KR20080107883A

KR20080107883A - 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로포함하는 면역 증강용 조성물

Info

Publication number: KR20080107883A
Application number: KR1020070056226A
Authority: KR
Inventors: 조재경; 장효진; 김광배
Original assignee: 주식회사 로제트
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2008-12-11

Abstract

본 발명은 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 (i) 해삼, (ii) 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 및 (iii) 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 해삼 단독의 추출물에 비해서 더 우수한 대식 세포 증식능, 대식 세포의 TNF-α 및 IL-1β 분비 유도능 및 대식 세포의 산화질소 분비능을 가지고 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 이용하면 면역 증강용 식품 및 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

해삼, 사물탕 약재, 갈근, 면역 증강

Description

해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물{Composition for immune enhancement comprising the extract of see cucumber, medicinal stuff of Samultang and Pueraria thunbergiana Benth as an active ingredient}

도 1은 본 발명의 조성물의 대식세포 활성능을 확인한 결과이다.

도 2는 본 발명의 조성물의 TNF-α 분비 촉진 효과를 확인한 결과이다.

도 3은 본 발명의 조성물의 IL-1β 분비 촉진 효과를 확인한 결과이다.

도 4는 본 발명의 조성물의 대식세포에서의 산화질소 생성능을 확인한 결과이다.

본 발명은 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 (i) 해삼, (ii) 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 및 (iii) 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.

해삼(see cucumber)은 전세계의 바다 밑바닥에 분포하며, 약효가 인삼과 같다고 해서 이름지어진 극피동물의 일종이다. 중국을 비롯한 동양에서 옛부터 진액을 보하는 약으로서, 당뇨병, 천식 등에 탁월한 효과를 나타내고, 기력상실과 허탈상태에서 기력을 되찾을 수 있는 약으로 알려져 있다. 한방과 민간요법에서는 해삼이 혈(血)을 보하고 양기(陽氣)를 돕는 데 쓰며, 인체 단핵세포와 거식세포의 담식능력을 제고시켜 면역기능을 왕성하게 하고 상처의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 해삼에는 단백질과 비타민 B류가 풍부하고, 요오드 성분이 많이 함유되어 있으며, 콘드로이틴성분이 다량 함유되어 있다고 한다.

당귀(Angelicae Gigantis Radix)는 산형과의 여러해살이 풀인 당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리로서 로서 주로 뿌리가 사용된다. 당귀는 심혈(心血)과 간혈(肝血)이 부족해서 일어나는 안면창백, 입술과 손톱에 광채가 없고 머리와 눈이 어지러우면서 가슴이 뛰는 증상에 보혈 작용을 하며, 여자의 생리 조절 작용이 뛰어나고 산전 산후 질환에 통용된다. 자궁 흥분과 억제 작용을 조절하고, 단백질 합성을 촉진시키며, 비타민 E 결핍을 방지하므로 유산을 막아주고, 관상 동맥의 혈류량을 촉진시키고 적혈구의 생성을 왕성하게 하며, 항염증, 진통 작용을 나타낸다. 상기 당귀는 예로부터 부인병에 쓰이는 대표적인 약재로서 생리를 조절하고 진통 효과를 갖는다.

천궁 (Cnidium officinale)은 다년생 초본으로 높이가 40-70 cm이고, 식물체에 향기가 나는 특징을 가지고 있다. 상기 천궁의 뿌리는 불규칙한 결절상의 덩어리로서 직경이 2-7 ㎝이며 표면은 황갈색으로 거친 주름이 있고 평행으로 융기한 윤절이 여러 개 있으며 정상부에는 오목한 원형의 줄기 흔적이 있다. 그 단면은 황백색 혹은 회황색인데 황갈색의 유실이 산재해 있고 형성층은 물결 모양의 황문을 이룬다. 천궁의 뿌리는 한방에서 보혈, 강장, 진정 및 진통 등을 목표로 냉증, 빈혈 및 월경 장애 등 각종 부인병 질환에 쓰이고 있다.

숙지황(熟地黃; Rehmanniae Radix Preparata)은 현삼과에 딸린 약용식물의 뿌리를 쪄서 말린 것으로, 한방에서 약재로 사용하고 있으며, 날것을 생지황, 말린 것을 건지황이라 하며, 숙지황 중 특히 술에 담갔다가 쪄서 말리기를 9번 되풀이하여 만든 것은 구지황이라 하여 그 약효를 으뜸으로 친다. 맛은 달면서도 쓴맛이 돌고 따뜻한 성질이 있어 혈을 보(補)하고 정(精: 생명이 발생하고 활동하는 데 기본이 되는 물질)을 보충해서 허리와 무릎이 시리고 아픈 증상이나 월경이상, 어지럼증 등을 치료하고 머리를 검게 하는 효능이 있다. 숙지황은 사물탕(四物湯)의 주요 약재이며 각종 만성병 중 몸이 허약하여 나타나는 내열(內熱), 인후건조(咽喉乾燥), 갈증 등의 증상에 쓰인다. 민간요법에서는 돼지고기를 삶은 국물과 함께 복용하면 습관성 변비에 효과가 있다고 알려져 있다.

백작약은 작약(Paeonia lactiflara Pall.)의 뿌리로 패오니플로 린(paeoniflorin)이 함유되어 있고, 정유, 지방유, 탄닌, 당, 전분, 점액질, 회백질이 함유되어 있으며, 진경작용(鎭痙作用), 순환계에 대한 작용, 진통, 진정, 항경련작용, 항염, 항균작용이 있다고 알려져 있다.

갈근(葛根, Pueraria thunbergiana Benth)은 칡뿌리의 껍질을 벗겨 잘게 썰어서 소금물 또는 백반수에 담가 말린 것으로 오래전부터 식용으로 칡차, 칡죽, 미숫가루 등에 사용되었고, 약용으로 감기, 머리 아픈데, 땀이 잘 나지 않고 가슴이 답답하고 갈증나는데, 당뇨병, 설사, 이질 등의 치료에 이용되었다. 한방에서는 발한, 해열, 완화제로서 고열, 두통, 고혈압, 심부전, 설사, 어깨가 결릴 때 처방한다. 특히 동의보감에 따르면 갈근은 평하고 맛은 달며 독이 없고 풍한으로 머리 아픈 것을 낫게 하며 땀이 나게 하여 감기, 몸살, 두통에 근육을 풀어주고 땀구멍을 열어 주며 숙독을 푼다고 전한다. 또한 번갈을 멈추며 음식 맛을 나게 하고 소화를 잘 되게 하며 가슴에 열을 없애고 소장을 잘 통하게 하며 쇠붙이에 다친 것을 낫게 한다고 한다. 이러한 갈근을 푸라린, 아피제닌, 이소플라보노이드, 제니스테인, 카코네인 등의 성분을 함유하고 있으며, 이들 성분 중에서 주로 이소플라보노이드와 관련된 성분 연구가 항산화 및 간 보호 작용 면에서 많이 보고 되었다.

이에 본 발명자는 해삼의 면역 증강 효과를 한약재와 조합하여 더욱 증진시켜 줄 수 있을 것이라는 점에 착안하여 증진된 면역 증강 효과를 가지는 조성물을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 혼합 추출물이 해삼 단독의 추출물에 비해서 더 우수한 면역 증강 효과를 가진다는 점을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 조성물은 (i) 해삼, (ii) 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재, 및 (iii) 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 이용되는 해삼, 당귀, 천궁, 숙지황, 백작약, 갈근은 시 장에서 용이하게 구입하여 사용할 수 있으며, 추출에 사용되는 각각의 재료는 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연건조할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 각각의 재료를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

추출방법은 당업계 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 6의 저급알코올에 의해 추출할 수 있다. 더 바람직하게는 물 또는 에틸알코올을 이용한 추출을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 열수추출할 수 있다. 추출시 각각의 재료에 대해 개별적으로 추출하여 이를 혼합하거나, 각각의 재료를 혼합하여 추출할 수도 있다.

추출시의 각각의 재료와 추출용매의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 재료 1g에 대하여 추출용매를 8 내지 12배(중량기준)로 사용할 수 있다.

추출시 온도는 바람직하게는 30 내지 100℃일 수 있다. 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 2 내지 24시간 바람직하게는, 4 내지 16시간 일 수 있다. 또한 추출시 교반기로 교반하는 경우 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물의 제조를 위한 추출은 분쇄한 각각의 재료에 약 10배(중량비율)의 열수를 첨가하고 80℃에서 12시간 동안 가열 추출한다. 상기 추출액을 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 회수한다. 회수한 상등액은 농축한 다음 건조시켜 분말화할 수 있다.

본 발명의 추출물의 제조를 위한 재료는 해삼 20 내지 50 중량부, 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 38 내지 68 중량부 및 갈근 12 내지 18 중량부를 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 해삼 32 중량부, 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 52 중량부 및 갈근 16 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 해삼, 사물탕 약재 및 갈근의 혼합 추출물을 제조하였으며, 본 발명의 조성물과의 비교를 위하여 해삼 단독 또는 사물탕 약재 및 갈근의 혼합추출물을 각각 제조하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 조성물의 면역 증강 효과를 확인하기 위하여 대식 세포 증식능, 대식 세포의 TNF-α 및 IL-1β 분비 유도능 및 대식 세포의 산화질소 분비능을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 조성물이 해삼 단독 또는 사물탕 약재 및 갈근 혼합 추출물에 비해서도 우수한 대식 세포 증식능, 대식 세포의 TNF-α 및 IL-1β 분비 유도능 및 대식 세포의 산화질소 분비능을 가지고 있어 면역 증강 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 조성물의 독성 여부를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 조성물은 투여시 특이한 증상 및 변화를 보이지 않아 안전한 물질임을 알 수 있었다.

정상 세포에 대해서는 세포 독성을 보이지 않아 안전하게 사용이 가능함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 면역 증강을 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물과 면역 증강 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 아울러, 본 발명의 조성물은 면역 증강 효과를 증진하기 위해 이에 한정되지는 않으나, 베타카로틴, 스쿠알렌, 엽록소 제품, 화분, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B6, 비타민 C, 나이아신, 판토텐산, 아연 등의 첨가물을 추가로 함유할 수도 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 조성물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 1 내지 100중량%를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 면역 증강을 위한 목적으로 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 조성물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조 성물을 말한다.

본 발명의 면역 증강용 약학적 조성물은 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 경피 투여, 피하 내, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명의 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토 즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 면역 증강 정도의 필요에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람 직하게 본 발명의 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 조성물의 농도는 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 조성물의 면역 증강제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

해삼, 사물탕 약재 및 갈근을 포함하는 조성물의 제조

말린 해삼 32g, 사물탕 약재인 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약 각각 13g씩 총 52g 및 갈근 16g을 혼합하여 1000ml의 정제수에서 12시간동안 열수 추출하였다. 추출된 추출물을 동결건조기(Samwon Freeze Dry System, SFDSF24, Samwon, 한국)를 이용하여 -70℃～-80℃에서 동결 건조한 후 분쇄기로 분쇄함으로써 30 mesh-50 mesh의 해삼, 사물탕 약재 및 갈근을 포함하는 본 발명의 조성물의 분말을 제조하였다.

<비교예 1>

해삼 조성물의 제조

말린 해삼 32g을 320ml의 정제수에서 12시간동안 열수 추출한 후 추출된 추출물을 동결건조기(Samwon Freeze Dry System, SFDSF24, Samwon, 한국)를 이용하여 -70℃～-80℃에서 동결 건조한 후 분쇄기로 분쇄함으로써 30 mesh-50 mesh의 해삼만을 포함하는 조성물의 분말을 제조하였다.

<비교예 2>

사물탕 약재 및 갈근을 포함하는 조성물의 제조

당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약 각각 13g씩 총 52g 및 갈근 16g을 혼합하여 680ml의 정제수에서 12시간동안 열수 추출하였다. 추출된 추출물을 동결건조기(Samwon Freeze Dry System, SFDSF24, Samwon, 한국)를 이용하여 -70℃～-80℃에서 동결 건조한 후 분쇄기로 분쇄함으로써 30 mesh-50 mesh의 사물탕 약재 및 갈근을 포함하는 조성물의 분말을 제조하였다.

<실시예 2>

본 발명의 조성물의 면역 증강 효과 확인

<2-1> 대식세포 증식 효과 확인

Balb/c 마우스(6주, 수컷, 대한실험동물센터, 한국)를 대상으로 대식세포 활성화 효과를 확인하였다. 이하에서 실험동물의 사육은 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 22± 1℃, 습도 55± 5%, 12시간/12시간의 명암주기의 조건으로 이루어졌다.

실험동물을 각 군당 5마리씩으로 하여 상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조한 조성물을 1일 1회 5mg씩 경구투여하였다. 대조군으로는 식염수를 투여한 것을 사용하였다. 3일이 경과 후 대식세포를 복강 세척으로 획득하여 실험에 적용하였다. 생쥐 복강에서 회수한 대식세포 수가 1×10⁶개/㎖ 이 되도록 RPMI-1640 불완전배지(incomplete RPMI-1640 media)에 재분산시키고, 이 분산액을 96-웰 플레이트 각 웰에 200㎕씩 분주한 다음 37℃에서 2시간 동안 배양하여 대식세포를 웰에 고정시킨 후 각 웰에 RPMI-1640 완전배지(10% 우태아혈청 포함, complete RPMI-1640 media)를 가하여 24시간 동안 배양시킨 후 활성화된 대식세포의 단일층에 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 첨가하여 세포막을 용해시켜 이때 분비되는 리소좀성 포스파타아제의 양을 ELISA 판독기(ELISA reader)로 405nm에서 흡광도를 측정하여 대식세포의 활성능 정도를 평가하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이 본 발명의 조성물을 투여한 군에서는 식염수를 투여한 대조군에 비해서 대식세포의 활성이 증가되었음을 알 수 있었다. 비교예 1에서 제조한 조성물을 투여한 군에서도 대조군에 비해서 대식세포의 활성이 증가하였으나, 본 발명의 조성물을 투여한 군에 비해 그 효과는 떨어졌다. 비교예 2에서 제조한 조성물을 투여한 군에서는 음성대조군에 비해서 큰 차이를 보이지 않았다.

	대조군	실험예 1	비교예 1	비교예 2
상대적 효소활성	100	157	121	105

<2-2> 대식세포의 TNF -α 및 IL -1β 분비 유도 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 조성물이 대식세포의 증식을 촉진한다는 것을 확인하였으므로 본 발명의 조성물의 대식세포의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 TNF-α 및 IL-1β 분비 유도 효과가 있는지 알아보았다.

Balb/c 마우스(6주령)에 2개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지 (thioglycollate medium; Gibco, 미국)를 투여한 후 4일 후에 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 RPMI-1640 배지(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, 미국)을 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 이를 원심분리한 후, 96-웰 플레이트에 2×10⁵ cell/well로 분주하였다. 이를 2시간동안 배양하여 대식세포를 웰에 고정시킨 후 각 웰에 RPMI-1640 완전배지(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 우태아 혈청을 추가, Gibco, 미국)을 가하여 3일간 100% 습도, 37℃, 5％ CO₂의 조건으로 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 RPMI-1640 불완전배지하에서 대식세포들을 실시예 1에서 제조한 본 발명의 조성물 및 비교예 1 내지 2에서 제조한 조성물을 농도별로 처리하였다. 이때 양성대조군으로는 LPS(lipopolysaccharide, 10㎍/㎖, Sigma, 미국)를 사용하였으며, 음성대조군으로는 배양배지를 처리한 것을 사용하였다. 처리후 각 배양액에서 ELISA kit(Chemicon, 미국)을 사용해 제조사의 지침에 따라 TNF-α와 IL-1β의 양을 조사하였다.

그 결과, 하기 표 2(단위 : pg/ml), 표 3(단위 : pg/ml), 도 2 및 도 3에서 보듯이 본원발명의 조성물은 농도의존적으로 대식세포를 자극하여 TNF-α와 IL-1β의 분비를 촉진하였다. 또한, 본 발명의 조성물은 TNF-α와 IL-1β의 분비에 있어서 비교예 1 및 2에서 제조한 조성물에 비해 더 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

TNF-α	LPS	0μg/ml	1μg/ml	3μg/ml	10μg/ml	30μg/ml	100μg/ml
실시예 1	-	0	551	1531	1987	2578	2813
비교예 1	-	0	213	605	887	912	954
비교예 2	-	0	99	201	355	407	406
LPS	4218	-	-	-	-	-	-

IL-1β	LPS	0μg/ml	1μg/ml	3μg/ml	10μg/ml	30μg/ml	100μg/ml
실시예 1	-	0	62	85	124	183	221
비교예 1	-	0	25	41	65	89	102
비교예 2	-	0	13	24	40	61	75
LPS	252	-	-	-	-	-	-

<2-3> 대식세포의 산화질소( NO ) 생성능 조사

대식세포로부터 생성되는 NO(nitric oxide)를 측정하기 위해서 96-웰 플레이트에 대식세포(1×10⁶ 세포/㎖)를 200 ㎕씩 각 웰에 분주하고 2시간 동안 배양하여 대식세포를 각 웰에 부착시켰다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 RPMI-1640 불완전배지하에서 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조한 조성물을 농도별로 투여하고, 동시에 대식세포를 활성화시키는 LPS(2μg/ml)을 넣었다. 24시간 동안 배양한 후(37℃, CO₂ 5.0%) 생성된 산화질소(NO)의 양을 다음과 같이 그리에스(Griess)법으로 측정하였다(Rockett, K. A. et al.,. Infec. Immunity. 59(9). p3280, 1990): 배지 100 ㎕와 그리에스 시약(1% sulfanilamide + 0.2% N-naphthylethylenediamine2HCl + 2.5% H₃PO₄) 100 ㎕를 혼합하여 새로운 96-웰 플레이트에 넣고 570nm에서 ELISA 리더(ELISA reader; Bio-Tek, 미국)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 하기 표 4(단위 : μM) 및 도 4에서 보듯이, 본 발명의 조성물이 대식세포에서 산화질소의 생성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 한편, 비교예 1의 조성물도 산화질소 생성을 촉진하였으나, 본 발명의 조성물에 비해서 그 정도가 낮았으며, 비교예 2의 조성물은 대식세포에서 산화질소 생성을 그다지 유도하지 않음을 알 수 있었다.

NO	LPS	1μg/ml	3μg/ml	10μg/ml	30μg/ml	100μg/ml
실시예 1	-	1.01	1.49	2.23	2.84	3.16
비교예 1	-	0.38	0.61	0.68	0.95	1.19
비교예 2	-	0.31	0.33	0.37	0.36	0.38
LPS	0.39	-	-	-	-	-

< 실시예 3>

본 발명의 조성물의 급성 독성 실험

SPF(specific pathogen free) SD 계 랫트(6주령, 대한실험동물센터)를 각 그룹별 3마리씩 나누고, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조한 조성물을 100mg/kg체중의 용량으로 경구투여하였다. 투여후 7일간 사육하면서 생존율, 임상증상 및 체중변화를 살펴본 후 7일 후 부검하여 장기의 이상여부를 확인하였다.

그 결과, 투여된 모든 동물에서 생존율은 100%이었으며, 특이한 임상 증상 및 체중변화도 없었다. 아울러, 부검소견에서도 특이한 변화는 관찰할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 100mg/kg체중의 용량에서도 안전한 물질임을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 조성물은 해삼 단독의 추출물에 비해서 더 우수한 대식 세포 증식능, 대식 세포의 TNF-α 및 IL-1β 분비 유도능 및 대식 세포의 산화질소 분비능을 가지고 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 이용하면 면역 증강용 식품 및 약학적 조성물을 제조할 수 있다.

Claims

(i) 해삼, (ii) 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 및 (iii) 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 해삼 20 내지 50 중량부, 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 38 내지 68 중량부 및 갈근 12 내지 18 중량부의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물 또는 에틸알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
(i) 해삼, (ii) 당귀, 천궁, 숙지황 및 백작약이 동일한 비율로 혼합된 사물탕 약재 및 (iii) 갈근의 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.