KR20030063106A

KR20030063106A - 관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법

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Publication number: KR20030063106A
Application number: KR1020020086627A
Authority: KR
Inventors: 신성섭; 진미림; 정형진; 전향; 오진환; 어해관; 김봉철; 조병욱; 김선영
Original assignee: 주식회사 팬제노믹스
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-12-30
Publication date: 2003-07-28
Also published as: US7074435B2; AU2003235613A1; US20030143290A1; WO2003059370A1; KR100540033B1

Abstract

본 발명은 전통 한의학 이론에 근거하여 한방 복합 생약을 이용하여 제조한 관절염 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 관절, 특히 연골에 대한 보호 작용 및 풍, 한, 습으로 인한 관절염의 증상을 근본적으로 개선시키고자 우슬, 방풍, 천마 등 20여가지 생약재를 적정비로 혼합하여 물 또는 알코올성 수용액으로 추출한 다음, 감압 농축하여 동결 건조시켜 만든 관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 관절염 치료용 복합 생약 조성물은 독성 등의 부작용이 없으면서 관절염에 대해서는 우수한 예방 및 치료 효과를 나타내며, 상기 방법에 의해 추출된 생약재 추출물을 선택적으로 가감하여 엑스제, 액제, 산제, 환제, 정제, 캅셀제 및 패취제 등으로 제조하여 건강 기능성 식품 및 의약품으로 제조하는 것을 특징으로 하는 것으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법{Crude Drug Compositions for treating or preventing arthritic diseases and the process for preparing them}

본 발명은 복합 생약재로부터 유효활성 성분을 추출 및 정제하는 방법과 그 추출물을 함유한 생약 조성물 및 이를 이용한 항관절염 치료법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우슬, 방풍, 천마 등 23가지 생약재를 적정비로 혼합하여 열수 혹은 알코올성 수용액으로 추출 농축함으로써 관절연골 보호효과를 가지는 관절염 치료법 및 상기 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

관절염은 크게 골관절염 (퇴행성 관절염, Osteoarthritis)과 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 구분된다.

골관절염은 퇴행성 관절염이라고도 불리우는 가장 흔히 볼 수 있는 관절염으로 중년 또는 노년에 주로 발생하고, 무릎 관절과 엉덩이 관절과 같이 체중을 많이 받는 관절에 통증, 강직감 및 점진적인 운동장애 등을 초래하는 질환이다. 원인으로는 과거에는 단순히 나이가 들어서 발생하는 노화현상으로 생각하였으나 현재는여러 가지 원인이 있는 것으로 알려져 있는데, 한가지 원인이 아니라 연령, 유전적 요소, 비만, 관절의 모양, 호르몬 등의 여러 가지 원인이 복합적으로 이루어짐으로써 증상이 다르게 나타나는 것으로 생각되고 있다. 골관절염은 주로 관절연골(cartilage)의 손상에 관여하는데, 연골의 손상에 주로 관여하는 것으로 알려진 매트릭스 메탈로프로테나제 (matrix metalloproteinases, MMPs)가 작용하여 연골조직을 파괴하게 되며, 그 주위의 뼈에 퇴행성 변화를 일으킨다. 또한, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨-1(IL-1), 종양괴사인자-α(TNF-α) 등을 유도시키게 되는데 이로 인하여 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다(Fernandes J. C. et al.,The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology,39, pp237-46, 2002).

반면에, 류마티스성 관절염 (Rheumatoid arthritis)은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 관절염에 걸린 환자의 경우, 관절의 활막 (synovial membrane) 조직이 증생(hyperplasia)되며 동시에 대식세포(macrophage), 수상세포(dendritic cell) 및 활성화된 T 림프구와 B 림프구가 활막 조직으로 이동하고 다형핵 세포(polymorphonuclear cell)는 활액(synovial fluid) 내와 연골(cartilage) 표면에 축적되어 염증을 유발하게 된다. 이같은 활막 조직의 염증은 알려지지 않은 자가항원에 대해 반응성이 있는 T 림프구가 유발하는 것으로 생각되고 있다. 그럼에도 불구하고 대부분의 조직에 침윤된 T 림프구는 세포 표면에 활성화 표지를 나타내지 않으며 사이토카인(cytokine)을 거의 발현하지도 않는다. 이와 대조적으로 류마티스성 관절염 증상을 가진 활막조직과 활액에는 대식세포 (macrophage)에서 유래된 사이토카인들이 매우 많이 관찰되고 있다. 이러한 사이토카인으로는 활막 섬유 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려진 인터루킨-1 (IL-1), 종양괴사인자-α(TNF-α) 등이 있다. 이러한 실험 결과들은 T 림프구가 활막 조직의 염증을 유발하는 데 매우 중요하며, 이후의 염증 증상은 활성화된 활막 세포들로부터 유래된 사이토카인에 의해 유지된다는 가설을 제시한다(Carson D.A. et al.,J. Clin. Invest.,87, pp379-383, 1991 : Tighe H. et al.,J. Exp. Med.,177, pp10-118, 1993 : Burmester G. R. et al., Arthritis Rheum, 40, pp5-18, 1997 : Panayi G. S.,Curr. Opin. Rheumatol.,9, pp236-240, 1997).

또한, 활막 조직의 증생은 관절염에 있어서 혈관이 없는 연골부에 발생하는 결합조직층인 판누스 (pannus)를 형성하여 질환 관절의 연골과 골조직을 비가역적으로 파괴하게 되는데, 여기에는 연골조직 파괴인자로 알려진 매트릭스 메탈로프로테나제(MMPs) 등이 작용하여 연골조직이 파괴되게 된다.

이상과 같이 골관절염 및 류마티스성 관절염 등 모든 관절염 치료의 이상적인 목표는 질환 관절의 연골과 골조직을 보호 유지시키는 것이다. 따라서 연골을 보호유지시키는데 관여하는 사이토카인으로 알려진 IL-4(Interleukin-4)를 활성화시키면 연골 보호에 효과가 있을 것으로 예상된다(Kim S. H. et al.,J. Immunol.,166, pp3499-3505, 2001). 이외에도 연골조직 파괴인자로 잘 알려진 MMPs가 있고, 이 효소의 저해제로 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)가 있다. MMP 중에서도 MMP-2는 평상시에 결합조직의 개조(remodeling)에 중요한 생리적 활성을 나타내지만, 관절염이 발생한 관절에 있어서는 심각한 조직 손상을 유도하므로, 이MMP-2를 억제시킴과 동시에 이 효소의 저해제인 TIMP-2의 유도활성을 갖는 약물을 개발한다면 관절염에 있어서 가장 중요한 증상중의 하나인 연골파괴를 막을 수 있을뿐만 아니라 이로 인한 환자의 심각한 고통도 예방할 수 있을 것이다 (Mengshol J. A. et al.,Arthritis Rheum.,46, pp13-20, 2002). 아직까지 이런 기전을 이용한 관절염 치료제는 개발되어 있지 않으며, 지금까지 사용된 약품들도 효과가 매우 제한적이어서 일단 관절염이 발생하면 환자의 심각한 고통은 물론 경제적 손실을 가져오고 있다.

현재 사용되고 있는 골관절염 및 류마티스 관절염의 치료방법은 다음과 같다. 초기 치료에 많이 사용되는 약물은 비스테로이드성 소염제 (NSAID: non-steroidal anti-inflammatory drug)로서, 이들 NSAID들은 증세를 약간 호전시키기는 하지만 관절부위 연골 손실이나 질병의 진행을 막을 수는 없으며, 부작용이 심하게 나타나 이 치료법을 사용하는 환자의 절반 가량이 1년 이내에 치료를 중단해야만 한다. 다음 단계로는 금을 포함하는 화합물 약제 (gold drugs; gold sodium thiomalate, gold sodium thiosulfate)나 페니실아민 (penicillamine), 항말라리아제 (anti-malarials)와 같은 항관절염 제제 (disease modifying anti-rheumatic drugs; DMARDs) 등이 사용된다. 그러나 이 제재들 역시 관절염의 진행을 다소 감소시키지만 심각한 부작용을 동반할 수 있기 때문에 DMARD를 이용한 치료법이 시작된 5년 이후에는 5-15% 환자만이 이 약물들의 사용을 고수한다. 이상의 치료제가 더 이상 효과를 보이지 않을 경우에는 류마티스가 발생한 관절부위를 외관절 시술에 의해 인공관절로 교체해야만 하는 경우도 있다(Simon L. S.,Int. J. Clin.Pract.,54, pp243-249, 2000).

이와는 별도로 최근에는 생약재를 이용한 관절염 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있으며 의약품 개발도 이루어지고 있으나 아직까지는 염증반응 억제에 주로 치중하여 개발되고 있는 실정이다. 이처럼 현재까지 개발되어 사용되고 있는 관절염 치료제의 대부분은 관절질환의 연골과 골조직을 보호 유지시키는데 주목하여 고안되었다기 보다는 오히려 염증반응을 억제시키는 것이었으며, 대부분의 경우는 미미한 치료 효과만을 나타내는 한계를 갖고 있었다.

본 발명에서 제시하는 주성분인 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교, 위령선을 비롯하여 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인, 방풍, 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자 등 이상 23가지 생약재들은 일반적으로 한약재로서 널리 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 독성 등의 부작용이 적은 특징을 갖고 있다.

이들 각각의 생약들의 특성과 구체적인 작용을 살펴보면 다음과 같다.

모과(木瓜)는 장미과(Rosaceae)의 모과나무(Chaenomeles sinensisKOEHNE) 또는 명자나무(Chaenomeles speciosaNAKAI)의 성숙한 열매를 건조한 것을 일컫는 것으로서, 예로부터 한방에서는 모과가 비위를 조화시키며 습을 제거하는 약물로 인식되어 급성 위장병, 각기병, 근육통, 관절염, 신경통에 효험있는 약재로 처방되고 있으며 진해, 거담, 폐렴, 기관지염 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp132-134, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp314-315, 1998).

당귀(當歸)는 미나리과(Umbelliferae)의 참당귀(Angelica gigasNAKAI)의 뿌리를 건조한 것을 일컫는 것으로, 중국에서는 당귀(Angelica sinensisDIELS)의 뿌리를 건조한 것을 사용하며, 일본에서는 일당귀(Angelica acutilobaKITAGAWA)의 뿌리를 건조한 것을 사용하여 왔다. 당귀는 보혈, 활혈의 효능과 허를 보충하는 작용으로 혈병의 요약으로서 부인의 산후병, 빈혈, 두통 등의 치료에 효과적으로 처방되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp409-411, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp684-686, 1998).

천궁(川芎)은 미나리과(Umbelliferae) 속 식물로서, 그 종류로는 한국자생의 천궁(Cnidium officinaleMAKINO), 야생품인 토천궁(Ligusticum wallichiiFRANCH var.officinaleYOOK), 일본 천궁(Angelica genuflexaMUTT) 및 중국산 천궁(Ligusticum chuaxiongHORT)의 근경을 일컫는 것으로서, 예로부터 당귀와 더불어 산부인과의 요약으로 빈혈, 두통, 보혈강장 등 각종 처방에 배합되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp418-420, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp479-481, 1998).

우슬(牛膝)은 비름과(Amaranthaceae)의 쇠무릎(Achyranthes japonicaMiq. NAKAI)의 지하부를 일컫는 것으로, 회우슬(Achyranthes bidendataBLUME) 및 천우슬(Cyathula officinalisKUAN)의 뿌리 두가지가 상용된다. 예로부터 우슬은 몸의 냉기와 습기를 제거함으로써 관절을 통하게 하여 활혈, 통경의 작용이 있고 근골을 튼튼히 하여 보간, 익신의 효능이 있다고 알려져 있다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp240-242, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp504-507,1998).

천마(天麻)는 난초과(Orchidaceae)의 천마(Gastrodia elataBLUME)의 근경 외피를 제거하고 쪄서 건조한 것을 일컫는 말로, 예로부터 두통의 요약으로 분류되어 두통, 어지러움 등의 치료에 사용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp424-425, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp602-604, 1998).

오가피(五加皮)는 오갈피나무과(Araliaceae)의 오갈피나무(Acanthopanax gracilistylusW. W. SMITH)의 근피이며, 일반적으로 남오가피라고 칭한다. 한방에서는 거풍습, 강근골하는 효능이 잘 알려져 있으며 이수작용이 있어서 수종 등을 치료하는데 응용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp283-285, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp320-321, 1998).

홍화(紅花)는 국화과(Compositae)의 잇꽃(Carthamus tinctoriusL.)의 관상화를 건조한 것을 일컫는 말로, 여름에 꽃이 피어 꽃색이 누런색에서 새빨갛게 변할 때 따서 서늘한 곳에 말려서 사용하며, 한방에서는 부인병, 냉증, 갱년기 장애 등의 혈행 장애 치료에 사용한다고 알려져 있다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp343-345, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp501-502, 1998).

계피(桂皮)는 녹나무과(Lauraceae)의 계수나무(Cinnamomum cassiaBLUME,Cinnamomum aromaticumNees)의 수피를 그대로 사용하거나 또는 주피를 제거한 것을 말하며, 특이한 향기와 달고 매운맛을 지녀 한방에서는 감기, 진통, 진경 등에 많이 배합하여 사용해 왔다(현대생약학, 생약학연구회, 학창사, pp154-158, 1993).

속단(續斷)은 꿀풀과(Labiatae)의 속단(Phlomis umbrosaTURCZ.)의 뿌리를칭하는 것으로, 혈맥을 통하게 하는 작용이 강하여 타박, 골절 등의 증상을 치료하는데 사용하고, 또한 조직재생을 촉진하는 작용이 알려져 있다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp232-233, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp662-663, 1998).

진교(秦)는 용담과(Gentianceae)의 큰잎용담(Gentiana macrophyllaPALLAS)의 뿌리이며, 한방에서는 거풍습, 청허열 등의 효능이 알려져 있어서 수족마비 등의 질환에 응용되어 사용해 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp391-393, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp311-313, 1998).

위령선(威靈仙)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)의 으아리(Clematis mandshuricaMAX.)의 뿌리이며, 예로부터 통풍의 요약으로 사용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp303-305, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp309-310, 1998).

의이인(薏苡仁)은 벼과(Gramineae)의 율무(Coix lacryma-jobiL. var.mayuenSTAPF)의 종피를 제거한 성숙한 종자를 일컫는 말이며, 한방에서는 풍, 습, 비통을 치료하는 데에 사용하며 설사 등을 치료하는 데에도 사용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp316-319, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp347-349, 1998).

방풍(防風)은 미나리과(Umbelliferae)의 방풍(Ledebouriella seseloidesWOLF.)의 뿌리를 건조한 것을 일컫는 말이며, 한방에서는 습을 치료하며 풍병의 주약으로 알려져 있다. 해열, 진통약으로 감기, 두통, 관절통, 사지경련, 파상풍 등에 유용하게 사용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp160-161, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp169-171, 1998).

추가적으로 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자 등의 생약들도 강근골하고 거풍습하는 작용이 있음은 잘 밝혀져 있는 사실이다.

이상과 같이 이들 각각의 생약들은 각종 상처나 종기, 폐렴, 기관지염 등 급 만성염증과 빈혈, 두통, 감기 및 신경통 등에 일반적으로 사용되는 약재들로 구성되어 있으며, 각각의 생약재들은 고유한 약리작용 및 주효능을 지니고 있다. 그러나 지금까지는 이들 각각의 생약들은 단방 생약으로서의 효능과 유효성분 분리 및 제조방법에 대해서만 연구되어 왔으며, 또한 간혹 몇가지 약재들을 혼합하여 사용해 관절염에 대한 치료효과를 보려는 시도가 있었지만 이들의 관절염 치료에 대한 약효가 과학적으로 입증될만한 것이 못되었고 그 효과도 미비하였다. 더구나 관절염 치료의 핵심인 관절의 연골과 골조직을 보호 유지시키고 재생시키는 것에 초점이 맞추어져 있지 않았다.

이에 본 발명자는 상기 복합생약제로부터 이들 각각의 생약들의 특성과 효능을 최대한 살리고 관절염에 대한 치료효과 특히 연골 보호 작용을 극대화시키기 위하여 한방의 원리에 근거한 거풍습, 강근골, 활혈 및 조직재생 촉진작용을 중심으로 100여종의 후보 생약을 선정하여 이를 바탕으로 관절염 치료에 대한 검정 실험을 거쳐 괄목한 만한 관절염 치료효과를 갖는 생약들의 배합을 찾아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 관절염의 치료, 연골 보호 및 관절염의 악화를 억제하는 복합생약 조성물을 제공하는 것이다.

도 1 은 본 발명의 실시예 1 내지 3의 복합생약 조성물인 PG201-1, 201-2 및 PG201-3을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 2 는 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 실험 과정 및 생약조성물을 처리하여 유발된 관절염의 예방 및 치료 과정을 나타낸 모식도이고,

도 3 은 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델에서 PG201-1 및 PG201-2의 투여로 인한 관절염의 효과적인 발생 예방률을 나타낸 그래프이고,

도 4a 는 PG201-1과 PG201-2에 의한 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 발부종 치료효과를 시간의 경과에 따른 관절의 붓기 정도(Paw Thickness) 측정으로 나타낸 그래프이고, 도 4b는 PG201-1과 PG201-2에 의한 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 발부종에 대한 치료효과를 시간 경과에 따른 관절염 진행 단계(Index Grade) 측정으로 나타낸 그래프이며,

도 5a, 도 5c 및 도 5e는 각각 음성 대조군, PG201-1 및 PG201-2 투여군의콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 무릎 조직에서의 활막세포 (synovial fibroblasts) 증생정도를 조사한 사진이고, 도 5b, 도 5d 및 도 5f는 각각 음성 대조군, PG201-1 및 PG201-2 투여군의 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 무릎 조직에서의 연골 손상 정도를 조사한 사진이며,

도 6a 는 PG201-1과 PG201-2에 의해 발목관절에서의 염증성 사이토카인인 TNF-α의 농도 억제효과를 나타낸 그래프이고, 도 6b는 PG201-1과 PG201-2에 의해 발목관절에서의 염증성 사이토카인인 IL-1β의 농도 억제효과를 나타낸 그래프이며,

도 7 은 PG201-1과 PG201-2에 의해 연골을 보호 유지시키는 데 관여하는 IL-4 (Interleukin-4) 사이토카인의 활성효과를 나타낸 그래프이며,

도 8 은 연골보호인자인 TIMP-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2)와 연골파괴인자인 MMP-2(Matrix metalloproteinase-2)의 혈액내 상대적 비율을 나타낸 그래프이며,

도 9a 는 PG201-2의 농도에 따른 관절염 발생율을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 PG201-2의 농도에 따른 관절염 지수의 변화를 나타낸 그래프이며,

도 10 은 골관절염 환자의 활막세포에서 PG201-1 및 PG201-3에 의한 염증성 사이토카인인 IL-6의 억제효과를 나타내는 그래프이고,

도 11 은 류마티즘 환자의 활막세포에서 PG201-1 및 PG201-3에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8의 억제효과를 나타내는 그래프이고,

도 12a 는 신장상피세포인(normal kidney epitherium) 293 세포주에서PG201-1 및 PG201-3에 의한 염증성 전사인자인 NF-κB의 억제효과를 보여주는 그래프이고, 도 12b 는 동일 세포주에서 PG201-1 및 PG201-3에 의한 AP-1의 억제효과를 보여주는 그래프이며, 도 12c 는 동일 세포주에서 PG201-1 및 PG201-3에 의한 CREB-1의 억제효과를 보여주는 그래프이고, 도 12d 는 동일 세포주에서 PG201-1 및 PG201-3에 의한 ISRE의 억제효과를 보여주는 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기에 있어서, 모과(木瓜)는 모과나무(Chaenomeles sinensisKOEHNE) 및 대체가능한 동속 근연식물인 명자나무(Chaenomeles speciosaNAKAI), 참명자나무(Chaenomeles lagenariaKOIDZ), 풀명자나무(Chaenomeles japonicaSPACH) 또는 채노멜레스 티베티카(Chaenomeles thibetica)의 과실(果實)을 포함한다.

상기의 우슬(牛膝)은 대체가능한 쇠무릎(Achyranthes japonicaNAKAI), 회우슬(Achyranthes bidentataBL.), 천우슬(Cyathula officinalisKUAN) 및 홍우슬(Cyathula capitata)의 근(根)을 포함한다.

상기의 오가피(五加皮)는 오가피나무(Acanthopanax gracilistylusW. W. Smith) 및 대체가능한 동속 근연 식물인 참오갈피나무(Acanthopanax sessiliflorusSEEM.), 섬오갈피(Acanthopanax koreannumNAKAI), 털오갈피(Acanthopanax rufinerveNAKAI), 가시오갈피(Acanthopanax senticosusHARMS),왕가시오갈피(Acanthopanax senticosusvar.koreanusNAKAI), 서울오갈피(Acanthopanax seoulenseNAKAI) 및 당오갈피(Acanthopanax sieboldianumMAKINO)의 잎, 열매, 줄기 및 뿌리를 포함한다.

상기의 속단(續斷)은 대체가능한 속단(Phlomis umbrosaTURCZ.), 산속단(Phlomis koraiensisNAKAI), 속단(Dipsacus japonicusMIQ.), 천속단(Dipsacus asper), 딥사커스 치넨시스(Dipsacus chinensis) 및 티젤(Dipsacus fullonum)의 근(根)을 포함한다.

상기의 진교는 큰잎용담(Gentiana macrophyllaPALLAS) 및 대체가능한 동속 근연식물인 초용담(Gentiana scabraBUNGE var.buergeriMAX.), 젠티아나 만슈리카(Gentiana manshurica) 및 젠티아나 루티아(Gentiana lutea)의 근(根)을 포함한다.

상기의 위령선(威靈仙)은 으아리(Clematis mandshuricaRUPR.) 및 대체가능한 동속 근연식물인 누른종덩굴(Clematis chiisanensis), 할미밀망(Clematis trifloraCHUNG), 클레마티스 치넨시스(Clematis chinensisRetz.) 및 클레마티스 아르만디(Clematis armandii)의 근(根)을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 필수 복합생약 즉, 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선 이외에 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 진피, 의이인, 방풍, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자로 구성된 군으로부터 선택된 생약추출물을 추가적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기에 있어서, 천궁(川芎)은 천궁(Cnidium officinaleMAKINO), 중국산 천궁(Ligusticum chuanxiongHORT), 토천궁(Ligusticum wallichiiFRANCH var.officinaleYOOK), 리구스티쿰 몬니에리(Ligusticum monnieri), 리구스티쿰 자포니쿰(Ligusticum japonicum) 및 리구스티쿰 루시둠(Ligusticum lucidum)의 근경(根莖)을 포함한다.

상기의 홍화(紅花)는 잇꽃(Carthamus tinctoriusL.)의 건조된 관상화 뿐만 아니라 종자를 포함하며, 상기의 방풍(防風)은 방풍(Ledebouriella seseloidesWOLF.), 식방풍(Peucedanum japonicumTHUNB.), 토당귀(Peucedanum decursivumMAXIM.) 및 퓨스다눔 오스트러티움(Peucedanum ostruthium)의 근(根)을 포함한다.

추가적으로 본 발명은 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선의 배합비가 1 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 인 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 생약들은 당업계에서 자명하고 본 발명의 예방 및 치료 목적과 동일 또는 유사한 용도로 사용할 수 있는 동속 생약들을 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 추출물의 양은 전체 조성물의 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량비를 갖는 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 관절염 치료를 위한 복합 생약 추출물은 물 또는 알콜성 수용액으로 추출하는 것을 특징으로 하는데, 좀 더 구체적으로 설명하면,

1) 건조 상태의 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 재료의 표면에존재하는 이물질 등을 제거하기 위하여 세척한 다음 건조기에서 말린 후, 적절한 배합비, 바람직하게는 1 : 1 : 1 : 0.5 내지 2 : 0.5 내지 2 : 0.5 내지 2의 중량비로 혼합하거나 또는 기타 추가 가능한 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인 및 방풍 등의 생약들을 적정한 비율로 혼합한 다음, 이 복합 생약들의 5 내지 20배, 바람직하게는 10 내지 15배 부피/중량의 증류수, 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 증류수 단독 또는 10 내지 50% 물과 에탄올의 혼합용매를 가하여, 0 내지 상온, 바람직하게는 4 내지 10℃의 온도에서 12시간 내지 5개월간, 바람직하게는 1 내지 3개월 동안 냉침을 하거나, 80 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 이상의 추출온도에서 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 열수 추출법으로 추출 총량의 10 내지 50배의 물로 2 내지 5회 동안 추출하여 극성 용매에 가용한 복합생약 추출물을 얻는 제 1단계,

2) 상기 추출 단계로부터 수득한 추출액을 여과한 후, 이를 40 내지 80℃에서 감압 농축하여 얻어진 엑스를 엑스 총량의 10~60배의 물로 1 내지 5회 공비 농축한 다음, 동결건조 혹은 진공건조, 바람직하게는 동결건조하여 분말엑스를 만드는 단계를 거쳐서 제조하는 제 2단계를 포함하는 제조공정으로부터 얻어질 수 있다.

본 발명은 기본적으로 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선이 1 : 1 : 1 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 의 중량비로 혼합되고, 이외에 필요에 따라 기타 생약재들이 적정비로 혼합되어 이루어진 혼합생약으로부터 추출한 복합 생약조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에서 관절염 치료효과를 효과적으로 유지하는 범위 내에서 복합생약들을 적절하게 그 구성생약을 첨가하거나 혹은 삭제하거나, 그 배합비를 적절하게 가감할 수 있으며, 본 발명의 목적에 적합하게 사용될 수 있는 것들을 포함한다.

상기의 관절염은 급성, 만성 류마티스, 위축성 관절염, 만성 염증성 관절염, 변형성 관절염, 감염성 관절염, 폐경기 관절염, 단절성 관절염, 비대증 관절염, 화농성 관절염 또는 결핵성 관절염에 의한 관절염 및 퇴행성 골관절염 질환을 포함한다.

또한, 본 발명은 관절염 질환 환자를 치료하기 위한 관절염 치료제를 제조하기 위해 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 상기 복합생약추출물의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 제법으로 제조된 분말엑스를 유효성분으로 함유하는 소염진통제를 제공한다.

본 발명은 상기 복합생약으로 이루어진 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인체를 포함한 포유동물들의 관절염을 치료하는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 관절염 치료용 복합생약조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 생약조성물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 생약조성물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 생약조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제(isotonic agents), 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 생약조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 10g의 양, 바람직하게는 1 내지 5g의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 생약조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 생약조성물을 이용한 관절염의 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 복합생약 추출물들을 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델을 이용하여 관절염에 대한 치료 및 예방 효과를 시험하여 본 결과, 음성대조군(100%)에 비해 본 발명의 복합생약 조성물인 PG201-1 및 PG201-2 투여군은 발목 관절부위의 붓기 정도가 현저히 감소하였고, 임상적 의의가 있는 관절염(염증 2단계 이상) 발생율도 대조군(55%)에 비해 현저히 감소함을 확인하였으며, 또한 무릎 관절부위의 조직학적인 소견으로도 음성대조군에 비해 연골 조직의 손상 정도가 현저히 감소하여 본 발명의 관절염의 발생 억제 및 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다. 경구 투여에 사용되는 기재는 멸균수나 생리식염수 같은 음용수를 사용하였으며, 소주 같은 음용 가능한 알콜을 상기 기재에 첨가하여 알콜성 수용액 등으로도 사용하였다.

특히, 음성 대조군에 비해 본 발명의 복합생약 조성물들이 연골 보호 작용이 알려진 혈액내 IL-4(Interleukin-4)의 수치를 2배 이상 증가시켰으며, 더욱이 관절염이 발생한 관절에 있어서 심각한 조직손상을 유도하는 주요한 매트릭스 메탈로프로테나제인 MMP-2를 억제시켰고, 이들 효소의 저해제로 작용하는 대표적인 TIMP-2를 활성화시킴을 확인하였다.

또한, 복합 생약조성물인 PG201-1 및 PG201-3을 골관절염 및 류마티스 관절염 환자의 활막세포(synovial fibroblasts)에 처리하였을때, 관절염의 진행정도에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인들인 IL-6과 IL-8 등이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 복합 생약조성물인 PG201-2를 가지고 여러 증상의 관절염 환자들에게 임상실험을 수행하였을 때 골관절염 및 류마티스 관절염 환자 중 50% 이상의 치료효과를 보였으며, 기타 여러 관절통 환자중 70% 이상의 치료효과를 보였다.

즉, 본 발명의 관절염 치료용 복합 생약조성물은 관절염에 있어서 가장 중요한 증상중 하나인 연골파괴에 관여하는 인자들을 조절함으로써 연골파괴를 막을 수 있으며, 이로 인해 모든 관절염 환자에 이용될 수 있고 연골파괴로 인해 고통에 시달리는 환자에게 근본적인 치료를 제공할 수 있어 바람직하다.

또한, 본 발명은 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 예방을 위한 건강 기능성 식품을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 필수 복합생약 즉, 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선 이외에 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인, 방풍, 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자로 구성된 군으로부터 선택된 생약을 추가적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 예방을 위한 건강 기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기의 건강 기능성 식품은 건강을 위한 건강식품, 건강음료, 첨가물 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 복합생약 추출물은 각종 관절염의 예방 등의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.1 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 1~30g, 바람직하게는 3 ~ 10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 크실리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

건강식품용 개발을 위하여 본 발명의 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 음료류, 껌류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명은 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 가축사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 필수 복합생약 즉, 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선 이외에 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인, 방풍, 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자로 구성된 군으로부터 선택된 생약을 추가적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 가축사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 조성물은 통상의 가축사료로 사용되어 가축에게 약효가 검증된 생약재를 투여함으로써 항생제를 대체할 수 있어 청정 육제품을 생산하여 국민 건강을 지킬 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 열수추출법에 의한 극성용매 가용추출물의 제조(PG201-1)

(1-1) 물 용매를 이용한 열수추출법

경동시장에서 구입하고 경희대학교 한약학실로부터 검증을 받은 건조하여 분쇄한 상태의 생약재, 즉 모과, 우슬, 오가피 및 계피를 각각 80g씩 동량으로 혼합하고 여기에 진교, 위령선, 당귀, 천궁, 천마 및 홍화를 50g씩 혼합하고, 속단 및 방풍을 40g씩 혼합한 다음 분쇄기로 완전히 가루가 될 때까지 분쇄하였다. 이 혼합 생약재에 10ℓ의 증류수를 가하여 잘 교반한 다음 90 내지 95℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고, 같은 방법으로 3회에 걸쳐 여액을 모아 55~65℃로 생약추출물을 감압농축한 후, 동결건조시켜 생약조성물 분말 엑스 70g을 얻었다(도 1 참조).

(1-2) 물-알콜 혼합용매를 이용한 열수추출법

상기 실시예 1-1의 분쇄된 혼합 생약재에 10ℓ의 25% 알콜을 가해 잘 교반한 다음, 열을 가해 90 내지 95℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고, 같은 방법으로 3회에 걸쳐 여액을 모아 55~65℃에서 생약추출물을 감압농축한 후, 동결건조시켜 생약조성물 분말 엑스 (PG201-1) 70g을 얻어 이를 시료로 사용하였다(도 1 참조).

실시예 2. 냉침 추출법에 의한 극성용매 가용추출물의 제조(PG201-2)

실시예 1-1과 동일한 구성의 혼합 생약재에 10ℓ의 25% 알콜을 가해 잘 교반한 다음에 4℃ 냉장고에서 3개월, 6개월 그리고 12개월 동안 냉침시켜 유효성분을 추출한 후, 여액을 여과하여 55~65℃로 생약추출물을 감압농축한 다음에 동결건조시켜 생약조성물 분말 엑스(PG201-2) 70g을 얻어 이를 시료로 사용하였다(도 1 참조).

실시예 3. 냉침 추출법에 의한 극성용매 가용추출물의 제조(PG201-3)

상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 각각 80g씩 동량으로 혼합하여 10ℓ의 25% 알콜을 가해 잘 교반한 다음, 상온에서 2일 이상 교반추출한 후, 여액을 여과하여 55~65℃로 생약추출물을 감압농축한 다음에 동결건조시켜 생약조성물 분말 엑스(PG201-3) 45g을 얻어 이를 시료로 사용하였다(도 1 참조).

참고예 1. 추출 방법 및 추출단계별 생약 수득량의 비교

실시예 1 내지 실시예 2의 제조방법과 동일하게 복합 생약재들을 혼합하고 열수 추출 및 냉침 추출을 각각 3회씩 실시하여, 각 추출횟수 및 추출기간에 따른 단계별 수득량을 전체 수득량에 대한 백분율로 나타내었다(표 1 참조).

열수 추출물 및 냉침 추출물의 추출조건에 따른 추출양의 비교

추출 방법	1차	2차	3차
실시예 1 추출법(열수 추출)	물단독	65 %	25 %	10 %
실시예 1 추출법(열수 추출)	혼합용매	70 %	25 %	5 %
실시예 2 추출법(냉침 추출)	3개월	65 %	25 %	10 %
	6개월	70 %	25 %	5 %
	12개월	70 %	25 %	5 %

실험 결과, 물과 알콜의 혼합용매를 이용한 열수 추출법 및 물과 알콜의 혼합용매를 이용한 장기간의 냉침 추출법은 모두 2차 추출만으로 전체 수득량의 90% 이상이 추출되는 것을 알 수 있었으며, 결과적으로 3차 이상의 추출법은 비경제적임을 확인할 수 있었다.

실험예 1. 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델을 이용한 관절염 치료 효과실험

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 추출물들의 관절염 치료효과를 알아보기 위하여 하기 문헌의 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델 실험을 응용하여 실험을 실시하였다(Courtenay J. S., et al.,Nature,283, pp666-668, 1980 ; Kim J. M. et al.,Arthritis Rheum,46, pp793-801, 2002).

1. 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델의 제조

콜라겐-유도 관절염 (collagen-induced arthritis, CIA) 마우스 모델은 인간의 류마티스성 관절염과 유사한 특징을 지닌 자가면역질환계열의 관절염 모델로서, 하기와 같이 제조하였다.

소의 2형 콜라겐 (Chondrex사, 미국) 100㎍을 프로인트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant, GibcoBRL, 미국)에 혼합하여 에멀젼화 (emusification)한 후, 이 에멀젼화된 콜라겐 용액을 9 내지 10 주령의 DBA/1 마우스 (Jackson Laboratory사, 미국)의 꼬리 부위에 피내 주사하여 면역시켰다. 1차 면역 후 21일째에 소의 2형 콜라겐 100㎍을 프로인트 불완전 보조제 (Freund's incomplete adjuvant, GibcoBRL, 미국)에 혼합하여 에멀젼화한 후, 꼬리 부위에 피내 주사하여 2차 면역(boosting) 반응을 유도하였으며, 2차 면역 후 1~2주가 지나면 관절염 증상이 점차적으로 나타나기 시작하였다(도 2 참조).

2. 1차 면역 반응 유도 실시후의 관절염 예방효과 실험

1차 면역 반응 유도 후, 그 다음 날로부터 매일같이 경구 투여용 존대를 이용하여 시험물질을 경구 투여하였다. 그룹 당 10마리의 마우스를 선택한 후, 한 그룹은 실시예 1의 생약조성물 PG201-1을 멸균수를 이용해 2㎎/㎖ 농도로 만든 후, 이 중 100㎕를 경구 투여하였고, 또 다른 그룹은 실시예 2의 생약조성물 PG201-2를 25% 에탄올을 이용하여 2㎎/㎖ 농도로 만든 후, 이 중 100㎕를 경구 투여하였다. 한편, 음성대조군으로는 음용수만을 경구 투여하였으며, 또 다른 음성대조군으로 25% 알코올만을 역시 경구 투여하였다. 이후 관절염 진행 추이를 살피며 관절 부위 종창(joint swelling)과 같은 육안적 소견, 관절 부위 활막 세포의 증생 정도, 연골 손상도 측정과 같은 조직학적 소견 및 관절부위 연골 손상 및 보호 관련 사이토카인 레벨과 같은 분자 생물학적 소견 등을 조사하여 관절염의 심화 정도를 측정하였다. 이상과 같이 관절염의 심화 정도를 측정했을 때, 연골 손상을 가져오는 관절염의 진행정도(Index Grade)가 2 이상인 것을 관절염 발생 기준으로 삼아서 관절염의 발생율을 백분율로 환산하였다(도 3 참조).

3. 2차 면역반응 후의 관절염 치료효과 실험

2차 면역 반응 유도 후, 그 다음 날로부터 매일같이 20일 동안 경구 투여용 존대를 이용하여 시험물질을 경구 투여하였다. 그룹 당 10마리의 마우스를 선택한 후, 한 그룹은 실시예 1의 PG201-1을 멸균수를 이용해 2㎎/㎖ 농도로 만든 후, 이 중 100㎕를 경구 투여하였고, 또 다른 그룹은 실시예 2의 PG201-2를 25% 에탄올를 이용해 2㎎/㎖ 농도로 만든 후 이 중 100㎕를 경구 투여하였다. 한편, 음성대조군으로는 음용수만을 경구 투여하였고, 또 다른 음성대조군으로 25% 에탄올만을 역시 경구 투여하였다. 이후 관절염 진행 추이를 살피며 관절 부위 종창(joint swelling)과 같은 육안적 소견, 관절 부위 활막 세포의 증생 정도, 연골 손상도 측정과 같은 조직학적 소견 및 관절부위 연골 손상 및 보호 관련 사이토카인 레벨과 같은 분자 생물학적 소견 등을 조사하여 관절염의 심화 정도를 측정하였다. 이상과 같이 관절염의 심화 정도를 측정했을 때, 시간에 따른 관절염의 치료 정도를 관절의 붓기 정도(Paw Thickness)와 관절염 진행 단계(Index Grade)를 기준으로 나타내었다(도 4a 및 도 4b 참조).

4. 관절염 심화 정도 측정

(4-1) 측정 방법

류마티스성 관절염의 병리 중 가장 중요한 점은 관절 활막세포의 증생과 이로 인한 연골조직의 비가역적 파괴로 요약될 수 있으며, 이 활막세포의 증생과 연골조직 손상의 진행을 판정하기 위해, 조직학적 분석이 가장 유효하다.

상기 관절염 심화 정도를 측정하기 위한 지표들의 구체적인 판정 또는 측정 방법들로서 각 음성대조군, PG201-1 및 PG201-2 투여군의 무릎 관절을 분리하여 조직학적 분석을 수행하였다.

마우스의 무릎 조직을 분리한 후 10% 완충 포르말린 용액 (10% formalin in PBS)을 이용하여 고정하고, 10% EDTA 용액을 이용하여 칼슘제거과정 (decalcification)을 거친 후에 파라핀에 고정하였다. 이후 7㎛의 표준 정면 절편을 만들고 헤마톡실린/에오신 (Hematoxylin/Eosin) 또는 사프라닌-O/패스트그린 (Safranin O/fast green) 염색을 수행하였다 (Bakker A. C. et al., Arthritis and Rheumatism, 40, pp893-900, 1997 ; Apparailly Florence et al.,J. Immunol., 160, pp5213-5220, 1998).

활막세포의 증생 정도는 헤마톡실린/에오신 염색의 결과를 바탕으로 하기 논문에서 제시한 기준에 따라 정상은 0, 가벼운 염증과 미약한 활막의 증생은 1, 판누스의 형성과 중증도 이상의 활막 증생은 2로 분류하였으며, 활막세포의 증생 정도가 2 이상인 경우를 관절염 발생으로 판정하였다(Apparailly Florence et al.,J. Immunol., 160, pp5213-5220, 1998 ; Lubberts Erik et al.,J. Immunol., 163,pp4546-4556, 1999).

연골 손상의 정도는 사프라닌-O/패스트그린 염색의 결과를 바탕으로 하기 논문에서 제시한 기준에 따라 정상은 0, 연골세포의 공포화 (vacuolation) 및 프로테오글라이칸 (proteoglycan)의 미약한 소실은 1, 상기 1의 증상에 더하여 연골 미란(erosion)이 관찰되면 2, 두 군데 이상의 연골 미란 및 연골하층 (subchondral layer)의 파괴는 3으로 분류하였으며, 이중 2 이상을 관절염 발생으로 판정하였다(Lubberts Erik et al.,J. Immunol., 163, pp4546-4556, 1999).

발목 부위의 관절염 진행은 관절 부위 종창과 같은 육안적 소견과 연골 손상 및 보호와 관련된 사이토카인의 발현량과 같은 분자생물학적 소견으로 판단하였다.

관절 부위 종창은 육안 소견을 바탕으로 하기 논문에서 제시한 기준에 따라 정상은 0, 종창 및 미약한 발적은 1, 현저한 발적 및 종창은 2, 창상을 동반한 심한 수종은 3으로 분류하였으며, 이 중 2 이상인 경우를 관절염 발생으로 판정하였다(Apparailly Florence et al.,J. Immunol., 160, pp5213-5220, 1998).

연골 보호 유지에 주로 작용하는 사이토카인인 IL-4(Interleukin-4)의 혈액내 수치, 연골 손상을 유지시키는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 MMP-2의 혈청 및 발목 관절 부위내 발현량을 ELISA 리더 (VERSAmax, Molecular Devices사, 미국)를 이용하여 측정하였으며, 연골 손상을 억제시키는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 MMP의 저해제인 TIMP-2의 혈청 및 발목 관절 부위내 발현량도 ELISA 리더를 이용하여 측정하였고, 관절조직 단백질 1g당 10ng 이상의 MMP-2가 나타나는 경우를 관절염 발생으로 분류하였다.

(4-2) 실험 결과

본 발명의 복합생약조성물의 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델을 이용한 관절염 예방 및 치료 효과를 관절 부위의 육안적 소견, 조직학적 소견 및 분자생물학적 소견 결과를 이용하여 확인하였다.

마우스의 뒷다리 발목 관절 부위의 종창(joint swelling) 정도를 조사한 결과, PG201-1 및 PG201-2 투여군이 음성대조군에 비해 종창 정도가 현저히 낮게 나타났다. 즉, 종창 정도를 기준으로 하여 관절염 발생률을 조사하였을 경우, 음성대조군의 경우 관절염 발생률이 55%인 반면에 PG201-1 및 PG201-2 투여군은 각각 15% 및 25%를 나타내었으며, 이로서 본 발명의 생약조성물 투여가 관절염 발생률을 현저히 감소시킴을 확인할 수 있었다(표 2 및 도 3 참조).

또한, 마우스의 뒷다리 발목 관절 부위의 붓기(Paw thickness) 정도와 관절염 진행 지수를 조사한 결과, PG201-1 및 PG201-2 투여군이 음성대조군에 비해 유의적으로 발목 관절부위의 붓기와 관절염 진행지수를 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 4a 및 도 4b 참조).

또한, 마우스의 뒷다리 무릎 관절부위의 연골조직 손상정도를 기준으로 관절염 발생률을 조사하였을 때, 음성대조군은 90%인 반면에 PG201-1 및 PG201-2 투여군은 각각 15% 및 25%로 본 발명의 생약조성물 투여가 관절염 발생률을 현저히 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d, 도 5e 및 도 5f 참조).

또한, 마우스의 뒷다리 무릎 관절부위의 연골조직 염증정도를 직접적으로 나타내주는 사이토카인의 수치를 조사한 결과, PG201-1 및 PG201-2 투여군은 TNF-α수치를 유의적으로 감소하였으며, 특히 PG201-2는 약 10% 정도로 감소하였고, 동일한 결과로서 PG201-1 및 PG201-2 투여군이 대조군에 비해 IL-1β수치를 절반 이하로 감소하였다(도 6a 및 도 6b 참조).

또한, 연골 조직을 보호 및 유지시키는 데 주로 작용하는 IL-4의 수치를 조사한 결과, PG201-1 및 PG201-2 투여군이 대조군에 비해 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 7 참조).

또한, 연골 손상을 유도시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 MMP-2 및 이의 저해제인 TIMP-2의 혈액내 발현량을 혈액내 MMP-2 대비 TIMP-2의 비율로 측정한 결과, 본 발명의 PG201-2 투여군이 대조군에 비해 두 배 이상 증가함을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

이외에 상기의 관절염 모델에서 PG201-2의 농도를 5㎎/㎏에서 300㎎/㎏까지 용량별로 처리하여 실시한 결과, PG201-2 농도가 10㎎/㎏ 이상에서 관절염 치료효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 9a 및 도 9b 참조).

이상의 결과들을 종합할 때, 복합 생약조성물을 꾸준히 매일같이 경구 투여하게 되면, 관절염을 유도시킨 무릎 관절과 발목 관절부위에서의 관절염 발생률이 현저히 감소하고, 관절의 손상 및 보호와 관련된 사이토카인들의 생체내 조절을 통해 관절염의 진행을 저해하고 연골을 보호 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.

	발목관절종창(%)	관절연골손상(%)	MMP-2 검출(%)
음성대조군	55	90	85
PG201-1	15	38	46
PG201-2	25	41	41

실험예 2. 활맥세포에서의 염증성 사이토카인들의 억제 효과 실험

상기 실시예 1 및 실시예 3에서 제조된 복합생약 조성물인 PG201-1 및 PG201-3의 관절염 치료효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

1 명의 정상인, 2 명의 류마티스 관절염 환자 및 1 명의 골관절염 환자의 무릎관절을 절제한 후, 활액(synovium)을 효소분해법으로 분리하였다(Takaynagi H, et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,240,pp279-286, 1997). 즉, 1㎎/㎖의 콜라게나제(Boehringer-Mannheim사, 미국)와 0.15㎎/㎖의 DNA 분해효소(DNAse) Ⅰ이 들어있는 배지로 90분 동안 교반하면서 인큐베이션한 후, 70㎛ 세포 여과기(cell strainer, Falcon사, 미국)로 여과하여 현탁한 세포주를 피콜/파큐(Ficoll/Paque, AmershamBiosciences사, 스웨덴) 용액에 올려놓고 400g에서 30분 동안 원심분리하여 순수 활막세포를 얻어 세포주를 생리식염수로 세척하였다. 분리된 세포를 20%(v/v) FBS/DMEM(GibcoBRL사, 미국) 배지로 분주하여 37℃ 의 온도, 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 조건에서 배양하였다. 분리된 세포를 1×10⁵개씩 24 웰 플레이트에 분주하여 IL-1β를 1ng/㎖로 1시간 처리한 후, 시험 약물들을 처리하여 48시간 동안 배양하였으며, 이때 PG201-1 및 PG201-3은 100㎍/㎖, 항류마티스제 메토트렉세이트(methotrexate)는 5㎍/㎖, 관절연골 생성을 촉진하는 글루코사민(glucosamine)은 100㎍/㎖ 농도로 각각 세포주에 처리하였으며, 48시간 배양후 세포상층액을 수거하여 염증성 사이토카인들인 IL-6 및 IL-8 등의 사이토카인을 ELISA 리더(VERSAmax, Molecular Devices사, 미국)로 측정하였다(Inoue H, et al.,Acta. Pol. Pharm.,57, pp238-139, 2000 ; Shikhman A.R. et al.,J. Immunol.,166, pp5155-5160, 2001).

상기와 같이 골관절염 및 류마티스 관절염의 진행정도에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인들인 IL-6와 IL-8을 측정한 결과, PG201-1 및 PG201-3을 투여한 군이 기존에 사용하는 항관절염 제제의 하나인 메토트렉세이트(MTX) 투여군에 비해 그 수치가 비슷하거나 더 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(도 10 및 도 11 참조).

실험예 3. 신장상피 293 세포주에서의 염증성 전사인자 억제 및 조절작용

상기한 PG201-1 및 PG201-3의 관절염 치료효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

신장상피(normal kidney epithelium) 293 세포주 (ATCC사, 미국)를 10⁵개/웰로 24웰 플레이트에 분주하여 6시간 이상 안정화시킨 후, 루시퍼라제 리포터(Luciferase reporter)가 클로닝된 DNA 플라스미드인 NF-κB, AP-1, CREB-1, ISRE 등을 리포좀이 없는 지질형(non-liposomal lipid formulation)인 에펙텐(Effectene, QIAGEN사, 미국)으로 형질감염시켰다(Maekawa K, et al.,Inflamm. Res.,48(11), pp575-581, 1999). 24시간 배양후, 배지를 제거하고 약물처리를 하여 다시 24시간 배양한 다음 세포를 수득하여 용해시킨 후, 루시퍼라제 리포터 시험법 시스템(Luciferase reporter assay system; Promega사, 미국)으로 반응하여 화학발광기(chemiluminometer, Victor1420, Wallac사, 미국)로 NF-κB, AP-1, CREB-1, ISRE의 활성을 측정하였으며, 이때 처리한 PG201-1 및 PG201-3 등의 시험약물 농도는 상기 실험예 2와 동일하였다(Firestein G. S. et al.,Arthritis Rheum,42, pp609-621, 1999 ; Casola A., et al.,Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.,283, pp1280-1290, 2002 ; Gouze J. N. et al.,FEBS Lett.,510, pp166-170, 2002).

실험 결과, 본 발명의 PG201-1 및 PG201-3은 관절염 진행정도와 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 염증성 전사인자들인 NF-κB, AP-1, CREB-1, ISRE 등의 활성을 음성대조군에 비해 유의적으로 억제함을 확인할 수 있었다(도 12a, 도 12b, 도 12c 및 도 12d 참조).

실험예 4. 관절염의 임상실험효과

본 발명의 실시예 2에서 제조된 PG201-2에 대한 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, 여러 종류의 관절염 환자를 대상으로 하기와 같은 임상실험(Human study)을 실시하였다.

2001년 1월부터 2002년 10월까지 23세 내지 82세 사이의 성인남녀 환자 71명을 증상에 따라 1 내지 12개월 동안 PG201-2를 매일 복용하게 하였으며, 투여후 증상의 개선정도는 통증완화 및 관절의 운동성 증진 등을 종합적으로 평가하였다

본 발명의 복합생약 조성물인 PG201-2 투여시에 유의할만한 부작용이 관찰되지 않았으며, 결과적으로 PG201-2는 골관절염 및 류마티스 관절염 환자에서 50% 이상의 치료효과를 보였으며, 기타 여러 관절통 환자에서 70% 이상의 치료 효과를 보였다(표 3 참조).

PG201-2의 임상실험 결과

증상(N=71)	개선 정도	병원진단여부
증상(N=71)	20% 미만	병원진단여부	20 ~ 25%	50% 이상
골관절염 (퇴행성 관절염 질환)N=17	6 (35.3%)	4 (23.5%)	7 (41.2%)	Ｏ
류마티스 관절염N=4	2 (50.0%)		2 (50.0%)	Ｏ
요통, 디스크, 좌골신경통N=13	1 (7.7%)	4 (30.8%)	8 (61.5%)	Ｏ
일반적인 관절통 (무릎, 손목, 허리, 어깨 부위)N=37	4 (10.8%)	2 (5.4%)	31 (83.8%)	X

실험예 5. 독성 실험

래트를 사용하여 생약조성물인 PG201-2의 급성독성 시험을 실시하였다.

108.3 내지 126.0g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Sprague-Dawley, Biogenomics사) 래트를 암수 각각 5마리씩 2군으로 나누어 본 발명의 생약조성물인 PG201-2를 각각 8000㎎/㎏의 용량으로 경구투여한 후, 14일 동안 독성여부를 관찰하였다.

실험 결과, PG201-2는 그 투여 가능 용량인 8000㎎/㎏에서 사망예를 전혀 관찰할 수 없었으며, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없어 안전한 약물임을 확인할 수 있었다.

하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 복합생약조성물100 ㎎

소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎

메틸파라벤0.8 ㎎

프로필파라벤0.1 ㎎

주사용 멸균증류수적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2의 복합생약조성물200 ㎎

유당100 ㎎

전분100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 3의 복합생약조성물100 ㎎

유당50 ㎎

전분50 ㎎

탈크2 ㎎

스테아린산마그네슘적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 3의 복합생약조성물1000 ㎎

설탕20 g

이성화당20 g

레몬향적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 기능성 식품의 제조

실시예 2의 복합생약조성물1000 ㎎

비타민 혼합물적량

비타민 A 아세테이트70 ㎍

비타민 E1.0 ㎎

비타민 B10.13 ㎎

비타민 B20.15 ㎎

비타민 B60.5 ㎎

비타민 B120.2 ㎍

비타민 C10 ㎎

비오틴10 ㎍

니코틴산아미드1.7 ㎎

엽산50 ㎍

판토텐산 칼슘0.5 ㎎

무기질 혼합물적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연0.82 ㎎

탄산마그네슘25.3 ㎎

제1인산칼륨15 ㎎

제2인산칼슘55 ㎎

구연산칼륨90 ㎎

탄산칼슘100 ㎎

염화마그네슘24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 기능성 음료의 제조

실시예 1의 복합생약조성물1000 ㎎

구연산1000 ㎎

올리고당100 g

매실농축액2 g

타우린1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 87℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2㎖용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

본 발명이 제공하는 복합 생약조성물들은 종창의 감소와 같은 육안적 소견 뿐만 아니라 활막 조직의 증생 억제, 연골 손상 관련 사이토카인의 조절로 인한 연골 조직의 손상 감소 등의 분자생물학적 및 조직학적 소견에서도 관절염의 진행을 현저히 억제하므로, 현재까지는 효과적인 치료법이 제시되지 않고 있는 관절염의 치료에 효과적이고 안전하게 사용될 수 있다.

Claims

모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 필수 복합생약 이외에 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인, 방풍, 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자로 구성된 군으로부터 선택된 생약추출물을 추가적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
제 1항에 있어서, 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선의 배합비가 1 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 인 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 관절염은 급성, 만성 류마티스, 위축성 관절염, 만성 염증성 관절염, 변형성 관절염, 감염성 관절염, 폐경기 관절염, 단절성 관절염, 비대증 관절염, 화농성 관절염 또는 결핵성 관절염에 의한 관절염 및퇴행성 골관절염 질환을 포함하는 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추출물 양이 전체 조성물의 0.01 내지 95% 중량비를 갖는 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 약제학적으로 사용되는 제제 형태가 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 액제, 주사제 중에서 선택된 어느 하나인 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 복합생약 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 건조 상태의 복합생약들을 건조한 후, 적절한 배합비로 혼합하고, 이 복합 생약들의 5 내지 20배 부피/중량의 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매를 가하여, 0℃ 내지 상온에서 12시간 내지 5개월간 냉침을 하거나, 80 내지 100℃의 추출온도에서 1시간 내지 24시간 동안 열수추출법으로 2 내지 5회 동안 추출하여 극성 용매에 가용한 추출물을 얻는 제 1단계, 이 단계로부터 수득한 추출물을 여과한 후, 40 내지 80℃에서 감압 농축하여 얻어진 엑스를 엑스 총량의 10~60배의 물로 1 내지 5회 공비 농축한 다음, 동결건조 또는 진공건조를 통하여 분말엑스를 제조하는 제 2단계로 이루어짐을 특징으로 하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선의 배합비가 1 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 인 제조방법.
제 7항에 있어서, 증류수를 추출용매로 추출하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 10 내지 50% 물과 에탄올의 혼합용매를 추출용매로 사용하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 4 내지 10℃에서 냉침으로 추출하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 1 내지 3개월 동안 냉침으로 추출하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 90℃ 이상의 온도에서 열수 추출하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 3 내지 5시간 동안 열수 추출하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 엑스 총량의 10 내지 50배의 물로 2~3회 공비농축하는 제조방법.
제 1항 또는 제 2항의 복합생약추출물 분말엑스를 유효성분으로 함유하는 소염진통제.
모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교 및 위령선을 필수적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 예방을 위한 건강 기능성 식품.
제 17항에 있어서, 상기 필수 복합생약에 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피, 의이인, 방풍, 진피, 창출, 인동, 목통, 골담초, 감초, 강활, 도인, 두충 및 사상자로 구성된 생약군으로부터 선택된 생약을 추가적으로 포함하는 복합생약 추출물을 함유하는 관절염 예방을 위한 건강 기능성 식품.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강 기능성 식품.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 첨가제의 비율이 전체조성물 100 중량부 당 1 내지 약 20 중량부인 건강 기능성 식품.