KR101310981B1 - 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의예방 및 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 괴각 추출물은 알레르기를 유발하는 Th2 사이토카인 및 호산구의 활성을 억제하며 호산구의 기관지 폐포로의 침윤을 억제하고 메타콜린에 의한 기도과민 반응을 억제하므로 알레르기 질환의 예방 또는 개선에 매우 유용하다.
알레르기, 괴각, 추출물
Description
도 1a는 본 발명의 괴각 추출물이 IL-5의 자극에 의한 Y16 세포주의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
#: 마우스 IL-5를 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
*: 괴각 추출물을 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
도 1b는 본 발명의 괴각 추출물이 IL-3의 자극에 의한 BAF/B03 세포주의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
#: 마우스 IL-3를 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
*: 괴각 추출물을 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01).
도 1c는 본 발명의 괴각 추출물이 GM-CSF의 자극에 의한 형질전환된 Y16 세 포주의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
#: 마우스 GM-CSF를 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
*: 괴각 추출물을 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
도 2는 본 발명의 괴각 추출물이 IL-5 자극에 의한 호산구의 LTC4 방출 정도에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
#: 사람 IL-5를 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
*: 괴각 추출물을 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
도 3은 난황 감작 알레르기 마우스 모델에서 본 발명의 괴각 추출물의 처리에 따른 기관지 폐포로의 호산구의 침윤 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
A: 정상 마우스
B: 난황 감작 알르레기 마우스 모델
C: 괴각 추출물을 처리한 난황 감작 알르레기 마우스 모델
도 4는 메타콜린을 투여한 난황 감작 알레르기 마우스 모델에서 괴각 추출물의 처리에 따른 기도 저항성 정도를 측정한 결과이다.
*: 괴각 추출물을 첨가하지 않은 경우와 비교시 유의적인 차이가 있음(p<0.01)
본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
알레르기 질환이란 외부 물질(알레르겐)에 대해 개체의 면역 기전이 보통보다도 과민한 반응을 나타낼 때 유발되는 질환을 말한다. 이와 같은 알레르기 질환은 기온, 습도 등의 기후변화, 풍토, 환경오염, 직업 등에 따라 발생빈도가 높은 면역성 질환이지만 아직까지 근본적인 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.
현재까지 개발되어 온 항알레르기 제제는 발작의 발단이 되는 염증 세포가 생산하는 화학 전달물질을 여러 레벨로 저해하는 것이 대부분이었다. 즉, 비만세포가 여러 종류의 알레르겐에 의해 탈과립되면 비만세포 내 과립에 저장되어 있던 히스타민, 헤파린 및 단백질 분해 효소 등의 화학 물질들을 유리되어 즉각적인 알레르기 반응 및 염증반응이 일어난다. 알레르기 질환의 증상을 완화시키는 치료제로는 거의 대부분이 상기와 같은 화학 물질을 저해하는 항히스타민제가 사용되고 있으며 심한 경우 스테로이드 제제가 병용 투여되고 있다. 그러나, 상기와 같은 합성 제품들은 완전한 치료를 기대할 수 없으며 장기간 사용시 그 효과가 떨어지고 전신성 부작용이 심하게 일어나는 단점이 있다.
한편, 최근에는 여러 연구 그룹에 의해 Th2 세포가 생산하는 사이토카인이 알레르기 발증의 열쇠로서 발견되었다(O' Garra, A. Immunity 8:275, 1998; Glimcher L. H. et al., Genes Dev. 14:1693, 2000; Murphy K. M. et al., Annul Rev. Immunol. 18:451, 2000). 이에 따라, 상기 Th2 사이토카인의 활성 억제를 표적으로 한 약물을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 셰링 플라우(Schering-Plough)사에서는 사람 IL-5의 단일 항체를 알레르기 치료제로 개발하기 위한 임상 시험을 실시하고 있고, 로슈(Roche)사에서는 IL-5를 저해하는 이소티아졸론(isothiazolone) 유도체를 합성하였으나 다른 단백질에 대한 비특이적 반응을 일으켜 의약품으로 개발하기에는 한계를 가지고 있다.
한편, 괴각(Sophorae Fructus)은 회화나무(학명: Sophora japonica Linne)의 열매를 말한다. 상기 회화나무는 콩과에 속하는 낙엽교목으로 한국, 일본 및 중국 등에 분포하며, 회화나무의 열매인 괴각은 혈당상승 작용 및 항균 작용이 알려져 있으며, 치질, 여성의 자궁 출혈, 요혈의 치료, 토혈, 각혈 및 탈항의 치료 등에 사용되어 왔다(김창민 외, 중약대사전 제1권, 도서출판 정담, 496∼509, 1998).
이에 본 발명자들은 알레르기 질환을 예방 및 개선할 수 있으며 부작용이 없는 새로운 조성물을 찾고자 연구하던 중 회화나무 열매인 괴각의 추출물이 Th2 사이토카인 및 호산구의 활성을 억제하며 호산구의 기관지 폐포로의 침윤을 억제하고 메타콜린에 의한 기도과민 반응을 억제하므로 알레르기 질환을 매우 효과적으로 예방 및 개선하는 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 괴각 추출물을 유효 성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 괴각 추출물을 유효 성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "괴각(Sophorae Fructus)"은 콩과식물인 회화나무의 열매를 말한다. 바람직하게는, 상기 괴각은 회화나무의 완숙한 열매를 말한다.
본 발명의 괴각 추출물의 제조를 위해 사용되는 괴각은 완숙된 열매로서 고유의 색태 및 향미를 가지며 이미·이취가 없는 것이 바람직하다.
본 발명의 괴각 추출물은 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 제조한 다음 상기 추출물에 효소를 처리하여 제조할 수 있다. 추출용매로는 예를 들어, 물, 에탄올 및 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알코올을 사용하여 추출할 수 있다. 상기 용매 추출법에 의해 추출물을 제조하는 경우에는 열수 추출, 초음파 추출 및 환류 추출 방법을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 괴각 추출물은 물을 용매로 이용하여 열수 추출방법에 의해 제조될 수 있다.
열수 추출시의 괴각과 물의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 괴각 분말에 물을 3배∼20배(중량기준)로 첨가할 수 있다 바람직하게는, 추출효율을 증가시키기 위해서 괴각 분말에 대하여 물을 5배∼10배(중량기준)로 첨가할 수 있다.
추출시 온도는 상압 하의 실온에서 수행하는 것이 바람직하며 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 1시간 내지 6시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.
추출에 사용되는 괴각은 수확한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연 건조하는 방법을 모두 사용할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 괴각 또는 그 건체를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 괴각 추출물은 괴각을 20∼40mesh의 크기로 분쇄한 다음 상기 괴각 분말에 음용수를 3배∼20배, 바람직하게는 5∼10배로 첨가하고 100∼130℃, 바람직하게는 120∼125℃에서 1시간∼3시간 동안 열수 추출한다. 상기 열수 추출액을 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 회수함으로써 괴각 추출물을 제조할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 수득한 괴각 추출물의 효소처리는 바람직하게는, 열수 추출액에 효소를 추출액 대비 0.01∼1%(v/v)를 처리하여 4∼24시간 동안 반응시킨 다음 농축한 후 동결건조하여 제조할 수 있다. 상기 효소로는 아밀라아제, 펙틴아제를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 괴각 추출물은 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지고 있다. 상기에서 "알레르기 질환"이란 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대해 신체 면역계가 과도한 반응을 일으켜서 유발되는 질환을 말한다. 상기 알레르기 질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나 알레르기성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 중이염, 아나필락틱 쇼 크(anaphylatic shock) 및 알레르기성 결막염 등이 포함될 수 있다. 상기 알레르기성 피부염으로는 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기 등이 포함될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 괴각 추출물의 알레르기 질환의 예방 또는 개선 효과는 본 발명자들에 의해 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통해 확인되었다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 괴각 추출물이 Th2 사이토카인인 IL-5, IL-3 및 GM-CSF의 활성을 억제하는지 여부를 조사하였다(실시예 3-1 참조). 실험 결과, 본 발명에 따른 괴각 추출물은 IL-5, IL-3 및 GM-CSF의 활성을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 1a∼도 1c 참조).
상기 IL-5, IL-3 및 GM-CSF는 Th2 세포가 알레르겐에 노출되었을 때 방출되는 사이토카인으로서 알레르기 질환을 유발한다. 보다 구체적으로, 상기 IL-5는 골수세포가 호산구로 분화되는 것을 촉진하며, 호산구와 혈관 내피세포간의 부착을 증가시켜 호산구를 표적 장기로 이동하는 것을 촉진하며 호산구의 세포사멸을 억제하고 호산구를 활성화시킨다. 활성화된 호산구에서는 MBP(major basic protein) 및 ECP(eosinophil cationic protein)와 같은 독성 단백질이 방출되고 이들은 표적장기의 상피세포를 손상시킨다. 이로 인해 기관지 천식과 같은 알레르기 질환이 유발된다. 또한 IL-3는 비만세포로부터 히스타민 및 루코트리엔(leukotriene, LT)을 방출시켜 알레르기 반응을 유도한다. 한편, IL-5가 상술한 바와 같은 세포반응을 나타내기 위해서는 알파와 베타 사슬로 구성된 수용체에 결합하여야 한다. IL-5 수용체 베타-사슬은 IL-3 및 GM-CSF의 수용체 베타 사슬과 서로 동일하다. 따라서 상기 사이토카인들은 유사한 세포내 신호전이를 통해 생리활성을 나타내며 알레르기 질환을 유발한다.
따라서 본 발명의 괴각 추출물은 Th2 사이토카인을 억제함으로써 Th2 사이토카인의 활성화에 의해 유발되는 알레르기 질환을 효과적으로 억제할 수 있다. 예를 들어, 문헌에는 아토피 동물모델에서 IL-5 단일항체가 IL-5가 수용성 IL-5 수용체에 결합하는 것을 함으로써 호산구의 침윤과 활성화가 억제되어 항알레르기 효과가 나타남이 보고 된 바 있다(Devos, R. 1995). 따라서 본 발명의 괴각 추출물의 경우에도 IL-5의 활성을 억제함으로써 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환을 억제할 수 있다.
나아가, 본 발명자들은 본 발명의 괴각 추출물이 Th2 사이토카인의 활성을 억제하므로 상기 Th2 사이토카인에 의해 촉진되는 호산구의 활성화를 억제하는지 여부를 조사하였다. 호산구는 활성화되어 LTC4를 방출하는데, 상기 LTC4는 기관지를 강력하게 수축시키는 작용을 나타내는 물질로서 천식과 같은 호흡기 알레르기 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Chari, S. et al., Am J. Clin Dermatol, 2:1, 2001).
이에 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서 천식 환자로부터 호산구를 분 리하고 본 발명에 따른 괴각 추출물이 IL-5 자극에 의한 호산구의 LTC4 방출을 억제하는지 여부를 조사하였다(실시예 3-2 참조). 그 결과, 본 발명에 따른 괴각 추출물은 호산구의 LTC4 방출을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 2 참조).
따라서 본 발명자들은 본 발명의 괴각 추출물이 알레르기 질환을 유발하는 Th2 사이토카인의 활성을 억제하여 호산구의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 난황 감작 알레르기 동물 모델을 이용한 생체 내 실험을 통해 본 발명의 괴각 추출물이 알레르기 질환의 예방 또는 개선하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 난황 감작 알레르기 마우스 모델을 제조하고 본 발명의 괴각 추출물이 상기 마우스 모델에서 기관지 폐포로의 호산구의 침윤을 억제하는지 여부를 조사하였다(실시예 4-1 참조). 그 결과, 대조군의 경우 난황 감작으로 인해 기관지 폐포로 침윤된 호산구의 숫자가 감작되지 않은 마우스에 비해 현저히 증가한 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 괴각 추출물을 투여한 실험군의 경우에는 기관지 폐포로 침윤된 호산구의 숫자가 급격하게 감소된 것으로 나타났다(표 1 및 도 3 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 난황 감작 알레르기 마우스 모델에 메타콜린을 농도에 따라 순차적으로 흡입시킨 후 기도 과민성 정도를 측정하였다. 실험 결과, 본 발명에 따른 괴각 추출물은 난황 감작 알레르기 마우스에서 메타콜린에 의해 유도되는 기도저항 정도를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 괴각 추출물은 항알레르기 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명은 상기 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 괴각 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 괴각 추출물과 갱년기 질환의 개선 및 예방효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 괴각 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 괴각 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 괴각 추출물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 0.1∼50중량%를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 본 발명의 괴각 추출물을 0.5mg/kg/day∼5mg/kg/day의 양으로 섭취하는 경우 알레르기 질환을 예방 및 개선할 수 있는 효과가 나타날 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 활성성분으로서 괴각 추출물 이외에 화장품학 및/또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 함유함으로써 당업계에 공지된 방법에 따라 국소 적용에 적합한 모든 형태의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 겔, 고체, 에멀전, 현탁액, 마이크로에멀전, 마이크로캡슐, 미세과립구, 이온형 및/또는 비이온형 소낭 분산제, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 스틱의 형태로 제조될 수 있다.
상기 화장품학 및/또는 피부학적으로 허용가능한 부형제로는 피부 연화제, 유화제, 농후제 및 용매를 포함할 수 있다.
상기 피부 연화제는 피부의 연화, 진정, 코팅, 매끄럽게 하거나 또는 촉촉하게 하기 위해 사용한다. 본 발명에서 피부 연화제는 당업계에 공지된 모든 종류를 사용할 수 있으며 예를 들어, 석유 기제, 지방산 에스테르, 알킬 에톡실레이트, 지방산 에스테르 에톡실레이트, 지방 알코올, 폴리실록산 또는 이의 혼합물일 수 있다. 이외에 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 트리에틸렌 글리콜, 경 랍, 왁스, 지방산, 지방 알코올 에테르, 글리세라이드, 아세토글리세라이드, 에톡실화 글리세라이드, 폴리하이드록시 알코올의 다른 지방산 에스테르, 라놀린 및 이의 유도체와 같은 통상적인 피부 연화제를 포함한다.
유화제는 화장료 조성물의 수상과 유상이 혼합되도록 하는 역할을 한다. 본 발명에서 유화제는 1종 이상을 임의로 함유할 수 있으며 비이온성, 음이온성 또는 양이온성을 모두 포함할 수 있다. 상기 유화제의 종류는 에멀전의 형태가 유중수 분산형인지 수중유 분산형인지에 따라 결정할 수 있다. 적합한 유화제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 솔비탄 트리올레이트, 솔비탄 트리스테아레이트, 글리세롤 모노올레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 모노라우레이트, 솔비탄 세스퀴올레이트, 솔비탄 모노올레이트, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 스테알릴에테르, 폴리옥시에틸렌솔비톨 밀랍 유도체, PEG 200 디라우레이트, PEG 200 모노스테아레이트, PEG 400 디올레이트, 솔비칸 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트 등이 있다.
농후제는 가교된 카르복시폴리메틸렌 중합체, 에틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 트라칸트검, 카라야검, 산탄검, 벤토나이트, 히드록시에틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스를 포함한다.
용매로는 정제수, 알코올 또는 정제수와 알코올의 혼합물을 사용할 수 있다.
기타 임의로 사용할 수 있는 일반적인 화장품 첨가제의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 파라-히드록시벤조에이트 에스테르와 같은 보존제, 부틸 히드록시 톨루엔, 아스코르브산 및 그 유도체 및 토코페롤 및 그 유도체와 같은 항산화제, 글 리세롤, 솔비톨, 2-피롤리돈-5-카르복실레이트, 디부틸프탈레이트, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 습윤제, 아세테이트, 인산염, 시트르산염, 트리에탄올아민 및 카르보네이트와 같은 pH 완충제, 밀랍, 파라핀과 같은 왁스류, 증점제, 활성 증강제, 착색제 및 향료가 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 중 본 발명의 괴각 추출물의 바람직한 함유량으로는 화장료의 전체 중량에 대해 약 0.1∼50중량%를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 본 발명의 괴각 추출물을 0.1mg∼10mg의 양으로 피부 표면에 처리하는 경우 알레르기 질환을 예방 및 개선할 수 있는 효과가 나타날 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
괴각 추출물의 제조
괴각(제성 약업사, 경동시장내) 20kg을 건식 분쇄기를 이용하여 30mesh의 크기로 분쇄하였다. 상기 분쇄물에 음용수를 첨가하여 10배로 희석한 후(분쇄물:음용수=9:1) 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 그 후 50℃로 냉각시킨 다음 100mesh의 여과포를 사용하여 여과한 후 다시 200mesh 여과포로 여과하여 침전물을 제거하고 여과액을 수득하였다. 상기 상등액을 농축기를 이용하여 1/2의 부피가 되도록 농축하여 괴각 추출물을 제조하였다. 상기 괴각의 농축액에 0.5%(v/v)의 농도가 되도록 아밀라아제를 첨가하여 50℃에서 16시간 동안 효소반응을 수행하였다. 상기 반응액을 원심분리하여 침전물을 수득하고 상기 침전물을 에탄올로 1시간 추출하였다. 상기 추출물을 200mesh 여과포로 여과하여 침전물을 제거하고 수득한 여과액을 농축기를 이용하여 1/5의 부피가 되도록 농축함으로써 괴각의 효소분해 추출물을 제조하였다. 상기 효소분해 추출물을 분무건조기를 이용하여 분무건조함으로써 분말화하였다.
<실시예 2>
생체 외(
in vitro
) 실험을 통한 괴각 추출물의 알레르기 질환의 예방 및 치료효과 조사
<2-1> 괴각 추출물의 Th
2
사이토카인의 활성 억제 효과
본 발명에 따른 괴각의 효소분해 추출물이 알레르기 반응에 중요한 역할을 수행하는 Th2 사이토카인의 활성을 억제하는 효과가 있는지 조사하였다. Th2 사이토카인으로는 알레르기 질환을 유발하는 주원인으로 알려진 IL-5, IL-3, GM-CSF를 대상으로 하였다.
상기 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물의 IL-5, IL-3 및 GM-CSF의 활성 억제 효과는 Y16 세포주가 마우스 IL-5에 의존하여 증식하는 특성, BAF/BO3 세포주가 마우스 IL-3에 의존하여 증식하는 특성 및 GM-CSF 수용체 α-체인을 암호화하는 cDNA로 형질전환시킨 Y16 세포주가 마우스 GM-CSF에 의존하여 증식하는 특성을 사용하여 본 발명에 따른 괴각의 효소분해 추출물이 각 세포주의 증식을 억제하는지 여부를 측정함으로써 확인하였다.
즉, Y16 세포주(일본동경대 의과학연구소, Kiyoshi Takatsu 교수로부터 제공받음)를 96-웰 플레이트에 웰 당 1×105개 씩 분주하고 마우스 IL-5(씨그마-알드리치) 3U/ml와 상기 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물을 각각 1, 3, 10, 30㎍/ml의 농도로 함께 첨가하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 여기에 WST-1 발색시약을 첨가하고 Y16 세포주의 증식정도를 450nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 이때 음성 대조군에는 괴각의 효소분해 추출물을 첨가하지 않았다. 세포 증식 억제율은 IL-5만 처리한 군의 세포 증식도에 대한 IL-5와 괴각의 효소분해 추출물을 처리한 군의 세포 증식도의 감소정도를 백분율로 나타내었다.
또한, BAF/BO3 세포주(일본 오사카 의대, Toshio Hirano 교수로부터 제공받음)를 96-웰 플레이트에 웰 당 2×105개씩 분주하고 마우스 IL-3(씨그마-알드리치) 10U/ml와 상기 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물을 각각 1, 3, 10, 30㎍/ml의 농도로 함께 첨가하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 이때, 음성 대조군에는 괴각의 효소 분해 추출물을 첨가하지 않았다. 세포 증식 억제율은 IL-3만 처리한 군의 세포 증식도에 대한 IL-3와 괴각의 효소분해 추출물을 처리한 군의 세포 증식도의 감소 정도를 백분율로 나타내었다.
GM-CSF 수용체 α-사슬을 암호화하는 cDNA로 형질전환된 Y16 세포주(일본 동경대 의과학연구소, Kiyoshi Takatsu 교수로부터 제공받음)를 96-웰 플레이트에 웰 당 5×105개씩 분주하고 마우스 GM-CSF 2.5U/ml와 상기 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물을 각각 1, 3, 10, 30㎍/ml의 농도로 함께 첨가하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 이때, 음성 대조군에는 괴각의 효소분해 추출물을 첨가하지 않았다. 세포 증식 억제율은 GM-CSF만 처리한 군의 세포 증식도에 대한 GM-CSF와 괴각의 효소분해 추출물을 처리한 군의 세포 증식도의 감소 정도를 백분율로 나타내었다.
상기 실험은 독립적으로 5회 반복하였으며, 측정된 결과는 평균±표준편차로 나타냈고 유의적 차이는 던넷(Dunnet) 검정방법으로 검증하였다.
실험 결과, IL-5의 처리에 의해 Y16 세포주의 증식은 증가되었으며 이러한 Y16 세포주의 증식은 괴각의 효소분해 추출물에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 즉, 괴각의 효소분해 추출물을 1㎍/ml 첨가한 경우에는 세포 증식 억제율이 21%로 나타났고 3㎍/ml를 첨가한 경우에는 53%, 10㎍/ml를 첨가한 경우에는 72%, 30㎍/ml 를 첨가한 경우에는 87%의 증식 억제율을 나타냈다. 50%의 증식 억제 효과를 나타내는 농도(ED50)는 2.8㎍/ml였다(도 1a).
또한, IL-3의 처리에 의해 BAF/B03 세포주의 증식은 증가되었으며, 이러한 BAF/BO3 세포주의 증식은 괴각의 효소분해 추출물에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 즉, 괴각의 효소분해 추출물을 1㎍/ml로 첨가한 경우에는 세포 증식 억제율이 15%로 나타났고, 3㎍/ml를 첨가한 경우에는 46%, 10㎍/ml를 첨가한 경우에는 74%, 30㎍/ml를 첨가한 경우에는 85%로 나타났다. ED50 값은 4.1㎍/ml였다(도 1b).
또한, GM-CSF에 의해 GM-CSF 수용체 α-사슬을 암호화하는 cDNA로 형질전환된 세포주의 증식은 증가되었으며 이러한 형질전환 세포주의 증식은 괴각의 효소분해 추출물에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 즉, 괴각의 효소분해 추출물을 1㎍/ml의 농도로 첨가한 경우 세포 증식 억제율은 16%로 나타났고, 3㎍/ml를 첨가한 경우에는 32%, 10㎍/ml를 첨가한 경우에는 57%, 30㎍/ml를 첨가한 경우에는 76%로 나타났다. ED50값은 8.3㎍/ml로 나타났다(도 1c).
따라서 본 발명의 괴각 추출물은 Th2 사이토카인의 활성을 억제함을 알 수 있었다.
<2-2> 괴각 추출물의 호산구 활성 억제 효과
본 발명에 따른 괴각의 효소분해 추출물이 알레르기 질환을 앓고 있는 환자로부터 분리한 호산구의 활성을 억제하는 효과가 있는지를 조사하였다. 호산구의 활성 억제 정도는 IL-5 자극에 의해 방출되는 LTC4의 양의 감소정도를 측정함으로써 분석하였다. 상기 LTC4는 활성화된 호산구에 의해 분비되는 루코트리엔의 일종으로 염증반응의 매개자이다.
이를 위해 먼저, 천식으로 진단받은 환자의 혈액으로부터 CD16 항체를 이용한 음성 면역침강법으로 호산구를 분리하였다. 상기에서 천식환자로부터 분리한 호산구를 6-웰 플레이트에 웰 당 1×106개씩 분주하고 인간 IL-5(씨그마 알드리치) 10U/ml와 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물을 각각 1, 3, 10, 30㎍/ml의 농도로 함께 첨가한 다음 2시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 원심분리하여 상징액을 수득하였다. 상기 상징액에 존재하는 LTC4의 양을 ELISA로 측정하였다. LTC4의 방출 억제율은 IL-5만 처리한 군의 LTC4의 방출양에 대한 IL-5와 괴각의 효소분해 추출물을 처리한 군의 LTC4 방출양의 감소비율을 백분율로 나타내었다.
상기 실험은 독립적으로 3회 반복하였으며, 측정된 결과는 평균±표준편차로 나타냈고 유의적 차이는 던넷(Dunnet) 방법으로 검증하였다.
실험 결과, 본 발명에 따른 괴각의 효소분해 추출물은 IL-5의 자극에 의한 천식 환자로부터 분리한 호산구의 LTC4의 방출량을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다. 즉, 괴각의 효소분해 추출물을 1㎍/ml의 농도로 첨가한 경우 LTC4의 방출 억제율은 15%로 나타났고, 3㎍/ml를 첨가한 경우에는 32%, 10㎍/ml를 첨가한 경우에는 74%, 30㎍/ml를 첨가한 경우에는 93%의 억제율을 나타냈다. ED50값은 5.9㎍/ml이었다(도 2).
따라서, 본 발명의 괴각 추출물은 호산구의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
생체 내(
in vivo
) 실험을 통한 괴각 추출물의 알레르기 질환의 예방 및 치료효과 조사
<3-1> 난황 감작 알레르기 동물 모델에서 괴각 추출물의 항알레르기 활성 조사
본 발명에 따른 괴각 추출물이 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는지를 확인하기 위해, 난황 감작 알레르기 동물 모델을 제조하고 괴각 추출물의 항알레르기 활성을 조사하였다. 괴각 추출물의 항알레르기 활성은 상기 동물모델에서 기관지 폐포로의 호산구의 침윤 정도를 측정함으로써 판단하였다.
먼저, 난황 감작 알레르기 동물 모델을 다음과 방법으로 제조하고, 괴각의 효소분해 추출물을 투여한 후 기관지 폐포 세척액을 회수하여 폐포로 침윤된 호산구의 수치를 광학 현미경으로 검경하여 계측하였다. 실험동물로는 6∼8주령의 수 컷 Balb/c 마우스(체중 25∼30g)를 사용하였다. 난황 20㎍을 100㎕의 생리 식염수에 용해시킨 다음 여기에 동일한 부피의 Imject Alum 복합체를 첨가하였다. 상기 난황액 200㎕를 상기 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 복강주사는 실험 첫째날과 14일째 각 1회씩 2번 실시하였다. 실험 28일과 29일째 양일간 2% 난황을 연무기(neubilizer, Pari-Inhaler Boy)를 이용하여 매일 30분씩, 이틀 동안 국소 감작시켰다. 그 다음 마우스를 7마리씩 대조군과 실험군으로 분류하고, 실험 30일째에 실험군에 실시예 1의 괴각의 효소분해 추출물을 10% DMSO를 함유하는 생리식염수에 용해하여 제조한 괴각의 효소분해 추출물 100mg/kg을 정맥주사하고 1시간 후에 연무기를 이용하여 2% 난황을 30분간 흡입시켰다. 대조군에는 괴각의 효소분해 추출물의 용해에 사용한 10% DMSO를 함유하는 생리식염수를 주사하였다.
실험이 완료된 후 대조군과 실험군 마우스의 흉부를 절개하고 기도를 분리한 후 절개하여 폴리에틸렌 튜브를 삽관하였다. 1ml의 생리 식염수를 상기 튜브를 통해 기도로 주입시킨 후 폐를 부드럽게 마사지하여 기관지 폐포 세척액을 수집하였다. 이어 0.8ml의 생리 식염수를 상기와 동일한 방법으로 주입하고 기관지 폐포 세척액을 수집하였다. 상기에서 수집한 기관지 폐포 세척액 총 1.8ml를 원심분리하여 세포를 분리하고 세포자동도말장치인 사이토스핀(cytospin)을 이용하여 슬라이드를 제작하였다. 이를 라이트 김사(Wright-Giemsa) 염색을 한 후 광학현미경으로 ×1000 배율 시야에서 세포수를 계측하여 침윤된 호산구의 숫자를 백분율로 산출하였다. 또한, 중성구와 마크로파지도 광학현미경으로 검경하여 세포수를 계측하였다.
실험 결과, 대조군의 경우 난황 감작으로 인해 기관지 폐포로 침윤된 호산구의 숫자가 감작되지 않은 마우스에 비해 현저히 증가한 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 괴각 추출물을 투여한 실험군의 경우에는 기관지 폐포로 침윤된 호산구의 숫자가 급격하게 감소된 것으로 나타났다(도 3). 한편, 괴각 추출물을 투여한 실험군에서는 기관지 폐포로 침윤된 마크로파지의 숫자가 대조군과 비교하여 현저히 증가한 것으로 나타났다(표 1). 이러한 실험 결과는 알레르기를 억제하는 괴각 추출물의 작용기전을 규명하는 분자 표적 연구에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
| 그룹/면역세포 종류 | 호산구 | 중성구 | 마크로파지 | 기타 |
| 대조군 | 82% | 2% | 8% | 8% |
| 실험군 | 8% | 18% | 56% | 18% |
<3-2> 메타콜린 기관지 유발검사를 이용한 괴각 추출물의 항알레르기 활성 조사
메타콜린 기관지 유발검사를 수행함으로써 괴각 추출물이 기관지 천식의 특징인 기도과민 반응을 억제하는지 여부를 조사하였다. 상기 기도과민 반응은 기도폐쇄로 인해 유발되는 기도 저항성 정도를 측정함으로써 조사하였다.
상기 실시예 <3-1>에서 난황으로 감작시킨 마우스에 메타콜린을 2.5, 6.25, 12.5, 25 및 50mg/ml 농도로 5 단계로 나누어 각각 3분간 흡입시킨 다음 기도저항 정도를 OCP-2000(one chamber plethylsmography)을 사용하여 펜(penh)을 3분간 측정하였다. 상기 펜은 OCP-2000이 자동 계측한 상수인 호기시간(Ti), 이완시간(RT), 최대호기유속(PEF), 최대흡기유속(PIF)으로부터 자동 산출되는 지표로서 기도저항 정도를 반영한다.
상기 실험은 독립적으로 2회 반복하였으며, 측정된 결과는 평균ㅁ 표준편차로 나타냈고 유의적 차이는 던넷(Dunnet) 검정방법으로 검증하였다.
실험 결과, 대조군 마우스의 경우 흡입시킨 메타콜린의 용량에 의존하여 기도저항 정도가 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 본 발명에 따른 괴각 추출물을 투여한 실험군의 경우에는 메타콜린에 의해 유도되는 기도저항 정도가 대조군에 비해 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 특히, 메타콜린을 12.5∼50mg/ml를 흡입시킨 실험군의 경우 본 발명의 괴각 추출물은 기도저항을 대조군에 비해 65% 정도 억제하는 것으로 나타났다(도 4).
따라서, 본 발명의 괴각 추출물은 항알레르기 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
<제조예 1>
음료의 제조
통상의 음료 제조방법에 따라 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 성분들을 혼합한 다음 약 1시간 동안 85℃에서 교반하면서 가열한 후 제조된 용액을 여과하여 멸균함으로써 괴각 추출물을 포함하는 음료를 제조하였다.
| 성분 | 함량 |
| 실시예 1의 괴각 추출물 | 1000mg (0.1%) |
| 구연산 | 1000mg (0.1%) |
| 올리고당 | 100g (10%) |
| 타우린 | 1000mg (0.1%) |
| 정제수 | 전체 부피가 1000㎖가 되도록 첨가 |
<제조예 2>
비누의 제조
비누 베이스 99.5중량%(수분 포함)와 상기 실시예 1에서 제조한 괴각 추출물 0.5%(w/w)를 혼합기로 잘 혼합한 후 비누 제조기에서 압출, 절단 및 형타하여 고형 비누 조성물을 제조하였다.
<제조예 3>
크림의 제조
스테아린산 1.5g, 스테아릴알코올 2.2g, 스테아린산부틸 0.5g, 프로필렌글리콜 0.5g, 모노스테아린산글리세린 2.0g, 수산화칼륨 0.3g과 같은 유성 성분, 수성 성분, 계면활성제 등이 포함된 크림 베이스 40g에 상기 실시예 1에서 제조한 괴각 추출물을 0.5%(w/w) 농도로 혼합하여 혼합기에서 잘 유화시키고, 탈기, 여과 및 냉각하여 크림 조성물을 제조하였다. 상기 조성물에 첨가제로서 킬레이트제, 향료 및 색소를 첨가하고, 적은 양의 유성 성분이 존재하도록 처방은 수중유형(oil/water)으로 제조하였다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 괴각 추출물은 알레르기를 유발하는 Th2 사이토카인 및 호산구의 활성을 억제하며 호산구의 기관지 폐포로의 침윤을 억제하고 메타콜린에 의한 기도과민 반응을 억제하므로 알레르기 질환의 예방 또는 개선에 매우 유용하다.
Claims (5)
- 괴각을 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알코올로 추출한 다음 아밀라아제 또는 펙티나아제를 처리함으로써 수득한 괴각의 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 괴각의 물 추출물은 열수 추출법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 알레르기 질환이 알레르기성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 알레르기성 중이염, 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock) 및 알레르기성 결막염으로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 알레르기성 피부염이 아토피 피부염, 건선, 접촉성 알레르기 피부염 및 두드러기임을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 괴각을 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알코올로 추출한 다음 아밀라아제 또는 펙티나아제를 처리함으로써 수득한 괴각의 효소분해 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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