KR101289290B1 - 해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역활성을 가지는 해삼 추출물에 관한 것으로, 구체적으로 해삼의 주산지인 해남에서 양식 및 생산되는 해삼을 에탄올로 추출한 다음, 이를 농축하여 다시 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 사용하여 순차적으로 분획을 진행하였고 이 중 클로로포름 추출물에서 탁월한 면역활성을 확인하였으며 이는 식품첨가물, 음료첨가물 및 건강 보조식품 등 기능성 식품 및 의약품에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물{Composition for immune enhancement comprising extract of see cucumber as active ingredient}

본 발명은 해삼(Stichopus japonicus) 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물, 상기 증진용 조성물을 첨가하여 제조된 면역 증진용 가공식품, 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 저하로 기인하는 질환 치료제에 관한 것이다.

현대사회는 웰빙(well-beng), 로하스(LOHAS) 열풍으로 인해 생존 자체보다는 생활수준의 향상이나 의료기술의 발달로‘삶의 질에 급격히 관심이 옮겨지고 있다. 특히, 식품 내의 특별한 성분들이 갖는 건강 증진 효과가 발견되면서 이른바 식품의 3차 기능에 주목하게 되었다.

전체 산업분야가 전반적으로 정체기에 있음에도 불구하고 건강식품산업은 새로운 발전의 계기가 되어 지속적인 성장을 거듭하고 있으며, 특히 우리나라의 식품산업은 원재료의 70% 이상을 수입에 의존하고 있으나, 건강식품산업은 국내 자생 원료만으로도 개발이 가능하므로, 관련 제도 및 국가적 지원 규모가 크게 확대될 전망이다.

바다의 인삼이라 불리고 있는 해삼(Stichopus japonicus)은 해양수산부가 우리나라의 8대 건강 웰빙 수산물로 지정할 정도로 국민기호도가 높고 친근한 식품이다. 해삼은 바다에서 나는 蔘이란 뜻으로 정약전의 자산어보(1814년) 이전부터 불린 이름이라 여겨지는데, 고서(古書)인「전어지」의 해삼조에서는“해삼은 성(性)이 온(溫)하고 몸을 보비(補肥)하는 바 그 효력이 인삼에 맞먹기 때문에 이러한 이름이 생겼다”고 하며, 본초강목(本草綱目) 등의 한방의서(韓方醫書)에 관절염 치료 및 피부노화예방, 성기능 강화 등 한약재로서의 다양한 효능들이 언급되어 있다.

최근 들어 해삼은 소비량이 증가하고 있으나, 생산량이 한정되어 매년 가격이 꾸준히 상승하고 있으며 특히, 중국에서 소비량이 증가하여 수산물 중 유일하게 국내산 해삼이 건해삼으로 가공 수출되고 있다.

최근 연구에 따르면 해삼의 항암효과 (Moon et al, 1998, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 350pp), 말라리아 예방효과, 콜라겐 (Liu et al. 1984 Guangxi Chinese Traditional Medicine, 18 pp.), 콘드로이틴 및 홀로톡신 다량함유 (Ryu et al. 2000 J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 72 pp.), 해삼 창자의 높은 바나듐(vanadium) 함량 (Zhonghua Yaohai 1993 Ha-Er-Bin Publishing House, 1542 pp.) 등의 놀라운 효과들이 밝혀지고 있으나, 그에 따른 산업화의 연구는 거의 없고 회로 먹거나 단순히 건조 방식으로 가공하는 것이 대부분이다. 이는 약효가 있는 해삼의 산지가 중국, 일본, 한국, 러시아 등에 국한되어 있기 때문인 이유가 가장 크다.

본 출원인은 국내 최초로 한방 원료를 첨가하여 비특이적 면역증진을 하는 해삼 양식용 배합사료를 개발하여 생산한 이래, 중국산 대비 저평가를 받고 있는 해삼을 고부가 가치가 있는 상품으로 가공할 방법을 모색하였다. 고문헌 및 각종 논문에 해삼에 콜라겐, 알긴산, 콘드로이친, 사포닌, 홀로톡신 등이 많아 건강에 매우 이롭다는 기재에 착안하여 건강식품 원료로 사용이 가능하다고 판단되어, 한의학과의 결합으로 시제품을 만들어 좋은 반응을 얻은 바 있다. 오래전부터 식품이자 약재로 사용해온 해삼을 이용한 건강기능성 식품 및 원료의 개발은 수입대체 효과뿐 아니라 이와 연관된 1, 2, 3차 산업의 동시적 발전, 및 앞으로 다가올 FTA에 대비한 강력한 수출 품목이 될 것으로 기대된다.

해삼을 주원료로 하는 기능성식품 개발과 새로운 기능성이 부여된 경쟁력 있는 제품의 개발을 위하여 해삼의 효능성분 분석 및 기존 시제품의 문제점을 개선한 해삼을 이용한 경옥고 제품 개발과 함께 신규 제형 및 이를 활용한 시제품을 개발하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 해삼(Stichopus japonicus) 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 첨가하여 제조된 면역 증진용 가공식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 저하로 기인하는 질환 치료제를 제공한다.

본 발명의 해삼 추출물은 면역 증진용 식품, 화장품 및 의약품 소재로서 활용가치가 높다. 또한, 우리나라의 허브류와 접목한 제품의 개발로 향후 건강식품 분야에서 소재가 다양해 질 것으로 기대된다. 본 발명의 저온 건조한 건해삼 제조방법으로 향후 다양한 제형의 제품 생산이 가능해져, 매출신장이 기대된다.

도 1은 생해삼을 보여준다.
도 2는 실험에 사용한 생해삼의 크기를 보여준다.
도 3은 해삼 필터링 과정을 보여준다.
도 4는 해삼 추출물의 농축 과정을 보여준다. 4-1: 해삼 추출 후 모습; 4-2: 해삼 추출물의 농축 중 혼탁해지는 모습; 4-3: 해삼 추출물이 혼탁해지는 모습; 4-4: 해삼 추출물이 젤 상태로 변해가는 모습.
도 5는 클로로포름 분획 과정 및 농축과정을 보여준다. 5-1: 클로로포름 분획 과정; 5-2: 클로로포름 분획물의 농축물.
도 6은 동결건조기를 이용한 건조방법을 보여준다.
도 7은 동결건조 후의 해삼을 보여준다.
도 8은 해삼의 동결 건조물과 일반 건조물의 상태를 보여준다. 8-1: 동결 건조 한 해삼; 8-2: 일반 건조 한 해삼.
도 9는 MTS assay 법을 이용한 H-3 추출물(클로로포름 추출물)의 세포 독성 검증 결과를 보여준다.
도 10은 해삼 추출물 중 H-3(클로로포름 추출물)의 면역반응을 보여준다.
도 11은 해삼 추출물 중 H-3(클로로포름 추출물)의 면역세포의 활성화 정도를 보여준다.
도 12는 해삼 추출물 중 H-3(클로로포름 추출물)의 염증반응 관련 효능을 보여준다.
도 13은 해삼을 이용한 제품 개발 과정을 보여준다. 13-1: 생해삼; 13-2: 생해삼; 13-3: 건조된 해삼; 13-4: 할복 후의 해삼; 13-5: 건해삼을 사용한 경옥고.
도 14는 해삼 제품의 관능평가 결과를 보여준다. 14-1: 제품의 향에 대한 평가 결과; 14-2: 제품의 맛에 대한 평가 결과.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해삼(Stichopus japonicus) 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

상기 해삼은 생해삼 또는 음건 후 저온 건조한 건해삼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 저온은 35~45℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 건해삼은

내장을 제거한 생해삼을 25~35분간 끓는 물에 데치는 단계;

상기 데친 해삼을 음건하는 단계; 및

상기 음건한 해삼을 35~45℃에서 저온 건조하는 단계를 포함하여 제조한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역 증진용 조성물은 홍삼, 숙지황, 백봉령 및 한봉으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 4가지 추출물을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 면역 증진용 조성물에 포함되는 홍삼, 숙지황, 백봉령 및 한봉은 시장에서 용이하게 구입하여 사용할 수 있으며, 추출에 사용되는 각각의 재료는 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연건조할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 각각의 재료를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

상기 홍삼, 숙지황, 백봉령 및 한봉의 추출방법은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 6의 저급알코올에 의해 추출할 수 있다. 더욱 바람직하게는 물 또는 에탄올을 이용한 추출을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 열수 추출할 수 있다. 추출 시 각각의 재료에 대해 개별적으로 추출하여 이를 혼합하거나, 각각의 재료를 혼합하여 추출할 수도 있다. 추출 시의 각각의 재료와 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 재료 1g에 대하여 추출용매를 8 내지 12배(중량기준)로 사용할 수 있다. 추출 시 온도는 바람직하게는 30 내지 100℃일 수 있다. 추출 시간은 추출 온도에 따라 다르지만, 2 내지 24시간, 바람직하게는 4 내지 16시간일 수 있다. 또한 추출 시 교반기로 교반하는 경우 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 제조를 위한 추출은 분쇄한 각각의 재료에 약 10배(중량비율)의 열수를 첨가하고 80℃에서 12시간 동안 가열 추출한다. 상기 추출액을 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 회수한다. 회수한 상등액은 농축한 다음 건조시켜 분말화할 수 있다.

본 발명의 면역 증진용 조성물의 제조를 위한 재료는 해삼 20 내지 80 중량부에 홍삼, 숙지황, 백봉령 및 한봉이 동일한 비율로 혼합된 약재 20 내지 80 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 해삼(Stichopus japonicus) 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물은 하기와 같이 수득될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

해삼의 유효성분을 40~50℃, 빛이 차단된 상태에서 에탄올로 추출하는 단계;

상기 에탄올 추출물을 농축하는 단계;

상기 농축한 추출물을 헥산:물=1:1 용액에 현탁하는 단계;

상기 현탁액을 12시간 방치한 후 분리된 헥산층을 수득하는 단계;

상기 수득한 헥산층을 42℃로 고정한 항온 수조에서 농축하여 헥산을 제거하는 단계;

상기 헥산이 제거된 해삼 농축물을 클로로포름으로 분획하는 단계; 및

상기 클로로포름 분획물을 농축하는 단계를 거쳐 클로로포름 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명의 실시예 2에서는 본 발명의 클로로포름 분획물의 독성 여부를 MTS assay를 이용하여 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 클로로포름 분획물은 투여 시 세포독성이 극히 미미하여 안전한 물질임을 알 수 있었다.

본 발명은 또한, 본 발명의 면역 증진용 조성물을 첨가하여 제조된 면역 증진용 가공식품을 제공한다. 본 발명의 가공식품은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 가공식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물과 면역 증진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 아울러, 본 발명의 조성물은 면역 증진 효과를 더욱 증진하기 위해 이에 한정되지는 않으나, 베타카로틴, 스쿠알렌, 엽록소 제품, 화분, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B6, 비타민 C, 나이아신, 판토텐산, 아연 등의 첨가물을 추가로 함유할 수도 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 1 내지 100중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분획물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 분획물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 분획물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 면역 증진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 저하로 기인하는 질환 치료제를 제공한다. 상기 질환은 면역기능이 저하되어 발생하는 모든 질환을 포함하며, 예를 들어 암, 감기 등 감염성 질환, 에이즈 등을 포함한다.

본 발명자들은 실시예 2에 기재된 것처럼, 쥐(mouse) 지라세포(splenocyte)를 사용하여 면역세포의 활성화 정도를 상기와 같이 수득된 본 발명의 조성물을 사용하여 분석하였다. 본 발명의 조성물에 의해 양 의존적(dose-dependent)으로 면역반응이 유도됨을 확인하였다 (도 11). 또한, 면역반응에 관여하는 사이토카인 중 면역반응을 촉진하는 IL-6의 유전자 발현량의 측정에서도 본 발명의 조성물의 높은 면역 활성 효능을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 포함하는 약학 조성물 및 화장품학적으로 허용 가능한 기제를 포함하는 화장용 조성물을 포함한다.

본 발명의 면역증진제 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물을 0.1 내지 90중량%로 포함할 수 있다. 그러나, 분획물의 함량은 상기한 수치에 한정되지 않으며, 사용방법 및 제형에 따라 적절히 조절하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 분획물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 분획물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 분획물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 분획물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 해삼 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 포함하는 조성물은 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물, 분획물 또는 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

재료 및 방법

1. 해삼 추출 및 농축과정

해삼은 생해삼, 건해삼, 해삼 끓인 물, 해삼 절개, 해삼 내장으로 분류하여 실험을 하였다. 해삼이 생산되는 시기에 관한 실험도 병행하였는데 2월, 4월, 6월, 8월 각 4번을 반복하여 해삼의 주산지인 해남에서 생해삼을 가지고 와서 실험하였다.

실험에 사용된 유기용매는 산업화 과정에서 필요한 에탄올을 사용하였으며 추출 조건은 해삼의 각 부위 및 상태에 따라 달리하였다.

1-1. 생해삼

크기가 15~30cm 되는 비교적 큰 것들을 이용하였다 (도 1, 2). 산지에서 공급된 해삼은 표면의 끈적이는 부분이 상하지 않도록 하여, 알코올에 침지하여 추출한 후 농축과정을 거쳤다.

해삼을 알코올에 침지 후 상온에서 추출하였다. 또한 추출 과정에서 천연성분의 파괴를 막기 위해 빛이 들어가지 않게 비이커를 두 겹의 알루미늄 호일로 싸서 빛을 완전히 차단하였다.

이렇게 추출한 해삼을 침지 시간별로 다양한 사이즈의 필터를 다단계로 사용하여 여과하였다 (도 3).

농축하는 과정은 도 4와 같고, 농축에 사용된 기기는 하기와 같다.

Rotary Vacuum Evaporator : EYELA N-N series

Water Bath : EYELA SB651

Vacuum Pump : EYELA ASIROTOR A-3S

항온 수조(Water bath)의 온도는 에탄올 및 추출물이 손상되지 않게 하기 위해 45℃로 셋팅하여 이용하였다.

추출물은 농축을 시작한지 4시간 정도 경과 되었을 때 노란색으로 변하기 시작했고, 8시간이 경과 한 후에는 둥근플라스크 주변에 이물질이 생기기 시작하면서 안에 있는 추출물의 색이 더 진하게 변했으며, 12시간 정도 경과 후 수분과 알코올은 거의 날아가고 분말화가 시작되었다. 최종 분말화가 되기까지 소요된 시간은 27시간이었다.

생해삼의 추출 후, 농축한 농축물을 이용하여 물질 분석을 하기 위해 분획(fraction)을 실시하였다.

100kg의 생해삼에서 얻은 농축물을 이용하여 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올에서 각각 분획을 수행하였다.

가. 헥산( Hexan )

헥산과 증류수 500㎖에, 농축액 500㎖를 넣은 후 분획을 수행하였다.

헥산과 농축물을 20여 분간 흔들고, 이때 거품이 너무 많이 올라오기 때문에 간헐적으로 뚜껑을 열고 거품을 제거하였다. 농축액과 헥산이 완전히 섞이고 12시간이 지난 후 층을 분리하여 이를 사용하였다.

농축은 항온 수조를 42℃로 고정하여 사용하였고, 농축되는 시간은 빠른 편이었다. 농축 결과 젤 상태로 남아 있어, 이를 48시간 정도 더 농축을 하였으나 유분이 많아서 인지 더 이상 농축이 진행되지 않았다.

나. 클로로포름

헥산이 제거된 농축물을 이용하여 클로로포름으로 분획하였다 (도 5).

분획은 12시간 동안 수행하였고, 농축할 때 거품이 많이 일어 공기를 더 넣었다. 상기 농축과정에 거품이 일어나는 현상은 인삼과 같이 사포닌이 많이 함유된 것이나 당이 많이 함유된 품종에서 나타나는 현상이다.

공기 조정을 하는 시간이 많이 소요되어 농축까지 소요된 시간은 약 34시간이었다.

농축이 완료된 후의 모습은 해삼의 등에 나 있는 문양과 같은 것이 플라스크에 묻어 나왔다.

여러 번 반복하여 실험을 하였지만 이런 현상은 반복되었고 마치 얼어붙은 것처럼 살얼음과 같은 것이 묻어 있었다.

다. 에틸아세테이트( Ethyl - acetate )

에틸아세테이트를 사용한 분획은 상당히 빨라 2시간 정도 소요되었다.

다른 유기성분들의 분획 과정에서 많은 량의 분획물을 얻을 수 있었지만 에틸아세테이트 처리구에서는 소량을 얻는데 거쳤다.

라. n- 부탄올

n-부탄올을 사용한 분획 과정은 빨라 3시간 정도 소요되었다. 다른 유기물들과는 달리 농축에 소요되는 시간은 비교적 빨라 6시간 만에 농축이 완료되었다.

1-2. 건해삼

건해삼을 만드는 과정은 두 가지를 이용하였다. 냉동건조 방법은 일반적으로 이용하지 않는 방법으로 동결건조기에서 -80℃로 하여 5일간 동결건조한 후 상태를 확인하였고, 두 번째로 일반 건조 방법은 일반적으로 어촌에서 행하는 방법으로 해삼을 상온에 두고 바람이 잘 통하게 낮에는 선풍기를 돌려주는 방식으로 약 15일 정도 소요되었다.

상기 두 가지 방법 중 동결건조가 상업화하는데 많은 도움이 될 것으로 사료된다 (도 6 ~ 8).

도 7에서 볼 수 있듯이 외견상 비교했을 때는 동결건조한 해삼은 형태를 유지하고 있는 반면, 일반 건조한 해삼은 수축되어 있었다.

상기 두 처리구는 중량 및 분말화 과정에서도 많은 차이를 보였다.

동결건조한 해삼의 경우는 개당 무게가 13~15g이었고, 일반 건조의 경우는 약 4~5g 정도로 동결건조 했을 때 무게가 더 많이 나갔다.

또한, 상기 두 처리구를 분말화 했을 때, 동결건조는 스펀지처럼 가루가 많이 나지만 일반 건조의 경우는 너무 딱딱해 잘게 갈아지지 않는 단점을 보였다.

2. 해삼 추출물의 면역활성 분석

2-1. 세포 독성 검증

- 검정(Assay) 방법: MTS assay

- 시료: 해삼 추출물 13종

- 해삼 추출물의 농도별 세포 독성 확인 결과, 전체적으로 세포 독성이 미미함을 확인하였다 (도 9).

2-2. 해삼 추출물 중 H-3(클로로포름 추출물)의 면역반응 및 면역세포 활성화 효능 분석

면역반응에 관여하는 사이토카인 중 면역반응을 촉진하는 IL-6의 유전자 발현량의 변화를 측정하여 면역 활성 효능을 분석하였다 (도 10).

아울러, 쥐(mouse) 지라세포(splenocyte)를 사용하여 면역세포의 활성화 정도를 분석하였다.

H-3의 농도별 면역반응 활성화 효능 확인 결과 양 의존적(dose-dependent)으로 면역반응이 유도됨을 확인하였다 (도 11).

2-3. 해삼 추출물 중 H-3(클로로포름 추출물)의 염증 반응 관련 물질 분석

외부 항원을 제거하여 숙주를 보호하는 과정 중 하나인 염증반응에 관여하는 사이토카인 중 염증세포들을 활성화시키고, 그들을 염증부위로 유인하는 화학유인 인자로 잘 알려진 IL-8의 단백질 발현량의 변화를 측정하여 염증반응 관련 효능을 분석하였다.

H-3의 농도별 염증반응 관련 효능 확인 결과 양 의존적으로 염증반응이 유도됨을 확인하였다 (도 12).

3. 기능성 식품 시제품 개발

위탁기관의 결과를 토대로 논의한 결과, 추출물 상태로 첨가하여 시제품을 제작하는 것은 아직 위험성이 있다고 판단되어 음건 방식의 건해삼을 이용한 시제품 제작에 들어가기로 하였다.

사전 시장조사 결과 기존의 식품들이 홍삼이나 인삼 등의 향과 맛에만 집중하여 시장에서 갈수록 배척당하는 주요인이 됨과 동시에, 해외시장에서의 외면을 받는다고 판단되어, 영양성분과 맛을 살리는 최적의 방안을 모색한 결과, 우리나라의 천연재료들을 사용한 경옥고를 기반으로 한 제품을 기획하게 되었다.

3-1. 생해삼을 이용한 제품 개발

할복하여 세척과정을 거친 생해삼과 홍삼, 숙지황, 백봉령, 한봉을 이용하여 기존 경옥고 생산 방식인 중탕 방식으로 144시간을 다려 제품을 제작하였다.

그러나 해산물 특유의 비린 향으로 인해 식품으로서는 적합하지 않다는 결론에 이르렀다.

3-2. 건해삼을 이용한 제품 개발

할복 후 세척과정을 거친 생해삼을 기존 건해삼 생산 방식과 동일한 과정을 거쳐 건해삼을 생산한 뒤, 200mesh로 분쇄하여 해삼과 홍삼, 숙지황, 백봉령, 한봉을 이용하여 기존 경옥고 생산 방식인 중탕 방식으로 144시간을 다려 제품을 제작하였다.

해삼 특유의 비린 향이 생해삼보다는 적은 편이나, 기호성에 있어서 거부감이 들 정도여서 상용화하기에 무리가 있다고 판단되어 다른 건조 방식을 고려하게 되었다.

동결건조를 한 해삼의 경우, 신선한 느낌이 나고 바다 향이 은은하게 나서 상용화의 기대를 하였으나, 분쇄과정이 복잡하고 고비용이 소요되며, 혼합과정에서도 필요 이상으로 부풀어서 적합하지 않다고 판단되었다.

다양한 실험 끝에 할복하여 내장을 제거한 생해삼을 30분간 끓는 물에 데치고, 음건한 뒤, 45도 이하에서 저온 건조한 건해삼이 건조율이나 분쇄과정, 혼합과정에서도 우수하다고 판단되었다.

약간 해삼 특유의 비린 향이 느껴지기는 하지만, 기호성에 있어 오히려 맛을 돋구는 역할을 하여 식품으로서 적합하다는 결론에 이르렀으며, 한봉을 첨가하여 brix도 36brix로 적합하였다.

3-3. 다양한 제형의 개발

경옥고를 기반으로 한 제형에 있어서는 맛이나 향 부분에서 우수한 평가를 받았으나, 편리성에 있어서는 적합하지 않다는 판단을 하였다.

기존 바이어들을 대상으로 제형에 관한 문의를 한 결과, 가격이나 인식 면에서 부담 없이 접근이 가능한 제형으로, 양갱 형태를 선택하여 연구를 진행하였다.

영양과 향, 기능성 부분을 살리면서 최대한 기존 양갱의 맛을 유지하기 위한 배합 비율을 실험한 결과, 해삼을 주원료로 한 경옥고를 28% 넣은 상태가 가장 좋다는 평가를 받았다.

3-4. 시장조사 및 관능평가

해삼경옥고 및 해삼양갱은 연구기획 단계부터 해외시장을 목표로 제작된 제품으로서, 시장 반응 평가를 위해 국내에서 개최된 서울국제식품전, 동경국제식품전, 홍콩국제식품전에 참가하여 시장 반응을 검토하였다.

특히 홍콩국제식품전에서는 3만여 명을 대상으로 시식프로모션을 펼쳐, 설문조사를 실시하였고, 매우 긍정적인 반응을 확인하였다 (도 14).

설문장소 : HKTDC FOOD EXPO 2009 홍콩컨벤션센터

일 시 : 2009년 08월 13일 ~ 17일

시식인원 : 해삼경옥고 - 약 25,000명; 해삼양갱 - 약 10,000명

설문응답 : 158 명

설문내용:

a. 제품의 향은 어떠한가? (What about the smell of the product? )

1. 매우 좋음(Very good); 2. 좋음(Good); 3. 보통(usually); 4. 좋지 않음(Bad); 5.매우 좋지 않음(Very bad) (도 14-1)

b. 제품의 맛은 어떠한가? (What about the tasts of the product?)

1. 달다(sweet); 2. 짜다(salty); 3. 시다(sour); 4. 쓰다(bitter) (도 14-2)

Claims (7)

1. 해삼(Stichopus japonicus)의 유효성분을 40~50℃, 빛이 차단된 상태에서 에탄올로 추출하는 단계;
   상기 에탄올 추출물을 농축하는 단계;
   상기 농축한 추출물을 헥산:물=1:1 용액에 현탁하는 단계;
   상기 현탁액을 방치한 후 분리된 헥산층을 수득하는 단계;
   상기 수득한 헥산층을 항온 수조에서 농축하여 헥산을 제거하는 단계;
   상기 헥산이 제거된 해삼 농축물을 클로로포름으로 분획하는 단계; 및
   상기 클로로포름 분획물을 농축하는 단계를 거쳐 제조된 해삼 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 해삼은 생해삼 또는 음건 후 저온 건조한 건해삼인 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 건해삼은
   내장을 제거한 생해삼을 25~35분간 끓는 물에 데치는 단계;
   상기 데친 해삼을 음건하는 단계; 및
   상기 음건한 해삼을 35~45℃에서 저온 건조하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 전체 조성물 기준으로 0.1~90중량% 범위 내로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
6. 삭제
7. 삭제

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