KR101913828B1 - 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물 - Google Patents
지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 지초 추출물을 이용함으로써 근관세포로의 분화가 촉진되고, 비만성 근감소증을 예방 또는 치료하며, 운동수행 능력 향상용 건강기능식품을 제조할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
골격근은 인체에서 가장 큰 부분을 차지하는 기관으로 총 몸무게의 40 내지 50%를 차지하며 에너지 항상성 및 열 생성 등을 비롯한 체내 여러 대사 기능에서도 중요한 역할을 한다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상 감소하기 시작하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준까지 감소하므로, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다.
노화가 진행되면 과체중 또는 비만 이환율이 급격하게 증가하는 것으로 보고되어 있고, 비만에 해당하는 노인은 정상 체중인 노인보다 거동이 더욱 불편할 뿐 아니라 사망률 또한 급격하게 증가한다.
노년기 비만은 근감소의 원인 중 하나인 것으로 알려져 있다. 즉, 비만이 유도되면, 근육내 지방 침착으로 인한 근육량 감소와 더불어 비만세포 유래 염증인자가 증가하고, 근육미토콘드리아 기능의 저하로 인해 근육량 및 근육기능이 더욱 약화된다. 또한 비만으로 인하여 인슐린 분비에 이상이 발생하면 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못하므로 근육발달장애를 일으킬 수 있어 근감소증이 발병할 수 있다.
근감소증은 골다공증, 인슐린저항성, 관절염과 같은 노인성 만성질환과도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있는데, 근감소증의 예방 또는 개선을 통해서 노화로 인한 신체 활동력의 감소를 완화할 수 있다. 세계의 진행성 운동실조증 및 근력약화 치료제 시장은 2011년 약 140억 달러의 규모를 기록하였고, 그 이후에는 9.4%의 연평균 복합 성장률을 보이며 성장함으로써 2017년에는 약 235억 달러에 이를 것으로 전망되고 있다.
근감소증의 치료 방법으로는 미토콘드리아 생성을 증가시키고, 근육 단백질의 분해를 억제하며, 항염제를 이용하는 방법 등이 제시되고 있으나 현재 뚜렷한 치료약은 없는 실정이다.
근감소증을 예방하기 위한 것으로서 끼니마다 25 내지 30 g에 해당하는 양질의 단백질을 섭취하는 식이요법도 제안되었으나, 이는 달걀 4 내지 5개 또는 닭가슴살 약 120 g을 매 끼니마다 섭취해야만 도달할 수 있는 양으로서 현실적으로 일반인이 실천하기는 매우 어렵다.
따라서 최근 많은 사람들이 단백질 보충제를 대안으로 선택하고 있으나, 단백질 보충제의 섭취는 단백질 과다 섭취의 원인이 될 수 있어 부작용이 발생할 가능성이 높다. 더욱이 신장 질환이 있는 경우에는 고단백질 식이를 수행할 수 없고, 노화가 진행됨에 따라 신장의 기능 또한 감소하므로 근감소증의 예방을 위해서 고단백질 섭취 이외의 다른 대안이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이에 본 발명자들은 근력 약화 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 개발하고자 하였다. 그 결과, 지초(Lithospermum erythrorhizon) 추출물이 근관세포에서 팔미트산에 의해 유도된 근감소 현상을 효과적으로 억제함을 발견하였으며, 따라서 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료를 위해 지초 추출물을 유용하게 이용할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지초 추출물의 근력 약화 관련 질환의 완화, 억제 또는 치료 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 근력 약화 관련 질환 완화, 억제, 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지초 추출물의 근력 약화 관련 질환 완화, 억제 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 지초 추출물은 지초의 용매 조추출물 및 이의 용매 분획물을 포함한다. 이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 지초(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서상의 "지초"는 뿌리가 붉은색을 띠며 예로부터 건위, 강장, 해독, 해열, 청혈에 뛰어난 효과가 있는 것으로 알려져 왔고, 천연색소로 활용될 뿐만 아니라 현재 진도홍주의 원료로도 사용되고 있으며, 최근 지초의 효능에 대해서는 항산화, 항염증, 항암, 항균 활성 등 다양한 효능이 있다고 보고되고 있다.
상기 '추출물'은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 지초 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.
상기 근줄기세포는 위성 세포(satellite cell) 또는 근아세포(myoblast), 예를 들어, 근아세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube), 예를 들어, 근관세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 지초 추출물은 지초 뿌리 추출물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 지초 추출물은 지초를 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.
지초의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 70%이상 내지 90%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 80%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
또한, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액, 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 지초 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 상기 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
예를 들면, 상기 지초를 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 지초 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 지초 추출물은 지초의 용매 조추출물, 용매 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다.
상기 지초 추출물은 지초의 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.
상기 용매는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 70%이상 내지 90%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 80%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
본 발명에 따른 지초 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 지초를 절단하고 물로 세척하여 협착물을 제거한 후, 상기 지초의 중량에 대하여 약 10 내지 20배 중량의 추출용매로 환류 추출한다. 추출 후 여과하여 여과액을 모은다. 추출 온도는 특별한 제한은 없지만 15 내지 110, 바람직하게는 20 내지 90인 것이 좋다.
추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 일 예에서, 추출공정을 2회 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매, 약 5 내지 15 부피배, 바람직하게는 8 내지 12 부피배로 환류 추출한다. 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 여과액과 합쳐서 감압농축을 하여 지초 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.
상기 지초 추출물 제조 시에 사용되는 용매의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음의 정제단계에서 사용되는 용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있으므로, 용매의 사용량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.
이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30 중량배, 바람직하게는 15 내지 25 중량배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결건조하여 분말상태의 지초 추출물로서 제조될 수 있다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태는 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 지초 추출물은 지초의 용매 조추출물, 용매 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다.
본 명세서상의 용어 "근력 약화 관련 질환"이란, 근육조직 또는 근세포가 감소하거나 소실되는 모든 질환을 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한, 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.
상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 또는 심위축증인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 근감소증은 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미하며, 예를 들어, 비만성 근감소증일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 비만성 근감소증은 노년기의 비만이 근감소를 더욱 가중시키는 현상을 의미하는 것으로서, 비만으로 인하여 근육 내에 지방이 침착되어 근육량이 감소함과 더불어 비만세포 유래 염증인자가 증가하고, 근육 내 미토콘드리아의 기능이 저하됨으로써 근육의 기능이 더욱 약화될 수 있고, 비만으로 인하여 인슐린 분비에 이상이 발생하는 경우, 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못하므로 근육 발달 장애를 일으킬 수 있다.
상기 근위축증은 사지의 근육이 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.
상기 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy)은 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육 섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다.
상기 심위축증은 심장이 외부적 또는 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠에 의하여 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 증상으로 나타난다.
상기 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화를 촉진한다.
상기 근줄기세포는 위성 세포 또는 근아세포, 예를 들어, 근아세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 근육세포는 근세포 또는 근관세포, 예를 들어, 근관세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 지초 추출물이 0.1 내지 2.0, 0.1 내지 1.5, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 2.0, 0.2 내지 1.5, 0.2 내지 1.0, 0.5 내지 2.0, 0.5 내지 1.5 또는 0.5 내지 1.0, 예를 들어, 0.5 내지 1.0 ug/ml 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 지초 추출물의 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 지초 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 명세서상의 용어 "운동수행 능력 향상"이란, 신체 수행의 강화, 최대 지구력의 강화, 근육량의 증가, 근육 회복의 강화, 근육 피로의 감소 또는 이들의 복합적인 효과를 의미한다.
상기 지초 추출물은 지초의 용매 조추출물, 용매 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 음료는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 지초 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로서, 상기 지초 추출물을 이용함으로써 팔미트산에 의해 유도된 근감소 현상을 억제할 수 있으므로, 이를 효과적으로 비만성 근감소증의 예방 및 치료에 이용할 수 있고, 운동수행 능력 향상용 건강기능식품 조성물로 이용할 수 있다.
도 1a는 지초 추출물이 근관세포에서 팔미트산의 처리에 의해 유도된 MHC, MHC2A, MHC2B 및 PGC1α 단백질의 발현 감소를 억제함을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 1b는 지초 추출물이 근관세포에서 팔미트산의 처리에 의해 유도된 MuRF1 mRNA의 발현 증가를 억제함을 나타내는 그래프이다.
도 1c는 지초 추출물이 근관세포에서 팔미트산의 처리에 의해 유도된 관의 형성 감소 및 직경 감소를 억제함을 나타내는 면역염색 결과이다.
도 2a는 지초 추출물이 근관세포에서 MHC, MHC2A 및 MHC2B 단백질의 발현을 농도의존적으로 증가시킴을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 2b는 지초 추출물이 근관세포에서 S6K, 4EBP1 및 p38 단백질의 인산화를 농도의존적으로 증가시킴을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 1b는 지초 추출물이 근관세포에서 팔미트산의 처리에 의해 유도된 MuRF1 mRNA의 발현 증가를 억제함을 나타내는 그래프이다.
도 1c는 지초 추출물이 근관세포에서 팔미트산의 처리에 의해 유도된 관의 형성 감소 및 직경 감소를 억제함을 나타내는 면역염색 결과이다.
도 2a는 지초 추출물이 근관세포에서 MHC, MHC2A 및 MHC2B 단백질의 발현을 농도의존적으로 증가시킴을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 2b는 지초 추출물이 근관세포에서 S6K, 4EBP1 및 p38 단백질의 인산화를 농도의존적으로 증가시킴을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 지초 추출물의 제조 방법
건조시킨 지초의 뿌리를 분쇄하고 10배 중량의 80(v/v)% 에탄올을 가하여 12시간 동안 실온에서 추출한 후, 이로부터 여과한 상등액을 감압건조기로 농축시킨 뒤 동결건조하여 지초 추출물을 제조하였다.
실시예 2: 세포 배양 및 근관세포의 분화 방법
C2C12 마우스(CRL1772; American type cell collection, USA) 유래 근아세포(myoblast)는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였고, 6-웰 플레이트에서 95%의 성장치(confluence)에 도달한 후 2(v/v)% 말 혈청(horse serum)이 함유된 DMEM 배지로 옮기고 4일 동안 배양하여 근관세포(myotube)로 분화시켰다.
실시예 3: RT-qPCR의 수행 방법
팔미트산(Palmitic acid, 이하 PA)으로 처리된 C2C12 마우스 유래 근관세포를 PBS로 2회 세척한 후 RNA 추출 키트(Nucleo RNA Spin , Macherey-Nagel, GmBH&Co, GA)의 사용자 권장 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출하였고, 추출된 RNA로 cDNA를 합성하여 실시간 정량적-중합효소 연쇄 반응(Real time-quantitative polymerase chain reaction, 이하 RT-qPCR)을 실시하였다.
PCR 분석은 분석기기(Applied Biosystems 7900 HT thermal cycler, Applied Biosystems)의 사용자 권장 사이클링 조건에 따라 실시하였고, 각 mRNA의 발현 정도를 확인하기 위하여 18s를 내부적 통제요인(endogeneous control)으로 하여 대조군에 대한 배수 변화(fold change) 값을 산출하고 상대적인 발현량을 비교하였다.
실시예 4: 웨스턴 블로팅의 수행 방법
배양된 근관세포를 RIPA 완충액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 용해하여 단백질을 추출한 후, SDS-PAGE 겔(gel)을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 이후 단백질이 옮겨진 멤브레인(membrane)을 5(v/v)% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 동안 블로킹(blocking)하였고, 1차 항체를 4℃ 에서 오버나잇(overnight), 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 부착한 후 증강 화학발광 (enhanced chemiluminescence, ECL) 용액을 이용하여 단백질의 발현을 측정하였다.
본 발명의 실시예에 따라 수행된 웨스턴 블로팅에 사용된 1차 항체는 β-액틴(β-actin, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), MHC(myosin heavy chain), MHC의 아형인 MHC2A(oxidative, fast type) 및 MHC2B(glycolytic, fast type)(Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, Iowa, USA), PGC1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, Abcam, Cambridge, MA, USA), S6K, p-S6K, 4EBP1(4E-binding protein 1), p-4EBP1, p38, p-p38(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), GAPDH(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)이다.
시험예 1: 지초 추출물의 팔미트산-유도 근감소증에 대한 억제 효과 확인
C2C12 세포주를 2(v/v)%의 말 혈청이 포함된 분화배지에서 4일 동안 근관세포로 분화시킨 후 0.0, 0.1 및 0.5 ug/ml의 농도에 해당하는 지초 추출물을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 0.75 mM의 팔미트산을 포함하는 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA)을 첨가하여 상기 근관세포에서의 근감소를 유도함으로써, 지초 추출물의 처리 농도에 따른 근감소 억제 효과를 관찰하였다. 대조군으로는 BSA만을 처리(BSA-C)하여 결과를 비교하였다.
도 1a 에서 확인할 수 있듯이, 팔미트산의 처리에 의해 MHC, MHC2A, MHC2B 그리고 PGC1α의 단백질 발현이 억제되었으나, 지초 추출물의 처리에 따라 MHC, MHC2A ,MHC2B 및 PGC1α의 단백질 발현이 농도의존적으로 회복되었다.
결과적으로 팔미트산에 의해 유도된 근관세포의 위축이 지초 추출물에 의해 보호되는 것을 확인하였으며, 특히 효과는 PGC1α의 발현이 증가함으로써 나타난 것으로 여겨진다.
도 1b에서 확인할 수 있듯이, 팔미트산(PA)의 처리에 의해 MURF1 mRNA의 발현이 유의적으로 증가하였으나, 지초 추출물의 처리에 따라 MuRF1 mRNA의 발현은 유의적으로 억제되었다. 근육 특이적인 유비퀴틴 연결효소(ligase)인 MURF1은 근위축의 유도와 관계가 있으므로, 팔미트산의 처리에 의해 유도된 근관세포의 위축이 지초 추출물 처리에 따라 저해됨을 확인할 수 있었다.
도 1c에서 확인할 수 있듯이, 근관세포에서 MHC를 면역염색(immunostaining)하여 형태를 관찰한 결과, 대조군(control)에 비하여 0.75 mM 팔미트산의 처리는 새로운 관(tube)의 형성을 억제할 뿐 아니라 이미 형성된 관의 직경도 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 지초 추출물을 0.5 ug/ml 처리한 결과 팔미트산에 의해 유도된 근관세포 직경의 감소가 억제되는 것을 확인하였다.
따라서 지초 추출물은 팔미트산에 의해 유도된 근관세포에서의 근감소 현상을 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.
시험예 2: 지초 추출물의 근관세포 분화 활성 효과 확인
C2C12 세포주를 2(v/v)%의 말혈청이 포함된 분화배지에서 0.0, 0.1, 0.5 및 1.0 ug/ml의 농도에 해당하는 지초 추출물을 처리하고 이후 72시간 동안 배양함으로써 근관세포로 분화시켰다.
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 지초 추출물을 첨가한 세포에서는 무첨가 대조군에 비하여 MHC, MHC2A, MHC2B의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 지초 추출물이 근아세포의 분화를 촉진시킴을 확인하였다.
결론적으로 근아세포 초기 분화에 관여하는 단백질인 p38의 인산화가 지초 추출물에 의해 증가하였으며, 단백질 합성에 관여하는 S6K, 4EBP1의 인산화가 증가하였다. 따라서 지초 추출물이 초기 분화를 촉진시키고, 단백질 합성인자를 활성화시켜 근육세포의 비대(hypertrophy)를 유도하는 것으로 판단할 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
- 지초(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 근줄기세포는 위성 세포(satellite cell) 또는 근아세포(myoblast)인 것인, 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)인 것인, 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 지초 추출물은 지초 뿌리 추출물인 것인, 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화 촉진용 조성물.
- 지초(Lithospermum erythrorhizon) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 또는 심위축증인 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제 5 항에 있어서, 상기 근감소증은 비만성 근감소증인 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 근줄기세포로부터 근육세포로의 분화를 촉진하는 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 근줄기세포는 위성 세포(satellite cell) 또는 근아세포(myoblast)인 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)인 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- ◈청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 지초 추출물을 0.1 내지 1.0 ug/ml 포함하는 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 지초 추출물은 지초 뿌리 추출물인 것인, 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
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