KR102557352B1 - 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 생열귀나무 추출물은 치주인대 세포의 증식을 촉진하고, 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키며, 광화작용(mineralization)을 증진하는 효과가 있고, 염증매개인자인 산화질소, 인터루킨-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 및 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는데 우수한 효과가 있다.
또한, 본 발명의 생열귀나무의 추출물은 치주염 유발 동물모델에서 CEJ-ABC 및 Furcation involvement 거리를 감소시켜 치주 질환의 예방 및 치료에 실제로 효과를 나타내는 것이 확인되었으며, 식품, 및 의약품 분야에서 치주 질환의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
본 발명의 생열귀나무 추출물은 치주인대 세포의 증식을 촉진하고, 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키며, 광화작용(mineralization)을 증진하는 효과가 있고, 염증매개인자인 산화질소, 인터루킨-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 및 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는데 우수한 효과가 있다.
또한, 본 발명의 생열귀나무의 추출물은 치주염 유발 동물모델에서 CEJ-ABC 및 Furcation involvement 거리를 감소시켜 치주 질환의 예방 및 치료에 실제로 효과를 나타내는 것이 확인되었으며, 식품, 및 의약품 분야에서 치주 질환의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
Description
본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치주 질환이란 치아 주변을 둘러싸고 있는 치주 인대와 치은 등의 연조직과 치조골 등의 경조직을 파괴하는 염증성 질환과 관련된 증상들을 포함하여 일컫는다.
연령이 증가함에 따라 선천적, 후천적으로 치조골 등이 악화될 경우 치주 질환이 발병하게 되며, 대표적인 치주 질환은 치주염(periodontal inflammation), 치은염(gingivitis), 및 치조골 형성장애(alveolar bone osteodystrophy) 등이 있다. 치은염은 잇몸의 연조직에 염증이 생기는 초기 치주 질환으로 비교적 증상이 가볍고 회복이 가역적인 상태이다. 치주염은 치은염이 치료되지 않고 염증이 잇몸과 치골 주변까지 진행되는 경우로 세균의 독소에 의해 자극된 만성 염증 반응이 진전되면 잇몸과 치아 사이에서 분리되어 감염된 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어져서 결국, 치주 인대에 염증이 생기게 되고 골소실이 일어난다. 또한, 치조골에서 조골세포에 의한 골형성과 파골세포에 의한 골흡수의 대사가 여러 가지 요인에 의해 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면 치조골다공증과 같은 치조골형성장애가 발생한다.
이러한 치주 질환 중, 치주염은 구강 내에서 발병 가능한 질병들 중에서 전 세계적으로 성인 인구에 있어서 가장 흔한 구강 질환 중 하나일 뿐만 아니라, 의료 관리 체계에 상당한 비용을 요구하는 주요한 공중 보건적 관심 사항이다.
치주 질환의 치료는 환자의 개선된 구강위생의 확립, 비외과적 혹은 외과적인 치석제거술, 치근활택술, 치은소파술과 신부착을 응용한 치주 조직의 재생술 등이 이용되었다. 그러나 이런 외과적인 치료 방법은 치료가 번거로우며 효과적인 치료가 어렵고 또한 병의 예방보다는 병이 어느 정도 진행되었을 경우 행하는 치료에 국한되어 있으므로, 치료를 하지 않을 때에는 대부분이 만성으로 진행되는 경우가 대부분이다. 또한, 부가적인 치료로 전신적인 항생제의 복용과 국소 서방형 제재가 사용되었으나, 불필요한 부위에도 약물이 너무 많이 전달되어 그로 인한 부작용과 최근 사용되는 항생제에 대한 내성을 나타내는 치주 질환균이 분리된 예가 보고되고 있어 심각한 문제점을 안고 있다.
또한, 치주 질환의 진행에 있어서 산화질소(NO), IL-1β, MMP-1, TNF-α와 같은 염증 매개 인자들이 증가하고, 이러한 인자들이 골 흡수를 유발하는데 강력한 작용을 하는 인자임이 밝혀져 있으므로 현재까지의 치주 질환 관련 연구는 상기 염증 매개인자들의 조절에 관련한 것이 대부분이다. 게다가, 치주 질환은 일반적인 염증, 관절염 등과 다르게 치조골의 손실, 염증, 진지발리스와 같은 치주염균에 의한 복합적인 유발원인을 가지는 특징이 있어, 항균 및 항염증, 치조골의 골형성을 촉진시키거나 골흡수를 억제하는 작용을 함께 나타내는 등의 복합적 연구 및 치료 방법이 필요하나, 이러한 치료를 위한 약물 연구 내지 치료법은 아직까지 개발되어 있지 않으며, 치주 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 약물 또는 치료제에 대한 개발이 필요한 실정이다.
또한, 최근 부작용이 적고 치료 효과는 개선한 천연물들이 주목을 받으면서, 다양한 치주 질환의 예방 또는 치료 목적으로 한 천연 추출물들의 개발이 필요한 실정이나, 아직까지 생열귀나무에 대한 치주 질환의 치료 또는 예방 효과에 대하여 알려진 바는 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 다양한 식물 추출물들을 대상으로 치주 질환의 치료 또는 예방 효과를 연구하였으며, 생열귀나무 추출물이 치조골의 골형성을 획기적으로 증가시키는 한편, 염증매개 인자의 생성을 억제시키는 활성이 있어, 이로 인해 천연소재인 생열귀나무 추출물 단독으로도 치주 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 치주 질환의 예방 또는 치료에 뛰어난 효과를 나타내는 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 치주 질환의 예방에 뛰어난 효과를 나타내는 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 치주 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 천연소재에서 유래한 물질을 탐색하기 위하여 다년간 실험을 수행하였고, 수백 종의 다양한 식물 추출물에 대한 치주 질환 효과를 검증하였다. 그 결과, 생열귀나무 추출물이 치주인대 세포(PDLC, Periodontal ligament progenitor cells)의 증식을 촉진하고, 산화질소의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타내며, 치주 인대 세포의 분화 지표인 알칼리성 포스파타아제의 활성을 증가시키고, 조골세포 및 치주 인대 세포에서 광화작용(mineralization)을 증진시켜 치주질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하고 본 발병을 완성하였다.
본 발명은 조성물은 부작용이 없이 안전한 천연 식물 소재 유래의 생열귀나무의 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 및 치료용 조성물로, 인체에 적용 시에도 부작용이 없이 안전하다.
본 발명의 "생열귀나무(Rosa davurica Pall.)"는 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 낙엽관목을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 생열귀나무 추출물이 퀘르세틴(Quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol 3,4-di-O-glucoside) 엘라그산(Ellagic acid), 및 아피제닌(Apigenin)을 다량으로 함유하는 것을 확인한 바 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 생열귀나무의 추출 처리로 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 생열귀나무의 추출에 있어서, 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 추출방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 생열귀나무를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 열수 추출 또는 냉침 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 생열귀나무를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다. 본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 생열귀나무의 추출물은 생열귀나무의 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매 중 어느 하나 이상의 부위에서 추출이 가능하다. 또한, 상기 생열귀나무 추출물은 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물에서도 추출이 가능하다.
본 발명에서, 상기 생열귀나무 추출물은 그 자체로 치주 질환의 예방 또는 치료 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 치주 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치조골 파손(alveolar bone breakage), 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy) 등을 예로 들 수 있고, 상기 치조골형성장애는 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia), 또는 치조골감소증(alveolar bone osteopenia)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 생열귀나무 추출물은 산화질소의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 생열귀나무 추출물이 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매의 모든 부위의 추출물에서 산화질소의 생성을 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 확인한 바 있다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 생열귀나무 추출물은 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL)에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 생열귀나무 추출물이 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매의 모든 부위의 추출물에서 인간 치주 인대 세포(HPDL Cell)와 조골세포(MG63 cell)에서 증가한 알칼리성 포스파타아제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 생열귀나무 추출물은 광화작용(mineralization)의 증진시키는 것을 특징으로 하는데, 조골세포에서 생열귀나무 추출물이 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매의 모든 부위의 추출물을 처리한 시험군에서 옥수수불검화 추출물을 처리한 양성대조군에 비해 증진된 광화작용이 확인할 수 있었다(도 5 참조).
또한, 본 발명의 생열귀나무 추출물은 백서 동물 모델에서 실제 치주염 개선효과가 있으며(도 6 및 도 7 참조), 염증성 사이토카인인 IL-1β, MMP-1 및 TNF-α의 발현을 억제하는 효과가 있다(도 8 참조).
본 발명의 상기 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물 형태일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있으며, 산제, 정제, 캅셀제, 주사제 및 액제인 것이 보다 바람직하다. 이러한 제제화는 약제학 분야에서 통상적으로 행하여지는 방법으로 수행될 수 있으며, Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 추가되는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 포함한다.
경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있고, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 경구용 조성물에 있어서 상기 산제, 정제, 캅셀제 등의 제형 이외에 예컨대 필름, 치약, 구강 양치 용액, 연고제, 분무제, 드레싱 용액, 도포제, 치실 또는 치주 포대 등으로 제형화 될 수 있다.
비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 생열귀나무 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 사용 방법 및 사용 목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 생열귀나무 추출물의 일일 투여량은 약 0.1 내지 500mg/kg으로 바람직하게는 50~200mg/kg이다. 본 발명의 약학적 조성물은 치주 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술 및 약물치료를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 생열귀나무 추출물은 세포 독성이 없고, 산화질소의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타내며, 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL)에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키고, 광화작용(mineralization)의 증진시키며, 염증성 사이토카인인 IL-1β, MMP-1 및 TNF-α의 발현을 억제하는 효과가 있으므로, 치주 질환의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 생열귀나무 추출물과 치주 질환의 예방 또는 개선에 대한 효과는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 생열귀나무 추출물의 분획물 또는 이의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미하며, 구체적으로 치주 질환의 예방 또는 개선의 효과를 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식용가능한 생열귀나무 추출물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL)의 광화작용(mineralization)을 증진시키고, 치주인대 세포의 증식을 촉진시키며, 치주 염증 질환의 개선에 뛰어나 효과가 있으므로, 치주 질환의 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 생열귀나무 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 치주 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 치주 질환을 예방 또는 치료시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 치주 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 치료 방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료 방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 치주 질환을 갖는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "인간을 제외한 동물"은 본 발명에 따른 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 치주 질환을 갖는 인간을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 치주 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 치료 대상 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 내지 500㎎/㎏이고, 바람직하게는 50 내지 200㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 자체적으로 치주 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으므로 치주 질환의 예방 및 치료용 조성물로 바로 이용될 수 있고, 치주 질환에 효과가 있는 천연 추출물들을 함유하는 다른 성분과 혼합하여 사용하는 형태로 이용이 가능하여, 이를 통해 치주 질환의 예방 및 치료 효과를 좀 더 높여줄 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 생열귀나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 생열귀나무 추출물은 치주인대 세포의 증식을 촉진하고, 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키며, 광화작용(mineralization)을 증진하는 효과가 있고, 염증매개인자인 산화질소, 인터루킨-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 및 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는데 우수한 효과가 있다.
(3) 또한, 본 발명의 생열귀나무의 추출물은 치주염 유발 동물모델에서 CEJ-ABC 및 Furcation involvement 거리를 감소시켜 치주 질환의 예방 및 치료에 실제로 효과를 나타내는 것이 확인되었으며, 식품, 및 의약품 분야에서 치주 질환의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
도 1은 생열귀나무의 추출물의 유효성분들을 HPLC를 사용하여 측정한 결과 그래프이다(맨 위에서부터 표준(A), 전초(B), 잎(C), 줄기(D), 뿌리(E), 및 열매(F)에 대한 그래프이고, Peak 1은 퀘르세틴, peak 2는 캠퍼롤, peak 3은 엘라그산에 대한 피크임).
도 2는 생열귀나무의 추출물의 처리에 따른 치주인대 세포(HPDL)의 세포 생존율 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 p-value<0.001임).
도 3은 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따라 염증 매개인자인 산화질소의 생성 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 Normal 군과 비교하여 p-value<0.001을 나타낸 것이고, ###은 LPS 단독처리군과 비교하여 p-value<0.001임).
도 4는 조골세포 및 치주인대 세포에서 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따른 알칼리성 포스파타아제(ALP, alkaline phosphatase)의 활성 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(도 4에서, ***는 p-value<0.001임).
도 5는 조골세포 및 치주인대 세포에서 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따른 광화작용 활성(Mineralization activity) 변화를 정리하여 나타낸 그래프이다(도 5에서, ***는 p-value<0.001임).
도 6은 생열귀나무 추출물의 처리에 따른 백서 모델에서의 치주염 개선 효과를 확인한 2D 및 3D 도면 사진이다.
도 7은 도 6의 도면으로부터 계산한 제1 대구치와 제2 대구치 끝단에서의 CEJ-ABC 수치와 Furcation Involvement 수치를 나타낸 그래프이다(**는 p-value< 0.01이고, ***는 p-value< 0.001임).
도 8은 생열귀나무 추출물의 처리에 따른 염증 매개인자인 IL-1β, MMP-1, 및 TNF-α의 발현량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 Normal 군과 비교하여 p-value<0.001을 나타낸 것이고, ##은 LPS 단독처리군과 비교하여 p-value<0.01을 나타낸 것이며, ###은 p-value<0.001을 나타낸 것임).
도 2는 생열귀나무의 추출물의 처리에 따른 치주인대 세포(HPDL)의 세포 생존율 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 p-value<0.001임).
도 3은 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따라 염증 매개인자인 산화질소의 생성 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 Normal 군과 비교하여 p-value<0.001을 나타낸 것이고, ###은 LPS 단독처리군과 비교하여 p-value<0.001임).
도 4는 조골세포 및 치주인대 세포에서 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따른 알칼리성 포스파타아제(ALP, alkaline phosphatase)의 활성 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(도 4에서, ***는 p-value<0.001임).
도 5는 조골세포 및 치주인대 세포에서 생열귀나무의 부위별 추출물의 처리에 따른 광화작용 활성(Mineralization activity) 변화를 정리하여 나타낸 그래프이다(도 5에서, ***는 p-value<0.001임).
도 6은 생열귀나무 추출물의 처리에 따른 백서 모델에서의 치주염 개선 효과를 확인한 2D 및 3D 도면 사진이다.
도 7은 도 6의 도면으로부터 계산한 제1 대구치와 제2 대구치 끝단에서의 CEJ-ABC 수치와 Furcation Involvement 수치를 나타낸 그래프이다(**는 p-value< 0.01이고, ***는 p-value< 0.001임).
도 8은 생열귀나무 추출물의 처리에 따른 염증 매개인자인 IL-1β, MMP-1, 및 TNF-α의 발현량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다(***는 Normal 군과 비교하여 p-value<0.001을 나타낸 것이고, ##은 LPS 단독처리군과 비교하여 p-value<0.01을 나타낸 것이며, ###은 p-value<0.001을 나타낸 것임).
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기에 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 또한, 하기에서 기재된 실험 결과에 따른 대조군, 비교군 및 실험군들 간의 유의성은 One-Way ANOVA로 검증하였다.
실시예 1. 생열귀나무 추출물의 제조
제조예 1-1. 생열귀나무 전초 추출물의 제조
생열귀나무의 전초(원산지: 국내산, 구입처:원삼로즈힙㈜)를 흐르는 물에 세척하여 불순물을 제거한 후, 생열귀나무의 전초 100g에 30% 에탄올 수용액 1L를 가하여 1일간 실온에서 교반훈 후 1시간 초음파하여 추출하였다. 상기 과정은 3-Batch로 진행하였다. 얻어진 추출액을 모은 후, 40℃ 이하에서 감압 농축한 후, 동결건조하여 분말형태로 제조하였다(제조예 1).
제조예 1-2. 생열귀나무 잎 추출물의 제조
생열귀나무의 잎을 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 생열귀나무 잎 추출물을 제조하였다.
제조예 1-3. 생열귀나무 줄기 추출물의 제조
생열귀나무의 줄기를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 생열귀나무 줄기 추출물을 제조하였다.
제조예 1-4. 생열귀나무 뿌리 추출물의 제조
생열귀나무의 뿌리를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 생열귀나무 뿌리 추출물을 제조하였다.
제조예 1-5. 생열귀나무 열매 추출물의 제조
생열귀나무의 열매를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 생열귀나무 열매 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 생열귀나무 추출물의 성분분석
상기 실시예 1에서 제조한 생열귀나무 추출물들의 지표 성분의 함량을 비교 분석하였다.
고속 액체크로마토 그래피 분석은 Thermo UHPLC U3000을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Sunfire TM C18 column(Waters, 250×4.6mm, 5μm)을 이용하였으며, 컬럼 온도는 30℃로 하였다. UV 파장은 280nm에서 측정하였으며 이동상은 0.1% 포름산이 포함된 물과 아세토나이트릴(gradient mode)을 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 생열귀나무 추출물(제조예 1-1 내지 1-5)은 이동상 용매에 1mg/ml의 농도로 용해하여 10uL를 주입한 후 유속 1ml/min으로 측정하였다. 상기 추출물의 지표성분 함량을 하기 [표 1]에 나타내었다.
[표 1]
상기 [표 1] 및 [도 1]을 참조하면, 생열귀나무의 전초는 퀘르세틴(Quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol 3,4-di-O-glucoside) 엘라그산(Ellagic acid) 및 아피제닌(Apigenin)이 다량 함유되어 있는 것으로 분석되었다.
또한, 다른 부위와 다르게 생열귀나무 잎은 퀘르세틴(Quercetin) 및 캠퍼롤(Kaempferol 3,4-di-O-glucoside)이, 생열귀나무 뿌리는 아피제닌(Apigenin)이 다량 함유되어 있는 것으로 분석되었다.
실험예 1. 생열귀나무 추출물의 치주인대 세포 증식 활성
실시예 1에서 제조한 제조예 1-1 내지 제조예 1-5의 생열귀나무 추출물이 인간 치주인대 세포(PDLC, Periodontal ligament progenitor cells)의 증식에 미치는 영향을 측정하였다.
구체적으로, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, Cambrex, USA)에서 배양한 치주인대 세포를 96 well plate에 0.5 × 104 cells/ml 농도로 접종한 후, 이산화탄소 항온 배양기(5% CO2, 95% 상대습도, 37℃)에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 생열귀나무의 추출물(제조예 1-1 내지 제조예 1-5)을 10ug/ml 및 100ug/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 5mg/㎖의 MTT 시약 20㎕를 상기 배양액에 넣고 37℃, 5% CO2 습윤 조건 하에서 4시간 동안 배양하였다.
배양 시, 살아있는 세포에는 보라색의 크리스탈이 형성된다.
4시간 배양 후 배지를 제거하고 DMSO 100㎕를 넣어 10분 동안 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 크리스탈을 녹인 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포 성장의 정도를 측정하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며, 실험 결과를 도 2에 정리하였다.
도 2를 참조하면, 생열귀나무의 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 열매 추출물은 대조군으로 사용한 옥수수불검화 추출물보다 각각 111%, 114%, 109%, 110%, 및 108% 증가한 치주인대 세포에 대한 증식 촉진 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해 본 발명의 생열귀나무 추출물이 치주인대 세포를 활성화하고, 세포 증식을 촉진하여 치주염 등의 치주 질환에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 생열귀나무 추출물의 항염증 활성
실시예 1에서 제조한 제조예 1-1 내지 제조예 1-5의 생열귀나무 추출물이 NO 생성에 미치는 활성을 측정하였다.
실험은 Sherman 등의 방법(Sherman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, p1301 - 1308, 1993)을 변형하여 LPS(Lipopolysaccharide)로 활성화를 유도한 쥐 단핵구/대식세포 세포주(RAW 264.7, 미국 세포주 은행 ATCC #TIB-71)를 대상으로 산화질소(NO)의 안정한 산화 생성물인 질산이온(NO3 -)의 생성에 미치는 생열귀나무 추출물의 영향을 아래와 같이 측정하였다.
구체적으로 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, Cambrex, USA)에서 배양한 RAW 264.7 세포를 48 well plate에 2.5 × 105 cells/ml 농도로 접종한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 활성화를 유도하였고, 이산화탄소 항온 배양기(5% CO2, 95% 상대습도, 37℃)에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액 50ul에 그리스 시약(Griess reagent) 50ul를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 0∼50uM의 농도별로 제조한 질산염을 사용하여 NO3 - 농도-흡광도 상관 계수를 작성한 후, RAW 264.7 세포에서 생성된 NO3 - 농도를 계산하였다. 생열귀나무 추출물을 DMSO 용액에 녹인 후, RAW 264.7 세포에 LPS와 동시에 최종 농도 10ug/ml 및 100ug/ml로 첨가하여 반응 후 NO3 - 농도를 측정하였고, 실험 결과를 도 3에 정리하였다.
도 3을 참조하면, 대조군으로 사용한 옥수수불검화 추출물과 비교하였을 때, 생열귀나무의 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매 추출물은 산화질소의 생성을 각각 72%, 75%, 65%, 61%, 68% 억제하여 생열귀나무 추출물을 투여한 시험군에서 더욱 우수한 염증 억제 활성을 나타내었다.
높은 농도에서 산화질소는 조골세포의 증식과 분화를 억제하나, 낮은 농도의 NO는 조골세포의 기능을 자극한다는 선행 연구(Raltson SH et al. Endocrinol. 135, p330-336, 1994; Riancho JA et al. J. Bone Miner Res. 10, p439-446, 1995)에 근거할 때, 본 발명의 생열귀나무 추출물은 치주염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 치주인대 세포 및 조골세포에서의 ALP 활성 증진
조골세포는 세포막에 알칼리성 포스파타아제(ALP, alkaline phosphatase)를 함유하고 있다. 알칼리성 포스파타아제는 칼슘과 인 대사에 관여하는 효소로, 세포 외막과 석회화 조직의 기질소포에서 높은 농도로 발견되며 pH 8-10의 염기성에서 최적의 활성을 나타낸다.
알칼리성 포스파타아제가 유기 인산(Organic phosphate)을 가수분해하여 석회화가 이루어지는 부위에서 국소적으로 인산 이온 농도를 증가시키고 세포외 기질에 인산칼슘을 침착시키는 석회화를 유도하는 역할을 수행하기 때문에 생열귀나무 추출물을 이용하여 알칼리성 포스파타아제 활성 변화를 확인하였다.
알칼리성 포스파타아제 활성도 검사는 p-nitrophenyl phosphate(pNPP, Sigma, St. Louis, MO, USA)의 가수분해 반응에 알칼리성 포스파타아제가 촉매로 작용하는 것을 이용하여, 가수분해 반응의 산물인 p-nitrophenol의 양을 측정함으로써 알칼리성 포스파타아제의 농도를 간접적으로 산출하는 것이다.
사람 유래의 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell, ATCC, Manasaas, USA) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL Cell)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100IU/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에 넣고, 5% CO2, 37℃로 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. 배양한 세포를 1x104 cells/well로 조정하여 96well plate에 분주하고 24시간 후 분화유도배지[50㎍/㎖ VitC 및 10mM β-glycerophosphate(β-GP)]로 교환한 후, 24시간 배양하여 시료처리를 하였다.
생열귀나무 추출물(제조예 1-1 내지 1-5)을 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖로 처리하고, 3일 뒤 PBS 용액을 이용하여 washing 한 다음 0.1 % Triton X-100을 20㎕씩 첨가하여 37℃에서 30분간 세포를 용해(lysis) 하였다. 용해 후, 20㎕ 0.1M glycine-NaOH buffer(pH 10.4)와 20㎕의 p-nitrophenyl phosphate(p-NPP)를 첨가한 후, 다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 100㎕의 0.1N NaOH로 반응을 중지하고, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 알칼리성 포스파타아제 활성은 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol(p-NP)를 측정하여 p-nitrophenol에 대한 표준곡선(standard curve)을 작성한 후 활성도를 대조군과 상대비교를 통해 도출하고, 도 4에 정리하였다.
도 4를 참조하면, 치주 인대 세포 분화의 지표인 알칼리성 포스파타아제가 대조군으로 사용한 옥수수불검화 추출물(ISD 100㎍/㎖)과 비교하여 생열귀나무 추출물에서 더욱 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었으며, 인간 치주 인대 세포(HPDL Cell)에서 생열귀나무 전초(제조예 1-1), 잎(제조예 1-2), 줄기(제조예 1-3), 뿌리(제조예 1-4), 및 열매(제조예 1-5) 추출물이 각각 146%, 146%, 142%, 146%, 및 144% 증가한 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 조골세포(MG63 cell)에서도 생열귀나무 전초(제조예 1-1), 잎(제조예 1-2), 줄기(제조예 1-3), 뿌리(제조예 1-4), 및 열매(제조예 1-5) 추출물이 옥수수불검화 추출물(ISD 100㎍/㎖)과 비교하여 각각 158%, 158%, 157%, 159% 및 159% 증가한 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 생열귀나무의 모든 부위의 추출물은 알칼리성 포스파타아제의 활성 증가를 유도함으로써 치주 질환의 예방 및 치료에 매우 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 치주인대 세포 및 조골세포에서의 광화작용 활성 증진
생열귀나무 추출물에 의해 조골세포 및 치주 인대 세포가 분화하여 골질이 형성되는지를 확인하기 위해 광화작용 활성(Mineralization activity)을 확인하였다.
조골세포 및 치주 인대 세포를 폴리스티렌(polystyrene) 세포배양 접시에 각각 부착시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% antibacterial-antifungal solution(PAA)과 10% FBS(PAA)를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2와 95% 습도가 유지되는 37℃ incubator에서 기본 배양하였다. 각각의 세포의 분화는 24well plate에 3 × 104 cell/well로 처리하여 이들 세포가 단층을 형성한 후, 분화유도배지[50㎍/㎖ Vit. C 및 10 mM β-glycerophosphate(β-GP)] 처리에 의해 유도하였다. 하루 간 배양 후 24 well Plate에 조골세포 및 치주 인대 세포를 골 무기질화 시키는 아스코르브산(ascorbic acid)과 베타-글리세로포스페이트(beta-glycerophosphate)를 각각 50ug/ml과 10mM의 농도로 배지에 첨가하여 조골세포 및 치주인대 세포를 활성화시켰다.
활성화된 세포를 2개 군으로 나누어 제1군에는 어떤 물질도 첨가하지 않고(대조군), 제2군은 다시 6개의 군으로 나누어 옥수수불검화 추출물과 생열귀나무 전초(제조예 1-1), 잎(제조예 1-2), 줄기(제조예 1-3), 뿌리(제조예 1-4), 및 열매(제조예 1-5) 추출물을 각각 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 배양 배지에 첨가하였다. 3일 간격으로 상기 생열귀나무 추출물이 포함된 배지로 교환하고 24일 동안 배양하였다. 그 후 각 세포를 10% 포름알데하이드(neutral formaldehyde) 용액으로 고정한 후, 알리자린 레드-에스 염색 용액(Alizarin red-S staining solution)에서 5분간 처리하고 세척하여 육안으로 붉은색의 석회화 결절의 형성 여부를 관찰하였다. 결절 형성을 확인한 후 10mM sodium phosphate(10% cetylpyridinium chloride, pH 7.0)를 1ml/well 농도로 첨가하여 ELISA 판독기로 550nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 정리하여 나타내었다.
도 5를 참조하면, 조골세포에서 생열귀나무 전초(제조예 1-1), 잎(제조예 1-2), 줄기(제조예 1-3), 뿌리(제조예 1-4), 및 열매(제조예 1-5) 추출물을 처리한 시험군은 옥수수불검화 추출물을 처리한 양성대조군에 비해 각각 142%, 144%, 139%, 143%, 및 148% 증진된 광화작용이 확인되었다.
또한, 치주 인대 세포에서 생열귀나무 전초(제조예 1-1), 잎(제조예 1-2), 줄기(제조예 1-3), 뿌리(제조예 1-4), 및 열매(제조예 1-5) 추출물을 처리한 시험군은 옥수수불검화 추출물을 처리한 양성대조군에 비해 각각 170%, 172%, 168%, 178%, 및 170% 증진된 광화작용이 확인되었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 생열귀나무 추출물은 광화작용(mineralization)의 증진을 통해 치주 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 백서 모델을 이용한 치조골 흡수 방지 및 치조골 재생 활성
Sprague-Dawley(대한바이오링크, 음성, 대한민국) 랫트 하악의 제2 대구치에 실크 봉합사를 이용한 결찰을 시행하여 치주염을 유발하였고, 치주염 유발이 확인된 랫트에 상기 제조예 1-1 내지 1-5의 생열귀나무 추출물(100, 200mg/kg)을 각각 6주간 투여한 후, 마이크로 CT(Micro Computed Tomography; Micro CT, Inveon™ Simens Medical Solutions USA, Inc.) 장비로 촬영하여 치조골 흡수 방지 및 치조골 재생 효과를 확인하였다. 양성대조군으로는 옥수수불검화 추출물(200mg/kg)을 투여한 시험군을 사용하였고, 음성대조군으로 정제수를 투여한 시험군을 사용하였다.
도 6은 치주염을 유발한 Sprague-Dawley 랫드에 베히클(vehicle, 정제수)의 경구투여군(음성대조군), 옥수수불검화 추출물의 경구투여군(양성대조군), 및 상기 제조예 1-1 내지 1-5의 생열귀나무 추출물(100, 200mg/kg)을 투여한 시험군을 각각 micro CT 장비로 촬영하여 치조골 흡수 방지 및 치조골 재생 효과를 확인한 사진이다.
또한, 도 7은 상기 시험군들의 제1대구치와 제2대구치 사이의 CEJABC(cemantoenamel junction-alveolar bone crest) 거리, 제2대구치와 제3대구치 사이의 CEJ-ABC 거리 및 치근 이개부(Furcation involvement)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7을 참조하면, 치주염 유발 음성대조군과 비교하여 본 발명의 생열귀나무 추출물을 처리한 모든 시험군에서 CEJ-ABC 거리 및 치근 이개부의 거리가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군인 옥수수불검화 추출물을 투여한 대조군보다 생열귀나무 추출물을 투여한 시험군에서 CEJ-ABC 거리 및 치근 이개부의 거리가 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 6 및 도 7의 결과를 바탕으로, 본 발명의 생열귀나무 추출물이 양성대조군으로 사용한 옥수수불검화 추출물에 비해 치조골 흡수 방지 및 치조골 재생에 효과적임을 임상적으로 확인할 수 있었다.
실험예 6.염증성 사이토카인(Cytokine) 발현 억제
염증성질환과 관련된 사이토카인인 Interleukin(IL)-1β, MMP-1, 및 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)의 발현량을 확인하고, 발현 감소 효과를 확인하였다.
실험은 뮤린 마크로파지(Murine macrophage) Raw 264.7 세포주(ATCC, Manasaas, USA)를 사용하였고, 염증 반응을 유도하는 LPS(Lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich, St. Louis, U.S.A)와 실시예 1에서 제조한 제조예 1-1 내지 1-5의 생열귀나무 추출물을 각각 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 Raw 264.7 세포주에 처리하고, 염증성 사이토카인인 IL-1β, MMP-1, 및 TNF-α의 발현량을 효소면역검사법(enzyme-linked immuno sorbentassay)로 측정하였다.
생열귀나무 추출물을 처리한 Raw 264.7 세포주에서 분리한 단백질 1μL(1/50 희석)와 IL-1β, MMP-1, 및 TNF-α platinum ELISA kit(eBioscience, San Die해, USA)를 이용하여 희석 완충용액(Sample Diluent, eBioscience, San Diego, USA) 49μL를 혼합하여 96웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 각각 2시간 동안 25℃ 실온에서 놓아둔 후, 완충용액(Wash Buffer, eBioscience, San Diego, USA)으로 2회 세척한 후, 바이오틴이 융합된 항체(Biotin-Conjugate antibody, eBioscience, San Diego, USA)를 넣고 2시간 동안 반응시켰다.
다시 완충용액(Wash Buffer, eBioscience, San Diego, USA)으로 2회 세척한 후, 융합 항체(Streptavidin-HRP conjugeted antibody, eBioscience, San Diego, USA) 100μL를 처리하고 1시간 실온에서 놓아둔 후 세척하였다. TMB(tetramethyl-benzidine) 기질을 100μL씩 분주하고 암소에서 30분간 방치 후, 100μL의 반응정지용액(Stop Solution, eBioscience, San Diego, USA)을 처리하고, 흡광도 측정기(Molecular Devices, Orleans, USA) 450nm에서 IL-1β, MMP-1 및 TNF-α에 대한 흡광도를 측정하였다.
도 8을 참조하면, 양성대조군으로 사용한 옥수수불검화 추출물 처리군과 비교하여 생열귀나무 추출물을 처리한 시험군에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, MMP-1 및 TNF-α의 발현량을 더욱 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 생열귀나무 추출물은 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 치주염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물은 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL)에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키고, 광화작용(mineralization)의 증진시키는 것을 특징으로 하고,
상기 치주 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치조골 파손(alveolar bone breakage) 및 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치주 질환인,
치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물은 생열귀나무(Rosa davurica Pall.)의 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 및 열매 중 어느 하나 이상의 부위에서 추출한 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물인 것을 특징으로 하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물은 산화질소의 생성을 억제하여 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물은 염증성 사이토카인인 IL-1β, MMP-1 및 TNF-α의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 생열귀나무(Rosa davurica Pall.) 추출물은 조골세포(Human osteoblast-like MG63 cell) 및 인간 치주 인대 세포(Human Periodontal ligament progenitor cells, HPDL)에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 증가시키고, 광화작용(mineralization)의 증진시키는 것을 특징으로 하고,
상기 치주 질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치조골 파손(alveolar bone breakage) 및 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치주 질환인,
치주 질환의 예방용 식품 조성물. - 제1항의 약학적 조성물을 치주 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 치주 질환을 예방 또는 치료시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 치주 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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