明の方法は異常な又は他の点で望ましくないＳＡＡの機能的活性を変化させるための価値ある道具を提供する。関連する側面において、本発明は、この機能的活性がＳＡＡにより媒介される限り、異常な又は他の点で望ましくないタニスの機能的活性を変化させる道具も提供する。
【００６０】
従って、本発明の別の一側面は哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、該アポリポタンパク質とタニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００６１】
より具体的には、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なＳＡＡが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、該ＳＡＡとタニスの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００６２】
本発明の更なる別の一側面は、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、アポリポタンパク質と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００６３】
より具体的には、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、ＳＡＡと該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００６４】
「異常な、望ましくない又は他の点で不適切な」機能的活性についての言及は、過剰な機能的活性について、それが望ましくないという点で不適切な生理的に正常な機能的活性について、又は不十分な機能的活性についての言及として理解されるべきである。例えば、ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は、II型糖尿病で検出される。II型糖尿病におけるＳＡＡの増加は組織修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用すると考えられる。この異化の増加は糖尿病患者で観察される低いＨＤＬ濃度についての可能な原因であると考えられる。正常な生理過程だが、アテローム斑におけるマクロファージによる取込みはII型糖尿病の動脈疾患の危険性の増大の原因の一部であると考えられる。従って、このような状況において、動脈疾患の進行に関連する危険性の一部を軽減するためにＳＡＡの機能的活性を少なくとも部分的に低レベル調節することが望まれる。別の一例において、ＳＡＡの刺激は、炎症性及び増殖性の関節リウマチ及び変形性関節症でしばしば見られる組織破壊に関与することが知られている酵素であるコラゲナーゼの誘導を起こさせることができる（ミッチェルら，１９９１、ブリンケルホッフら，１９８９）。従って、このような状況において、該疾患の進行に関連する危険性の一部を軽減するためにＳＡＡの機能的活性を少なくとも部分的に低レベル調節することが望まれる。
【００６５】
該状態は、
(i) 関節炎−ＳＡＡは慢性関節リウマチで増加し、ＳＡＡ濃度は疾患の重症度を反映すると考えられる（グリンデュルスら，１９９５、クンナンとホワイトヘッド，１９９９、クンナンら，２０００）。
(ii) 炎症状態−ＳＡＡは幾つかの炎症状態で増加し、血中濃度は炎症の程度を評価する可能な手段を表しうる。これらの状態は多発性硬化症（リストリら，１９９８）、強皮症（バンドヴェインら，１９８４）、外傷（モゼスら，１９８９）、強直性脊椎炎（ランゲら，２０００）、結腸炎（ヤングら，１９９９、デ・ヴィリアスら，２０００）、急性膵炎（ペジリら，２０００）を含む。
(iii) 移植−膵臓及び腎臓の移植拒絶の発作はＳＡＡの増加と関係づけられてきた（カスルら，１９９５、ハートマンら，１９９７、ムラーら，１９９７、ケイセンら，１９９９）。ＳＡＡは拒絶過程で早期に増加するらしく、患者の炎症状態の有用なマーカーであると考えられる。
(iv) 感染−ＳＡＡはウイルス感染及び急性下痢の感度の高い指標であることが示された（ウィッチェルら，１９８５、ダーリングら，１９９９）。
(v) 心臓疾患−ＳＡＡ濃度の増加は、心筋梗塞（リウジら，１９９４、キャスルら，１９９５、ダネシュら，１９９９）、冠状動脈性心臓病（ステファナディスら，２０００）、冠動脈病（エレンら，１９９９）、心疾患（リッドケットら，２０００）及びアテローム性動脈硬化（メックら，１９９４、エレンら，１９９９）の危険性の増加と関連している。
(vi) サルコイドーシス（サラザルら，２０００）
(vii) アルツハイマー病（チュングら，２０００）
(viii) 腎症（腎性アミロイドーシス）（カネコら，２０００）及び末期腎不全（ケイセンら，１９９９）
(ix) 腹部大動脈瘤（ローデら，１９９９）
(x) 肥満（ダネシュら，１９９９）
(xi) ２型糖尿病（ピックアップら，１９９７、ピックアップとクロック，１９９８）
(xii) タニス又はＳＡＡ又はそれらの相互作用に関する異常な免疫応答を伴う全ての状態
を含むことが好ましいが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で用いられる「被験体」という用語は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験用試験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ）及び捕獲した野生動物（例えばキツネ、カンガルー、シカ）を含む。該哺乳動物はヒト又は実験用試験動物であることが好ましい。該哺乳動物はヒトであることが更により好ましい。
【００６７】
「有効量」とは、望ましい応答を得るため、又は発症を遅らせるため又は進行を阻害するため又は治療される特定の状態の発症若しくは進行を共に中止させるために少なくとも部分的に必要な量を意味する。該量は治療される個体の健康状態及び身体状態、治療される個体の分類群、所望される防御の程度、組成物の製剤、医療状況の評価、並びに他の関連因子に応じて変化する。該量は機械的試験を通じて決定され得る比較的広い範囲内に収まることが予期される。
【００６８】
本明細書中、「治療」及び「予防」についての言及は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。「治療」という用語は被験体が完全回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防」とは該被験体が最終的に疾病状態に罹らないことを必ずしも意味しない。従って、治療及び予防は特定状態の症状の改善又は特定状態を発症する危険性を防止若しくは他の方法で低減することを含む。「予防」という用語は特定状態の重症度又は発症を低減するものと考えられる。「治療」も現存の状態の重症度を低減しうる。
【００６９】
本発明は、糖尿病の治療のため哺乳動物にインスリン投与をするとともに物質を投与するなどの治療の組み合わせを更に意図する。
【００７０】
医薬組成物の形態での変化用物質の投与は任意の簡便な手段により実施しうる。変化用物質の医薬組成物は特定の症例に依存する量で投与される場合に治療活性を示すことが意図される。変動は、例えばヒト又は動物及び選択された変化用物質に依存する。広範囲の用量が適用可能である。患者を考慮しながら、１日当たり体重１キログラム当たり、例えば約０．１ｍｇから約１ｍｇまでの変化用物質がに投与されうる。投与計画は最適な治療応答を生ずるように調整されうる。例えば幾つかに分割した量を日、週、月又は他の適切な時間間隔で投与してもよく、又は該用量は状況の切迫により示される場合はそれに比例して減少しうる。
【００７１】
該変化用物質は、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋内、皮下、皮内又は座剤又は移植（例えば徐放性分子を用いて）などによる簡便な様式で投与されうる。該変化用物質は酸付加塩又は例えば亜鉛、鉄等との金属錯体（この適用のため塩としてみなされる）など薬学的に許容しうる無毒性塩の形態で投与されうる。このような酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が錠剤の形で投与されるべき場合、該錠剤はトラガカント、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、アルギニン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含みうる。
【００７２】
投与の経路は、呼吸、気管内、鼻咽腔、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋内、眼内、くも膜下、大脳内、鼻腔内、注入、経口、経直腸、点滴静注を介するものを含み、パッチ及び移植を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
これらの方法に従って、本発明で定義された物質は一つ以上の他の化合物又は分子と共投与されうる。「共投与される」とは、同一製剤で又は同じ若しくは異なる経路を介した二つの異なる製剤での同時投与、又は同じ若しくは異なる経路による逐次投与を意味する。例えば当該物質はその効能を増強するためにアゴニスト剤とともに投与されうる。「逐次」投与とは二つの型の分子の投与の間で秒、分、時間又は日の時間的相違があることを意味する。これらの分子は任意の順序で投与してよい。
【００７４】
本発明の別の一側面は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、これまでに定義した物質の使用であって、その状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がアポリポタンパク質とタニスの相互作用を変化させるものである使用を意図する。。
【００７５】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００７６】
別の一側面において、本発明は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、これまでに定義した物質の使用であって、その状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がアポリポタンパク質とタニスの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００７７】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００７８】
更なる別の一側面において、本発明は一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／若しくは希釈剤と共にこれまでに定義した変化用物質を含む医薬組成物を意図する。該物質は活性成分と呼ばれる。
【００７９】
注射用途に適した医薬剤形は、滅菌水溶液（水溶性の場合）若しくは滅菌分散液及び滅菌注射溶液若しくは滅菌分散液の即時調製用の滅菌粉末を含み、又はクリームの剤形若しくは局所適用に適した他の剤形であってもよい。これは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は例えばレシチンなどの被覆剤の使用、分散の場合必要な粒子サイズの維持及び界面活性剤（superfactant）の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行われ得る。多くの場合、例えば糖類又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射組成物の持続吸収は例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる物質の組成物での使用により実施され得る。
【００８０】
滅菌注射溶液は上記で列挙した種々の他成分とともに適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要ならば続いてろ過滅菌することにより調製される。一般的に、分散液は基本分散媒及び上記で列挙したものから選んだ必要な他の成分を含む滅菌媒体中に滅菌した種々の活性成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥の技術である。これらの方法は活性成分の粉末に任意の付加的な所望成分を加えて予め滅菌ろ過した溶液からその粉末を作成する。
【００８１】
活性成分が適切に保護される場合、それらは例えば不活性な希釈剤とともに若しくは同化できる食用担体とともに経口投与してもよく、又は硬殻若しくは軟殻のゼラチンカプセルで包み込んでもよく、又は圧縮して錠剤にしてもよく、又は食事の食物とともに直接取込ませてもよい。治療用の経口投与のためには、該活性化合物は賦形剤と混ぜ、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウエハース等の剤形で用いてもよい。このような組成物及び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物及び調製物のパーセンテージは無論変更してもよく、そして単位重量の約５％から約８０％までが便利である。治療に有用な組成物中の活性化合物の量がこのような適切な用量で得られる。本発明の好ましい組成物又は調製物は経口投与単位剤形が約０．１μｇから２０００ｍｇまでの活性化合物を含むように調製される。
【００８２】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は以下に挙げる成分を含んでもよい。即ち、ガム、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチンなどの結合剤、燐酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、スクロース、ラクトース若しくはサッカリンなどの甘味料、又はペパーミント、冬緑油若しくはサクランボの風味などの着香料が添加されうる。投与単位剤形がカプセルの場合、上記の型の物質に加えて液体担体を含んでもよい。被覆剤として又は他の方法で投与単位の物理的形態を改変するための種々の他の物質が存在しうる。例えば錠剤、ピル又はカプセルはセラック、糖又は両方で被覆されうる。シロップ又はエリキシルは該活性化合物、甘味料としてスクロース、保存剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ若しくはオレンジの風味などの着香料を含みうる。無論、いずれの投与単位剤形を調製する際に用いられるどの物質も薬学的に純粋であり使用量において実質的に無毒であるべきである。その上、該活性化合物は徐放性の調製物及び製剤に組み込んでもよい。
【００８３】
医薬組成物は標的細胞をトランスフェクションできるベクターなどの遺伝分子も含んでもよい。上記ベクターは変化用物質をコードする核酸分子を保持するものである。該ベクターは例えばウイルスベクターであってよい。
【００８４】
本発明の更なる別の一側面は、本発明の方法で使用される場合、これまでに定義した物質に関する。
【００８５】
これまでに定義した変化用物質のスクリーニングは、ある物質をタニス及びＳＡＡなどのアポリポタンパク質を含む細胞培養とを接触させる工程、及びタニス−ＳＡＡ機能的活性の変化又は下流の標的細胞の活性若しくは発現の変化についてスクリーニングする工程を含む（決してこれに限定されないが）幾つかの適切な方法の任意の一つにより達成できる。このような変化の検出はウェスタン・ブロッティング、電気泳動における移動度変化検定及び／又はルシフェラーゼ、ＣＡＴなどのタニス又はＳＡＡの活性についてのレポーターの読取りなどの技術を利用して達成できる。
【００８６】
タニスタンパク質が試験の対象である細胞中に天然で存在しうること又はそれらをコードする遺伝子が試験目的で宿主細胞内にトランスフェクトされることが理解されるべきである。更に、天然に存在する又はトランスフェクトされた遺伝子が構成的に発現され、それにより、とりわけタニス−ＳＡＡ相互活性(interactivity)を低レベル調節する物質についてのスクリーニングに有用なモデルを提供する。又は該遺伝子は活性化を要し、それにより、とりわけある刺激条件下でタニス−ＳＡＡ相互活性を変化させる物質についてのスクリーニングに有用なモデルを提供する。更に、タニス核酸分子が細胞内にトランスフェクトされる限り、この分子はタニス遺伝子全体を含みうるし又は単にＳＡＡ結合部分などの遺伝子の一部を含みうる。
【００８７】
別の例では、検出の対照はタニスそれ自体ではなく、下流のタニス調節標的であってもよい。更なる他の例は最小レポーターに連結されたタニス結合部位を含む。例えばタニス−ＳＡＡ相互活性の変化はＳＡＡ又はタニスで刺激された細胞の下流シグナル発生成分の変化についてのスクリーニングにより検出できる。これは、タニス及びＳＡＡがその活性を調節する分子の変化を監視する系の１例である。
【００８８】
従って、本発明の別の一側面は、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とタニスの相互作用を変化させることができる物質を検出する方法であって、該タニス及びアポリポタンパク質を含むインビトロ系と候補物質とを接触させる工程、及び該相互作用に関連する発現表現型の変化を検出する工程を含む方法を提供する。
【００８９】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００９０】
「タニス」及び「ＳＡＡ」についての言及は、タニス若しくはＳＡＡの発現産物のいずれか、又はタニスタンパク質のＳＡＡ結合領域などのタニス分子若しくはＳＡＡ分子の一部若しくは断片についての言及として理解されるべきである。この点において、タニス又はＳＡＡの発現産物が細胞内で発現する限り、該細胞はタニス又はＳＡＡの核酸分子でトランスフェクトされた宿主細胞であってもよく、又は天然でタニス遺伝子を含む細胞であってもよい。
【００９１】
「該相互作用と関連する発現表現型の改変」を検出する工程についての言及は、ＳＡＡとタニスの相互作用の変化に関連した細胞の変化を検出する工程として理解されるべきである。これらは例えば細胞内の変化又は細胞外で観察できる変化として検出可能でありうる。例えばこれは下流の生産物のレベル若しくは活性における変化を検出する工程を含むが、これに限定されない。
【００９２】
本発明は更に下記の非限定的な実施例により規定される。
【実施例１】
【００９３】
タニスと相互作用するタンパク質についての酵母２ハイブリッド・スクリーニング
(i)材料及び方法
プラスミドの構築
タニス遺伝子はＳａｌＩ及びＮｃｏＩの制限部位を組込んだ遺伝子特異的プライマー（表３）を用いてハウスキーピング・ベクターからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物はＳａｌＩ及びＮｃｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社、ビバリー、米国）を用いた制限酵素消化にかけられる前にＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（キアーゲンPty社、オーストラリア）を用いてゲル精製した。消化後、試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一度抽出し、ＤＮＡを２容積の無水エタノール及び０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）で沈降させた。消化したＰＣＲ産物を２０μＬのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁しアガロースゲル電気泳動により相対濃度を決定した。
【００９４】
酵母プラスミドベクターｐＤＢＬｅｕ（ライフ・テクノロジーズ社、米国）を同様にＳａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、直鎖状産物を１．０％のアガロースゲルで分離した。消化断片を上記の様にゲル精製し、精製したベクターＤＮＡの濃度をアガロースゲル電気泳動により決定した。
【００９５】
消化後、タニスを調製されたｐＤＢＬｅｕベクターＤＮＡと連結し、この生成物を電気穿孔によりＤＨ５α（ライフ・テクノロジーズ社、米国）に形質転換した。形質転換体は２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートでの増殖により選択した。
【００９６】
組換え体クローンはベクターに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲの手段により同定した（表１）。次いで選択したクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定用の鋳型として用いた。陽性クローンのｐＤＢＢ５５９を２ハイブリッド・スクリーニングで使用するために選択した。それは、配列決定がｐＤＢＬｅｕのＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと共にフレーム内でクローニングされた１００％相同なタニス遺伝子配列を示したからである。
【００９７】
【表３】
【００９８】
株の構築
１００ｎｇのｐＤＢＢ５５９を、標準的な酢酸リチウム／ポリエチレングリコール手法を用いて酵母株のＭａＶ２０３（ライフ・テクノロジーズ社、米国）に形質転換した。ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含む形質転換体をロイシンを含まないプレート上での増殖により選択的に単離した。
【００９９】
３ＡＴ滴定
ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導されるＨＩＳ３発現の基底レベルを決定するために、活性化ドメインベクターｐＰＣ８６をｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞内に導入した。次に両プラスミドを含む細胞をヒスチジンを欠くが３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）を以下の濃度(0mM、10mM、25mM、50mM、75mM及び100mM)で含む選択培地上にパッチ接種した。３０℃で２４時間インキュベートした後、プレートをレプリカクリーン(replica clean)し、３０℃で更に２日間インキュベートした。両プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞の増殖は２５ｍＭ以上の濃度の３ＡＴの存在下で阻害された。その後の酵母２ハイブリッド・ライブラリー・スクリーニングで用いられるプレートには全て、ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導されるＨＩＳ３の基底発現をノックアウトするために２５ｍＭの３ＡＴを含めた。
【０１００】
ヒトの肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いた大規模形質転換
該ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞を、市販のｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて大規模形質転換用に特別に調製した。具体的にはＰｒｏＱｕｅｓｔ（商標）ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ライフ・テクノロジーズ社、米国）から収穫した１８μｇのプラスミドＤＮＡをｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞に形質転換した。約６．０×１０5個の形質転換体を２５ｍＭの３ＡＴを含むがロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠く選択培地上に播種した。ＨＩＳ３レポーター遺伝子を誘導した、従って潜在的な相互作用タンパク質を含んでいた形質転換体を選択して更なる分析に使用した。
【０１０１】
レポーター遺伝子発現の分析
単離したコロニーについてＨＩＳ＋陽性形質転換体と推定されたものをストリークし、結合レポーターであるＵＲＡ３及びｌａｃＺの誘導について試験した。ＨＩＳ＋と同定された３０個の形質転換体のうち、クローン１０、２５、２７及び２８の４クローンのみが上に挙げたレポーター遺伝子の少なくとも二つを誘導することが見出された。
【０１０２】
タニスとの相互作用の真偽を更に究明するため、各クローンから得たプラスミドＤＮＡを選択的に単離し、ＭａＶ２０３に再導入した。再形質転換検定はこれらのクローンが推定上のタニス相互作用タンパク質を含むことを確認した。全てのクローンが相互作用タンパク質をコードするプラスミドを含むと同定された。
【０１０３】
陽性クローンの配列同定
粗プラスミドＤＮＡを酵母クローン１０、２５、２７及び２８から調製し、ＤＨ１０Ｂ（ライフ・テクノロジーズ社、米国)エレクトロコンピテント(electrocompetent)細胞中に形質転換した。未知の候補タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上での増殖によるプールから単離した。各クローンのプラスミドＤＮＡを調製し、未知のｃＤＮＡの部分配列を決定した。
【０１０４】
(ii)結果
おとり：全長のタニス
ライブラリー：ヒトの肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリー
約６５万個の形質転換体をタニスとの相互作用についてスクリーニングした。４個の陽性相互作用クローンを同定し、配列決定した。
【０１０５】
【０１０６】
配列
pPC86-クローン10F <400>5
pPC86-クローン25F <400>6
pPC86-クローン27F <400>7
pPC86-クローン28F <400>8
pPC86-クローン10R <400>9
pPC86-クローン25R <400>10
pPC86-クローン27R <400>11
pPC86-クローン28R <400>12
【０１０７】
クローンの同定：
クローン10：血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
クローン25：ユビキリン
クローン27：ＳＡＡ
クローン28：ＳＡＡ
【０１０８】
配列分析の概要
クローン１０、２７及び２８：ホモサピエンスの血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）のｍＲＮＡに対して９７％の相同性、完全コード（ジェンバンク寄託：Ｍ２６１５２）。
【０１０９】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質はＨＤＬと主に関連するタンパク質のファミリーを含み、ＳＡＡはその合成が炎症中に極めて増加する（１０００倍までも）ため急性期応答タンパク質と考えられる。ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は、２型糖尿病で検出される。２型糖尿病で増加したＳＡＡは組織修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用しうる。この異化の増大は、糖尿患者で観察される低いＨＤＬ濃度の可能な原因であると考えられ、アテローム斑でのマクロファージによる取り込みは２型糖尿病における動脈疾患の危険性の増大の原因の一部でありうる。
【０１１０】
クローン２５： ヒトのＰＬＩＣ−１（ヒトのユビキリン１としても知られる）のｍＲＮＡに対して９７％の相同性。ユビキリンとも呼ばれるＰＬＩＣ−１（インテグリンと関連するタンパク質と細胞骨格を結び付けるタンパク質）は大きな複合体の中でプロテオソーム及びユビキチン・リガーゼの両方と物理的に結び付く。過剰発現した場合、ｈＰＬＩＣタンパク質は二つの無関係なユビキチン依存性プロテアソーム基質であるｐ５３及びＩカッパバルファ(IkappaBalpha)のインビボ分解を妨害するが、ユビキチン非依存性基質を妨害しない。最近の研究は、ｈＰＬＩＣタンパク質及びおそらく関連するユビキチン様ファミリーの構成員がユビキチン化機構を該プロテアソームと機能的に連結させてインビボのタンパク質分解に影響を及ぼすことを示唆している。
【実施例２】
【０１１１】
ＳＡＡとタニスの相互作用のバイアコア確認
バイアコアＪは親和性バイオセンサー技術に基づいて生体分子の存在及び性質を監視するための汎用系である。この系は、一方の結合相手がセンサー表面に付着し他方が該表面を通過する試料溶液中に存在する、特異的な分子の対合間の結合を検出することにより機能する。バイアコアＪは、試料がセンサー表面を通過する際に応答が得られるか否かを監視することにより結合相手を検出できる。結合曲線の形状を調べることにより結合活性を監視しそして比較もできる。検体（溶液中の試料）の濃度は得られる応答を測定し既知の試料から得られる標準曲線と比較することにより得られる。
【０１１２】
バイアコアＪで用いられる検出原理は、研究される分子を標識化する必要がなく、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び抱合分子を含むあらゆる種類の生体分子に適用される。
【０１１３】
バイアコアＪにより作成される出力は時間に対して応答をプロットすることにより得られる曲線であり、これはセンサーグラム（sensorgram) と呼ばれる。陰性及び陽性の両結合結果を示す典型的なセンサーグラムを以下に例示する。分析時の曲線の特徴は結合事象の性質についての詳細を提供できる。
【０１１４】
(i) 材料及び方法
組換えタニスの生産
タニス遺伝子をｐＧＥＸ５Ｘ１ベクター（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）にクローニングした。Ｎ末端ＧＳＴ融合タンパク質タグを備えたタニスタンパク質を発現させるためプラスミドを構築した。全長のタニス又はクローニングされた３断片、即ち、Ｎ末端（１〜３７アミノ酸）、Ｃプラス（５３〜１８９アミノ酸）若しくはＣ（１１７〜１８９アミノ酸）の１つのいずれかを発現する合計４個の構築物を作製した。これらのプラスミドのそれぞれのＤＮＡ配列を確認した。各プラスミドを大腸菌のＢＬ２１株（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）に別々に導入した。この株はｐＧＥＸ５Ｘ１プラスミドに含まれるＴ７プロモーターに特異的なバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含む。このポリメラーゼ遺伝子は対数期のＢＬ２１細菌培養にイソプロポチオガラクトシダーゼを添加することにより誘導されるＬａｃＺプロモーターの指揮下にある。誘導後、該細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを細胞溶解緩衝液に再懸濁する。次いで該細胞をデジタル・ソニファイアー（ブランソン社、米国）により生成する超音波を用いて溶解する。可溶性及び不溶性のタンパク質を遠心分離により分離し、上清はＧＳＴ−タニスを含む可溶性タンパク質を含む。可溶性画分のみを処理し、不溶性画分は廃棄する。グルタチオン・セファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）は該ＧＳＴタンパク質に対して強い親和性を有する。ＧＳＴ−タニスタンパク質は回収された可溶性画分が通過する際に該樹脂に結合する。該樹脂の洗浄により他の夾雑タンパク質が取除かれる。抽出されたＧＳＴ−タニスタンパク質を該樹脂ベッドへの還元グルタチオン（１０ｍＭ）（アマーシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）の添加により回収する。ＧＳＴ−タニスタンパク質が精製された程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定される。
【０１１５】
対照のＧＳＴ単独のタンパク質も上で概説した同じ方法を用いて調製される。
【０１１６】
全長のタニス（ＦＬ−タニス）のアミノ酸配列（１８９アミノ酸）＜４００＞１３
Ｎ末端のタニス（１〜３７アミノ酸）＜４００＞１４
Ｃ−プラス・タニス（５３〜１８９アミノ酸）＜４００＞１５
Ｃタニス（１１７〜１８９アミノ酸）＜４００＞１６
【０１１７】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質
ヒトの血清（トレース・サイエンティフィック社、オーストラリア）からサイズ排除クロマトグラフィーにより精製されたＳＡＡの９６％純粋な試料を全ての実験で用いた。
【０１１８】
バイアコアＪを用いたタニス−ＳＡＡ相互作用の研究
９６％純粋なＳＡＡをバイアコアＪ（バイアコア社、スウェーデン）の生体特異的センサー表面と共有結合させた。この表面はプラスチック・ホルダー（センサー・チップ）に搭載された金で被覆されたスライドガラスから構成される。ＣＭ５チップ（バイアコア社、スウェーデン）を全ての実験で使用した。このチップはＳＡＡが共有結合したカルボキシメチル化デキストランから成る親水性媒体で覆われる。タニスタンパク質の断片を該系に注入してこのチップの上を流し、センサーグラムは実時間で記録した。
【０１１９】
(ii) 結果
参照点Ｉは基線であり、ＧＳＴ−ＦＬタニスのそれぞれの注入は続いて共鳴単位（ＲＵ）を増加させた。タンパク質の相互作用は基線のＲＵ値に戻る応答の失敗により示される。注入後の値（点１、３、５、７）の間の差異は全長のタニスとＳＡＡとの結合事象を示す。注入点と最大ＲＵとの差異は二つのタンパク質間の親和性を示す。最大点後のＲＵの漸減は結合事象の解離を示す。これらのセンサーグラムは結合事象の急速な解離とともに潜在的に強い親和性結合を示す。一連の対照も注入してＳＡＡチップを通過させた。これらはＧＳＴ単独、ＢＳＡ（ＮＥＢ社、米国）単独及び緩衝液のみであった。これらのいずれも上に示したものと同様な応答を生じなかった。このことはこれが真の応答であることを示している。
【０１２０】
タニスのＧＳＴと融合した断片をＳＡＡと相互作用するタニスタンパク質の領域を潜在的に決定するために試験した（以下に示す）。Ｎ末端、Ｃ末端及びＣ末端＋コイル状のコイル領域を注入してＳＡＡチップ上をそれぞれ通過させた。化学合成された２４アミノ酸のペプチド（Ｎ末端）も注入した。Ｎ末端タニスの両形態はＲＵ値に変化を与えず、応答を生じなかった。Ｃプラス及びＣ領域の両方はＦＬタニスで見られたものと同様な曲線を生じた。Ｃプラス領域で達成された結果は異なるタンパク質のバッチで再現されたので、相互作用の存在を示唆している。Ｃプラス及びＣの実験から得られた結果は、ＳＡＡと相互作用するタニスタンパク質の領域がＣ末端の７２アミノ酸内に位置することを示唆している。
【実施例３】
【０１２１】
２型糖尿病と炎症の関連
(i) 研究設計及び方法
実験動物
Ｐ．オベサスのコロニーはディーキン大学（ジーロング、オーストラリア）で維持される。飼育する雌雄にはルツェルン(Lucerne)の食物及び標準的な食物を自由に与える。実験動物は４週齢で離乳させ、標準的な実験食物を与えた。この食餌ではエネルギーの１２％が脂肪から、６３％が炭水化物から、そして２５％がタンパク質から得られた（バラストック社、パケンハム、オーストラリア）。動物を１２時間の明暗周期（明06:00〜18:00）で温度制御された室内（22±1℃）で飼育した。動物は先に記載したそれらの血中グルコース及び血漿インスリンの濃度に従って１６週齢で正常な耐糖能（ｎＧＴ）、耐糖能異常（ＩＧＴ）、又は２型糖尿病に分類された。酵素グルコース分析器（モデル27、イエロー・スプリングス・インスツルメンツ社、イエロー・スプリングス、オハイオ州）を用いて全血中グルコースを測定された。血漿インスリン濃度は二抗体固相放射免疫検定（ファデセップ、Kabiファルマシア・ダイアグノスティックス、スウェーデン）を用いて測定した。
【０１２２】
ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ
１８週齢で、動物（各群からｎ＝６：ｎＧＴ、ＩＧＴ、及び２型糖尿病）は２４時間の絶食又は適宜の給餌のいずれかに無差別に割当てられた。２４時間後、該動物を屠殺し、その組織を直ちに取り出し、液体窒素中で凍結した。ＲＮＡはＲＮＡゾルＢ（テル−テスト、フレンズウッド、テキサス州）を用いて組織から抽出し、スーパースクリプトII(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)を用いて逆転写した。ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲはＲＮＡイメージｍＲＮＡディファレンシャル・ディスプレイ・システム（ゲンハンター社、ナッシュビル、テネシー州）を用いて肝臓のｃＤＮＡで実施した。タニス遺伝子は、Ｇアンカー・プライマー（5'-aag ctt ttt ttt ttg-3'）及び任意のプライマー（5'-aag ctt ctc aac g-3'）を用いて同定した。
【０１２３】
配列決定
DNA配列決定はABIプリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット及び373自動化蛍光DNA配列決定器（PEアプライド・バイオシステムズ社）を用いて実施した。転写産物の5′末端及び3′末端はマラソンcDNAライブラリー（クローンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）のRACEにより決定した。
【０１２４】
タニス遺伝子発現の測定
各ｃＤＮＡ試料におけるタニス遺伝子発現のレベルは、ＡＢＩプリズム７７００配列検出器上でタックマンＰＣＲ技術を用いて定量した。β−アクチンは反応におけるｃＤＮＡ量を規格化するための内部基準として用いた。プライマーの配列は下記の通りである。タニス遺伝子の前向き，5'-gat gcg ttc aat gat gtc ttc ct-3'（＜４００＞２２)、タニス遺伝子の逆向き，5'-ga agc aaa ccc cat caa ctg t-3'（＜４００＞２３）、β−アクチンの前向き，5'-gca aag acc tgt atg cca aca c-3' （＜４００＞２４）、β−アクチンの逆向き，5'-gcc aga gca gtg atc tct ttc tg-3'（＜４００＞２５）。蛍光発生のプローブ配列はタニス遺伝子については 5'-cac atc agt aat cct cac tgg tgg gct ca-3'（＜４００＞２６）、β−アクチン遺伝子については 5'-tgc tgg cac cag act tgc cct c-3' （＜４００＞２７）であった。タニス及びβ−アクチンのプローブはそれぞれ5′末端に付着したレポーター色素のＦＡＭ及びＶＩＣを有し、両プローブは3′末端に付着した消光色素のＴＡＭＲＡを有していた。ＰＣＲの条件は５０℃で２分間及び９５℃で１０分間の後９５℃で１５分間及び６０℃で１分間の４０周期であった。
【０１２５】
細胞培養
タニス遺伝子の発現は三つの細胞系統で研究された。即ち、ＨｅｐＧ２肝細胞（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ）、Ｃ２Ｃ１２筋管（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（オーストラリア、パークビル、サイロのランス・マコーリー博士により供給された贈物）である。全細胞は普通の方法でダルベッコ改変イーグル培地（5-25 mmol/lのグルコース）、１０％の仔牛血清及び抗体（ライフ・テクノロジーズ社、メルボルン、オーストラリア）中で培養した。
【０１２６】
酵母−２ハイブリッド・スクリーニング
酵母−２ハイブリッド・スクリーニングはプロクエスト２ハイブリッド・システム（ライフ・テクノロジーズ社）を用いて実施した。タニスのコード配列を酵母ベクターのｐＤＢＬｅｕにクローニングし、電気穿孔によりＤＨ５α細胞に形質転換した。組換えクローンはベクターに特異的なプライマー（前向き5'-gaa taa gtg cga cat cat cat c-3' （＜４００＞２８）、逆向き5'-gta aat ttc tgg caa ggt aga c-3' （＜４００＞２９））を用いてＰＣＲにより検出した。一つの陽性クローンであるｐＤＢＢ５５９を、酵母−２ハイブリッド・スクリーニングで使用するために選択した。挿入物の配列はタニスのｃＤＮＡ配列と１００％相同であることを確認し、ｐＤＢＬｅｕのＧＡＬ４・ＤＮＡ結合ドメインとフレームを合わせてクローニングした。ｐＤＢＢ５５９を酵母株のＭａＶ２０３に形質転換し、形質転換体の基底ＨＩＳ３発現の抑制に必要な３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）の量を種々の量の３ＡＴ（0-100 mmol/l)を含むプレート上での細胞増殖の滴定により決定した。ＭａＶ２０３細胞の増殖は１０ミリモル／ｌを越える３ＡＴの濃度で阻害された。従って、その後の酵母−２ハイブリッド・ライブラリー・スクリーニングで用いられた全てのプレートには、ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導される基底ＨＩＳ３発現を抑制するために２５ミリモル／ｌの３ＡＴを含めた。ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞は市販のｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて大規模の形質転換用に特別に調製した。具体的には、プロクエスト・ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから収集した１８μｇのプラスミドＤＮＡをｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞中に形質転換した。約６．０×１０5個の形質転換体を２５ミリモル／ｌの３ＡＴを含むがロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを含まない選択培地上に播種した。ＨＩＳ３レポーター遺伝子を誘導する形質転換体は潜在的に相互作用するタンパク質を含むと予測され、更なる分析用に選択した。推定されたＨＩＳ陽性形質転換体を二つの他の関連レポーターであるＵＲＡ３及びｌａｃＺの誘導について試験した。ＨＩＳ＋として初期に同定された形質転換体のうち、４個のクローンもＵＲＡ３及びｌａｃＺの発現を誘導する点で陽性であることが見出された。これらの４クローンから単離されたプラスミドを次に標準的な方法を用いて配列決定した。
【０１２７】
組換えタニスタンパク質及び血清アミロイドＡタンパク質の発現及び精製
完全な１８９アミノ酸のタニスタンパク質をコードするｃＤＮＡ、タニスのＣＯＯＨ−末端（アミノ酸５４〜１８９、タニス−Ｃと呼ぶ）断片をコードする領域に対応するｃＤＮＡ、及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）１β（アミノ酸１９〜１２２）の成熟配列をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−５Ｘ−１発現ベクター（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、バッキンガムシャイア、英国）に連結した。該ＧＳＴ、ＧＳＴ−全長タニス、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、及びＧＳＴ−ＳＡＡタンパク質を大腸菌のＢ１２１株中で発現させ、グルタチオン・セファロース・ビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアフィニティー精製した。発現したタンパク質の質及び量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー・ブルー染色により確認した。該ＧＳＴ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、及びＧＳＴ−ＳＡＡは十分に発現し精製されたが、一方、ＧＳＴ−全長タニスは発現が弱く、精製してもごく少量のタンパク質しか回収されなかった。全ての実験で対照として役立ったＧＳＴタンパク質は組換えＧＳＴ融合タンパク質を含んでいた。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴分析
実時間のタンパク質−タンパク質相互作用はバイアコアＡＢ社（アップサラ、スウェーデン）から購入したバイアコアＪ装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により検討した。この系は特異的な分子対の間の結合を検出する。この場合、一方（リガンド）はセンサーチップの表面に付着し、試料溶液中に存在する他方（検体）はその表面を通過する。全てのＳＰＲ実験でＨＢＳ緩衝液（１０ミリモル／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ミリモル／ｌのＮａＣｌ、３ミリモル／ｌのＥＤＴＡ、０．００５％のポリソルベート２０）をランニング緩衝液として用いた。ヒトの血漿（９５％純度）から精製されたＳＡＡはトレース・サイエンティフィック社（オーストラリア）から購入した。ＳＡＡ又はＧＳＴ−タニス−Ｃ又はＧＳＴ−ＳＡＡは供給された試薬（アミン・カップリング・キット、バイアコアＡＢ社）を用いてカルボジイミド化学によるアミン結合を介してセンサーチップ（ＣＭ５）に共有結合で固定した。前濃縮試験を実施し、ｐＨ４．０がリガンドをＣＭ５チップに結合させるのに最適であることを見出した。相互作用について試験するため、検体試料をランニング緩衝液中に希釈し（ＧＳＴ、ＧＳＴ−タニス、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、又はＧＳＴ−ＳＡＡ）、該センサーグラムが２共鳴単位（ＲＵ）より小さいノイズレベルをもつ安定な基線を示した場合にそれらをこの系に注入した。該チップは１０ミリモル／ｌのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の４分間の注入により使用中に再生した。
【０１２９】
統計分析
全てのデータは平均値±ＳＥとして表される。群間の比較はこの後の最小有意差試験を用いた分散分析により行なった。差異はＰ＜０．０５の場合に有意と考えた。
【０１３０】
(ii)結果
遺伝子を同定するためにディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲを用い、遺伝子の発現は給餌した対照と比べて絶食したＰ．オベサスの肝臓で増加した（図４Ａ）。このバンドを切り出し、配列決定して、公共データベースに明白な同族体は無く、新規なＰ．オベサスの遺伝子であることが明らかになった。この遺伝子は絶食を意味するヘブライ語である「タニス」と命名された。その後、幾つかの明らかに相同な配列がゲンバンクに提出された（例えば登録番号ＡＦ１５７３１７，ＡＦ３３５５４３）。ＲＡＣＥを用いて得られたＰ．オベサスの完全なタニスｍＲＮＡ配列は図４Ｂに示す。予測されるタニスのアミノ酸配列は、他種からの明らかに相同な遺伝子と整列させて、図４Ｃに示す。高レベルの同一性が種間で明白であり（表４）、重要な生理機能をもつ保存された遺伝子であることを示している。
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
タニスについてのＰ．オベサスのｍＲＮＡは１，１５５ヌクレオチドから成り、１８９アミノ酸のタンパク質をコードする。予測されるタニスタンパク質の配列分析は一つの膜貫通領域（アミノ酸２６〜４８）、ジロイシン・モチーフ、及びコイル状のコイル領域を示唆した。
【０１３３】
エクスパシー・ソフトウェア・ツール（http://www.expasy.ch）を用いた分析は、８個の可能なセリン・リン酸化部位、１個のスレオニン・リン酸化部位、３個の可能なＯ−グリコシル化部位、及び４個の可能なタンパク質キナーゼＣリン酸化部位を予測した。タニスはいずれの既知遺伝子ファミリーにも属さず、４４％のαへリックス、１７％の伸張シート、及び３９％のランダム・コイルの全体的構成を有すると予測された。
【０１３４】
Ｐ．オベサスのタニス遺伝子のゲノム構造はｇＤＮＡ及びｃＤＮＡの試料を直接配列決定することにより決定された、これを図４Ｄに示す。この遺伝子は７６から６６０までのヌクレオチドのサイズで並ぶ６個のエキソンから成る。エキソン６はＣＯＯＨ末端の２５アミノ酸及び3'非翻訳領域の５８５ヌクレオチドについてのコード配列を含む。ＡＤ−０１５として知られる対応するヒトの遺伝子は、遺伝子予測を用いたナショナル・センター・フォ・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＩＨ、ベテスダ、メリーランド州）でのゲノム配列の自動コンピュータ分析により導き出された。この配列を含むコンティグはｓｔＳＧ２６００５として同定された最も近いマーカーとともにＤ１５Ｓ１５７−ｑＴＥＬの間隔でヒトの染色体１５ｑ２６．３に局在した。マウス及びブタのシンテニーの染色体領域は４つの肥満に関連するＱＴＬ、即ち、Ｑｗ７（１９）、Ｂｗ６１（２０）、Ｐｆａｔ１（２１）、及びＳＳＣ７（２２）を含むことは興味深く、この領域の遺伝子は体脂肪の蓄積に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１３５】
肝臓のタニス遺伝子の発現はＰ．オベサスにおいて２４時間の絶食後２．２倍に増加した（Ｐ＜０．００１）。動物の下位群内では、絶食後のタニスの肝臓での遺伝子発現の増加は糖尿病の動物でのみ有意であった（３．１倍の増加、Ｐ＝０．０１０、図５）。無制限に給餌された動物では、肝臓でのタニス遺伝子の発現はそれらのｎＧＴの同腹子と比べてＩＧＴ（Ｐ＝０．０３９）及び２型糖尿病のＰ．オベサス（Ｐ＝０．０１５）の両方で減少した（図５）。その上、無制限に給餌されたＰ．オベサスにおけるタニスの発現と血中トリグリセリド濃度（ピアソンｒ＝０．５９３、Ｐ＝０．００７、図６）、並びに血中グルコース（スピアマンｒ＝−０．３７８、Ｐ＝０．０１０）とインスリン濃度（スピアマンｒ＝−０．４１６、Ｐ＝０．００４）に線形相関が観察された。絶食２４時間後の肝臓のタニス遺伝子の発現と血中グルコース（スピアマンｒ＝０．３９５、Ｐ＝０．０１０）及びインスリン濃度（ピアソンｒ＝０．３７４、Ｐ＝０．０１５）の変化との相関の証拠もあった。多重線形回帰分析は血中グルコース濃度の変化のみがタニス遺伝子の発現と独立して関連する（Ｐ＝０．００４）ことを示し、このことはこれら二つの変数の間の関係を示唆している。その上、食物エネルギーの制限が２週間継続した場合（通常の食物摂取の６７％で）、肝臓におけるタニス遺伝子の発現は無制限に給餌された対照動物に比べて２．２倍増加した（１．９１±０．２９対０．８７±０．０８任意単位、Ｐ＝０．００６）。
【０１３６】
インビボで得られた結果に従って、細胞培養実験はＨｅｐＧ２肝細胞におけるタニス遺伝子の発現が培地中のグルコース濃度により極度に調節されることを示した（Ｐ＝０．００６、図７）。培地中のグルコース濃度の増加はタニス遺伝子の発現レベルで用量依存性の減少を惹起し、約９０％抑制の１２．５ミリモル／ｌのグルコースで最大効果が観察された。
【０１３７】
タックマンＰＣＲ 及びノーザン・ブロットの両方を用いて肝臓以外の組織でのタニス遺伝子の発現を試験した。タニス遺伝子の発現は視床下部、肝臓、骨格筋、脂肪組織、精巣、心臓及び腎臓を含む試験された全ての組織においてタックマンＰＣＲにより検出された。ノーザン・ブロッティングは肝臓、脂肪組織、視床下部、及び骨格筋を含む様々な組織で予期されたサイズ（１，１５５ヌクレオチド）の単一バンドを示した（図８）。
【０１３８】
肝臓以外の組織におけるタニス遺伝子の発現様相は、脂肪組織、筋又は視床下部におけるタニス遺伝子の発現に対する絶食の効果を示さなかった（データは示していない）。しかしながら、インビトロのタニス遺伝子の発現は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（図９）及びＣ２Ｃ１２筋細胞のグルコースにより用量依存的に抑制された（２５ミリモル／ｌグルコースで５０％抑制の最大効果、Ｐ＝０．００２）。タニス遺伝子の発現は３Ｔ３−Ｌ１細胞（図９）及びＣ２Ｃ１２細胞においてインスリンによっても減少した。
【０１３９】
タニスタンパク質の生理的役割をさらに調べるために、酵母−２ハイブリッド・スクリーニングを行って相互作用タンパク質を同定した。タニスをおとりとして用いて、ヒトの肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られた約６６万個の形質転換体をスクリーニングした。３個の異なるレポーター遺伝子の発現分析のそれぞれから、４クローンが陽性であることが確認され、それぞれが中程度の強度の相互作用を示すという証拠が得られた。これらのクローンの配列決定により、４個の内３個が急性期炎症応答タンパク質であるＳＡＡをコードすることが示された。酵母−２ハイブリッド・スクリーニングで同定された合計３個の陽性クローンの全ヌクレオチド配列はＳＡＡ１遺伝子の対立遺伝子であるヒトのＳＡＡ１βの既知配列（ゲンバンク登録番号ＣＡＡ３９９７４）と対合した。
【０１４０】
タニスとＳＡＡとの推定上の相互作用はＳＰＲ分析により確認した。表面に連結した４，７３７ＲＵのヒトの血漿ＳＡＡがその表面結合したＣＭ５センサーチップをＧＳＴ−全長タニスとの相互作用を試験するために最初に用いた。そのセンサーグラムはＧＳＴ−タニスとの結合現象を明らかにした。予測された膜貫通ドメインを含むＧＳＴ−全長タニスは満足な程度まで発現及び精製することが困難であった。従って、膜貫通領域を含まないタニスのＣＯＯＨ末端の１３６アミノ酸断片を発現させそして精製した。ＧＳＴ−タニス−Ｃタンパク質は満足なレベルで発現し精製された。ＳＰＲ結合分析において、ＧＳＴ−タニス−Ｃはヒトの血漿ＳＡＡと結合することを示し、それは濃度依存性であった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。相互作用はＧＳＴ−タニスがリガンドとしてセンサーチップに結合しＳＡＡが検体として通過する逆の状況においてさえ陽性であることを示した（図１０Ｃ）。
【０１４１】
ヒトの血漿から精製されたＳＡＡは循環血に存在するＳＡＡの全ての形態を含むらしい不均一試料である。均一試料との相互作用を検討するために、ＳＡＡ１βをＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製し、ＳＰＲ分析によりタニスと相互作用するその能力を証明した（図１０Ｄ）。
【実施例４】
【０１４２】
砂ラットの組織におけるタニスタンパク質のレベル
タニスは糖尿病／肥満の砂ラットにおけるその異なる発現によって発見されたが、健常動物では絶食中の肝臓及び脂肪において見られなかった（図１１Ａ）。タンパク質レベルでのこの異なる発現を確認し確立するため、タニスタンパク質を含む原形質膜及びミクロソームをＣ群の動物（糖尿病及び肥満）の肝臓及び脂肪から単離した。三匹の給餌動物及び三匹の絶食動物におけるタニスタンパク質のレベルを抗タニス−Ｃ抗体を用いたウェスタン・ブロットで比較した。肝臓において、絶食により、とりわけ原形質膜及びより少ない程度でミクロソームで該タンパク質レベルが増加した（図１２Ｂ）。これらのデータはタニスタンパク質が動物の絶食に応答することも証明している。しかしながら、タニスタンパク質のレベルに及ぼす絶食の効果は脂肪組織の原形質膜又はミクロソームのいずれにおいてもほとんど観察されなかった。この相違についての原因の一部はその遺伝子発現における高い変動性によるものであろう（図１２Ａ）。
【実施例５】
【０１４３】
肝細胞でのグルコースへの応答としてのタニスの発現
先に報告されたように、タニス遺伝子の発現は糖尿病／肥満の砂ラットにおける絶食により高レベル調節されたが、健常な砂ラットにおいては調節されなかった。２４時間の絶食中に糖尿病／肥満動物の血漿グルコース濃度は有意に減少するが、健常な動物では減少が無いので、可能な機構の一つは該遺伝子がグルコースにより調節されるというものである。
【０１４４】
この仮説をＨｅｐＧ２肝細胞で検討した。タニス遺伝子の発現は該細胞が低グルコースで処理された場合に５〜６倍に増加し、ウェスタン・ブロットにより明らかなようにタニスタンパク質が同時に増加した（図１３）。
【実施例６】
【０１４５】
Ｈ４ II Ｅ細胞におけるグリコーゲン代謝
(i)グリコーゲン含量
グリコーゲン含量はその合成及び分解の最終結果であり、様々な生理学的な刺激又は状態により影響される。タニスの発現が肝細胞において絶食中に増強されるという事実は、それがグリコーゲン代謝に関与しうることを示唆している。この仮説は組換えアデノウイルスを用いてタニスを過剰発現させた後にＨ４IIＥ細胞のグリコーゲン含量及びグリコーゲン合成を測定することにより検討した。二つの別々の実験データを図１４に提示する。非感染又はＧＦＰ感染した細胞のグリコーゲン含量はインスリン処理で増加した。しかしながら、タニスに感染した細胞のインスリンに対する応答はより小さかった。結果として、これらはインスリンでの刺激後に有意に少ないグリコーゲンを含んでいた。このことはタニスがグリコーゲン合成を刺激するインスリンの能力を損傷させることを示唆している。
【０１４６】
(ii)グリコーゲン合成
グリコーゲン合成実験は何度も反復した。三回の独立実験から得られたデータを本明細書に提示する。非感染細胞では、グリコーゲン合成は１００ｎＭのインスリン処理により約５０％増加した。しかしながら、より高濃度のインスリン（即ち１０００ｎＭ）は更なる増加を生じなかった。ＧＦＰ（対照）ウイルスを用いた感染はグリコーゲン合成にほとんど影響を及ぼさなかった。全三回の実験において、グリコーゲン合成はタニスの過剰発現により減少するようであった（図１５）。これらのデータはグリコーゲン含量のデータと一致しており、グリコーゲン含量の減少はその合成の低下によることを示唆している。これらを併せ考慮すると、該データはタニスが肝細胞におけるグリコーゲン合成の調節に一つの役割を有することを示唆している。
【０１４７】
当業者は、本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外のものへの変形及び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあらゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書中で言及した又は示した段階、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集合的に包含し、並びに任意の二つ以上の該段階若しくは特徴の任意の組合わせ又はあらゆる組合わせをも包含する。
【０１４８】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は陰性及び陽性の結合結果を示す典型的なセンサーグラムのグラフ表示である。
【図２】図２は全長ＧＳＴ−タニスとＣＮ５チップに結合した血清アミロイドＡとの相互作用を示すセンサーグラムのグラフ表示である。基準点１：基線、６分間５μＬのＧＳＴ全長タニスを注入（基線及び注入点）。２，４，６：注入中の共鳴の最大変化（最大ＲＵ）。３，５，７：６分間５μＬのＧＳＴ全長タニスの注入（注入点）。
【図３】図３はＧＳＴ−タニスのＣ末端がＣＮ５チップに結合したＳＡＡとのみ相互作用することを示すセンサーグラムのグラフ表示である。基準点１，８：チップの再生、ＳＡＡと相互作用する任意のタンパク質のストリッピング。２，４，６：タニスＣプラスタンパク質の注入。３，５，７：注入中の最大応答（相互作用）。
【図４】図４は、Ａは絶食状態のＰ．オベサスの肝臓において高レベル調節されたタニス遺伝子の発現を示すｄｄｌＰＣＲゲルのオートラジオグラフ（矢印はタニス遺伝子に相当するバンドの位置を示す）の画像である。ＢはＰ．オベサスのタニス遺伝子のヌクレオチド配列（＜４００＞１７）及びアミノ酸配列（＜４００＞１８）である。推定膜貫通配列には下線が引いてある。Ｃはヒト（ＡＤ−０１５）（＜４００＞２０）及びマウス（Ｈ４７）（＜４００＞２１）の対応遺伝子と整列させたＰ．オベサスのタニス遺伝子のアミノ酸配列（＜４００＞１９）である。ＤはＰ．オベサスのタニス遺伝子のゲノム構造である。
【図５】図５はＰ．オベサスにおける肝臓のタニス遺伝子発現のグラフ表示である。Ａは給餌状態のＩＧＴ及び２型糖尿病のＰ．オベサスの肝臓におけるタニス遺伝子の発現の減少。Ｂは給餌状態と比較した２４時間絶食後のＰ．オベサスの肝臓におけるタニス遺伝子の発現の倍増。＊ｎＧＴ群と有意に異なる（P<0.05）。＊＊給餌された糖尿病群と比較して有意な増加（P=0.010）。
【図６】図６はＰ．オベサスにおける肝臓のタニス遺伝子の発現と血中トリグリセリド濃度との線形相関のグラフ表示である（r=0.593、P=0.007）。
【図７】図７はＨｅｐＧ２肝細胞におけるタニス遺伝子の発現に及ぼすグルコース濃度の増加の影響についてのグラフ表示である。＊０ミリモル／ｌのグルコース濃度と有意に異なる（P<0.001）。
【図８】図８はＰ．オベサスにおけるタニスについてのノーザンブロットの画像である。レーン１，サイズ・マーカー、レーン２，脂肪組織、レーン３，視床下部、レーン４，肝臓、レーン５，骨格筋。矢印はタニス遺伝子の位置を示す。
【図９】図９は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるタニス遺伝子の発現に及ぼすグルコース濃度（上パネル）及びインスリン（下パネル）濃度の影響についてのグラフ表示である。＊０ミリモル／ｌのグルコース濃度と有意に異なる（P<0.001）。＊＊０ミリモル／ｌのインスリン濃度と有意に異なる（P=0.020）。
【図１０】図１０はＳＰＲ分析によるタニスとＳＡＡとの実時間相互作用についてのグラフ表示である。リガンド（Ａ及びＢ、ヒトの血漿ＳＡＡ；Ｃ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ；Ｄ、ＧＳＴ−ＳＡＡ）をＣＭ５センサーチップ上に固定し、結合緩衝液で希釈した被検体（Ａ、Ｂ及びＤ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、５μｇ；Ｃ、ヒトの血漿ＳＡＡ、５μｇ）を該チップ上に注いだ。ＳＰＲの変化はＲＵで示した。該試料は４分間（Ａ、Ｃ及びＤ）又は６分間（Ｂ）注入した。注入点は矢印で示す。ＧＳＴ対照タンパク質のみ（Ａ、Ｂ及びＤ）の注入は結合現象を生じなかった。
【図１１】図１１は砂ラットの肝臓（左）及び脂肪組織（右）の分画及びウェスタンブロットの画像である。これらの組織はミトコンドリア／核（Ｍ／Ｎ）、原形質膜（ＰＭ）、高比重ミクロソーム（ＨＤＭ）、低比重ミクロソーム（ＬＤＭ）及び可溶性（Ｓｏｌ）タンパク質に分画し、抗タニス−Ｃ抗体でプローブした。該分画手法は上清（Ｓ１）からＭ／Ｎ（Ｐ１）を沈殿させるために低速回転（2000gx15分間）でガラスのダウンサー(douncer)で該組織をホモジナイズする工程を含んだ。該Ｓ１は18,000gx15分間で回転させペレット（Ｐ２）及び上清Ｓ２を得た。Ｐ２ペレットは更にスクロース勾配クッションで精製しＰＭを得た。Ｓ２画分は続いて100,000gx70分間で回転させＨＤＭを得、200,000gでＬＤＭ画分を得た。最終回転後の上清は可溶性タンパク質と指定した。
【図１２】図１２は砂ラットにおける給餌及び絶食（２４時間）中のタニス遺伝子の発現（Ａ）及びタンパク質のレベル（Ｂ）の画像である。パネルＡの遺伝子発現データは先の「四半期報告書」で提示され、該タンパク質レベルとの比較のためだけに本明細書に含まれる。パネルＢにおいて、原形質膜及びミクロソーム（高比重及び低比重のミクロソーム両方を含む）は三匹の給餌又は絶食の糖尿病／肥満の砂ラットの肝臓及び脂肪から単離された。各動物のタニスタンパク質は抗タニスＣ抗体を用いたウェスタンブロットで視覚化した。
【図１３】図１３はＨｅｐＧ２細胞における低グルコースにより増強されるタニス遺伝子の発現レベル及びタンパク質レベルの表示である。細胞は。ＤＭＥＭ（25mMのグルコース）及び10％のＦＢＳで培養した。次いで該細胞を種々の濃度のグルコース(0.5mM-25mM)を含むＤＭＥＭで２４時間処理した。全ＲＮＡを該細胞から抽出し、タニスの転写産物を逆転写及び実時間ＰＣＲにより定量した。タニスタンパク質は抗タニス−Ｃ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した。
【図１４】図１４はタニスを発現するＨ４IIＥ細胞におけるグリコーゲン含量についてのグラフ表示である。Ｈ４IIＥ細胞はタニス若しくはＧＦＰを発現するアデノウイルスで又はウイルス無しで感染させた。感染40時間後、細胞をインスリンで６時間処理し収集した。グリコーゲンをまずアミログルコシダーゼで消化することにより測定し、遊離したグルコースをヘキソキナーゼ及びＮＡＤＰの還元と連結させたグルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼにより酵素検定した。提示された値は１ウェルの細胞当たりの３４０ｎｍの吸光度であり、全ての処理において収集時にコンフルーエントに達した。
【図１５】図１５はＨ４IIＥ細胞におけるグリコーゲン合成を示すグラフ表示である。Ｈ４IIＥ細胞を６穴プレートで培養し、タニス若しくはＧＦＰを発現するアデノウイルスで感染させ又は感染させなかった。感染３０時間後、細胞をＤＭＥＭ（5.5mMのグルコース）中で一晩血清不足にさせた。次いで細胞を14Ｃグルコース（１μＣｉ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ（5.5mMのグルコース）中で３時間インキュベートし、３０％のＫＯＨで溶菌した。グリコーゲンはアセトンにより沈殿させ液体シンチレーションにより14Ｃを計数した。提示された値は１ウェルの細胞当たりのＤＰＭであり、細胞は全ての処理において収集時にコンフルーエントに達していた。
【０００１】
本発明は一般的に血清アミロイドＡ又はその誘導体、同族体、類似体、同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法に関する。より具体的にはタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の細胞内レベルを変化させることにより血清アミロイドＡの機能的活性を変化させる方法に関する。本発明の方法は、とりわけ異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態の治療及び／又は予防において特に有用である。本発明は更にタニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させ得る物質を同定及び／又は設計する方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者により引用された刊行物の書誌的詳細は本明細書の末尾にアルファベット順にまとめてある。
【０００３】
本明細書におけるいずれの先行技術についての言及も、この先行技術がオーストラリアの一般的常識の一部をなすという認識又は如何なる形式の示唆でもなく且つそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
血清アミロイドＡ（本明細書中「ＳＡＡ」と呼ぶ）タンパク質は炎症に応答して高レベル調節される急性期タンパク質のファミリーである。ＳＡＡは多型でもあり且つ同義遺伝子によりコードされるこのファミリーに与えられる集合名である（非特許文献１，２，３を参照）。詳しい分析により、ＳＡＡスーパーファミリーがヒトの染色体の１１ｐ１５に局在する密接に関連した遺伝子のクラスターであることが明らかになった（非特許文献４を参照）。ワトソンら（1994）は更にＳＡＡスーパーファミリーの機能性遺伝子の全て（即ちＳＡＡ１、ＳＡＡ２及びＳＡＡ４）が１１ｐ１５．４〜ｐ１５．１の領域内に位置付けられることを証明した（非特許文献５を参照）。
【０００５】
ＳＡＡは急性期応答中に高比重リポタンパク質（ＨＤＬ３）の第三画分と急速に結び付く小さなアポリポタンパク質である。該画分上でそれらは圧倒的に多いアポリポタンパク質になる。ＳＡＡは炎症中にＨＤＬ３のマクロファージへの結合を増強すると同時にＨＤＬ３の肝細胞への結合能を低下させる（非特許文献６を参照）。これらの変化はＳＡＡがＨＤＬ３を再構築し、それを肝細胞からマクロファージへ振り向けるためのシグナルとして作用し、次いでマクロファージは壊死の部位でコレステロール及び脂質残骸を呑食することを示唆している。このようにして、過剰のコレステロールは組織の修復に使用するため再配分され又は分泌され得る。
【０００６】
ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は２型糖尿病で検出される。２型糖尿病におけるＳＡＡの増加は、組織の修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用しうる。この増大した異化は糖尿病患者で観察される低いＨＤＬ濃度に対する可能な理由であると考えられ、アテローム斑でのマクロファージによる取り込みは２型糖尿病における動脈疾患の危険性の増大に対する理由の一部であり得るであろう。
【０００７】
ＳＡＡのレベルは損傷、感染又は炎症に応答して１０００倍までも増大し得る。続発性又は反応性のアミロイドーシスは様々な慢性及び再発性の炎症疾患の一つの結果である。続発性アミロイド沈着は主にアミロイドＡから構成され、ＳＡＡ前駆体からタンパク質分解により誘導されると考えられる。親生産物からの切断される際、アミロイドＡは凝集して、アミロイドーシスとして知られる全身合併症を惹起する不溶性の逆平行β−プリーツシート原線維を形成できる（非特許文献７を参照）。定義上、アミロイド原線維はコンゴレッドで陽性に染まり、偏光を用いて観察すると緑色の複屈折を示す。
【０００８】
血清アミロイドＡタンパク質は進化の間中よく保存され、関節炎、多発性硬化症、強皮症、外傷、強直性脊椎炎、大腸炎、急性膵炎、移植拒絶、感染及び心臓病を含む様々な他の病的状態に関係してきた。
【０００９】
従って、血清アミロイドＡタンパク質の作用機構の解明は、異常な又は他の点で望ましくない血清アミロイドの機能的活性により特徴付けられる状態を治療することに向けられた治療戦略及び／又は予防戦略の開発に必要である。
【非特許文献１】
バウゼルマン，エルエル、ヘルベルト，ピイエヌ、マッカダム，ケイピイダブリュジェイ(1980)，J.Exp.Med. 152:641-656。
【非特許文献２】
クルヴェ−ベッカーマン，ビイ、ネイラー，エスエル、マルシャル，エイ、ガードネル，ジェイシイ、ショーズ，ティビイ、ベンソン，エムディ(1986)，Biochem. Ciophys. Res. Commun. 137:1196-1204。
【非特許文献３】
クルヴェ−ベッカーマン，ビイ、マレ，イー、ビット，エイチ、プフェイフェル，シイ、ベンソン，エム、ステインメルツ，エイ(1991)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:1097-1102。
【非特許文献４】
セーラー，ジイシイ、ジョルドン，エスエイ、ビックモア，ダブリュエイ、ファンテス，ジェイエイ、ヴァン，ヘイニンゲン，ブイ、ホワイトヘッド，エイエス(1994)，Genomics 19:221-227。
【非特許文献５】
ワトソン，ジイ、シー，シイジイ、ウォー，ピイ(1994)，Genomics 23:694-696。
【非特許文献６】
ジェンセン，アイイー、ホワイトヘッド，エイエス(1998)，Biochem J 334(pt3):489-503。
【非特許文献７】
フォーク，アールエイチ、コメンゾ，アールジェイ、スキナー，エム(1997)，N Engl J Med 25 337(13):898-909。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に至る研究において、本発明者らはタニス（Ｔａｎｉｓ）タンパク質が血清アミロイドＡタンパク質と相互作用することを確定した。タニスの発現は絶食及び給餌により本質的に調節されることにより体重及びエネルギー代謝の調節機構を提供するとこれまで考えられてきた。本発明を決して限定するものではないが、タニスは膜結合タンパク質として存在し、受容体として機能すると考えられる。タニスと血清アミロイドＡとの相互作用の同定は、タニスの機能的役割に関する現状理解を顕著に拡大し、血清アミロイドＡが媒介する機能的活性の変化に向けられた方法論の開発をここに促進した。更に、異常な、望ましくない又は他の点で不適切な血清アミロイドＡの機能的活性により特徴付けられる状態を治療するための治療計画及び／又は予防計画の設計が促進される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本明細書及び以下の請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む(comprise)」という単語、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、明記した完全体若しくは段階又は完全体若しくは段階の群の包含を意味するが、任意の他の完全体若しくは段階又は完全体若しくは段階の群の排除を意味するわけではないと理解されるであろう。
【００１２】
本明細書は、パテントイン3.0版のプログラムを用いて作成されたヌクレオチド及びアミノ酸の配列情報を明細書の参照文献の後に提示する。個々のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、数字表示＜２１０＞、続いて配列識別子（例えば＜２１０＞１、＜２１０＞２等）により配列表で同定される。個々のヌクレオチド又はアミノ酸の配列の長さ、配列の型（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）等）及び生物の起源はそれぞれ数字表示場＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３で提示される情報により示される。本明細書で言及されるヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、数字表示フィールド＜４００＞、続いて配列識別子（例えば＜４００＞１、＜４００＞２等）で提示される情報により規定される。
【００１３】
本発明の一側面は、被験体においてアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該リポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
別の一側面では、被験体においてＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該ＳＡＡとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１５】
更に別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１６】
更なる別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の一側面は、哺乳動物における、異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられる状態の治療方法及び／又は予防方法であって、タニスと該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で有効量のある物質を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００１８】
本発明の更なる別の一側面は、哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における上に定義した物質の使用であって、、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なＳＡＡが媒介する細胞活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとＳＡＡとの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００１９】
別の一側面において、本発明は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、上で定義した物質の使用であって、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとＳＡＡとの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００２０】
更なる別の一側面において、本発明は上で定義した変化させる物質を一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤と共に含む医薬組成物を意図する。
【００２１】
本発明の更なる別の一側面は本発明の方法で用いられる場合の上で定義した物質に関する。
【００２２】
本発明の別の一側面は、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とタニスとの相互作用を変化させ得る物質を検出する方法であって、タニス及びＳＡＡを含むインビトロ系と推定された物質とを接触させる工程、及び該相互作用と関連して改変された発現の表現型を検出する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
本明細書を通して用いられる一文字及び三文字の略号は表１に定義される。
【００２４】
【表１】
発明の詳細な説明
本発明はタニスと血清アミロイドＡタンパク質との相互作用の関係の解明に一部基づいている。この測定により、望ましくない血清アミロイドＡの活性により特徴付けられる状態を処理するための治療方法及び／又は予防方法の合理的な設計が可能になる。更に、タニスが媒介する血清アミロイドＡの機能的活性の調節を変化させる物質の同定及び／又は設計が促進される。
【００２６】
従って、本発明の一側面は、被験体におけるアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
より具体的には、被験体におけるＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体若しくは化学的同等物と該ＳＡＡとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００２８】
「ＳＡＡ」についての言及は、急性期タンパク質のＳＡＡスーパーファミリーの任意の構成員についての言及と理解されるべきである。本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に限定することなく、ＳＡＡは小さなアポリポタンパク質である。それらのレベルは感染中、炎症中又は損傷後に著しく高まり、そしてそれらは高比重リポタンパク質の第三画分と結び付き、それによりＨＤＬ３を再構築し感染中にＨＤＬ３のマクロファージへの結合を強化することが知られている。ＳＡＡファミリーの各構成員に関して、「ＳＡＡ」という用語は該構成員又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の全形態を包含することも理解されるべきである。ＳＡＡｍＲＮＡの代替的スプライシングから生じる任意のイソ型又はＳＡＡの突然変異体若しくは多型変異体についての言及が含まれることも理解されるべきである。この点について、タンパク質のＳＡＡファミリーは多型であり且つ同義遺伝子によりコードされることが知られている。「ＳＡＡ」は、少なくとも一つのＳＡＡの機能的活性を示す任意の他分子についての言及を含むことが更に理解されるべきである。
【００２９】
「ＳＡＡが媒介する機能的活性」についての言及は、ＳＡＡの作用により直接的又は間接的に誘発される生理的過程又は細胞活性など任意の一つ以上の機能的活性についての言及として理解されるべきである。「直接的に」誘発される機能的活性は、ＳＡＡシグナル（例えば肝細胞からマクロファージへのＨＤＬ３の振り向け）又はＳＡＡとの相互作用（例えばＳＡＡへの結合後のＨＤＬ３の再構築）の結果として最初に誘発される活性についての言及として理解されるべきである。「間接的に誘発される活性」は以上で定義したような直接作用の下流の結果である活性として理解されるべきである。例えば、ＳＡＡの誘導は、核因子−カッパＢ、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質及びＳＡＡ活性化因子という少なくとも３つの転写因子のＤＮＡ結合活性の増大と関連することが知られている（レイとレイ、1999）。これらの転写因子はＳＡＡに特異的なものではなく、幾つかの他の遺伝子の転写を改変することが知られている。これらの因子の活性化は従って上で同定した転写因子の結合活性を改変することによりこれらの遺伝子の発現を間接的に改変することがある。
【００３０】
「タニス」又は「タニスをコードするヌクレオチド配列」についての言及は、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の全ての形又はタニスの機能を有する他分子についての言及として理解されるべきである。これは例えばタニスのあらゆるタンパク質形若しくは核酸形又は例えばタニスｍＲＮＡの代替的スプライシングから生じる任意のイソ型若しくはタニスの突然変異体若しくは多型変異体を含むタニスの機能的同等物若しくは誘導体を含む。「タニスをコードするヌクレオチド配列」についての言及は、タニスの発現を調節する任意のタニス調節要素（プロモーター又はエンハンサーなど）への言及を含み、そしてタニス・ゲノムＤＮＡ転写の開始部位と終結部位との間以外の位置にある部位を含むと理解されるべきである。「タニス」とはタニスの機能的活性を示す任意の他分子についての言及を含むことも理解されるべきである。このような分子は例えばタニスの機能的活性を示す内生的に発現する分子又は体内に導入されタニスの機能の少なくとも一つを模倣する分子を含む。これらの分子は組換え体でも、合成体でも又は天然に存在するものであってもよい。特定されない限りは、タニスをコードする核酸分子の発現又はタニス発現産物の機能的活性を変化させることについての如何なる言及も、タニスの機能的同等物又は誘導体の発現又は機能的活性を変化させることについての言及を含むと理解されるべきである。本発明を決して限定することなく、タニスは「バンド５５」又は「Ｂ５５」としても知られ、その核酸のｃＤＮＡ配列及びゲノム配列は国際特許公開第ＷＯ０１／０２５６０号で提供される。これは参照により本明細書にインコーポレートされる。ヒトのタニスは＜４００＞１３で示される配列を含む。ゲノム配列はエキソン及びイントロンを含んでもよいことが理解されるべきである。ゲノム配列はプロモーター領域又は他の調節領域も含みうる。国際特許公開第ＷＯ０１／０２５６０号に開示されたゲノム配列は転写開始部位から転写終結部位までの配列部分にのみ対応すると理解されるべきである。従って、本発明により包含されるこの配列及び他のゲノム配列は転写開始部位から転写終結部位までを包含するより多くの配列又は少ない配列のいずれかを含んでもよい。例えばそれは転写の部位（単数又は複数）の上流又は下流に位置する調節配列などの付加的な非翻訳配列を含みうる。タニスをコードする核酸分子についての言及はタニスとして下線を引いた文字で本明細書中に示される。
【００３１】
本発明を任意の一理論又は作用様式に限定することなく、タニスはＳＡＡと相互作用すると決定された。タニスはＳＡＡの受容体として機能する膜結合分子として存在すると考えられる。従って、ＳＡＡはタニスとの相互作用を介して細胞にシグナル伝達すると考えられる。タニス−ＳＡＡ相互作用関係の存在の解明はＳＡＡが媒介する細胞活性及び／又は生理的過程を変化させる機構を提供する。「変化」とは上下への調節を意味する。タニスとＳＡＡの間の相互作用の変化は（高レベルへの調節又は低レベルへの調節のいずれかの意味において）部分的であっても完全であってもよいと理解されるべきである。
【００３２】
部分的な変化は所与の被験体に正常で起こるＳＡＡ−タニス相互作用の一部だけが本発明の方法により影響を受ける場合に生じ（例えば本発明の方法が該細胞がＳＡＡにより媒介性される能的活性を受ける時間の一部だけ被験体に適用されるか又はＳＡＡとタニスとの相互作用を変化させる物質が全てのタニス−ＳＡＡ相互作用を飽和するのに不十分な濃度で提供される）、一方、完全な変化はタニス−ＳＡＡ相互作用の全てが変化を受ける場合に生じる。
【００３３】
好ましい方法はＳＡＡ−タニス相互作用の変化を介してＳＡＡが媒介する機能的活性を変化させることであるが、特にタニスが非膜結合形態でも機能しうる限り、ＳＡＡとのその相互作用の変化を介してタニスが媒介する機能的活性を変化させることも可能である。
【００３４】
従って、別の一側面では、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３５】
より具体的には、被験体においてタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、ＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法が提供される。
【００３６】
「タニスが媒介する機能的活性」についての言及は、タニスの作用を介して直接的又は間接的に誘発される細胞活性又は細胞シグナル機構などの任意の一つ以上の機能的活性についての言及として理解されるべきである。「直接的」及び「間接的」作用についての言及はＳＡＡが媒介する機能的活性に関して上に定義したものと同じ一般的な意味を有するべきである。
【００３７】
タニスとＳＡＡとの相互作用の変化は、
(i) 相互作用の目的に利用できるタニス又はＳＡＡの細胞内濃度を変化させるために、タニス又はＳＡＡ又はその誘導体、同族体若しくは類似体をコードする核酸分子を細胞に導入する工程又はタニス又はＳＡＡ又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体のタンパク質形を被験体に導入する工程、
(ii) 遺伝子の転写調節及び／又は翻訳調節を変化させるタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程であって、該遺伝子がタニス遺伝子又はＳＡＡ遺伝子であってよい工程、
(iii) タニスとＳＡＡの間の相互作用に拮抗するタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程、
(iv) タニスとＳＡＡの間の相互作用を作動するタンパク質性分子又は非タンパク質性分子を細胞に導入する工程、
を含む幾つかの技術のいずれか一つにより達成されうるが、これらに限定されない。
【００３８】
「物質」についての言及は、タニスとＳＡＡとの相互作用を変化させる任意のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子についての言及として理解されるべきであり、例えば上記の(i)〜(iv)の項で詳述した分子を含む。当該物質は任意のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子と連結、結合又は他の方法で結び付きうる。例えばそれは、それを局在化された領域へ標的化することを可能にする分子と結び付きうる。
【００３９】
該タンパク質性分子は融合タンパク質又は例えば天然産物のスクリーニング後に得られるものを含む天然、組換え又は合成の供給源に由来しうる。該非タンパク質様分子は例えば天然産物のスクリーニングなどの天然起源に由来しても又は化学合成されてもよい。本発明はタニス−ＳＡＡ相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用できる該タニス又はＳＡＡの化学類似体を意図する。化学アゴニストは必ずしも該タニス又はＳＡＡに由来しうるものではないが、一定のコンフォメーションの類似性を共有しうる。或いは、化学アゴニストは該タニス又はＳＡＡの一定の生理化学的性質を模倣するよう特異的に設計されうる。アンタゴニストはタニスとＳＡＡの相互作用を遮断、阻害又は他の方法で防止できる任意の化合物であってよい。アンタゴニストは被験体の細胞において該タニス又はＳＡＡ又は該タニスの一部に特異的なモノクローナル抗体、及び遺伝子若しくはｍＲＮＡの転写若しくは翻訳を防止するアンチセンス核酸を含む。発現の変化は抗原、ＲＮＡ、リボソーム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡアプタマー（aptamers) 、抗体又は共抑制での使用に適した分子を利用しても達成されうる。このような分子を同定する際の使用に適したスクリーニング方法は以下でより詳細に記載する。
【００４０】
該タンパク質性分子又は非タンパク質性分子はＳＡＡとタニスの相互作用を変化させるために直接的又は間接的のいずれかで作用しうる。該分子はタニス又はＳＡＡ分子と結び付く場合は直接的に作用する。該分子はタニス又はＳＡＡ以外の分子と結び付く場合は間接的に作用する。該他の分子はＳＡＡとタニスの相互作用を直接的又は間接的のいずれかで変化させる。従って、本発明の方法は調節段階のカスケードの誘導を介したタニス−ＳＡＡ相互作用の調節を包含する。
【００４１】
「誘導体」とは融合タンパク質を含む天然、合成又は組換えの供給源から得られる断片、一部、部分、突然変異体、変異体及び擬似体を含む。一部又は断片は例えばタニス又はＳＡＡの活性領域を含む。誘導体はアミノ酸の挿入、欠失又は置換により誘導しうる。アミノ酸挿入誘導体はアミノ及び／又はカルボキシルの末端融合並びに１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。アミノ酸配列挿入変異体は一つ以上のアミノ酸残基が該タンパク質の所定部位に導入されたものであるが、得られる産物の適切なスクリーニングを行なえば無作為な挿入も可能である。欠失変異体は該配列からの一つ以上のアミノ酸の除去により特徴付けられる。置換アミノ酸変異体は該配列の少なくとも一つの残基が除去されその場所に異なる残基が挿入されたものである。置換アミノ酸変異体の１例は同類アミノ酸置換である。同類アミノ酸置換は典型的には下記の群内での置換を含む。即ち、グリシン及びアラニン、バリン，イソロイシン及びロイシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、リシン及びアルギニン、並びにフェニルアラニン及びチロシンである。アミノ酸配列への付加は他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合を含む。
【００４２】
「同族体」についての言及は、処置される種以外の種に由来する核酸分子又はタンパク質についての言及として理解されるべきである。
【００４３】
核酸分子又はタンパク質分子の化学的同等物及び機能的同等物とは、これら分子の任意の一つ以上の機能的活性を示す分子として理解されるべきであり、化学合成され又は天然産物のスクリーニングなどのスクリーニング工程を介して同定されるなどして任意の供給源から誘導してもよい。
【００４４】
誘導体は、ペプチド、ポリペプチド又は他のタンパク質性分子若しくは非タンパク質性分子と融合した全タンパク質の特定のエピトープ又は部分を有する断片を含む。
【００４５】
本明細書で意図される類似体は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成中の側鎖への修飾、非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み並びにタンパク質性分子若しくはそれらの類似体にコンフォメーション上の制約を課す架橋剤及び他の方法の使用を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
核酸配列の誘導体は同様に他の核酸分子との融合を含む１個又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加により誘導してもよい。本発明の核酸分子の誘導体はオリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制及び融合での使用に適した分子を含む。核酸配列の誘導体は縮重変異体も含む。
【００４７】
本発明により意図される側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応後ＮａＢＨ4 を用いた還元による還元アルキル化、メチルアセチミデートを用いたアミジン化、無水酢酸を用いたアシル化、シアン酸塩とアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、並びにピリドキサール−５−リン酸によるリシンのピリドキシル化後ＮａＢＨ4 を用いた還元などのアミノ基の修飾を含む。
【００４８】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬を用いた複素環縮合産物の形成により修飾されうる。
【００４９】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレアの形成を介したカルボジイミドの活性化の後続いて例えば対応するアミドへの誘導により修飾されうる。
【００５０】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセタミドを用いたカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸の酸化、他のチオール化合物を用いた混合ジスルフィドの形成、マレイミド，無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応、４−クロロメルクリベンゾエート，４−クロロメルクリフェニルスルホン酸，フェニルメルクリクロライド，２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでシアン酸塩を用いたカルバモイル化などの方法により修飾されうる。
【００５１】
トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドを用いた酸化、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド又はハロゲン化スルフェニルを用いたインドール環のアルキル化により修飾されうる。他方でチロシン残基はテトラニトロメタンを用いたニトロ化により改変され３−ニトロチロシン誘導体を形成しうる。
【００５２】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化又はジエチルピロカルボネートを用いたＮ−カルボエトキシル化により達成されうる。
【００５３】
タンパク質合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を組み込んだ例は、ノルロイシン、４−アミノブチル酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図される非天然アミノ酸の一覧を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【表２−１】
【表２−２】
架橋剤は、例えばｎ＝１からｎ＝６までの（ＣＨ2 ）n スペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤並びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分と他の基に特異的な反応性部分を通常含むへテロ二官能性試薬を用いて、３Ｄコンフォメーションを安定化させるために使用できる。
【００５８】
本発明の好ましい方法は被験体を治療することであるが、本発明の方法はインビトロでの適用に適応されうることを理解されるべきである。このような適応は当業者により機械的に実施されうるであろう。例えばタニス膜結合分子を介して媒介される細胞活性を変化させることを求める範囲で、ＳＡＡ又はこれまで定義した変化用物質との相互作用をインビトロで実施することが可能である。これは例えばＳＡＡ−タニス相互作用を変化させる分子についてのスクリーニングのインビトロ系を確立することが求められる場合に望まれることがある。或いは、被験体への導入前に本明細書で定義した方法に従って細胞のインビトロ集団を処理することが望まれることがある。これらの細胞は例えば初めに該被験体から単離され、そして次いで、適切な処理の後に戻されうる。
【００５９】
本発明の更なる側面は、病的状態の治療及び／又は予防についての本発明の使用に関する。本発明を如何なる一理論又は一作用様式に限定することも意図しないが、ＳＡＡの多面的活性は、これらの分子を健康状態及び病的状態の両方の生理的過程の多数の側面の不可欠な機能要素とならしめる。従って、本発明の方法は異常な又は他の点で望ましくないＳＡＡの機能的活性を変化させるための価値ある道具を提供する。関連する側面において、本発明は、この機能的活性がＳＡＡにより媒介される限り、異常な又は他の点で望ましくないタニスの機能的活性を変化させる道具も提供する。
【００６０】
従って、本発明の別の一側面は哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、該アポリポタンパク質とタニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００６１】
より具体的には、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なＳＡＡが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、該ＳＡＡとタニスの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００６２】
本発明の更なる別の一側面は、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、アポリポタンパク質と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に向けられる。
【００６３】
より具体的には、哺乳動物において異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、ＳＡＡと該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００６４】
「異常な、望ましくない又は他の点で不適切な」機能的活性についての言及は、過剰な機能的活性について、それが望ましくないという点で不適切な生理的に正常な機能的活性について、又は不十分な機能的活性についての言及として理解されるべきである。例えば、ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は、II型糖尿病で検出される。II型糖尿病におけるＳＡＡの増加は組織修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用すると考えられる。この異化の増加は糖尿病患者で観察される低いＨＤＬ濃度についての可能な原因であると考えられる。正常な生理過程だが、アテローム斑におけるマクロファージによる取込みはII型糖尿病の動脈疾患の危険性の増大の原因の一部であると考えられる。従って、このような状況において、動脈疾患の進行に関連する危険性の一部を軽減するためにＳＡＡの機能的活性を少なくとも部分的に低レベル調節することが望まれる。別の一例において、ＳＡＡの刺激は、炎症性及び増殖性の関節リウマチ及び変形性関節症でしばしば見られる組織破壊に関与することが知られている酵素であるコラゲナーゼの誘導を起こさせることができる（ミッチェルら，１９９１、ブリンケルホッフら，１９８９）。従って、このような状況において、該疾患の進行に関連する危険性の一部を軽減するためにＳＡＡの機能的活性を少なくとも部分的に低レベル調節することが望まれる。
【００６５】
該状態は、
(i) 関節炎−ＳＡＡは慢性関節リウマチで増加し、ＳＡＡ濃度は疾患の重症度を反映すると考えられる（グリンデュルスら，１９９５、クンナンとホワイトヘッド，１９９９、クンナンら，２０００）。
(ii) 炎症状態−ＳＡＡは幾つかの炎症状態で増加し、血中濃度は炎症の程度を評価する可能な手段を表しうる。これらの状態は多発性硬化症（リストリら，１９９８）、強皮症（バンドヴェインら，１９８４）、外傷（モゼスら，１９８９）、強直性脊椎炎（ランゲら，２０００）、結腸炎（ヤングら，１９９９、デ・ヴィリアスら，２０００）、急性膵炎（ペジリら，２０００）を含む。
(iii) 移植−膵臓及び腎臓の移植拒絶の発作はＳＡＡの増加と関係づけられてきた（カスルら，１９９５、ハートマンら，１９９７、ムラーら，１９９７、ケイセンら，１９９９）。ＳＡＡは拒絶過程で早期に増加するらしく、患者の炎症状態の有用なマーカーであると考えられる。
(iv) 感染−ＳＡＡはウイルス感染及び急性下痢の感度の高い指標であることが示された（ウィッチェルら，１９８５、ダーリングら，１９９９）。
(v) 心臓疾患−ＳＡＡ濃度の増加は、心筋梗塞（リウジら，１９９４、キャスルら，１９９５、ダネシュら，１９９９）、冠状動脈性心臓病（ステファナディスら，２０００）、冠動脈病（エレンら，１９９９）、心疾患（リッドケットら，２０００）及びアテローム性動脈硬化（メックら，１９９４、エレンら，１９９９）の危険性の増加と関連している。
(vi) サルコイドーシス（サラザルら，２０００）
(vii) アルツハイマー病（チュングら，２０００）
(viii) 腎症（腎性アミロイドーシス）（カネコら，２０００）及び末期腎不全（ケイセンら，１９９９）
(ix) 腹部大動脈瘤（ローデら，１９９９）
(x) 肥満（ダネシュら，１９９９）
(xi) ２型糖尿病（ピックアップら，１９９７、ピックアップとクロック，１９９８）
(xii) タニス又はＳＡＡ又はそれらの相互作用に関する異常な免疫応答を伴う全ての状態
を含むことが好ましいが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で用いられる「被験体」という用語は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験用試験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ）及び捕獲した野生動物（例えばキツネ、カンガルー、シカ）を含む。該哺乳動物はヒト又は実験用試験動物であることが好ましい。該哺乳動物はヒトであることが更により好ましい。
【００６７】
「有効量」とは、望ましい応答を得るため、又は発症を遅らせるため又は進行を阻害するため又は治療される特定の状態の発症若しくは進行を共に中止させるために少なくとも部分的に必要な量を意味する。該量は治療される個体の健康状態及び身体状態、治療される個体の分類群、所望される防御の程度、組成物の製剤、医療状況の評価、並びに他の関連因子に応じて変化する。該量は機械的試験を通じて決定され得る比較的広い範囲内に収まることが予期される。
【００６８】
本明細書中、「治療」及び「予防」についての言及は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。「治療」という用語は被験体が完全回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防」とは該被験体が最終的に疾病状態に罹らないことを必ずしも意味しない。従って、治療及び予防は特定状態の症状の改善又は特定状態を発症する危険性を防止若しくは他の方法で低減することを含む。「予防」という用語は特定状態の重症度又は発症を低減するものと考えられる。「治療」も現存の状態の重症度を低減しうる。
【００６９】
本発明は、糖尿病の治療のため哺乳動物にインスリン投与をするとともに物質を投与するなどの治療の組み合わせを更に意図する。
【００７０】
医薬組成物の形態での変化用物質の投与は任意の簡便な手段により実施しうる。変化用物質の医薬組成物は特定の症例に依存する量で投与される場合に治療活性を示すことが意図される。変動は、例えばヒト又は動物及び選択された変化用物質に依存する。広範囲の用量が適用可能である。患者を考慮しながら、１日当たり体重１キログラム当たり、例えば約０．１ｍｇから約１ｍｇまでの変化用物質がに投与されうる。投与計画は最適な治療応答を生ずるように調整されうる。例えば幾つかに分割した量を日、週、月又は他の適切な時間間隔で投与してもよく、又は該用量は状況の切迫により示される場合はそれに比例して減少しうる。
【００７１】
該変化用物質は、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋内、皮下、皮内又は座剤又は移植（例えば徐放性分子を用いて）などによる簡便な様式で投与されうる。該変化用物質は酸付加塩又は例えば亜鉛、鉄等との金属錯体（この適用のため塩としてみなされる）など薬学的に許容しうる無毒性塩の形態で投与されうる。このような酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が錠剤の形で投与されるべき場合、該錠剤はトラガカント、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、アルギニン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含みうる。
【００７２】
投与の経路は、呼吸、気管内、鼻咽腔、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋内、眼内、くも膜下、大脳内、鼻腔内、注入、経口、経直腸、点滴静注を介するものを含み、パッチ及び移植を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
これらの方法に従って、本発明で定義された物質は一つ以上の他の化合物又は分子と共投与されうる。「共投与される」とは、同一製剤で又は同じ若しくは異なる経路を介した二つの異なる製剤での同時投与、又は同じ若しくは異なる経路による逐次投与を意味する。例えば当該物質はその効能を増強するためにアゴニスト剤とともに投与されうる。「逐次」投与とは二つの型の分子の投与の間で秒、分、時間又は日の時間的相違があることを意味する。これらの分子は任意の順序で投与してよい。
【００７４】
本発明の別の一側面は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、これまでに定義した物質の使用であって、その状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がアポリポタンパク質とタニスの相互作用を変化させるものである使用を意図する。。
【００７５】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００７６】
別の一側面において、本発明は哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造における、これまでに定義した物質の使用であって、その状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がアポリポタンパク質とタニスの相互作用を変化させるものである使用を意図する。
【００７７】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００７８】
更なる別の一側面において、本発明は一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／若しくは希釈剤と共にこれまでに定義した変化用物質を含む医薬組成物を意図する。該物質は活性成分と呼ばれる。
【００７９】
注射用途に適した医薬剤形は、滅菌水溶液（水溶性の場合）若しくは滅菌分散液及び滅菌注射溶液若しくは滅菌分散液の即時調製用の滅菌粉末を含み、又はクリームの剤形若しくは局所適用に適した他の剤形であってもよい。これは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は例えばレシチンなどの被覆剤の使用、分散の場合必要な粒子サイズの維持及び界面活性剤（superfactant）の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により行われ得る。多くの場合、例えば糖類又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射組成物の持続吸収は例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる物質の組成物での使用により実施され得る。
【００８０】
滅菌注射溶液は上記で列挙した種々の他成分とともに適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要ならば続いてろ過滅菌することにより調製される。一般的に、分散液は基本分散媒及び上記で列挙したものから選んだ必要な他の成分を含む滅菌媒体中に滅菌した種々の活性成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥の技術である。これらの方法は活性成分の粉末に任意の付加的な所望成分を加えて予め滅菌ろ過した溶液からその粉末を作成する。
【００８１】
活性成分が適切に保護される場合、それらは例えば不活性な希釈剤とともに若しくは同化できる食用担体とともに経口投与してもよく、又は硬殻若しくは軟殻のゼラチンカプセルで包み込んでもよく、又は圧縮して錠剤にしてもよく、又は食事の食物とともに直接取込ませてもよい。治療用の経口投与のためには、該活性化合物は賦形剤と混ぜ、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウエハース等の剤形で用いてもよい。このような組成物及び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物及び調製物のパーセンテージは無論変更してもよく、そして単位重量の約５％から約８０％までが便利である。治療に有用な組成物中の活性化合物の量がこのような適切な用量で得られる。本発明の好ましい組成物又は調製物は経口投与単位剤形が約０．１μｇから２０００ｍｇまでの活性化合物を含むように調製される。
【００８２】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等は以下に挙げる成分を含んでもよい。即ち、ガム、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチンなどの結合剤、燐酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、スクロース、ラクトース若しくはサッカリンなどの甘味料、又はペパーミント、冬緑油若しくはサクランボの風味などの着香料が添加されうる。投与単位剤形がカプセルの場合、上記の型の物質に加えて液体担体を含んでもよい。被覆剤として又は他の方法で投与単位の物理的形態を改変するための種々の他の物質が存在しうる。例えば錠剤、ピル又はカプセルはセラック、糖又は両方で被覆されうる。シロップ又はエリキシルは該活性化合物、甘味料としてスクロース、保存剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ若しくはオレンジの風味などの着香料を含みうる。無論、いずれの投与単位剤形を調製する際に用いられるどの物質も薬学的に純粋であり使用量において実質的に無毒であるべきである。その上、該活性化合物は徐放性の調製物及び製剤に組み込んでもよい。
【００８３】
医薬組成物は標的細胞をトランスフェクションできるベクターなどの遺伝分子も含んでもよい。上記ベクターは変化用物質をコードする核酸分子を保持するものである。該ベクターは例えばウイルスベクターであってよい。
【００８４】
本発明の更なる別の一側面は、本発明の方法で使用される場合、これまでに定義した物質に関する。
【００８５】
これまでに定義した変化用物質のスクリーニングは、ある物質をタニス及びＳＡＡなどのアポリポタンパク質を含む細胞培養とを接触させる工程、及びタニス−ＳＡＡ機能的活性の変化又は下流の標的細胞の活性若しくは発現の変化についてスクリーニングする工程を含む（決してこれに限定されないが）幾つかの適切な方法の任意の一つにより達成できる。このような変化の検出はウェスタン・ブロッティング、電気泳動における移動度変化検定及び／又はルシフェラーゼ、ＣＡＴなどのタニス又はＳＡＡの活性についてのレポーターの読取りなどの技術を利用して達成できる。
【００８６】
タニスタンパク質が試験の対象である細胞中に天然で存在しうること又はそれらをコードする遺伝子が試験目的で宿主細胞内にトランスフェクトされることが理解されるべきである。更に、天然に存在する又はトランスフェクトされた遺伝子が構成的に発現され、それにより、とりわけタニス−ＳＡＡ相互活性(interactivity)を低レベル調節する物質についてのスクリーニングに有用なモデルを提供する。又は該遺伝子は活性化を要し、それにより、とりわけある刺激条件下でタニス−ＳＡＡ相互活性を変化させる物質についてのスクリーニングに有用なモデルを提供する。更に、タニス核酸分子が細胞内にトランスフェクトされる限り、この分子はタニス遺伝子全体を含みうるし又は単にＳＡＡ結合部分などの遺伝子の一部を含みうる。
【００８７】
別の例では、検出の対照はタニスそれ自体ではなく、下流のタニス調節標的であってもよい。更なる他の例は最小レポーターに連結されたタニス結合部位を含む。例えばタニス−ＳＡＡ相互活性の変化はＳＡＡ又はタニスで刺激された細胞の下流シグナル発生成分の変化についてのスクリーニングにより検出できる。これは、タニス及びＳＡＡがその活性を調節する分子の変化を監視する系の１例である。
【００８８】
従って、本発明の別の一側面は、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とタニスの相互作用を変化させることができる物質を検出する方法であって、該タニス及びアポリポタンパク質を含むインビトロ系と候補物質とを接触させる工程、及び該相互作用に関連する発現表現型の変化を検出する工程を含む方法を提供する。
【００８９】
該アポリポタンパク質はＳＡＡであることが好ましい。
【００９０】
「タニス」及び「ＳＡＡ」についての言及は、タニス若しくはＳＡＡの発現産物のいずれか、又はタニスタンパク質のＳＡＡ結合領域などのタニス分子若しくはＳＡＡ分子の一部若しくは断片についての言及として理解されるべきである。この点において、タニス又はＳＡＡの発現産物が細胞内で発現する限り、該細胞はタニス又はＳＡＡの核酸分子でトランスフェクトされた宿主細胞であってもよく、又は天然でタニス遺伝子を含む細胞であってもよい。
【００９１】
「該相互作用と関連する発現表現型の改変」を検出する工程についての言及は、ＳＡＡとタニスの相互作用の変化に関連した細胞の変化を検出する工程として理解されるべきである。これらは例えば細胞内の変化又は細胞外で観察できる変化として検出可能でありうる。例えばこれは下流の生産物のレベル若しくは活性における変化を検出する工程を含むが、これに限定されない。
【００９２】
本発明は更に下記の非限定的な実施例により規定される。
【実施例１】
【００９３】
タニスと相互作用するタンパク質についての酵母２ハイブリッド・スクリーニング
(i)材料及び方法
プラスミドの構築
タニス遺伝子はＳａｌＩ及びＮｃｏＩの制限部位を組込んだ遺伝子特異的プライマー（表３）を用いてハウスキーピング・ベクターからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物はＳａｌＩ及びＮｃｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社、ビバリー、米国）を用いた制限酵素消化にかけられる前にＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（キアーゲンPty社、オーストラリア）を用いてゲル精製した。消化後、試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一度抽出し、ＤＮＡを２容積の無水エタノール及び０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）で沈降させた。消化したＰＣＲ産物を２０μＬのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁しアガロースゲル電気泳動により相対濃度を決定した。
【００９４】
酵母プラスミドベクターｐＤＢＬｅｕ（ライフ・テクノロジーズ社、米国）を同様にＳａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、直鎖状産物を１．０％のアガロースゲルで分離した。消化断片を上記の様にゲル精製し、精製したベクターＤＮＡの濃度をアガロースゲル電気泳動により決定した。
【００９５】
消化後、タニスを調製されたｐＤＢＬｅｕベクターＤＮＡと連結し、この生成物を電気穿孔によりＤＨ５α（ライフ・テクノロジーズ社、米国）に形質転換した。形質転換体は２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートでの増殖により選択した。
【００９６】
組換え体クローンはベクターに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲの手段により同定した（表１）。次いで選択したクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定用の鋳型として用いた。陽性クローンのｐＤＢＢ５５９を２ハイブリッド・スクリーニングで使用するために選択した。それは、配列決定がｐＤＢＬｅｕのＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと共にフレーム内でクローニングされた１００％相同なタニス遺伝子配列を示したからである。
【００９７】
【表３】
株の構築
１００ｎｇのｐＤＢＢ５５９を、標準的な酢酸リチウム／ポリエチレングリコール手法を用いて酵母株のＭａＶ２０３（ライフ・テクノロジーズ社、米国）に形質転換した。ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含む形質転換体をロイシンを含まないプレート上での増殖により選択的に単離した。
【００９９】
３ＡＴ滴定
ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導されるＨＩＳ３発現の基底レベルを決定するために、活性化ドメインベクターｐＰＣ８６をｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞内に導入した。次に両プラスミドを含む細胞をヒスチジンを欠くが３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）を以下の濃度(0mM、10mM、25mM、50mM、75mM及び100mM)で含む選択培地上にパッチ接種した。３０℃で２４時間インキュベートした後、プレートをレプリカクリーン(replica clean)し、３０℃で更に２日間インキュベートした。両プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞の増殖は２５ｍＭ以上の濃度の３ＡＴの存在下で阻害された。その後の酵母２ハイブリッド・ライブラリー・スクリーニングで用いられるプレートには全て、ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導されるＨＩＳ３の基底発現をノックアウトするために２５ｍＭの３ＡＴを含めた。
【０１００】
ヒトの肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いた大規模形質転換
該ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞を、市販のｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて大規模形質転換用に特別に調製した。具体的にはＰｒｏＱｕｅｓｔ（商標）ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ライフ・テクノロジーズ社、米国）から収穫した１８μｇのプラスミドＤＮＡをｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞に形質転換した。約６．０×１０5個の形質転換体を２５ｍＭの３ＡＴを含むがロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを欠く選択培地上に播種した。ＨＩＳ３レポーター遺伝子を誘導した、従って潜在的な相互作用タンパク質を含んでいた形質転換体を選択して更なる分析に使用した。
【０１０１】
レポーター遺伝子発現の分析
単離したコロニーについてＨＩＳ＋陽性形質転換体と推定されたものをストリークし、結合レポーターであるＵＲＡ３及びｌａｃＺの誘導について試験した。ＨＩＳ＋と同定された３０個の形質転換体のうち、クローン１０、２５、２７及び２８の４クローンのみが上に挙げたレポーター遺伝子の少なくとも二つを誘導することが見出された。
【０１０２】
タニスとの相互作用の真偽を更に究明するため、各クローンから得たプラスミドＤＮＡを選択的に単離し、ＭａＶ２０３に再導入した。再形質転換検定はこれらのクローンが推定上のタニス相互作用タンパク質を含むことを確認した。全てのクローンが相互作用タンパク質をコードするプラスミドを含むと同定された。
【０１０３】
陽性クローンの配列同定
粗プラスミドＤＮＡを酵母クローン１０、２５、２７及び２８から調製し、ＤＨ１０Ｂ（ライフ・テクノロジーズ社、米国)エレクトロコンピテント(electrocompetent)細胞中に形質転換した。未知の候補タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを含む細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地上での増殖によるプールから単離した。各クローンのプラスミドＤＮＡを調製し、未知のｃＤＮＡの部分配列を決定した。
【０１０４】
(ii)結果
おとり：全長のタニス
ライブラリー：ヒトの肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリー
約６５万個の形質転換体をタニスとの相互作用についてスクリーニングした。４個の陽性相互作用クローンを同定し、配列決定した。
【０１０５】
配列
pPC86-クローン10F <400>5
クローンの同定：
クローン10：血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
クローン25：ユビキリン
クローン27：ＳＡＡ
クローン28：ＳＡＡ
【０１０８】
配列分析の概要
クローン１０、２７及び２８：ホモサピエンスの血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）のｍＲＮＡに対して９７％の相同性、完全コード（ジェンバンク寄託：Ｍ２６１５２）。
【０１０９】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質はＨＤＬと主に関連するタンパク質のファミリーを含み、ＳＡＡはその合成が炎症中に極めて増加する（１０００倍までも）ため急性期応答タンパク質と考えられる。ＳＡＡを含む急性期応答タンパク質の増加は、２型糖尿病で検出される。２型糖尿病で増加したＳＡＡは組織修復のため肝臓からマクロファージへＨＤＬコレステロールを振り向けるように作用しうる。この異化の増大は、糖尿患者で観察される低いＨＤＬ濃度の可能な原因であると考えられ、アテローム斑でのマクロファージによる取り込みは２型糖尿病における動脈疾患の危険性の増大の原因の一部でありうる。
【０１１０】
クローン２５： ヒトのＰＬＩＣ−１（ヒトのユビキリン１としても知られる）のｍＲＮＡに対して９７％の相同性。ユビキリンとも呼ばれるＰＬＩＣ−１（インテグリンと関連するタンパク質と細胞骨格を結び付けるタンパク質）は大きな複合体の中でプロテオソーム及びユビキチン・リガーゼの両方と物理的に結び付く。過剰発現した場合、ｈＰＬＩＣタンパク質は二つの無関係なユビキチン依存性プロテアソーム基質であるｐ５３及びＩカッパバルファ(IkappaBalpha)のインビボ分解を妨害するが、ユビキチン非依存性基質を妨害しない。最近の研究は、ｈＰＬＩＣタンパク質及びおそらく関連するユビキチン様ファミリーの構成員がユビキチン化機構を該プロテアソームと機能的に連結させてインビボのタンパク質分解に影響を及ぼすことを示唆している。
【実施例２】
【０１１１】
ＳＡＡとタニスの相互作用のバイアコア確認
バイアコアＪは親和性バイオセンサー技術に基づいて生体分子の存在及び性質を監視するための汎用系である。この系は、一方の結合相手がセンサー表面に付着し他方が該表面を通過する試料溶液中に存在する、特異的な分子の対合間の結合を検出することにより機能する。バイアコアＪは、試料がセンサー表面を通過する際に応答が得られるか否かを監視することにより結合相手を検出できる。結合曲線の形状を調べることにより結合活性を監視しそして比較もできる。検体（溶液中の試料）の濃度は得られる応答を測定し既知の試料から得られる標準曲線と比較することにより得られる。
【０１１２】
バイアコアＪで用いられる検出原理は、研究される分子を標識化する必要がなく、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び抱合分子を含むあらゆる種類の生体分子に適用される。
【０１１３】
バイアコアＪにより作成される出力は時間に対して応答をプロットすることにより得られる曲線であり、これはセンサーグラム（sensorgram) と呼ばれる。陰性及び陽性の両結合結果を示す典型的なセンサーグラムを以下に例示する。分析時の曲線の特徴は結合事象の性質についての詳細を提供できる。
【０１１４】
(i) 材料及び方法
組換えタニスの生産
タニス遺伝子をｐＧＥＸ５Ｘ１ベクター（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）にクローニングした。Ｎ末端ＧＳＴ融合タンパク質タグを備えたタニスタンパク質を発現させるためプラスミドを構築した。全長のタニス又はクローニングされた３断片、即ち、Ｎ末端（１〜３７アミノ酸）、Ｃプラス（５３〜１８９アミノ酸）若しくはＣ（１１７〜１８９アミノ酸）の１つのいずれかを発現する合計４個の構築物を作製した。これらのプラスミドのそれぞれのＤＮＡ配列を確認した。各プラスミドを大腸菌のＢＬ２１株（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）に別々に導入した。この株はｐＧＥＸ５Ｘ１プラスミドに含まれるＴ７プロモーターに特異的なバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含む。このポリメラーゼ遺伝子は対数期のＢＬ２１細菌培養にイソプロポチオガラクトシダーゼを添加することにより誘導されるＬａｃＺプロモーターの指揮下にある。誘導後、該細胞を遠心分離により収集し、細胞ペレットを細胞溶解緩衝液に再懸濁する。次いで該細胞をデジタル・ソニファイアー（ブランソン社、米国）により生成する超音波を用いて溶解する。可溶性及び不溶性のタンパク質を遠心分離により分離し、上清はＧＳＴ−タニスを含む可溶性タンパク質を含む。可溶性画分のみを処理し、不溶性画分は廃棄する。グルタチオン・セファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）は該ＧＳＴタンパク質に対して強い親和性を有する。ＧＳＴ−タニスタンパク質は回収された可溶性画分が通過する際に該樹脂に結合する。該樹脂の洗浄により他の夾雑タンパク質が取除かれる。抽出されたＧＳＴ−タニスタンパク質を該樹脂ベッドへの還元グルタチオン（１０ｍＭ）（アマーシャム・ファルマシア・バイオテクAB、スウェーデン）の添加により回収する。ＧＳＴ−タニスタンパク質が精製された程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定される。
【０１１５】
対照のＧＳＴ単独のタンパク質も上で概説した同じ方法を用いて調製される。
【０１１６】
全長のタニス（ＦＬ−タニス）のアミノ酸配列（１８９アミノ酸）＜４００＞１３
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質
ヒトの血清（トレース・サイエンティフィック社、オーストラリア）からサイズ排除クロマトグラフィーにより精製されたＳＡＡの９６％純粋な試料を全ての実験で用いた。
【０１１８】
バイアコアＪを用いたタニス−ＳＡＡ相互作用の研究
９６％純粋なＳＡＡをバイアコアＪ（バイアコア社、スウェーデン）の生体特異的センサー表面と共有結合させた。この表面はプラスチック・ホルダー（センサー・チップ）に搭載された金で被覆されたスライドガラスから構成される。ＣＭ５チップ（バイアコア社、スウェーデン）を全ての実験で使用した。このチップはＳＡＡが共有結合したカルボキシメチル化デキストランから成る親水性媒体で覆われる。タニスタンパク質の断片を該系に注入してこのチップの上を流し、センサーグラムは実時間で記録した。
【０１１９】
(ii) 結果
参照点Ｉは基線であり、ＧＳＴ−ＦＬタニスのそれぞれの注入は続いて共鳴単位（ＲＵ）を増加させた。タンパク質の相互作用は基線のＲＵ値に戻る応答の失敗により示される。注入後の値（点１、３、５、７）の間の差異は全長のタニスとＳＡＡとの結合事象を示す。注入点と最大ＲＵとの差異は二つのタンパク質間の親和性を示す。最大点後のＲＵの漸減は結合事象の解離を示す。これらのセンサーグラムは結合事象の急速な解離とともに潜在的に強い親和性結合を示す。一連の対照も注入してＳＡＡチップを通過させた。これらはＧＳＴ単独、ＢＳＡ（ＮＥＢ社、米国）単独及び緩衝液のみであった。これらのいずれも上に示したものと同様な応答を生じなかった。このことはこれが真の応答であることを示している。
【０１２０】
タニスのＧＳＴと融合した断片をＳＡＡと相互作用するタニスタンパク質の領域を潜在的に決定するために試験した（以下に示す）。Ｎ末端、Ｃ末端及びＣ末端＋コイル状のコイル領域を注入してＳＡＡチップ上をそれぞれ通過させた。化学合成された２４アミノ酸のペプチド（Ｎ末端）も注入した。Ｎ末端タニスの両形態はＲＵ値に変化を与えず、応答を生じなかった。Ｃプラス及びＣ領域の両方はＦＬタニスで見られたものと同様な曲線を生じた。Ｃプラス領域で達成された結果は異なるタンパク質のバッチで再現されたので、相互作用の存在を示唆している。Ｃプラス及びＣの実験から得られた結果は、ＳＡＡと相互作用するタニスタンパク質の領域がＣ末端の７２アミノ酸内に位置することを示唆している。
【実施例３】
【０１２１】
２型糖尿病と炎症の関連
(i) 研究設計及び方法
実験動物
Ｐ．オベサスのコロニーはディーキン大学（ジーロング、オーストラリア）で維持される。飼育する雌雄にはルツェルン(Lucerne)の食物及び標準的な食物を自由に与える。実験動物は４週齢で離乳させ、標準的な実験食物を与えた。この食餌ではエネルギーの１２％が脂肪から、６３％が炭水化物から、そして２５％がタンパク質から得られた（バラストック社、パケンハム、オーストラリア）。動物を１２時間の明暗周期（明06:00〜18:00）で温度制御された室内（22±1℃）で飼育した。動物は先に記載したそれらの血中グルコース及び血漿インスリンの濃度に従って１６週齢で正常な耐糖能（ｎＧＴ）、耐糖能異常（ＩＧＴ）、又は２型糖尿病に分類された。酵素グルコース分析器（モデル27、イエロー・スプリングス・インスツルメンツ社、イエロー・スプリングス、オハイオ州）を用いて全血中グルコースを測定された。血漿インスリン濃度は二抗体固相放射免疫検定（ファデセップ、Kabiファルマシア・ダイアグノスティックス、スウェーデン）を用いて測定した。
【０１２２】
ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ
１８週齢で、動物（各群からｎ＝６：ｎＧＴ、ＩＧＴ、及び２型糖尿病）は２４時間の絶食又は適宜の給餌のいずれかに無差別に割当てられた。２４時間後、該動物を屠殺し、その組織を直ちに取り出し、液体窒素中で凍結した。ＲＮＡはＲＮＡゾルＢ（テル−テスト、フレンズウッド、テキサス州）を用いて組織から抽出し、スーパースクリプトII(インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ社、ロックビル、メリーランド州)を用いて逆転写した。ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲはＲＮＡイメージｍＲＮＡディファレンシャル・ディスプレイ・システム（ゲンハンター社、ナッシュビル、テネシー州）を用いて肝臓のｃＤＮＡで実施した。タニス遺伝子は、Ｇアンカー・プライマー（5'-aag ctt ttt ttt ttg-3'）及び任意のプライマー（5'-aag ctt ctc aac g-3'）を用いて同定した。
【０１２３】
配列決定
DNA配列決定はABIプリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット及び373自動化蛍光DNA配列決定器（PEアプライド・バイオシステムズ社）を用いて実施した。転写産物の5′末端及び3′末端はマラソンcDNAライブラリー（クローンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）のRACEにより決定した。
【０１２４】
タニス遺伝子発現の測定
各ｃＤＮＡ試料におけるタニス遺伝子発現のレベルは、ＡＢＩプリズム７７００配列検出器上でタックマンＰＣＲ技術を用いて定量した。β−アクチンは反応におけるｃＤＮＡ量を規格化するための内部基準として用いた。プライマーの配列は下記の通りである。タニス遺伝子の前向き，5'-gat gcg ttc aat gat gtc ttc ct-3'（＜４００＞２２)、タニス遺伝子の逆向き，5'-ga agc aaa ccc cat caa ctg t-3'（＜４００＞２３）、β−アクチンの前向き，5'-gca aag acc tgt atg cca aca c-3' （＜４００＞２４）、β−アクチンの逆向き，5'-gcc aga gca gtg atc tct ttc tg-3'（＜４００＞２５）。蛍光発生のプローブ配列はタニス遺伝子については 5'-cac atc agt aat cct cac tgg tgg gct ca-3'（＜４００＞２６）、β−アクチン遺伝子については 5'-tgc tgg cac cag act tgc cct c-3' （＜４００＞２７）であった。タニス及びβ−アクチンのプローブはそれぞれ5′末端に付着したレポーター色素のＦＡＭ及びＶＩＣを有し、両プローブは3′末端に付着した消光色素のＴＡＭＲＡを有していた。ＰＣＲの条件は５０℃で２分間及び９５℃で１０分間の後９５℃で１５分間及び６０℃で１分間の４０周期であった。
【０１２５】
細胞培養
タニス遺伝子の発現は三つの細胞系統で研究された。即ち、ＨｅｐＧ２肝細胞（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ）、Ｃ２Ｃ１２筋管（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（オーストラリア、パークビル、サイロのランス・マコーリー博士により供給された贈物）である。全細胞は普通の方法でダルベッコ改変イーグル培地（5-25 mmol/lのグルコース）、１０％の仔牛血清及び抗体（ライフ・テクノロジーズ社、メルボルン、オーストラリア）中で培養した。
【０１２６】
酵母−２ハイブリッド・スクリーニング
酵母−２ハイブリッド・スクリーニングはプロクエスト２ハイブリッド・システム（ライフ・テクノロジーズ社）を用いて実施した。タニスのコード配列を酵母ベクターのｐＤＢＬｅｕにクローニングし、電気穿孔によりＤＨ５α細胞に形質転換した。組換えクローンはベクターに特異的なプライマー（前向き5'-gaa taa gtg cga cat cat cat c-3' （＜４００＞２８）、逆向き5'-gta aat ttc tgg caa ggt aga c-3' （＜４００＞２９））を用いてＰＣＲにより検出した。一つの陽性クローンであるｐＤＢＢ５５９を、酵母−２ハイブリッド・スクリーニングで使用するために選択した。挿入物の配列はタニスのｃＤＮＡ配列と１００％相同であることを確認し、ｐＤＢＬｅｕのＧＡＬ４・ＤＮＡ結合ドメインとフレームを合わせてクローニングした。ｐＤＢＢ５５９を酵母株のＭａＶ２０３に形質転換し、形質転換体の基底ＨＩＳ３発現の抑制に必要な３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３ＡＴ）の量を種々の量の３ＡＴ（0-100 mmol/l)を含むプレート上での細胞増殖の滴定により決定した。ＭａＶ２０３細胞の増殖は１０ミリモル／ｌを越える３ＡＴの濃度で阻害された。従って、その後の酵母−２ハイブリッド・ライブラリー・スクリーニングで用いられた全てのプレートには、ＧＡＬ４ＤＢ−タニスにより誘導される基底ＨＩＳ３発現を抑制するために２５ミリモル／ｌの３ＡＴを含めた。ｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞は市販のｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いて大規模の形質転換用に特別に調製した。具体的には、プロクエスト・ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから収集した１８μｇのプラスミドＤＮＡをｐＤＢＢ５５９プラスミドを含むＭａＶ２０３細胞中に形質転換した。約６．０×１０5個の形質転換体を２５ミリモル／ｌの３ＡＴを含むがロイシン、トリプトファン及びヒスチジンを含まない選択培地上に播種した。ＨＩＳ３レポーター遺伝子を誘導する形質転換体は潜在的に相互作用するタンパク質を含むと予測され、更なる分析用に選択した。推定されたＨＩＳ陽性形質転換体を二つの他の関連レポーターであるＵＲＡ３及びｌａｃＺの誘導について試験した。ＨＩＳ＋として初期に同定された形質転換体のうち、４個のクローンもＵＲＡ３及びｌａｃＺの発現を誘導する点で陽性であることが見出された。これらの４クローンから単離されたプラスミドを次に標準的な方法を用いて配列決定した。
【０１２７】
組換えタニスタンパク質及び血清アミロイドＡタンパク質の発現及び精製
完全な１８９アミノ酸のタニスタンパク質をコードするｃＤＮＡ、タニスのＣＯＯＨ−末端（アミノ酸５４〜１８９、タニス−Ｃと呼ぶ）断片をコードする領域に対応するｃＤＮＡ、及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）１β（アミノ酸１９〜１２２）の成熟配列をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−５Ｘ−１発現ベクター（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、バッキンガムシャイア、英国）に連結した。該ＧＳＴ、ＧＳＴ−全長タニス、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、及びＧＳＴ−ＳＡＡタンパク質を大腸菌のＢ１２１株中で発現させ、グルタチオン・セファロース・ビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアフィニティー精製した。発現したタンパク質の質及び量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー・ブルー染色により確認した。該ＧＳＴ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、及びＧＳＴ−ＳＡＡは十分に発現し精製されたが、一方、ＧＳＴ−全長タニスは発現が弱く、精製してもごく少量のタンパク質しか回収されなかった。全ての実験で対照として役立ったＧＳＴタンパク質は組換えＧＳＴ融合タンパク質を含んでいた。
【０１２８】
表面プラズモン共鳴分析
実時間のタンパク質−タンパク質相互作用はバイアコアＡＢ社（アップサラ、スウェーデン）から購入したバイアコアＪ装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により検討した。この系は特異的な分子対の間の結合を検出する。この場合、一方（リガンド）はセンサーチップの表面に付着し、試料溶液中に存在する他方（検体）はその表面を通過する。全てのＳＰＲ実験でＨＢＳ緩衝液（１０ミリモル／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ミリモル／ｌのＮａＣｌ、３ミリモル／ｌのＥＤＴＡ、０．００５％のポリソルベート２０）をランニング緩衝液として用いた。ヒトの血漿（９５％純度）から精製されたＳＡＡはトレース・サイエンティフィック社（オーストラリア）から購入した。ＳＡＡ又はＧＳＴ−タニス−Ｃ又はＧＳＴ−ＳＡＡは供給された試薬（アミン・カップリング・キット、バイアコアＡＢ社）を用いてカルボジイミド化学によるアミン結合を介してセンサーチップ（ＣＭ５）に共有結合で固定した。前濃縮試験を実施し、ｐＨ４．０がリガンドをＣＭ５チップに結合させるのに最適であることを見出した。相互作用について試験するため、検体試料をランニング緩衝液中に希釈し（ＧＳＴ、ＧＳＴ−タニス、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、又はＧＳＴ−ＳＡＡ）、該センサーグラムが２共鳴単位（ＲＵ）より小さいノイズレベルをもつ安定な基線を示した場合にそれらをこの系に注入した。該チップは１０ミリモル／ｌのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の４分間の注入により使用中に再生した。
【０１２９】
統計分析
全てのデータは平均値±ＳＥとして表される。群間の比較はこの後の最小有意差試験を用いた分散分析により行なった。差異はＰ＜０．０５の場合に有意と考えた。
【０１３０】
(ii)結果
遺伝子を同定するためにディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲを用い、遺伝子の発現は給餌した対照と比べて絶食したＰ．オベサスの肝臓で増加した（図４Ａ）。このバンドを切り出し、配列決定して、公共データベースに明白な同族体は無く、新規なＰ．オベサスの遺伝子であることが明らかになった。この遺伝子は絶食を意味するヘブライ語である「タニス」と命名された。その後、幾つかの明らかに相同な配列がゲンバンクに提出された（例えば登録番号ＡＦ１５７３１７，ＡＦ３３５５４３）。ＲＡＣＥを用いて得られたＰ．オベサスの完全なタニスｍＲＮＡ配列は図４Ｂに示す。予測されるタニスのアミノ酸配列は、他種からの明らかに相同な遺伝子と整列させて、図４Ｃに示す。高レベルの同一性が種間で明白であり（表４）、重要な生理機能をもつ保存された遺伝子であることを示している。
【０１３１】
【表４】
タニスについてのＰ．オベサスのｍＲＮＡは１，１５５ヌクレオチドから成り、１８９アミノ酸のタンパク質をコードする。予測されるタニスタンパク質の配列分析は一つの膜貫通領域（アミノ酸２６〜４８）、ジロイシン・モチーフ、及びコイル状のコイル領域を示唆した。
【０１３３】
エクスパシー・ソフトウェア・ツール（http://www.expasy.ch）を用いた分析は、８個の可能なセリン・リン酸化部位、１個のスレオニン・リン酸化部位、３個の可能なＯ−グリコシル化部位、及び４個の可能なタンパク質キナーゼＣリン酸化部位を予測した。タニスはいずれの既知遺伝子ファミリーにも属さず、４４％のαへリックス、１７％の伸張シート、及び３９％のランダム・コイルの全体的構成を有すると予測された。
【０１３４】
Ｐ．オベサスのタニス遺伝子のゲノム構造はｇＤＮＡ及びｃＤＮＡの試料を直接配列決定することにより決定された、これを図４Ｄに示す。この遺伝子は７６から６６０までのヌクレオチドのサイズで並ぶ６個のエキソンから成る。エキソン６はＣＯＯＨ末端の２５アミノ酸及び3'非翻訳領域の５８５ヌクレオチドについてのコード配列を含む。ＡＤ−０１５として知られる対応するヒトの遺伝子は、遺伝子予測を用いたナショナル・センター・フォ・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＩＨ、ベテスダ、メリーランド州）でのゲノム配列の自動コンピュータ分析により導き出された。この配列を含むコンティグはｓｔＳＧ２６００５として同定された最も近いマーカーとともにＤ１５Ｓ１５７−ｑＴＥＬの間隔でヒトの染色体１５ｑ２６．３に局在した。マウス及びブタのシンテニーの染色体領域は４つの肥満に関連するＱＴＬ、即ち、Ｑｗ７（１９）、Ｂｗ６１（２０）、Ｐｆａｔ１（２１）、及びＳＳＣ７（２２）を含むことは興味深く、この領域の遺伝子は体脂肪の蓄積に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１３５】
肝臓のタニス遺伝子の発現はＰ．オベサスにおいて２４時間の絶食後２．２倍に増加した（Ｐ＜０．００１）。動物の下位群内では、絶食後のタニスの肝臓での遺伝子発現の増加は糖尿病の動物でのみ有意であった（３．１倍の増加、Ｐ＝０．０１０、図５）。無制限に給餌された動物では、肝臓でのタニス遺伝子の発現はそれらのｎＧＴの同腹子と比べてＩＧＴ（Ｐ＝０．０３９）及び２型糖尿病のＰ．オベサス（Ｐ＝０．０１５）の両方で減少した（図５）。その上、無制限に給餌されたＰ．オベサスにおけるタニスの発現と血中トリグリセリド濃度（ピアソンｒ＝０．５９３、Ｐ＝０．００７、図６）、並びに血中グルコース（スピアマンｒ＝−０．３７８、Ｐ＝０．０１０）とインスリン濃度（スピアマンｒ＝−０．４１６、Ｐ＝０．００４）に線形相関が観察された。絶食２４時間後の肝臓のタニス遺伝子の発現と血中グルコース（スピアマンｒ＝０．３９５、Ｐ＝０．０１０）及びインスリン濃度（ピアソンｒ＝０．３７４、Ｐ＝０．０１５）の変化との相関の証拠もあった。多重線形回帰分析は血中グルコース濃度の変化のみがタニス遺伝子の発現と独立して関連する（Ｐ＝０．００４）ことを示し、このことはこれら二つの変数の間の関係を示唆している。その上、食物エネルギーの制限が２週間継続した場合（通常の食物摂取の６７％で）、肝臓におけるタニス遺伝子の発現は無制限に給餌された対照動物に比べて２．２倍増加した（１．９１±０．２９対０．８７±０．０８任意単位、Ｐ＝０．００６）。
【０１３６】
インビボで得られた結果に従って、細胞培養実験はＨｅｐＧ２肝細胞におけるタニス遺伝子の発現が培地中のグルコース濃度により極度に調節されることを示した（Ｐ＝０．００６、図７）。培地中のグルコース濃度の増加はタニス遺伝子の発現レベルで用量依存性の減少を惹起し、約９０％抑制の１２．５ミリモル／ｌのグルコースで最大効果が観察された。
【０１３７】
タックマンＰＣＲ 及びノーザン・ブロットの両方を用いて肝臓以外の組織でのタニス遺伝子の発現を試験した。タニス遺伝子の発現は視床下部、肝臓、骨格筋、脂肪組織、精巣、心臓及び腎臓を含む試験された全ての組織においてタックマンＰＣＲにより検出された。ノーザン・ブロッティングは肝臓、脂肪組織、視床下部、及び骨格筋を含む様々な組織で予期されたサイズ（１，１５５ヌクレオチド）の単一バンドを示した（図８）。
【０１３８】
肝臓以外の組織におけるタニス遺伝子の発現様相は、脂肪組織、筋又は視床下部におけるタニス遺伝子の発現に対する絶食の効果を示さなかった（データは示していない）。しかしながら、インビトロのタニス遺伝子の発現は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（図９）及びＣ２Ｃ１２筋細胞のグルコースにより用量依存的に抑制された（２５ミリモル／ｌグルコースで５０％抑制の最大効果、Ｐ＝０．００２）。タニス遺伝子の発現は３Ｔ３−Ｌ１細胞（図９）及びＣ２Ｃ１２細胞においてインスリンによっても減少した。
【０１３９】
タニスタンパク質の生理的役割をさらに調べるために、酵母−２ハイブリッド・スクリーニングを行って相互作用タンパク質を同定した。タニスをおとりとして用いて、ヒトの肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られた約６６万個の形質転換体をスクリーニングした。３個の異なるレポーター遺伝子の発現分析のそれぞれから、４クローンが陽性であることが確認され、それぞれが中程度の強度の相互作用を示すという証拠が得られた。これらのクローンの配列決定により、４個の内３個が急性期炎症応答タンパク質であるＳＡＡをコードすることが示された。酵母−２ハイブリッド・スクリーニングで同定された合計３個の陽性クローンの全ヌクレオチド配列はＳＡＡ１遺伝子の対立遺伝子であるヒトのＳＡＡ１βの既知配列（ゲンバンク登録番号ＣＡＡ３９９７４）と対合した。
【０１４０】
タニスとＳＡＡとの推定上の相互作用はＳＰＲ分析により確認した。表面に連結した４，７３７ＲＵのヒトの血漿ＳＡＡがその表面結合したＣＭ５センサーチップをＧＳＴ−全長タニスとの相互作用を試験するために最初に用いた。そのセンサーグラムはＧＳＴ−タニスとの結合現象を明らかにした。予測された膜貫通ドメインを含むＧＳＴ−全長タニスは満足な程度まで発現及び精製することが困難であった。従って、膜貫通領域を含まないタニスのＣＯＯＨ末端の１３６アミノ酸断片を発現させそして精製した。ＧＳＴ−タニス−Ｃタンパク質は満足なレベルで発現し精製された。ＳＰＲ結合分析において、ＧＳＴ−タニス−Ｃはヒトの血漿ＳＡＡと結合することを示し、それは濃度依存性であった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。相互作用はＧＳＴ−タニスがリガンドとしてセンサーチップに結合しＳＡＡが検体として通過する逆の状況においてさえ陽性であることを示した（図１０Ｃ）。
【０１４１】
ヒトの血漿から精製されたＳＡＡは循環血に存在するＳＡＡの全ての形態を含むらしい不均一試料である。均一試料との相互作用を検討するために、ＳＡＡ１βをＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製し、ＳＰＲ分析によりタニスと相互作用するその能力を証明した（図１０Ｄ）。
【実施例４】
【０１４２】
砂ラットの組織におけるタニスタンパク質のレベル
タニスは糖尿病／肥満の砂ラットにおけるその異なる発現によって発見されたが、健常動物では絶食中の肝臓及び脂肪において見られなかった（図１１Ａ）。タンパク質レベルでのこの異なる発現を確認し確立するため、タニスタンパク質を含む原形質膜及びミクロソームをＣ群の動物（糖尿病及び肥満）の肝臓及び脂肪から単離した。三匹の給餌動物及び三匹の絶食動物におけるタニスタンパク質のレベルを抗タニス−Ｃ抗体を用いたウェスタン・ブロットで比較した。肝臓において、絶食により、とりわけ原形質膜及びより少ない程度でミクロソームで該タンパク質レベルが増加した（図１２Ｂ）。これらのデータはタニスタンパク質が動物の絶食に応答することも証明している。しかしながら、タニスタンパク質のレベルに及ぼす絶食の効果は脂肪組織の原形質膜又はミクロソームのいずれにおいてもほとんど観察されなかった。この相違についての原因の一部はその遺伝子発現における高い変動性によるものであろう（図１２Ａ）。
【実施例５】
【０１４３】
肝細胞でのグルコースへの応答としてのタニスの発現
先に報告されたように、タニス遺伝子の発現は糖尿病／肥満の砂ラットにおける絶食により高レベル調節されたが、健常な砂ラットにおいては調節されなかった。２４時間の絶食中に糖尿病／肥満動物の血漿グルコース濃度は有意に減少するが、健常な動物では減少が無いので、可能な機構の一つは該遺伝子がグルコースにより調節されるというものである。
【０１４４】
この仮説をＨｅｐＧ２肝細胞で検討した。タニス遺伝子の発現は該細胞が低グルコースで処理された場合に５〜６倍に増加し、ウェスタン・ブロットにより明らかなようにタニスタンパク質が同時に増加した（図１３）。
【実施例６】
【０１４５】
Ｈ４ II Ｅ細胞におけるグリコーゲン代謝
(i)グリコーゲン含量
グリコーゲン含量はその合成及び分解の最終結果であり、様々な生理学的な刺激又は状態により影響される。タニスの発現が肝細胞において絶食中に増強されるという事実は、それがグリコーゲン代謝に関与しうることを示唆している。この仮説は組換えアデノウイルスを用いてタニスを過剰発現させた後にＨ４IIＥ細胞のグリコーゲン含量及びグリコーゲン合成を測定することにより検討した。二つの別々の実験データを図１４に提示する。非感染又はＧＦＰ感染した細胞のグリコーゲン含量はインスリン処理で増加した。しかしながら、タニスに感染した細胞のインスリンに対する応答はより小さかった。結果として、これらはインスリンでの刺激後に有意に少ないグリコーゲンを含んでいた。このことはタニスがグリコーゲン合成を刺激するインスリンの能力を損傷させることを示唆している。
【０１４６】
(ii)グリコーゲン合成
グリコーゲン合成実験は何度も反復した。三回の独立実験から得られたデータを本明細書に提示する。非感染細胞では、グリコーゲン合成は１００ｎＭのインスリン処理により約５０％増加した。しかしながら、より高濃度のインスリン（即ち１０００ｎＭ）は更なる増加を生じなかった。ＧＦＰ（対照）ウイルスを用いた感染はグリコーゲン合成にほとんど影響を及ぼさなかった。全三回の実験において、グリコーゲン合成はタニスの過剰発現により減少するようであった（図１５）。これらのデータはグリコーゲン含量のデータと一致しており、グリコーゲン含量の減少はその合成の低下によることを示唆している。これらを併せ考慮すると、該データはタニスが肝細胞におけるグリコーゲン合成の調節に一つの役割を有することを示唆している。
【０１４７】
当業者は、本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外のものへの変形及び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明はこのようなあらゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書中で言及した又は示した段階、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集合的に包含し、並びに任意の二つ以上の該段階若しくは特徴の任意の組合わせ又はあらゆる組合わせをも包含する。
【０１４８】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は陰性及び陽性の結合結果を示す典型的なセンサーグラムのグラフ表示である。
【図２】図２は全長ＧＳＴ−タニスとＣＮ５チップに結合した血清アミロイドＡとの相互作用を示すセンサーグラムのグラフ表示である。基準点１：基線、６分間５μＬのＧＳＴ全長タニスを注入（基線及び注入点）。２，４，６：注入中の共鳴の最大変化（最大ＲＵ）。３，５，７：６分間５μＬのＧＳＴ全長タニスの注入（注入点）。
【図３】図３はＧＳＴ−タニスのＣ末端がＣＮ５チップに結合したＳＡＡとのみ相互作用することを示すセンサーグラムのグラフ表示である。基準点１，８：チップの再生、ＳＡＡと相互作用する任意のタンパク質のストリッピング。２，４，６：タニスＣプラスタンパク質の注入。３，５，７：注入中の最大応答（相互作用）。
【図４】図４は、Ａは絶食状態のＰ．オベサスの肝臓において高レベル調節されたタニス遺伝子の発現を示すｄｄｌＰＣＲゲルのオートラジオグラフ（矢印はタニス遺伝子に相当するバンドの位置を示す）の画像である。ＢはＰ．オベサスのタニス遺伝子のヌクレオチド配列（＜４００＞１７）及びアミノ酸配列（＜４００＞１８）である。推定膜貫通配列には下線が引いてある。Ｃはヒト（ＡＤ−０１５）（＜４００＞２０）及びマウス（Ｈ４７）（＜４００＞２１）の対応遺伝子と整列させたＰ．オベサスのタニス遺伝子のアミノ酸配列（＜４００＞１９）である。ＤはＰ．オベサスのタニス遺伝子のゲノム構造である。
【図５】図５はＰ．オベサスにおける肝臓のタニス遺伝子発現のグラフ表示である。Ａは給餌状態のＩＧＴ及び２型糖尿病のＰ．オベサスの肝臓におけるタニス遺伝子の発現の減少。Ｂは給餌状態と比較した２４時間絶食後のＰ．オベサスの肝臓におけるタニス遺伝子の発現の倍増。＊ｎＧＴ群と有意に異なる（P<0.05）。＊＊給餌された糖尿病群と比較して有意な増加（P=0.010）。
【図６】図６はＰ．オベサスにおける肝臓のタニス遺伝子の発現と血中トリグリセリド濃度との線形相関のグラフ表示である（r=0.593、P=0.007）。
【図７】図７はＨｅｐＧ２肝細胞におけるタニス遺伝子の発現に及ぼすグルコース濃度の増加の影響についてのグラフ表示である。＊０ミリモル／ｌのグルコース濃度と有意に異なる（P<0.001）。
【図８】図８はＰ．オベサスにおけるタニスについてのノーザンブロットの画像である。レーン１，サイズ・マーカー、レーン２，脂肪組織、レーン３，視床下部、レーン４，肝臓、レーン５，骨格筋。矢印はタニス遺伝子の位置を示す。
【図９】図９は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるタニス遺伝子の発現に及ぼすグルコース濃度（上パネル）及びインスリン（下パネル）濃度の影響についてのグラフ表示である。＊０ミリモル／ｌのグルコース濃度と有意に異なる（P<0.001）。＊＊０ミリモル／ｌのインスリン濃度と有意に異なる（P=0.020）。
【図１０】図１０はＳＰＲ分析によるタニスとＳＡＡとの実時間相互作用についてのグラフ表示である。リガンド（Ａ及びＢ、ヒトの血漿ＳＡＡ；Ｃ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ；Ｄ、ＧＳＴ−ＳＡＡ）をＣＭ５センサーチップ上に固定し、結合緩衝液で希釈した被検体（Ａ、Ｂ及びＤ、ＧＳＴ−タニス−Ｃ、５μｇ；Ｃ、ヒトの血漿ＳＡＡ、５μｇ）を該チップ上に注いだ。ＳＰＲの変化はＲＵで示した。該試料は４分間（Ａ、Ｃ及びＤ）又は６分間（Ｂ）注入した。注入点は矢印で示す。ＧＳＴ対照タンパク質のみ（Ａ、Ｂ及びＤ）の注入は結合現象を生じなかった。
【図１１】図１１は砂ラットの肝臓（左）及び脂肪組織（右）の分画及びウェスタンブロットの画像である。これらの組織はミトコンドリア／核（Ｍ／Ｎ）、原形質膜（ＰＭ）、高比重ミクロソーム（ＨＤＭ）、低比重ミクロソーム（ＬＤＭ）及び可溶性（Ｓｏｌ）タンパク質に分画し、抗タニス−Ｃ抗体でプローブした。該分画手法は上清（Ｓ１）からＭ／Ｎ（Ｐ１）を沈殿させるために低速回転（2000gx15分間）でガラスのダウンサー(douncer)で該組織をホモジナイズする工程を含んだ。該Ｓ１は18,000gx15分間で回転させペレット（Ｐ２）及び上清Ｓ２を得た。Ｐ２ペレットは更にスクロース勾配クッションで精製しＰＭを得た。Ｓ２画分は続いて100,000gx70分間で回転させＨＤＭを得、200,000gでＬＤＭ画分を得た。最終回転後の上清は可溶性タンパク質と指定した。
【図１２】図１２は砂ラットにおける給餌及び絶食（２４時間）中のタニス遺伝子の発現（Ａ）及びタンパク質のレベル（Ｂ）の画像である。パネルＡの遺伝子発現データは先の「四半期報告書」で提示され、該タンパク質レベルとの比較のためだけに本明細書に含まれる。パネルＢにおいて、原形質膜及びミクロソーム（高比重及び低比重のミクロソーム両方を含む）は三匹の給餌又は絶食の糖尿病／肥満の砂ラットの肝臓及び脂肪から単離された。各動物のタニスタンパク質は抗タニスＣ抗体を用いたウェスタンブロットで視覚化した。
【図１３】図１３はＨｅｐＧ２細胞における低グルコースにより増強されるタニス遺伝子の発現レベル及びタンパク質レベルの表示である。細胞は。ＤＭＥＭ（25mMのグルコース）及び10％のＦＢＳで培養した。次いで該細胞を種々の濃度のグルコース(0.5mM-25mM)を含むＤＭＥＭで２４時間処理した。全ＲＮＡを該細胞から抽出し、タニスの転写産物を逆転写及び実時間ＰＣＲにより定量した。タニスタンパク質は抗タニス−Ｃ抗体を用いたウェスタンブロットで検出した。
【図１４】図１４はタニスを発現するＨ４IIＥ細胞におけるグリコーゲン含量についてのグラフ表示である。Ｈ４IIＥ細胞はタニス若しくはＧＦＰを発現するアデノウイルスで又はウイルス無しで感染させた。感染40時間後、細胞をインスリンで６時間処理し収集した。グリコーゲンをまずアミログルコシダーゼで消化することにより測定し、遊離したグルコースをヘキソキナーゼ及びＮＡＤＰの還元と連結させたグルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼにより酵素検定した。提示された値は１ウェルの細胞当たりの３４０ｎｍの吸光度であり、全ての処理において収集時にコンフルーエントに達した。
【図１５】図１５はＨ４IIＥ細胞におけるグリコーゲン合成を示すグラフ表示である。Ｈ４IIＥ細胞を６穴プレートで培養し、タニス若しくはＧＦＰを発現するアデノウイルスで感染させ又は感染させなかった。感染３０時間後、細胞をＤＭＥＭ（5.5mMのグルコース）中で一晩血清不足にさせた。次いで細胞を14Ｃグルコース（１μＣｉ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ（5.5mMのグルコース）中で３時間インキュベートし、３０％のＫＯＨで溶菌した。グリコーゲンはアセトンにより沈殿させ液体シンチレーションにより14Ｃを計数した。提示された値は１ウェルの細胞当たりのＤＰＭであり、細胞は全ての処理において収集時にコンフルーエントに達していた。
Claims (21)
- 被験体におけるアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法。
- 該相互作用の高レベル調節が該アポリポタンパク質の機能的活性を高レベル調節するものでありそして該相互作用の低レベル調節が該アポリポタンパク質の機能的活性を低レベル調節するものである、請求項１記載の方法。
- 該アポリポタンパク質が血清アミロイドＡである、請求項１又は請求項２記載の方法。
- 被験体におけるタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体の機能的活性を変化させる方法であって、アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該被験体に投与する工程を含む方法。
- 該相互作用の高レベル調節が該タニスの機能的活性を高レベル調節するものでありそして該相互作用の低レベル調節が該タニスの機能的活性を低レベル調節するものである、請求項４記載の方法。
- 該アポリポタンパク質が血清アミロイドＡである、請求項４又は請求項５記載の方法。
- 哺乳動物における異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、タニスと該アポリポタンパク質との相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法。
- 哺乳動物における異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられる状態を治療及び／又は予防する方法であって、アポリポタンパク質と該タニスとの相互作用を変化させるのに十分な時間及び条件の下で、ある物質の有効量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法。
- 該相互作用の高レベル調節が該アポリポタンパク質又はタニスが媒介する機能的活性を高レベル調節するものでありそして該相互作用の低レベル調節が該アポリポタンパク質又はタニスの機能的活性を低レベル調節するものである、請求項７又は請求項８記載の方法。
- 該アポリポタンパク質が血清アミロイドＡである、請求項７〜請求項９いずれか１項に記載の方法。
- 該状態がII型糖尿病、炎症、心臓血管病、移植拒絶、感染、サルコイドーシス、アルツハイマー病、腎症、腹部大動脈瘤又は肥満である、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
- 哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造におけるある物質の使用であって、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なアポリポタンパク質が媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとアポリポタンパク質との相互作用を変化させるものである使用。
- 該相互作用の高レベル調節が該アポリポタンパク質の機能的活性を高レベル調節するものでありそして該相互作用の低レベル調節が該アポリポタンパク質の機能的活性を低レベル調節するものである、請求項１２記載の使用。
- 該アポリポタンパク質が血清アミロイドＡである、請求項１２又は請求項１３記載の使用。
- 哺乳動物のある状態を治療するための医薬の製造におけるある物質の使用であって、該状態が異常な、望ましくない又は他の点で不適切なタニスが媒介する機能的活性により特徴付けられるものであり、該物質がタニスとアポリポタンパク質との相互作用を変化させるものである使用。
- 該相互作用の高レベル調節が該タニスの機能的活性を高レベル調節するものでありそして該相互作用の低レベル調節が該タニスの機能的活性を低レベル調節するものである、請求項１５記載の使用。
- 該アポリポタンパク質が血清アミロイドＡである、請求項１５又は請求項１６記載の使用。
- 一つ以上の薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤とともにある物質を含む医薬組成物であって、該物質がタニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体との相互作用を変化させるものであり、その変化がタニス及び／又はアポリポタンパク質の機能的活性を調節するものである、医薬組成物。
- 請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の方法に従って使用される場合に、タニス又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とアポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体との相互作用を変化させる物質。
- アポリポタンパク質又はその誘導体、同族体、類似体、化学的同等物若しくは擬似体とタニスとの相互作用を変化させることができる物質を検出する方法であって、該タニス及び該アポリポタンパク質を含むインビトロ系と該物質と推定されるものを接触させる工程、並びに該相互作用と関連する発現の表現型の変化を検出する工程を含む方法。
- 請求項２０の方法に従って同定された物質。
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