KR101350824B1 - 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 - Google Patents

리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101350824B1
KR101350824B1 KR1020110134885A KR20110134885A KR101350824B1 KR 101350824 B1 KR101350824 B1 KR 101350824B1 KR 1020110134885 A KR1020110134885 A KR 1020110134885A KR 20110134885 A KR20110134885 A KR 20110134885A KR 101350824 B1 KR101350824 B1 KR 101350824B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nal
lipid
lipase
library
peptide
Prior art date
Application number
KR1020110134885A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130067461A (ko
Inventor
유재훈
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020110134885A priority Critical patent/KR101350824B1/ko
Publication of KR20130067461A publication Critical patent/KR20130067461A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101350824B1 publication Critical patent/KR101350824B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/222—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having aromatic groups, e.g. dipivefrine, ibopamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/03—Organic compounds
    • A23L29/035—Organic compounds containing oxygen as heteroatom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/03—Organic compounds
    • A23L29/045—Organic compounds containing nitrogen as heteroatom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 리파아제에 대한 특이적 기질인 지질-펩타이드 라이브러리의 제작 및 이를 이용하여 합성한 리파아제에 대한 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강식품, 또는 식품첨가제에 에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 본 발명의 1세대, 2세대 및 3세대 지질-펩타이드 라이브러리는 특정 리파아제에 대해 특이적으로 결합하여 이를 저해하며, 이를 이용해 합성한 리파아제 저해제인 sp-X1X2, Butyl-sp-X1X2 ether 및 Heptyl-sp-X1X2 ether는 특정 리파아제를 저해하고, 높은 특이성을 유지함으로써, 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강식품, 또는 식품첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물{Composition for obesity and disorders of lipid metabolism associated disease containing selective lipase lipid―peptide substrate library and lipase inhibitors using it as an active ingredient}
본 발명은 지질-펩타이드 라이브러리를 이용한 리파아제에 대한 특이적 저해제 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 이용하여 췌장 리파아제에 특이적이고 강력한 결합력을 가진 라이브러리를 스크리닝한 후 이를 이용하여 췌장 리파아제에 대한 특이적 저해제를 합성하는 방법에 의해 합성된 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강식품, 또는 식품첨가제에 관한 것이다.
건강한 상태에서 지질 대사는 지질의 섭취와 소모 사이에서 균형을 유지하고 있으나, 선진국 사회로의 발전에 따른 고 에너지 식생활과 안락한 생활 습관으로 인한 에너지 대사의 균형을 잃게 되면 비만이 나타나게 된다. 비만은 체지방 및 체중 증가 그 자체의 문제뿐만 아니라, 고혈압, 당뇨병, 심혈관계 질환 등 만성질환을 유발하는 주요원인으로 부각되고 있으며, 비만 환자의 발병률 상승과 이로 인한 사망률이 급격한 증가 추세에 있다. 그러므로 지질대사의 조절은 이들 비만 및 이로 인한 질병의 예방 및 치료를 위해 매우 중요하다.
비만은 일반적으로 과체중 상태를 뜻하지만 엄밀한 의미로는 체내에 지방조직이 과다하게 축적되어 있는 상태를 말한다. 비만인 사람에게서 잘 나타나는 특징이 바로 내장 비만으로, 내장 지방이 많아지면 고지혈증, 고혈압, 당뇨병에 걸릴 확률이 높고, 그 다음 단계인 동맥경화증으로 발전한다. 또한, 비만인 사람은 요산을 원활하게 배출하지 못하기 때문에 요산 수치도 높아지며, 이로 인해 혈액 속에 요산의 양이 증가하면 관절에 요산이 쌓여 통증이 생기며, 내장 지방이 쌓이면 장에 분포하는 신경의 감각이 저하되어 장의 촉진 운동이 원활하게 이뤄지지 않기 때문에 변비에도 걸리기 쉽다. 비만도가 높을수록 당뇨병과 담석증, 고혈압, 심장질환 및 뇌졸중 등의 대사증후군 유병률이 증가하므로, 비만은 그 자체가 갖는 문제점뿐만 아니라, 심혈관계 질환이나 당뇨, 호흡기 질환, 골관절염 같은 질병을 유발할 수 있기 때문에 전 세계적으로 비만에 많은 관심이 모아지고 있으며(Antipatis V. J. et al., 2001, Obesity as a global problem. In International textbook of obesity. Per Bjorntorp, ed. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK. p3-22), 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에서는 비만을 세계적인 영양문제로 다루어 건강을 해치는 단순 위험인자가 아닌 치료해야 할 질병으로 인식하고 있다(World Health Organization. 1998. Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Report of WHO Consultation on Obesity, Geneva). 미국에서 행해진 역학조사결과에 의하면 1991년 비만과 관련된 질병에 의한 사망자가 280,000명이며, 이들의 약 80%가 BMI>30인 고도비만자이다. 이와 같이, 비만으로 인해 야기되는 경제적 부담과 인명적 손실이 막대하며 큰 사회적 문제가 되고 있다.
비만의 주요원인인 체지방을 감소시키거나 혈중 지질 농도를 개선하기 위한 바이오 식품의약 소재 및 제품과 관련하여 임상허가를 얻은 몇몇 의약품을 비롯하여 민간 처방 혹은 전통적 재료에 근거한 다양한 제품이 폭발적으로 시장에 나오고 있고, 국내 소기업부터 대기업에 이르기까지 다양한 시장전략을 구사하고 있는 상황은 전 세계 공통의 현상으로 건강 염려 내지 질환 예방에 대한 엄청난 수요를 반영하고 있으나, 항비만 약제로 개발된 대부분의 제품은 심각한 부작용을 동반하므로 판매가 금지된 것들도 상당수에 이르는 실정이다. 예를 들어, 아미노피린은 탁월한 체지방 분해효과에도 불구하고 정신신경계, 순환기계, 소화기계에 걸쳐 폭넓은 부작용이 보고된 바 있고, 펜프루라민, 텍스펜플루라민, 토피라메이, 에페드린, 갑상선호르몬제, 이뇨제, 설사제, 디곡신, 이소프로테레놀 등도 2002년 비만치료 부적합 약물로 판정되어 식품의약품안전청에 의해 판매가 금지되었다.
리파아제(EC 3.1.1.3)는 지방의 소화와 흡수에 관여하는 중요한 효소로 과도한 지방 섭취로 인한 지질 대사 이상과 관련된 질병(비만, 동맥 경화증, 고혈압, 당뇨)에 관여한다. 따라서 상업적으로 시판된 Orlistat(tetrahydrolipstatin(THL) analogues)을 비롯하여 자연에서 추출한 여러 저해제가 치료 목적으로 연구되고 있다. 하지만 이러한 물질들은 일반적으로 선택성이 부족하여 췌장 리파아제, 간 리파아제, 모노- 또는 다이아실 글리세롤 리파아제 등의 이소자임을 모두 저해한다는 단점이 있다. 심지어 THL은 리파아제와 효소 기작이 비슷한 간의 에스터레이즈(EC 3.1.1.1)까지 저해한다. 또한, 상기 약들은 복통, 장내 가스 저류, 지질성 대변, 간 손상 등의 부작용도 갖고 있으며, 약의 소수성 때문에 지용성 비타민의 흡수가 제한되어 심각한 지질성 비타민 결핍증을 야기하기도 한다. 따라서 이러한 부작용을 최소화하고 체계적인 영양 섭취를 위하여 효소 특이성을 가진 저해제 개발을 위한 노력이 필요하다.
이에 본 발명자들은 지질-펩타이드 라이브러리을 완성하고 이를 이용하여 다양한 이소자임에 대해 특이적인 저해효과를 가진 리파아제 저해제를 개발하여, 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관질환 및 동맥경화증에 보다 높은 예방 및 치료 효과를 가지는 지질-펩타이드 라이브러리, 리파아제 저해제 스크리닝 방법 및 이를 토대로 한 췌장 리파아제 특이적 저해제를 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 하기 화학식 1로 표시되는 리파아제 저해제를 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure 112011099538785-pat00001
여기에서, R은 C3 내지 C7의 탄소사슬 또는 C3 내지 C7의 알킬카보닐이고, X1, X2는 각각 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리파아제 저해제.
또한, 본 발명의 목적은, 하기 화학식 3으로 표시되는 지질-펩타이드 라이브러리를 제공하는 것이다:
[화학식 3]
Figure 112011099538785-pat00002
.
또한, 본 발명의 목적은, 지질 유도체와 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 결합하는 단계를 포함하는 지질-펩타이드 라이브러리 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 리파아제 특이적 기질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 예방용 건강식품을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은, 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 식품 산패 방지용 식품첨가제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 리파아제 저해제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112011099538785-pat00003
여기에서, R은 C3 내지 C7의 탄소사슬 또는 C3 내지 C7의 알킬카보닐이고, X1, X2는 각각 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리파아제 저해제.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 지질-펩타이드 라이브러리를 제공한다:
[화학식 3]
Figure 112011099538785-pat00004
.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질 유도체와 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 결합하는 단계를 포함하는 지질-펩타이드 라이브러리 제조 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리파아제 특이적 기질 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 예방용 건강식품을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 식품 산패 방지용 식품첨가제를 제공한다.
본 발명의 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 스크리닝하여 합성한 리파아제 저해제들은 특정 종 기원 리파아제를 특이적으로 저해함을 확인함으로써, 이를 통해 개발된 기존의 리파아제 저해제에 비해 부작용이 적은 췌장 리파아제 특이적 저해제 및 라이브러리를 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강식품, 또는 식품첨가제의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 지질-펩타이드 라이브러리를 합성하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 2는 네 가지 다른 기원의 리파아제인 TLL, CVL, HPL 및 PPL에 대한 1세대 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과를 효소 반응 생성물로 보여주는 그림이다;
no enzyme: 리파아제를 넣지 않은 음성 대조군;
substrate only: 지질-펩타이드 라이브러리를 첨가하지 않고 기질인 p-nitrophenyl butyrate만을 넣은 양성 대조군;
TLL: Thermomyces lanuginosus lpiase;
CVL: Chromobacterium viscosum lipase;
HPL: Human pancreatic lipase; 및
PPL: Porcine pancreatic lipase.
도 3은 지질-펩타이드 라이브러리의 펩타이드 부위인 sp-X1X2를 합성하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 4는 리파아제 저해제인 sp-X1X2에 소수성 사슬을 에테르 결합으로 연결하여 Butyl-sp-X1X2 ether, Heptyl-sp-X1X2 ether의 리파아제 저해제를 합성하는 과정을 나타낸 도식이다.
도 5는 sp-X1X2의 리파아제 저해 효과를 Dixon plot으로 확인한 그래프이다.
도 6은 Butyl-sp-X1X2 ether의 리파아제 저해 효과를 Dixon plot으로 확인한 그래프이다.
도 7은 Heptyl-sp-X1X2 ether의 리파아제 저해 효과를 Dixon plot으로 확인한 그래프이다.
도 8은 네 가지 다른 기원의 리파아제인 TLL, CVL, HPL 및 PPL에 대한 2세대 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과를 효소 반응 생성물로 보여주는 그림이다;
no enzyme: 리파아제를 넣지 않은 음성 대조군;
substrate only: 지질-펩타이드 라이브러리를 첨가하지 않고 기질인 p-nitrophenyl butyrate만을 넣은 양성 대조군;
TLL: Thermomyces lanuginosus lpiase;
CVL: Chromobacterium viscosum lipase;
HPL: Human pancreatic lipase; 및
PPL: Porcine pancreatic lipase.
도 9는 네 가지 다른 기원의 리파아제인 TLL, CVL, HPL 및 PPL에 대한 2세대 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과를 효소 반응 생성물로 보여주는 그림이다;
no enzyme: 리파아제를 넣지 않은 음성 대조군;
substrate only: 지질-펩타이드 라이브러리를 첨가하지 않고 기질인 p-nitrophenyl butyrate만을 넣은 양성 대조군;
TLL: Thermomyces lanuginosus lpiase;
CVL: Chromobacterium viscosum lipase;
HPL: Human pancreatic lipase; 및
PPL: Porcine pancreatic lipase.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 리파아제 저해제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112011099538785-pat00005
여기에서, R은 C3 내지 C7의 탄소사슬 또는 C3 내지 C7의 알킬카보닐이고, X1, X2는 각각 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리파아제 저해제.
상기 R은 OH인 것을 특징으로 하는 하기 화학식 2로 표시되는 리파아제 저해제인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 2]
Figure 112011099538785-pat00006
.
상기 X1 및 X2는: FF; FW; FY; WF; WW; WY; YF; YW; YY; Nal1Nal1; Nal1Nal2; Nal2Nal1; Nal2Nal2; FNal2; WNAl2; YNal2; Nal2F; Nal2W; Nal2Y; HH; HK; HR; KH; KK; KR; RH; RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 선별된 1세대 기질 라이브러리의 효소 반응 생성물 즉, 펩타이드 부위인 sp-FF를 합성하여 리파아제(CVL) 저해 효과를 확인하였다(도 3 참조). 그 결과, sp-FF는 37 μM의 저해 상수(K i )를 갖는 보통 수준의 저해 효과를 보였으며(도 5 참조), 식별 상수 DR 값이 160 이상으로 해당 리파아제에서만 작용하는 선택성을 보였다(표 11 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 라이브러리의 지질-펩타이드가 리파아제를 저해하는지 알아보기 위해 본 발명의 지질-펩타이드 라이브러리의 펩타이드 부위인 sp-FF에 소수성 사슬을 에테르 결합으로 연결한 두 번째 저해제(Butyl-sp-FF ether 및 Heptyl-sp-FF ether)를 합성하였다(도 4 참조). 합성한 두 가지 저해제의 리파아제 저해 효과를 확인한 결과, Butyl-sp-FF ether는 해당 리파아제(CVL)에 대해 sp-FF보다 20배 정도 높은 2.6 μM의 저해상수를 갖는 저해 효과를 보였으며(도 6 참조), 식별 상수 DR 값이 84로 다른 리파아제들에 대한 높은 특이성을 유지하였다(표 11 참조). sp-FF에 더 긴 소수성 사슬을 도입한 저해제 Heptyl-sp-FF ether는 효소에 대한 결합력은 증가한 0.37 μM의 저해상수를 가졌으나(도 7 참조), 식별 상수 DR 값이 140으로 이소자임에 대한 특이성은 감소하였다. 이를 통해, 저해제의 탄소 사슬 길이가 저해제의 결합력에 중요하다는 것을 알 수 있었으며, 합성한 리파아제 저해제인 sp-FF, Butyl-sp-FF ether 및 Heptyl-sp-FF ether는 해당 리파아제인 CVL에 대해 합당한 수준의 결합력을 갖는 동시에 상용화된 저해제인 Orlistat보다 20배 이상 향상된 우수한 효소 특이성을 갖고 있음을 확인하였다(표 11 참조).
또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 지질-펩타이드 라이브러리를 제공한다:
[화학식 3]
Figure 112011099538785-pat00007
.
상기 X1, X2는: 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 X1 및 X2는: FF; FW; FY; WF; WW; WY; YF; YW; YY; Nal1Nal1; Nal1Nal2; Nal2Nal1; Nal2Nal2; FNal2; WNAl2; YNal2; Nal2F; Nal2W; Nal2Y; HH; HK; HR; KH; KK; KR; RH; RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 지질 유도체와 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 결합하는 단계를 포함하는 지질-펩타이드 라이브러리 제조 방법을 제공한다.
상기 아미노산은: 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 두 개 이상의 아미노산은: FF; FW; FY; WF; WW; WY; YF; YW; YY; Nal1Nal1; Nal1Nal2; Nal2Nal1; Nal2Nal2; FNal2; WNAl2; YNal2; Nal2F; Nal2W; Nal2Y; HH; HK; HR; KH; KK; KR; RH; RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 지질에 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 결합시킨 지질-펩타이드 결합체들로 구성된 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 라이브러리를 파라-나이트로페닐 부티레이트와 혼합한 혼합물을 표적 리파아제와 함께 배양하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 배양한 혼합물에서 가수분해 산물인 파라나이트로페놀의 양을 측정하여 가장 적게 소모된 지질-펩타이드 기질을 선별하는 단계를 포함하는 리파아제 특이적 기질 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 아미노산은: 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 아르지닌(Arg, R), 및 나프틸알라닌(Nal1, Nal2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 두 개 이상의 아미노산은: FF; FW; FY; WF; WW; WY; YF; YW; YY; Nal1Nal1; Nal1Nal2; Nal2Nal1; Nal2Nal2; FNal2; WNAl2; YNal2; Nal2F; Nal2W; Nal2Y; HH; HK; HR; KH; KK; KR; RH; RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 배양은 온도 30 ℃ 및 pH 7.2 내지 8.0인 조건에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 리파아제 기질의 소수성 상보 부위를 최소화하고 기질의 나머지 부위(펩타이드 부위)의 역할을 최대화하기 위하여, 리파아제의 일반적인 기질인 트리-아실글리세라이드 대신 그보다 짧은 모노-부틸 에스터를 주머니 모양 상보 부위로 사용하고, 리파아제의 소수성 부위를 인식하는 펩타이드 부위의 아미노산 종류를 달리 사용하여, 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 제작하였다(도 1 참조). 그 결과, 방향족 아미노산을 이용한 1세대, naphthylalanine을 이용한 2세대 및 염기성 아미노산을 이용한 3세대의 지질-펩타이드 기질 라이브러리가 제작되었다(표 1, 표 4 및 표 7 참조).
또한, 상기 1세대 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 이용하여, 네 가지 다른 기원의 리파아제인 테르모미세스 랑구이노수스 리파아제(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL), 크로모박테륨 비스코숨 리파아제(Chromobacterium viscosum lipase, CVL), 인간 췌장 리파아제(Human pancreatic lipase, HPL) 및 돼지 췌장 리파아제(Porcine pancreatic lipase, PPL)에 대한 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과를 효소 반응 생성물을 HPLC로 정량하여 스크리닝하였고(도 2 참조), 특정 기원 리파아제를 선택적으로 저해하는 1세대 라이브러리를 선별하여 효소 반응 속도론 분석을 수행하였다(도 2 참조). 그 결과, CVL를 1세대 지질-펩타이드 라이브러리의 Butyrate-sp-FF가 저해함을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 2세대의 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 이용하여, 네 가지 다른 기원의 리파아제인 테르모미세스 랑구이노수스 리파아제(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL), 크로모박테륨 비스코숨 리파아제(Chromobacterium viscosum lipase, CVL), 인간 췌장 리파아제(Human pancreatic lipase, HPL) 및 돼지 췌장 리파아제(Porcine pancreatic lipase, PPL)에 대한 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과를 효소 반응 생성물을 HPLC로 정량하여 스크리닝하였고, PPL을 2세대 지질-펩타이드 라이브러리의 Butyrate-sp-Nal2Nal2가, HPL을 2세대 지질-펩타이드 라이브러리의 Butyrate-sp-Nal2Nal2가 저해함을 확인하였다(도 8 및 도 9 참조)
이를 통해, 지질-펩타이드 라이브러리의 펩타이드 부위가 해당 효소의 상보적 부위에 잘 인식된다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 지질대사 관련 질환은 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관질환 및 동맥경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 예방용 건강식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 포함하는 식품 산패 방지용 식품첨가제를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 방향족 아미노산을 이용한 1세대, naphthylalanine을 이용한 2세대 및 염기성 아미노산을 이용한 3세대의 지질-펩타이드 기질 라이브러리가 제작하였으며, 이를 다른 기원의 리파아제에 대한 활성 저해 효과를 HPLC로 정량하여 스크리닝하였고, 특정 기원 리파아제를 선택적으로 저해하는 지질-펩타이드를 선별하여 이의 리파아제 저해능을 확인하였다. 그 결과, 특정 리파아제를 특정 지질-펩타이드 라이브러리가 저해함을 확인하였으며, 스크리닝하여 선별한 특정 지질-펩타이드 라이브러리를 이용해 합성한 리파아제 저해제의 특정 리파아제에 대한 저해 효과를 확인한 결과, 합당한 수준의 결합력을 갖는 동시에 상용화된 저해제인 Orlistat보다 20배 이상 향상된 우수한 효소 특이성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 및 건강식품으로 유용하게 사용할 수 있으며, 박테리아의 리파아제를 저해하여 식품 산패 방지용 식품첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 상기 리파아제 저해제 및 라이브러리를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 갈화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 갈화 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 1세대 지질- 펩타이드 라이브러리를 이용한 리파아제 저해제 합성
<1-1> 1세대 지질- 펩타이드 라이브러리( Butyrate - sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은 소수성 상보 부위를 최소화하여 나머지 부위의 역할을 최대화하기 위해 모노-부틸 에스테르(mono-butyl ester)를 상보 부위로 사용하여 지질-펩타이드 라이브러리를 제작하였다.
구체적으로, 지질-펩타이드 라이브러리의 합성을 위해 색 변화에 의해 쉽게 활성이 측정되는 기질인 파라-나이트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate)를 Pd/C 존재 하에 메탄올 용매에서 수소(H2) 기체와 교반하여 나이트로(nitro) 작용기를 환원시켜 아민(amine) 작용기로 만들었다. 이를, 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 아실 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 합성하였다(도 1). 이때, 기질인 라이브러리의 펩타이드 사슬이 효소의 소수성 부위와 상보적으로 작용을 할 수 있도록 세 개의 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr : 각각 F, W, Y로 표시) 중 2 개를 선택하여 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyrate-sp-X1X2)(화학식 1)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 30 내지 40%의 수율로 생성물인 1세대 지질-펩타이드 라이브러리들을 얻을 수 있었다(표 1).
Figure 112011099538785-pat00008
1세대 라이브러리 번호 및 이름
번호 이름
1 Butyrate-sp-FF
2 Butyrate-sp-FW
3 Butyrate-sp-FY
4 Butyrate-sp-WF
5 Butyrate-sp-WW
6 Butyrate-sp-WY
7 Butyrate-sp-YF
8 Butyrate-sp-YW
9 Butyrate-sp-YY
<1-2> 리파아제 저해제( sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은 지질-펩타이드 라이브러리의 리파아제에 의한 반응 생성물이 그 자체로 리파아제 저해제가 될 수 있는지 확인하기 위하여, 기질 라이브러리의 펩타이드 부위인 spacer-X1X2(sp-X1X2)를 합성하였다.
구체적으로, 4-아미노페놀(aminophenol)을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 dH2O:MeOH = 3:1 용매 상에서 SDS존재 하에 숙신산 무수물와 반응시켜 아민 자리에 숙신산 작용기를 도입하였다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 리파아제 저해제인 sp-X1X2를 합성하였다(도 3). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 리파아제 저해제의 펩타이드 사슬이 효소의 소수성 부위와 상보적으로 작용을 할 수 있도록 세 개의 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr : 각각 F, W, Y로 표시) 중 2 개를 선택하여 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 저해제인 sp-X1X2(화학식 2)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었으며 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제 sp-X1X2들을 얻을 수 있었다(표 2).
Figure 112011099538785-pat00009
1세대 저해제들
sp - X 1 X 2
sp-FF
sp-FW
sp-FY
sp-WF
sp-WW
sp-WY
sp-YF
sp-YW
sp-YY
<1-3> 리파아제 저해제( Butyl - sp - X 1 X 2 ether 및 Heptyl - sp - X 1 X 2 ether) 의 합성
본 발명자들은, 저해제의 탄소 사슬 길이가 저해제의 결합력에 중요한지 알아보기 위해, <실시예 1-2>의 sp-X1X2에 소수성 사슬을 에테르 결합으로 연결한 리파아제 저해제를 제조하였다.
구체적으로, 부틸 4-나이트로페닐 에테르와 헵틸 4-나이트로페닐 에테르를 각각 메탄올 용매에서 촉매량의 Pd/C 및 수소 가스와 교반하여 나이트로기를 아미노기로 환원시켰다. 생성된 아민을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켜 숙신산 유도체를 합성하였다. 그 후, 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 리파아제 저해제를 합성하였다(도 4). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 리파아제 저해제의 펩타이드 사슬이 효소의 소수성 부위와 상보적으로 작용을 할 수 있도록 세 개의 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr : 각각 F, W, Y로 표시) 중 2 개를 선택하여 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyl-sp-X1X2 및 Heptyl-sp-X1X2)(화학식 3 및 4)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제들을 얻을 수 있었다(표 3).
Figure 112011099538785-pat00010
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
Figure 112011099538785-pat00011
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
1세대 저해제들
Butyl - sp - X 1 X 2 ether Heptyl-sp-X 1 X 2 ether
Butyl-sp-FF ether Heptyl-sp-FF ether
Butyl-sp-FW ether Heptyl-sp-FW ether
Butyl-sp-FY ether Heptyl-sp-FY ether
Butyl-sp-WF ether Heptyl-sp-WF ether
Butyl-sp-WW ether Heptyl-sp-WW ether
Butyl-sp-WY ether Heptyl-sp-WY ether
Butyl-sp-YF ether Heptyl-sp-YF ether
Butyl-sp-YW ether Heptyl-sp-YW ether
Butyl-sp-YY ether Heptyl-sp-YY ether
< 실시예 2> 2세대 지질- 펩타이드 라이브러리를 이용한 리파아제 저해제 합성
<2-1> 2세대 지질- 펩타이드 라이브러리( Butyrate - sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은, 포유류의 리파아제인 HPL(Human pancreatic lipase) 및 PPL(Porcine pancreatic lipase)의 저해제 개발을 위해, 효소의 소수성 부위와 μ-μ 상호작용을 더 강하게 할 것으로 예상되는 나프탈알라닌(naphthylalanine, Nal1, Nal2)이 포함된 지질-펩타이드 라이브러리를 합성하였다.
구체적으로, 지질-펩타이드 라이브러리의 합성을 위해 색 변화에 의해 쉽게 활성이 측정되는 기질인 파라-나이트로페닐 부티레이트(p-nitrophenyl butyrate)를 Pd/C 존재 하에 메탄올 용매에서 수소(H2) 기체와 교반하여 나이트로(nitro) 작용기를 환원시켜 아민(amine) 작용기로 만들었다. 이를, 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 10 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 아실 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 합성하였다(도 1). 이때, 기질의 펩타이드 사슬은 효소의 소수성 부위와 μ-μ 상호작용을 더 강하게 할 것으로 예상되는 나프탈알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyrate-sp-X1X2)(화학식 1)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 2세대 지질-펩타이드 라이브러리들을 얻을 수 있었다(표 4).
[화학식 3]
Figure 112011099538785-pat00012
2세대 라이브러리 번호 및 이름
번호 이름
10 Butyrate-sp-Nal1Nal1
11 Butyrate-sp-Nal1Nal2
12 Butyrate-sp-Nal2Nal1
13 Butyrate-sp-Nal2Nal2
14 Butyrate-sp-FNal2
15 Butyrate-sp-WNal2
16 Butyrate-sp-YNal2
17 Butyrate-sp-Nal2F
18 Butyrate-sp-Nal2W
19 Butyrate-sp-Nal2Y
<2-2> 2세대 리파아제 저해제( sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은 2세대 지질-펩타이드 라이브러리와 리파아제의 반응 생성물이 그 자체로 리파아제 저해제가 될 수 있는지 확인하기 위하여, 기질 라이브러리의 펩타이드 부위인 sp-X1X2를 합성하였다.
구체적으로, 4-아미노페놀을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 dH2O:MeOH = 3:1 용매 상에서 SDS존재 하에 숙신산 무수물와 반응시켜 아민 자리에 숙신산 작용기를 도입하였다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 10 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 저해제인 sp-X1X2를 합성하였다(도 3). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 펩타이드 사슬을 효소의 소수성 부위와 μ-μ 상호작용을 더 강하게 할 것으로 예상되는 나프탈알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 저해제인 sp-X1X2(화학식 2)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었으며 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제 sp-X1X2들을 얻을 수 있었다(표 5).
[화학식 2]
Figure 112011099538785-pat00013
2세대 저해제들
sp - X 1 X 2
sp-Nal1Nal1
sp-Nal1Nal2
sp-Nal2Nal1
sp-Nal2Nal2
sp-FNal2
sp-WNal2
sp-YNal2
sp-Nal2F
sp-Nal2W
sp-Nal2Y
<2-3> 2세대 리파아제 저해제( Butyl - sp - X 1 X 2 ether 및 Heptyl - sp - X 1 X 2 ether )의 합성
본 발명자들은, 저해제의 탄소 사슬 길이가 저해제의 결합력에 중요한지 알아보기 위해, <실시예 2-2>의 sp-X1X2에 소수성 사슬을 에테르 결합으로 연결한 리파아제 저해제를 제조하였다.
구체적으로, 부틸 4-나이트로페닐 에테르와 헵틸 4-나이트로페닐 에테르를 각각 메탄올 용매에서 촉매량의 Pd/C 및 수소 가스와 교반하여 나이트로기를 아미노기로 환원시켰다. 생성된 아민을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켜 숙신산 유도체를 합성하였다. 그 후, 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 10 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 리파아제 저해제를 합성하였다(도 4). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 펩타이드 사슬을 효소의 소수성 부위와 μ-μ 상호작용을 더 강하게 할 것으로 예상되는 나프탈알라닌(Nal1, Nal2)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyl-sp-X1X2 및 Heptyl-sp-X1X2)(화학식 3 및 4)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제 Butyl-sp-X1X2 ether 및 Heptyl-sp-X1X2 ether들을 얻을 수 있었다(표 6).
[화학식 4]
Figure 112011099538785-pat00014
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
[화학식 5]
Figure 112011099538785-pat00015
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
2세대 저해제들
Butyl - sp - X 1 X 2 ether Heptyl - sp - X 1 X 2 ether
Butyl-sp-Nal1Nal1 ether Heptyl-sp-Nal1Nal1 ether
Butyl-sp-Nal1Nal2 ether Heptyl-sp-Nal1Nal2 ether
Butyl-sp-Nal2Nal1 ether Heptyl-sp-Nal2Nal1 ether
Butyl-sp-Nal2Nal2 ether Heptyl-sp-Nal2Nal2 ether
Butyl-sp-FNal2 ether Heptyl-sp-FNal2 ether
Butyl-sp-WNal2 ether Heptyl-sp-WNal2 ether
Butyl-sp-YNal2 ether Heptyl-sp-YNal2 ether
Butyl-sp-Nal2F ether Heptyl-sp-Nal2F ether
Butyl-sp-Nal2W ether Heptyl-sp-Nal2W ether
Butyl-sp-Nal2Y ether Heptyl-sp-Nal2Y ether
< 실시예 3> 3세대 지질- 펩타이드 라이브러리를 이용한 리파아제 저해제 합성
<3-1> 3세대 지질- 펩타이드 라이브러리( Butyrate - sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은, 방향족 아미노산 이외의 아미노산을 이용하여 라이브러리를 제작하기 위해, 염기성 아미노산(His, Lys, Arg : 각각 H, K, R 로 표시)을 이용하여 3세대 지질-펩타이드 라이브러리를 합성하였다.
구체적으로, 지질-펩타이드 라이브러리의 합성을 위해 색 변화에 의해 쉽게 활성이 측정되는 기질인 파라-나이트로페닐 부티레이트를 Pd/C 존재 하에 메탄올 용매에서 수소(H2) 기체와 교반하여 나이트로(nitro) 작용기를 환원시켜 아민(amine) 작용기로 만들었다. 이를, 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 아실 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 지질-펩타이드 기질 라이브러리를 합성하였다(도 1). 이때, 기질의 펩타이드 사슬은 염기성 아미노산(His, Lys, Arg : 각각 H, K, R 로 표시)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyrate-sp-X1X2)(화학식 1)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 3세대 지질-펩타이드 라이브러리들을 얻을 수 있었다(표 7).
[화학식 3]
Figure 112011099538785-pat00016
3세대 라이브러리 번호 및 이름
번호 이름
20 Butyrate-sp-HH
21 Butyrate-sp-HK
22 Butyrate-sp-HR
23 Butyrate-sp-KH
24 Butyrate-sp-KK
25 Butyrate-sp-KR
26 Butyrate-sp-RH
27 Butyrate-sp-RK
28 Butyrate-sp-RR
<3-2> 3세대 리파아제 저해제( sp - X 1 X 2 )의 합성
본 발명자들은 3세대 지질-펩타이드 라이브러리와 리파아제의 반응 생성물이 그 자체로 리파아제 저해제가 될 수 있는지 확인하기 위하여, 기질 라이브러리의 펩타이드 부위인 sp-X1X2를 합성하였다.
구체적으로, 4-아미노페놀을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 dH2O:MeOH = 3:1 용매 상에서 SDS존재 하에 숙신산 무수물와 반응시켜 아민 자리에 숙신산 작용기를 도입하였다. 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 리파아제 저해제인 sp-X1X2를 합성하였다(도 3). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 펩타이드 사슬을 염기성 아미노산(His, Lys, Arg : 각각 H, K, R 로 표시)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 sp-X1X2(화학식 2)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었으며 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제 sp-X1X2들을 얻을 수 있었다(표 5).
[화학식 2]
Figure 112011099538785-pat00017
3세대 저해제들
sp - X 1 X 2
sp-HH
sp-HK
sp-HR
sp-KH
sp-KK
sp-KR
sp-RH
sp-RK
sp-RR
<3-3> 3세대 리파아제 저해제( Butyl - sp - X 1 X 2 ether 및 Heptyl - sp - X 1 X 2 ether )의 합성
본 발명자들은, 저해제의 탄소 사슬 길이가 저해제의 결합력에 중요한지 알아보기 위해, <실시예 3-2>의 sp-X1X2에 소수성 사슬을 에테르 결합으로 연결한 리파아제 저해제를 제조하였다.
구체적으로, 부틸 4-나이트로페닐 에테르와 헵틸 4-나이트로페닐 에테르를 각각 메탄올 용매에서 촉매량의 Pd/C 및 수소 가스와 교반하여 나이트로기를 아미노기로 환원시켰다. 생성된 아민을 고체상 펩타이드 합성에 필요한 숙신산(succinic acid) 작용기를 갖는 지질 유도체를 합성하기 위하여 숙신산 무수물(Succinic anhydride)과 DIPEA 존재 하에 DMF 용매에서 3시간 동안 반응시켜 숙신산 유도체를 합성하였다. 그 후, 이 유도체에 Fmoc-protected amino acid로 합성한 두 개의 아미노산으로 구성된 9 가지의 펩타이드를 고체상 펩타이드 합성 방법을 이용하여 지질 유도체와 아마이드 결합으로 연결시켜, 소수성 사슬 반대편에 펩타이드 부위를 갖는 리파아제 저해제를 합성하였다(도 4). 이때, 지질-펩타이드 라이브러리와 마찬가지로 펩타이드 사슬을 염기성 아미노산(His, Lys, Arg : 각각 H, K, R 로 표시)으로 구성하였다. 고체 지지체에서 떼어낸 지질-펩타이드(Butyl-sp-X1X2 및 Heptyl-sp-X1X2)(화학식 3 및 4)들은 역상(reverse-phase) HPLC로 분리되었다.
그 결과, 평균 30 내지 40%의 수율로 생성물인 리파아제 저해제들을 얻을 수 있었다(표 9).
[화학식 4]
Figure 112011099538785-pat00018
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
[화학식 5]
Figure 112011099538785-pat00019
상기 식에서, X1 및 X2는 아미노산 측쇄이다.
3세대 저해제들
Butyl - sp - X 1 X 2 ether Heptyl - sp - X 1 X 2 ether
Butyl-sp-HH ether Heptyl-sp-HH ether
Butyl-sp-HK ether Heptyl-sp-HK ether
Butyl-sp-HR ether Heptyl-sp-HR ether
Butyl-sp-KH ether Heptyl-sp-KH ether
Butyl-sp-KK ether Heptyl-sp-KK ether
Butyl-sp-KR ether Heptyl-sp-KR ether
Butyl-sp-RH ether Heptyl-sp-RH ether
Butyl-sp-RK ether Heptyl-sp-RK ether
Butyl-sp-RR ether Heptyl-sp-RR ether
< 실험예 1> 1세대 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과
<1-1> 1세대 지질- 펩타이드 라이브러리의 리파아제 저해 효과 스크리닝
본 발명자들은 네 가지 다른 기원의 리파아제인 테르모미세스 랑구이노수스 리파아제(Thermomyces lanuginosus lpiase, TLL), 크로모박테륨 비스코숨 리파아제(Chromobacterium viscosum lipase, CVL), 인간 췌장 리파아제(Human pancreatic lipase, HPL) 및 돼지 췌장 리파아제(Porcine pancreatic lipase, PPL)에 대한 1세대 지질-펩타이드 라이브러리의 효소 활성 저해 효과를 알아보고자 하였다.
구체적으로, 0.1 mM의 발색(chromogenic) 기질 파라-나이트로페닐 부티레이트와 합성된 각각의 지질-펩타이드 라이브러리 0.1 mM 씩을 섞은 기질을 준비하고, 효소의 활성을 위한 최적 pH 조건인 pH 7.2 내지 8.0(20 mM Tris buffer CVL: pH 7.7 HPL, PPL, TLL: pH 8.0)에서 배양하면서 효소 반응으로 생성되는 생성물인 파라-나이트로페닐의 양을 HPLC로 정량하였다(Agilent HPLC(Agilent 1100 series), 정지상: Zorbax C18(3.5 μm, 4.6 x 150 mm) 컬럼, 이동상: 0.1% TFA in acetonitrile: 0.1% TFA in water=3:7, 320 nm 파장에서 검출).
그 결과, 1세대 지질-펩타이드 라이브러리를 첨가한 시료들이 그렇지 않은 시료보다 생성물(p-nitrophenol)의 생성이 감소하였으며, TLL, HPL, PPL에 비해 CVL이 지질-펩타이드에 의한 활성 저해 효과가 가장 컸다. CVL은 Butyrate-sp-FF에 의해 가장 활성이 저해되었으며, TLL, HPL, PPL은 각각 Butyrate-sp-FW, Butyrate-sp-FY, Butyrate-sp-YF에 의해 활성이 가장 많이 저해되었다(도 2).
<1-2> 1세대 지질- 펩타이드 라이브러리의 효소-반응 속도론 분석( CVL 및 Butyrate - sp - FF )
본 발명자들은 <실험예 1-1>에서 효소 활성이 가장 많이 감소하고 가장 큰 선택성을 보인 CVL와 선별된 1세대 라이브러리 Butyrate-sp-FF의 결합력을 알아보기 위해 효소 반응 속도론에 기초하여 Butyrate-sp-FF와 파라-나이트로페닐 부티레이트의 K m 값을 구하고 비교하였다.
구체적으로, 파라-나이트로페닐 부티레이트의 K m 값을 구하기 위하여 파라-나이트로페닐 부티레이트의 농도를 다르게 한 7개의 시료(0, 2.5/10 mM, 2.5/7 mM. 2.5/5 mM. 2.5/3 mM. 2.5/2 mM 2.5 mM)를 30 ℃ pH 8.0에서 CVL과 배양하며 생성물의 양을 정량하였으며, K m 값은 Lineweave - Burk plot을 통하여 계산하였다. 또한, Butyrate-sp-FF의 K m 값을 구하기 위하여 파라-나이트로페닐 부티레이트의 농도를 다르게 한 7개의 시료(0. 0.025/10 mM, 0.025/7 mM. 0.025/5 mM, 0.025/3 mM, 0.025/2 mM. 0.025 mM)를 30 ℃ pH 8.0에서 CVL과 배양하며 생성물의 양을 정량하였고 K m 값은 Lineweave - Burk plot을 통하여 계산하였다.
그 결과, Butyrate-sp-FF의 K m 값이 펩타이드 부위가 없는 기질인 파라-나이트로페닐-부티레이트의 K m 값보다 약 20배 향상되었다(표 10). 이를 통해, Butyrate-sp-FF의 펩타이드 부위가 해당 효소의 상보적 부위에 잘 인식되는 것을 알 수 있었다.
CVL의 효소 반응 속도
선별된 기질 K m (mM) V max (μMs-1)
CVL
 파라-나이트로페닐 부티레이트 3.5 0.055
Butyrate-sp-FF 0.18 0.0021
약 20배 개선
<1-3> 1세대 리파아제 저해제( sp - FF , Butyl - sp - FF ether 및 Heptyl - sp - FF ether)의 리파아제 저해 효과
본 발명자들은 선별된 1세대 라이브러리 Butyrate-sp-FF를 이용해 <실시예 1-2> 및 <실시예 1-3>에서 합성한 리파아제 저해제인 sp-FF, Butyl-sp-FF ether 및 Heptyl-sp-FF ether의 CVL 저해 효과를 확인하기 위해, K i 값을 측정하였다.
구체적으로, sp-FF의 K i 를 측정하기 위하여 2가지 종류의 세트를 구성하였다. 한 세트는 0.1 mM의 파라-나이트로페닐 부티레이트와 5가지 농도(0, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM)의 저해제를 넣은 시료 5개로 구성하였고, 다른 한 세트는 0.5 mM의 파라-나이트로페닐 부티레이트와 5가지 농도(0, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM)의 저해제를 넣은 시료 5개로 구성하였다. 각 시료에 CVL을 넣고 배양하면서 생성물의 양을 HPLC로 정량하였으며, K i 값은 Dixon plot을 통해 계산되었다. Butyl-sp-FF ether와 Heptyl-sp-FF ehter의 경우, 첨가된 저해제의 양을 조절하여 sp-FF와 같은 방법으로 측정하였다(Butyl-sp-FF ether: 0, 2 μM, 4 μM, 6 μM, 8 μM, Heptyl-sp-FF: 0, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM ). 또한, 같은 방법으로 첨가된 저해제의 양을 조절하여 다른 리파아제에 대한 저해제의 K i 를 측정하였다(Butyl-sp-FF ether against PPL, HPL: 0, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, Heptyl-sp-FF ether against PPL, HPL:0, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM).
그 결과, 선별된 1세대 라이브러리 Butyrate-sp-FF의 리파아제 저해제 sp-FF, Butyl-sp-FF ether 및 Heptyl-sp-FF ether는 해당 리파아제(CVL)를 유의적으로 저해하였으며(도 5, 도 6 및 도 7), 특히, Butyl-sp-FF ether는 해당 리파아제에 대해 sp-FF보다 20배 정도 높은 저해능을 보이면서(K i =2.6 mM, 도 6), 다른 리파아제들에 대한 높은 특이성 또한 유지하였다(DR=230). 또한, sp-FF에 더 긴 소수성 사슬을 도입한 저해제(Heptyl-sp-FF ether)는 효소에 대한 결합력은 증가했으나(K i =0.37 mM, 도 7) 이소자임에 대한 특이성은 감소하여(DR=140), 저해제의 탄소 사슬 길이가 저해제의 결합력 및 이소자임에 대한 특이성에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 아울러, PPL, HPL, TLL에 대한 sp-FF의 저해능은 저해제를 5 mM이상 첨가하여도 저해 효과가 보이지 않아 NC로 표시하였으며, Butyl-sp-FF ether와 Heptyl-sp-FF ether의 TLL에 대한 저해능 역시 저해제를 5 mM이상 첨가하여도 저해 효과가 보이지 않아 NC로 표시하였다.
따라서, 선별된 리파아제 저해제(sp-FF, Butyl-sp-FF ether 및 Heptyl-sp-FF ether)는 CVL에 대해 합당한 수준의 결합력을 갖는 동시에 상용화된 저해제인 Orlistat보다 20배 향상된 우수한 효소 특이성을 갖고 있음을 확인하였다(표 11).
리파아제 저해제의 K i 와 DR 값
리파아제 K i (μM)
sp-FF Butyl-sp-FF ether Heptyl-sp-FF ether Orlistat
CVL 37 2.6 0.37 2.5 x 10-6
TLL NCa NC NC 9.3 x 10-6
PPL NC 230 39 4.9 x 10-6
HPL NC 210 67 3.1 x 10-5
DRb >160 84 140 6
NCa(Not Calculated): 저해제를 5 mM 이상 첨가한 경우에도 활성 저해 효과가 관찰되지 않아 저해 상수를 측정할 수 없었다(K i >5ⅹ106 nM).
DRb (discrimination ratio) = Ki , averaged agains to the lipases / K i against CVL .
< 실험예 2> 2세대 라이브러리의 리파아제 활성 저해 효과 스크리닝
본 발명자들은 네 가지 다른 기원의 리파아제인 테르모미세스 랑구이노수스 리파아제(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL), 크로모박테륨 비스코숨 리파아제(Chromobacterium viscosum lipase, CVL), 인간 췌장 리파아제(Human pancreatic lipase, HPL) 및 돼지 췌장 리파아제(Porcine pancreatic lipase, PPL)에 대한 2세대 지질-펩타이드 라이브러리의 효소 활성 저해 효과를 알아보고자 하였다.
구체적으로, 0.1 mM의 발색(chromogenic) 기질 파라-나이트로페닐 부티레이트와 합성된 각각의 2세대 지질-펩타이드 라이브러리 0.1 mM 씩을 섞은 기질을 준비하고, 효소의 활성을 위한 최적 pH 조건(20 mM Tris buffer CVL: pH 7.7 HPL, PPL, TLL: pH 8.0)에서 배양하면서 효소 반응으로 생성되는 생성물인 파라-나이트로페닐의 양을 HPLC로 정량하였다(Agilent HPLC(Agilent 1100 series), 정지상: Zorbax C18(3.5 μm, 4.6 x 150 mm) 컬럼, 이동상: 0.1% TFA in acetonitrile: 0.1% TFA in water=1:1, 320 nm 파장에서 검출).
그 결과, TLL, CVL에 비해 포유류인 HPL, PPL이 2세대 지질-펩타이드에 의한 활성 저해 효과가 컸으며, PPL은 Butyrate-sp-Nal2Nal2에 의해, HPL은 Butyrate-sp-Nal2Nal2에 의해 활성이 가장 많이 저해되었다(도 8 및 도 9).

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 지질 유도체와 2개의 아미노산으로 구성된 펩타이드가 결합된 하기 화학식 3으로 표시되는 지질-펩타이드를 모두 포함하는 라이브러리:
    [화학식 3]
    Figure 112013072862014-pat00032

    (여기서, X1X2는 FF, FW, FY, WF, WW, WY, YF, YW, YY, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F, Nal2W, Nal2Y, HH, HK, HR, KH, KK, KR, RH, RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것).
  5. 제 4항에 있어서, 상기 라이브러리는 하기 화학식 2로 표시되는 지질-펩타이드를 추가적으로 포함하는 라이브러리:
    [화학식 2]
    Figure 112013072862014-pat00033

    (여기서, X1X2는 FF, FW, FY, WF, WW, WY, YF, YW, YY, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F, Nal2W, Nal2Y, HH, HK, HR, KH, KK, KR, RH, RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것).
  6. 제 4항에 있어서, 상기 라이브러리는 하기 화학식 4로 표시되는 지질-펩타이드를 추가적으로 포함하는 라이브러리:
    [화학식 4]
    Figure 112013072862014-pat00034

    (여기서, X1X2는 FF, FW, FY, WF, WW, WY, YF, YW, YY, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F, Nal2W, Nal2Y, HH, HK, HR, KH, KK, KR, RH, RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것).
  7. 제 4항에 있어서, 상기 라이브러리는 하기 화학식 5로 표시되는 지질-펩타이드를 추가적으로 포함하는 라이브러리:
    [화학식 5]
    Figure 112013072862014-pat00035

    (여기서, X1X2는 FF, FW, FY, WF, WW, WY, YF, YW, YY, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F, Nal2W, Nal2Y, HH, HK, HR, KH, KK, KR, RH, RK 및 RR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것).
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 1) 제 4항의 라이브러리를 준비하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 라이브러리를 파라-나이트로페닐 부티레이트와 혼합한 혼합물을 표적 리파아제와 함께 배양하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 배양한 혼합물에서 가수분해 산물인 파라나이트로페놀의 양을 측정하여 가장 적게 소모된 지질-펩타이드 기질을 선별하는 단계를 포함하는 리파아제 특이적 기질 스크리닝 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 10항에 있어서, 단계 2)의 배양은 온도 30 ℃ 및 pH 7.2 내지 8.0인 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 리파아제 특이적 기질 스크리닝 방법.
  14. 하기 화학식 1로 표기되는 리파아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관질환 및 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112013072862014-pat00036

    (여기서, R이
    Figure 112013072862014-pat00037
    일 때, X1X2는 FF, FW, WW, WY, YW, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F 및 Nal2W로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
    R이 H, 부틸(butyl)기 또는 헵틸(heptyl)기일 때, X1X2는 FF 임).
  15. 삭제
  16. 하기 화학식 1로 표기되는 리파아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간, 제2형 당뇨, 고지혈증, 심혈관질환 및 동맥경화로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 지질대사 이상 관련 질환의 예방용 건강식품:
    [화학식 1]
    Figure 112013072862014-pat00038

    (여기서, R이
    Figure 112013072862014-pat00039
    일 때, X1X2는 FF, FW, WW, WY, YW, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F 및 Nal2W로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
    R이 H, 부틸(butyl)기 또는 헵틸(heptyl)기일 때, X1X2는 FF 임).
  17. 하기 화학식 1로 표기되는 리파아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 식품 산패용 방지제:
    [화학식 1]
    Figure 112013072862014-pat00040

    (여기서, R이
    Figure 112013072862014-pat00041
    일 때, X1X2는 FF, FW, WW, WY, YW, Nal1Nal1, Nal1Nal2, Nal2Nal1, Nal2Nal2, FNal2, WNal2, YNal2, Nal2F 및 Nal2W로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
    R이 H, 부틸(butyl)기 또는 헵틸(heptyl)기일 때, X1X2는 FF 임).
KR1020110134885A 2011-12-14 2011-12-14 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물 KR101350824B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110134885A KR101350824B1 (ko) 2011-12-14 2011-12-14 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110134885A KR101350824B1 (ko) 2011-12-14 2011-12-14 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130067461A KR20130067461A (ko) 2013-06-24
KR101350824B1 true KR101350824B1 (ko) 2014-01-13

Family

ID=48863286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110134885A KR101350824B1 (ko) 2011-12-14 2011-12-14 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101350824B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070027747A (ko) * 2004-06-30 2007-03-09 콤비네이토릭스, 인코포레이티드 대사 질환의 치료 방법 및 시약
KR100857411B1 (ko) 2006-07-21 2008-09-08 한올제약주식회사 리파아제 저해제의 경구 투여용 방출조절 약학 제제 및이의 제조 방법
KR20090056796A (ko) * 2007-11-29 2009-06-03 한미약품 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
KR20100065951A (ko) * 2008-12-09 2010-06-17 서울대학교산학협력단 펩타이드―당 결합체를 이용한 당 가수분해 효소에 대한 특이적 저해제 및 이의 스크리닝 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070027747A (ko) * 2004-06-30 2007-03-09 콤비네이토릭스, 인코포레이티드 대사 질환의 치료 방법 및 시약
KR100857411B1 (ko) 2006-07-21 2008-09-08 한올제약주식회사 리파아제 저해제의 경구 투여용 방출조절 약학 제제 및이의 제조 방법
KR20090056796A (ko) * 2007-11-29 2009-06-03 한미약품 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
KR20100065951A (ko) * 2008-12-09 2010-06-17 서울대학교산학협력단 펩타이드―당 결합체를 이용한 당 가수분해 효소에 대한 특이적 저해제 및 이의 스크리닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130067461A (ko) 2013-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101115560B1 (ko) 생체내 비분해성 펩티드, 안지오텐신 변환효소 저해제, 의약 및 기능성 식품
ES2626792T3 (es) Agente para mejorar la resistencia a la insulina
Bränning et al. Malt in combination with Lactobacillus rhamnosus increases concentrations of butyric acid in the distal colon and serum in rats compared with other barley products but decreases viable counts of cecal bifidobacteria
JP5916387B2 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤
KR20120080580A (ko) 지방분해 촉진작용을 갖는 조성물
Pei et al. An ACE inhibitory peptide from Isochrysis zhanjiangensis exhibits antihypertensive effect via anti-inflammation and anti-apoptosis in HUVEC and hypertensive rats
WO2016084957A1 (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤
JP2021165290A (ja) α−グルコシダーゼに関連付けられる病的状態の予防及び／又は治療のための組成物
KR101350824B1 (ko) 리파아제 특이적 지질-펩타이드 기질 라이브러리 및 이를 이용한 리파아제 저해제를 유효성분으로 함유하는 비만 및 지질대사 이상 관련 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물
WO2013133032A1 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤
JP5307019B2 (ja) 骨吸収抑制剤、並びにこれを含有する飲料、食品及び医薬品
US11116822B2 (en) Method for treatment of liver steatosis or non-alcoholic fatty liver by using 2-monoacylglycerol cleaving enzyme
WO2016132483A1 (ja) ヒトキマーゼ阻害剤及びヒトキマーゼの活性が関与する疾患の予防治療用薬剤
JP5848428B2 (ja) 経口用医薬組成物および機能性食品
KR20120080164A (ko) 피부 거칠음 경감 경구 조성물
US20220330595A1 (en) Angiotensin-converting enzyme inhibitor, blood pressure-lowering agent, and beverages and food products
WO2007069716A1 (ja) 内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物
BRPI0612183A2 (pt) metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou seus sais, seus usos, métodos de tratamento, medicamento, suplemento alimentìcio, alimento, composições, processos de produção de isoleucina-treonina-prolina ou seu sal, de produção de metionina-alanina-prolina ou seu sal e de produção de metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina
JP5197087B2 (ja) 高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法
Aluko Cardiovascular benefits of food protein-derived bioactive peptides
JP2015021001A (ja) 納豆菌を用いたマコンブ発酵物の血圧上昇抑制剤
US9278117B2 (en) Composition and method for the safe and effective inhibition of pancreatic lipase in mammals
Litson Identifying peptides from oat protein with potential hypocholesterolemic and satiety effects
JP2009040696A (ja) 新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド
KR20180090979A (ko) 2-모노아실글리세롤 분해 효소를 포함하는 간지방증 또는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160224

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200102

Year of fee payment: 7