KR20170013365A - 정공등복합방 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로서, 상기 정공등복합방은 계혈등 29 내지 33중량%, 희렴 21 내지 25중량%, 우슬 13 내지 17중량% 및 잔량으로서 정공등을 포함함을 특징으로 하는 정공등복합방 추출물을 포함함을 특징으로 한다.

Description

정공등복합방 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물{Jeonggongdun Complex Herbal Acupuncture for anti-inflammatory}

본 발명은 정공등복합방 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

관절염은 크게 골관절염 (퇴행성 관절염, Osteoarthritis)과 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 구분된다. 골관절염은 퇴행성 관절염이라고도 불리우는 가장 흔히 볼 수 있는 관절염으로 중년 또는 노년에 주로 발생하고, 무릎 관절과 엉덩이 관절과 같이 체중을 많이 받는 관절에 통증, 강직감 및 점진적인 운동장애 등을 초래하는 질환이다. 원인으로는 과거에는 단순히 나이가 들어서 발생하는 노화현상으로 생각하였으나 현재는 여러 가지 원인이 있는 것으로 알려져 있는데, 한가지 원인이 아니라 연령, 유전적 요소, 비만, 관절의 모양, 호르몬 등의 여러 가지 원인이 복합적으로 이루어짐으로써 증상이 다르게 나타나는 것으로 생각되고 있다. 골관절염은 주로 관절연골(cartilage)의 손상에 관여하는데, 연골의 손상에 주로 관여하는 것으로 알려진 매트릭스 메탈로프로테나제 (matrix metalloproteinases, MMPs)가 작용하여 연골조직을 파괴하게 되며, 그 주위의 뼈에 퇴행성 변화를 일으킨다. 또한, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨-1(IL-1), 종양괴사인자-α(TNF-α) 등을 유도시키게 되는데 이로 인하여 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다(Fernandes J. C. et al., The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology, 39, pp237-46, 2002).

반면에, 류마티스성 관절염 (Rheumatoid arthritis)은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 관절염에 걸린 환자의 경우, 관절의 활막 (synovial membrane) 조직이 증생(hyperplasia)되며 동시에 대식세포(macrophage), 수상세포(dendritic cell) 및 활성화된 T 림프구와 B 림프구가 활막 조직으로 이동하고 다형핵 세포(polymorphonuclear cell)는 활액(synovial fluid) 내와 연골(cartilage) 표면에 축적되어 염증을 유발하게 된다. 이같은 활막 조직의 염증은 알려지지 않은 자가항원에 대해 반응성이 있는 T 림프구가 유발하는 것으로 생각되고 있다. 그럼에도 불구하고 대부분의 조직에 침윤된 T 림프구는 세포 표면에 활성화 표지를 나타내지 않으며 사이토카인(cytokine)을 거의 발현하지도 않는다.

이와 대조적으로 류마티스성 관절염 증상을 가진 활막조직과 활액에는 대식세포 (macrophage)에서 유래된 사이토카인들이 매우 많이 관찰되고 있다. 이러한 사이토카인으로는 활막 섬유 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려진 인터루킨-1 (IL-1), 종양괴사인자-α(TNF-α) 등이 있다. 이러한 실험 결과들은 T 림프구가 활막 조직의 염증을 유발하는 데 매우 중요하며, 이후의 염증 증상은 활성화된 활막 세포들로부터 유래된 사이토카인에 의해 유지된다는 가설을 제시한다(Carson D.A. et al., J. Clin. Invest., 87, pp379-383, 1991 : Tighe H. et al., J. Exp. Med., 177, pp10-118, 1993 : Burmester G. R. et al., Arthritis Rheum, 40, pp5-18, 1997 : Panayi G. S., Curr. Opin. Rheumatol., 9, pp236-240, 1997).

또한, 활막 조직의 증생은 관절염에 있어서 혈관이 없는 연골부에 발생하는 결합조직층인 판누스(pannus)를 형성하여 질환 관절의 연골과 골조직을 비가역적으로 파괴하게 되는데, 여기에는 연골조직 파괴인자로 알려진 매트릭스 메탈로프로테나제(MMPs) 등이 작용하여 연골조직이 파괴되게 된다.

이상과 같이 골관절염 및 류마티스성 관절염 등 모든 관절염 치료의 이상적인 목표는 질환 관절의 연골과 골조직을 보호 유지시키는 것이다. 따라서 연골을 보호유지시키는데 관여하는 사이토카인으로 알려진 IL-4(Interleukin-4)를 활성화시키면 연골 보호에 효과가 있을 것으로 예상된다(Kim S. H. et al., J. Immunol., 166, pp3499-3505, 2001). 이외에도 연골조직 파괴인자로 잘 알려진 MMPs가 있고, 이 효소의 저해제로 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)가 있다. MMP 중에서도 MMP-2는 평상시에 결합조직의 개조(remodeling)에 중요한 생리적 활성을 나타내지만, 관절염이 발생한 관절에 있어서는 심각한 조직 손상을 유도하므로, 이 MMP-2를 억제시킴과 동시에 이 효소의 저해제인 TIMP-2의 유도활성을 갖는 약물을 개발한다면 관절염에 있어서 가장 중요한 증상중의 하나인 연골파괴를 막을 수 있을뿐만 아니라 이로 인한 환자의 심각한 고통도 예방할 수 있을 것이다 (Mengshol J. A. et al., Arthritis Rheum., 46, pp13-20, 2002). 아직까지 이런 기전을 이용한 관절염 치료제는 개발되어 있지 않으며, 지금까지 사용된 약품들도 효과가 매우 제한적이어서 일단 관절염이 발생하면 환자의 심각한 고통은 물론 경제적 손실을 가져오고 있다.

현재 사용되고 있는 골관절염 및 류마티스 관절염의 치료방법은 다음과 같다. 초기 치료에 많이 사용되는 약물은 비스테로이드성 소염제 (NSAID: non-steroidal anti-inflammatory drug)로서, 이들 NSAID들은 증세를 약간 호전시키기는 하지만 관절부위 연골 손실이나 질병의 진행을 막을 수는 없으며, 부작용이 심하게 나타나 이 치료법을 사용하는 환자의 절반 가량이 1년 이내에 치료를 중단해야만 한다. 다음 단계로는 금을 포함하는 화합물 약제 (gold drugs; gold sodium thiomalate, gold sodium thiosulfate)나 페니실아민 (penicillamine), 항말라리아제 (anti-malarials)와 같은 항관절염 제제 (disease modifying anti-rheumatic drugs; DMARDs) 등이 사용된다. 그러나 이 제재들 역시 관절염의 진행을 다소 감소시키지만 심각한 부작용을 동반할 수 있기 때문에 DMARD를 이용한 치료법이 시작된 5년 이후에는 5-15% 환자만이 이 약물들의 사용을 고수한다. 이상의 치료제가 더 이상 효과를 보이지 않을 경우에는 류마티스가 발생한 관절부위를 외관절 시술에 의해 인공관절로 교체해야만 하는 경우도 있다(Simon L. S., Int. J. Clin. Pract., 54, pp243-249, 2000).

이와는 별도로 최근에는 생약재를 이용한 관절염 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있으며 의약품 개발도 이루어지고 있으나 아직까지는 염증반응 억제에 주로 치중하여 개발되고 있는 실정이다. 이처럼 현재까지 개발되어 사용되고 있는 관절염 치료제의 대부분은 관절질환의 연골과 골조직을 보호 유지시키는데 주목하여 고안되었다기 보다는 오히려 염증반응을 억제시키는 것이었으며, 대부분의 경우는 미미한 치료 효과만을 나타내는 한계를 갖고 있었다.

대한민국 등록특허 등록번호 제0540033호(발명의 명칭: 관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법)은 관절, 특히 연골에 대한 보호 작용 및 풍, 한, 습으로 인한 관절염의 증상을 근본적으로 개선시키고자 우슬, 방풍, 천마 등 20여가지 생약재를 적정비로 혼합하여 물 또는 알코올성 수용액으로 추출한 다음, 감압 농축하여 동결 건조시켜 만든 관절염 치료용 생약 조성물 및 그 제조방법에 대하여 개시하고 있다.

특허문헌 1: 대한민국 등록특허 등록번호 제0540033

비특허문헌 1: Fernandes J. C. et al., The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology, 39, pp237-46, 2002. 비특허문헌 2: Carson D.A. et al., J. Clin. Invest., 87, pp379-383, 1991 : Tighe H. et al., J. Exp. Med., 177, pp10-118, 1993 : Burmester G. R. et al., Arthritis Rheum, 40, pp5-18, 1997 : Panayi G. S., Curr. Opin. Rheumatol., 9, pp236-240, 1997. 비특허문헌 3: Kim S. H. et al., J. Immunol., 166, pp3499-3505, 2001. 비특허문헌 4: Mengshol J. A. et al., Arthritis Rheum., 46, pp13-20, 2002. 비특허문헌 5: Simon L. S., Int. J. Clin. Pract., 54, pp243-249, 2000.

본 발명은 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 정공등복합방 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물은 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다. 상기 조성물은 약품, 화장품 또는 식품에 각각 사용될 수 있다.

상기 정공등복합방은 계혈등 29 내지 33중량%, 희렴 21 내지 25중량%, 우슬 13 내지 17중량% 및 잔량으로서 정공등을 포함할 수 있다.

상기 정공등복합방 추출물은 상기 정공등복합방의 주정 추출물 또는 상기 정공등복합방의 약침일 수 있다.

상기 정공등복합방의 주정 추출물은 상기 정공등복합방 52g을 기준으로 하여 70 내지 90%의 주정 1,000 내지 1,400㎖에 투입하고, 환류추출에 의하여 추출한 후, 증발농축시켜 분말화한 것일 수 있다.

상기 정공등복합방의 약침은 상기 정공등복합방의 열수추출물을 에탄올로 정제한 것일 수 있다.

본 발명에 따르면 생약제제, 특히, 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물로, 약품, 화장품 또는 식품에 각각 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 조직의 제조 공정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델(CIA-induced Rheumatoid Arthritis model)의 혈청 중의 AST에 대한 정공등복합방 약침(JCHA)의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 ALT에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 크레아티닌에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 BUN에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서의 정공등복합방 추출물의 세포독성의 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 여러 농도에서의 정공등복합방 추출물의 DPPH 유리 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 8은 여러 농도에서의 정공등복합방 추출물의 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 9는 RAW 264.7 세포에서의 활성산소종(ROS) 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10은 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 산화질소(NO) 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 11은 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 IL-1β 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 12는 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 IL-6 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 13은 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 IL-17 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 14는 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 IL-21 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 15는 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 TNF-α 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 16은 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 MCP-1 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 17은 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유발 GM-CSF 생성에 대한 정공등복합방 추출물의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 18은 DBA/1 생쥐의 류마티스성 관절염 징후의 대조군과 실험군 간을 비교한 사진이다.
도 19는 화학요법-유발 DBA/1 생쥐에서의 류마티스성 관절염 지수에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 20은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈액 중의 WBC의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 21은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈액 중의 호중구의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 22는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈액 중의 림프구의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 23은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈액 중의 단핵구의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 24는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 hs-CRP의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 25는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IgM의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 26은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IgG의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 27은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IL-β의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 28은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IL-6의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 29는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IL-17의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 30은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 IL-21의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 31은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 TNF-α의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 32는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 MCP-1의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 33은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 혈청 중의 GM-CSF의 수준에 대한 정공등복합방 약침의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 34는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 IL-1β mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 35는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 IL-6 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 36은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 IL-17 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 37은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 IL-21 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 38은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 TNF-α mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 39는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 MCP-1 mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 40은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 비장 중의 GM-CSF mRNA 수준을 나타내는 그래프이다.
도 41은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 후족부에서의 단층촬영-관절조영술(CT-arthrography)을 사용한 연골 퇴화를 영상화한 정공등복합방 약침의 효과를 나타내는 사진이다.
도 42는 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 3차원 미세단층촬영(3D Micro-CT)을 이용한 감소된 BV(골용적) 비율을 나타내는 정공등복합방 약침의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 43은 DBA/1 생쥐의 화학요법-유발 류마티스성 관절염 모델의 3차원 미세단층촬영을 이용한 감소된 BS(골 표면적)/BV(골용적) 비율을 나타내는 정공등복합방 약침의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 44는 DBA/1 생쥐의 콜라겐-유발 류마티스성 관절염 모델의 정공등복합방 약침의 효과들의 병리조직학적 검사 분석 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 정공등복합방 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물은 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 4종 복합생약을 포함하는 정공등복합방의 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 정공등(丁公藤: Erycibae Caulis)은 Erycibe obtusifolia Bentham 또는 광엽정공등(廣葉丁公藤) Erycibe schmidtii Craib (메꽃과 Convolvulaceae)의 덩굴성줄기의 뿌리와 줄기로 표증(表證)을 풀고 발한하며 풍사(風邪)를 몰아내고 습사(濕邪)를 없애고 비통을 없애며 부기를 가라앉히고 통증을 완화시키는 효능이 있는 약재이다.

상기 계혈등(鷄血藤)은 요약쌍떡잎식물 이판화군 장미목 콩과 식물인 밀화두(密花豆)의 줄기를 말려 만든 약재이다. 생약명은 무쿠나에 카울리스(Mucunae Caulis)이다. 쌍떡잎식물 이판화군 장미목 콩과 식물인 밀화두(密花豆)의 줄기를 말린 것으로, 한약재로 쓰인다. 중국 원산이며, 한국에서는 나지 않는다. 밀화두의 작은 줄기를 잘라 햇볕에 말린 것으로, 줄기의 즙액이 닭의 피처럼 붉은 색이어서 이런 이름이 붙었다. 한방에서는 심장과 비장에 작용해 혈액순환을 도와주고, 혈액을 보충하며, 어혈(瘀血)을 없애는 약재로 쓴다. 또 여성의 월경을 고르게 하는 작용이 있어, 월경불순, 월경통, 무월경에도 사용한다. 그 밖에 노인이나 부인의 퇴행성 질환, 손과 발의 위축증, 무기력과 어지럼증, 방사선 치료로 인한 종양환자의 백혈구감소증 등 다양한 용도로 쓰인다. 차로 달여 먹기도 하는데, 200㏄ 정도의 물에 10 내지 15g의 계혈등을 넣고 은근한 불에 달인 뒤, 하루 3회에 걸쳐 나누어 마신다. 특히 태양인에게 좋고, 코피나 토혈 등의 증상이 있는 사람은 복용하지 않는 것이 좋다.

상기 희렴은 국화과의 털진득찰(Siegesbeckia pubescens Makino) 또는 진득찰(Siegesbeckia glabrescens Makino)의 지상부를 사용해 만든 약재(한국). 중국에서는 털진득찰(선경희렴), 진득찰(모경희렴) 또는 희렴(Siegesbeckia orientalis)을 쓴다. 희렴이란 풀의 냄새가 돼지와 비슷하고 맵고 쏘는 맛이 있기 때문에 붙여졌다고 한다. 저고(猪膏)라는 이름도 있는데 이 또한 냄새로 인해 붙여진 이름이다. 또 다른 이름인 호고(虎膏), 구고(狗膏)는 호랑이나 개에게 물린 상처를 치료할때 사용했기 때문에 붙여졌다고 한다. 어린 싹을 익혀서 물에 담그면 쓴 맛이 없어지는데 기름과 소금을 쳐서 먹기때문에 점호채(粘糊菜)라고 부르기도 하였다. 이 약은 특이한 냄새가 조금 있고 맛은 쓰며 성질은 차다[苦寒]. 풍습(風濕)을 제거해 관절염, 사지동통마비, 굴신불리, 하지무력 및 중풍으로 인한 반신불수 등에 쓰고, 종기, 발진, 피부가려움증, 습진 등에 쓴다. 고혈압, 두통, 어지럼증, 급성간염 등에 사용한다. 약리작용으로 관절부종억제, 혈압강하작용이 보고되었다. 다른 이름으로 구고(狗膏), 저고초(猪膏草), 점호채(粘糊菜), 호고(虎膏), 호렴, 화렴, 황저모(黃猪母), 희선(希仙), 희렴초, 희선(稀仙), 희첨 등이 있다.

상기 우슬(牛膝)은 우리나라에서는 비름과의 쇠무릎(Achyranthes japonica Nakai) 또는 우슬(牛膝: Acyranthes bidentata Blume)의 뿌리를 말하며, 일본에서는 우슬(Acyranthes bidentata Blume)과 털쇠무릎(Achyranthes fauriei H. Lev . & Vaniot)을 쓴다. 중국은 우슬(Acyranthes bidentata Blume)만을 인정하고 있다. 옛날 뼈나 근육에 대한 병과 간과 신장병에 걸린 환자를 잘 치료하는 의원이 있었는데, 자신의 후계자로 삼을 진실한 제자를 찾기 위해 시험을 해보기로 했다. 그는 빈털터리 행색으로 제자들의 집에 머무르며 그들의 태도를 지켜보기로 했다. 그 결과 가장 어린 제자만이 돈 없는 스승을 진실하게 대하였다. 이에 감복한 의원은 그에게 한 약초의 효능을 전해주며 "뼈와 근육은 물론이고 간장과 신장의 병을 치료하는 약이니 이 약으로 많은 사람을 구해주거라"라는 말을 남겼다고 한다. 제자는 스승의 뜻대로 이 약초를 잘 써서 명의가 되었으며, 이 약초의 마디의 생김새가 마치 소의 무릎을 닮아 '우슬(牛膝)'이라 불렀다고 한다. 이 약은 냄새가 거의 없고 점액성이다. 맛은 약간 쓰고 시며 성질은 어느 한쪽으로 치우치지 않고 평하다[苦酸平]. 우슬은 생것을 쓰면 어혈과 종기를 없애고, 찌면 간과 신을 보해 근육, 골격을 튼튼하게 한다. 어혈을 제거해줌으로 생리불순, 산후복통에 쓰며, 골수를 보충하고 음기를 잘 통하게 하여 관절염에 쓰고, 음허화동으로 인한 입안과 혀의 발진을 치료한다. 약리작용으로 자궁흥분작용, 콜레스테롤 강하작용, 이뇨작용, 혈당강하작용, 간기능 개선작용 등이 보고되었다. 생김새는 가늘고 긴 원주형의 원뿌리 또는 곁뿌리가 달린 원뿌리 형태이며 근두부는 약간의 근경이 붙어 있든가 또는 제거되어 있다. 원뿌리는 대개 막대모양이거나 또는 약간 구부러졌고 바깥면은 회황색 또는 황갈색이며 많은 세로주름과 드문드문 곁뿌리의 자국이 있다. 다른 이름으로 우경(牛莖), 백배(百倍), 산현채(山菜), 대절채(對節菜), 계교골(鷄膠骨) 등이 있으며 특히 중국에서는 우슬을 하남성 회경(懷慶)산을 우량품으로 인정하여 회우슬(懷牛膝)이라고 부른다.

상기 정공등복합방은 계혈등 29 내지 33중량%, 바람직하게는 30 내지 32중량%, 희렴 21 내지 25중량%, 바람직하게는 22 내지 24중량%, 우슬 13 내지 17중량%, 바람직하게는 14 내지 16중량% 및 잔량으로서 정공등을 포함할 수 있다.

상기 정공등복합방 추출물은 상기 정공등복합방의 주정 추출물 또는 상기 정공등복합물의 약침일 수 있다.

상기 정공등복합방의 주정 추출물은 상기 정공등복합방 52g을 기준으로 하여 70 내지 90%, 바람직하게는 75 내지 85%의 주정 1,000 내지 1,400㎖, 바람직하게는 1,100 내지 1,300㎖에 투입하고, 환류추출에 의하여 추출한 후, 증발농축시켜 분말화한 것일 수 있다.

상기 정공등복합방의 약침은 상기 정공등복합방의 열수추출물을 에탄올로 정제한 것일 수 있다.

상기에서 "정공등복합방"은 정공등을 주약으로 포함하며, 여기에 계혈등, 희렴 및 우슬을 더 포함하는 것으로서, "JC"로 약칭되며, 상기 "약침"은 천연 한약재의 추출물을 정제한 것을 의미하며, 본 발명에서는 바람직하게는 에탄올로 추출한 후, 정제하여 수득된 것을 의미하는 것으로 사용되며, "AC"로 약칭되며, 따라서 정공등복합방약침(丁公藤複合方藥鍼(Jeonggongdun Complex Herbal Acupuncture은 "JCHA"로 표현될 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

실시예

1. 재료

1) 세포

실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주 은행에서 구입하였다.

2) 약재

본 실험에 사용한 정공등복합방(丁公藤複合方: Jeonggongdung Complex 이하, JC로 표기)의 구성 약재들은 대한민국 소재 옴니허브에서 구입하였고, 대전대학교 TBRC-RIC에서 구입하여 정선 후 사용하였고, 그 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다(표 1).

한약재명	생약학명(Pharmacognostic name)	중량(g)
정공등	Erycibae Caulis	16
계혈등	Spatholobi Caulis	16
희렴	Siegesbeckiae Herba	12
우슬	Achyranthis Radix	8
합계		52

3) 동물 및 사료

실험동물인 수컷 5주령의 DBA/1 생쥐(16 내지 22g)는 대한민국 소재 중앙실험동물에서 공급 받아 실험 당일까지 고형사료 (퓨리나)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간-12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리 위원회의 승인(동물사용 윤리위원회 승인번호 - DJUARB 2014-014)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 실험하였다.

4) 시약

사용된 시약은 이소프로판올(isopropanol: 미합중국 소재 시그마(Sigma Co.), 겔레드(gelred: 미합중국 소재 시그마), 둘베코 인산염 완충 염수(dulbecco's phosphate buffered saline: D-PBS ; 대한민국 소재 웰젠(Welgene)), 에테르(ether: 미합중국 소재 시그마), 둘베코 변성 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium ; 미합중국 소재 기브코비알엘(Gibco BRL Co.), 우태혈청(FBS: fetal bovine serum ; 미합중국 소재 인비트로겐(Invitrogen Co.), 지방다당체(LPS: lipopolysaccharide ; 미합중국 소재 시그마), 세포독성 분석 킷트(Cell viability assay kit)는 대한민국 서울 소재 대일랩서비스(Daeillab sevice), 산화질소 검출 킷트(Nitric Oxide detection kit)는 대한민국 수원 소재 인트론바이오테크놀로지(Intron Biotechnology), 디메틸설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide ; 미합중국 소재 시그마), 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(DPPH: 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl ; 미합중국 소재 시그마), 페니실린(penicillin ; 미합중국 소재 하이클론(Hyclone, Co.), 스트렙토마이신(streptomycin ; 미합중국 소재 하이클론), 아가로스(agarose ; 미합중국 소재 에프엠씨(FMC Co.), (2,7)-디클로로디히드로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA: (2,7)-dichlorodihydrofluorescin diacettate ; 미합중국 소재 시그마), 2,2'-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산(ABTS: 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ; 미합중국 소재 시그마), 포름알데히드(formaldehyde ; 미합중국 소재 시그마), 트리판블루(trypan blue ; 미합중국 소재 시그마), 면역화급 보빈 제2형 콜라겐 용액(Immunization Grade Bovine Type II Collagen, Solution ; 미합중국 소재 콘드렉스(Chondrex Co.), 불완전 프룬트 부형제(Incomplete Freund's Adjuvant ; 미합중국 소재 콘드렉스), 완전 프룬트 부형제(complete Freund's Adjuvant ; 미합중국 소재 콘드렉스), 에탄올(ethanol ; 독일국 소재 메르크(Merck Co.), 생쥐 사이토카인 밀리플렉스 맵 면역분석 킷트(Mouse cytokine milliplex map immunoassay kit ; 미합중국 소재 밀리포어(Millipore Co.), 인도메타신(Indomethacin ; 미합중국 소재 시그마), IL-17AF 효소면역측정 킷트(IL-17AF ELISA Kit ; 미합중국 소재 이바이오사이언스(eBioscience CO.), IL-21 효소면역측정 킷트(미합중국 소재 이바이오사이언스), MCP-1 효소면역측정 킷트(미합중국 소재 이바이오사이언스), GM-CSF 효소면역측정 킷트(미합중국 소재 이바이오사이언스), 생쥐 면역글로블린 M 효소면역측정 킷트(Mouse IgM ELISA kit ; 미합중국 소재 이바이오사이언스), 생쥐 면역글로블린 G 효소면역측정 킷트(미합중국 소재 이바이오사이언스), 총 RNA 제조 킷트(total RNA prep kit ; 대한민국 소재 인트론바이오(Intronbio.), 폴린-시오칼투 페놀 시약(Folin-Ciocalteu's phenol reagent ; 독일국 소재 메르크), 갈산(Gallic acid ; 미합중국 소재 시그마), 쿼세틴(Quercertin ; 미합중국 소재 시그마), 탄산나트륨(Sodium carbonate ; 미합중국 소재 시그마), 질산알루미늄(Aluminum nitrate nonahydrate ; 미합중국 소재 시그마), 아세트산칼륨 용액(Potassium acetate solution ; 미합중국 소재 시그마) 등을 사용하였다.

5) 기기

사용된 기기는 진공회전증발기(rotary vacuum evaporator ; 스위스 소재 뷔히(BCo.) B-480), 동결건조기(Freeze dryer ; 일본국 소재 아이엘라(EYELA Co.) FDU-540), CO₂ 배양기(미합중국 소재 포르마사이언티픽(Forma scientific Co.), 클린벤치(clean bench ; 대한민국 소재 비전사이언티픽(Vision scientific Co.), 오토클레이브(autoclave ; 일본국 소재 산요(Sanyo Co.), 와류혼합기(vortex mixer ; 대한민국 소재 비전사이언티픽), 분광광도계(spectrophotometer ; 일본국 소재 시마쯔(Shimadizu Co.), 원심분리기(centrifuge ; 미합중국 소재 시그마), 급속-냉동냉장고(deep-freezer ; 일본국 소재 산요), 서모사이클러 시스템(thermocycler system ; 독일국 소재 엠베게 바이오테크(MWG Biotech Co.), 제빙기(ice-maker ; 대한민국 소재 비전사이언티픽), 플레이트 교반기(plate shaker ; 미합중국 소재 랩라인(Lab-Line Co.), 효소면역측정 판독기(ELISA reader ; 미합중국 소재 몰레큘러디바이시즈(Molecular Devices Co.), 유세포 분석기(Flow cytometer ; 미합중국 소재 벡톤딕킨슨(Becton Dickinson, Co.), 광학현미경(Light Microscope ; 독일국 소재 칼자이스(Carl Zeiss, Co.), 퓨젼-에스엘(Fusion-SL ; 독일국 빌베르루마트(Vilber Lourmat.) 등을 사용하였다.

2. 방법

1) 시료 추출

JC 1첩에 80% 주정(C₂H₅OH) 1200㎖ 을 넣고 3시간 동안 환류추출 후 여과액을 얻어 진공회전증발기(rotary vacuum evaporator)에서 감압 농축하였다. 농축된 용액을 동결건조기(freeze dryer)로 동결 건조하여 분말 7.1 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하면서 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.

2) 약침의 제조

분쇄기를 이용하여 JC 2첩(104 g)을 분쇄하여 분말로 만들어, 삼각 플라스크에 넣고 증류수 500㎖를 가하여 3시간 동안 환류추출 후, 여과액을 여과지로 3회 여과한 후, 회전증발기(rotary evaporator)에 감압 농축하였다. 농축액에 90% 에틸알코올 30㎖를 가하여, 실온에서 교반한 후 방치하여 침전물이 생성되게 한 다음 여과하였다. 이 여과액을 회전증발기로 감압농축한 후, 농축액을 다시 여과하였다. 이 여과액에 80% 에틸알코올 30㎖를 가하여 잠시 교반 후 방치하여, 침전물이 생성되게 한 후 여과하였다. 여과액에 70% 에틸알코올 30㎖를 가하고 교반한 후 방치하였다가 다시 여과하는 조작을 2회 반복하였다. 여과액 중의 에틸알코올 성분을 회전증발기로 감압 제거하고, 남은 농축액이 20㎖가 되게 하였다. JC에서 얻은 약침을 감압 농축하여 수분을 모두 날려 얻은 분말을 1N 수산화나트륨(NaOH)를 이용하여 농축액을 pH 6.8이 되도록 조절하고, 4℃에서 12시간 방치한 후, 침전물을 제거하기 위해 주사여과(syringe filtering)하였다. 여과된 농축액에 인산염완충염수(PBS)를 첨가하여 5%로 희석하여 丁公藤複合方藥鍼(Jeonggongdun Complex Herbal Acupuncture 이하, JCHA로 표기)으로 사용하였다.

2) 안전성(safety) 검사

(1) 간 기능

혈청 내에서 AST, ALT 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 대한민국 서울 소재 서울의과학연구소에 분석 의뢰하였다. AST, ALT 활성도는 일본미생물자원학회 자외선법(JSCC UV method)의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다.

(2) 신 기능

혈청 내에서 크레아티닌(creatinine), 혈중요소질소(BUN: blood urea nitrogen) 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 서울의과학연구소에 분석 의뢰하였다. 크레아티닌의 함량은 크레아티닌 자페법(Creatinine Jaffe Method)의 원리, BUN의 함량은 키네틱 유브이 분석(Kinetic UV assay for urea/urea nitrogen)의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다.

(3) 세포독성 측정

RAW 264.7 세포는 96 웰 플레이트(well plate)에 2X10⁴세포/웰(cell/well)로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, JC를 각각 1, 10, 100(㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10㎕의 수용성 테트라졸리움염 용액(WST solution)을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

3. 시험관 내 실험(In vitro)

1) RAW 264.7 세포 배양

동결된 RAW 264.7 세포를 50㎖ 튜브에 옮기고 PBS 9㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상청액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 10% 우태혈청(FBS: fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin)으로 조성된 DMEM 배지 1㎖ 을 넣어 부유시켰다. 100㎜ 접시(dish)에 9㎖ 의 배지를 넣고, 세포를 부유시켜 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 5회 이상으로 하였고, 시료들을 처리하기 전에 24시간을 적응시켰다.

2) 항산화 효능 측정

(1) 총 페놀(phenol) 함량 측정

JC 추출물의 페놀 함량은 구트핑거(Gutfinger)의 방법을 응용하여 측정하였다. 추출 시료용액 1㎖ 에 50% 폴린-시오칼투 페놀 시약(Foiln-Ciocalteu's phenol reagent) 0.5㎖를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na₂CO₃ 포화용액 1㎖와 7.5㎖ 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 취해 760㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 갈산(gallic acid)를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 갈산등가량(GAE: Gallic acid equivalent)/g을 사용하였다.

(2) 총 플라보노이드(flavonoid) 함량 측정

JC 추출물의 플라보노이드 함량은 니에바 모레노(Nieva Moreno) 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.1㎖ 와 80% 에탄올 0.9㎖을 혼합한 혼합물 0.5㎖ 에 10% 질산알루미늄(aluminium niatate)와 1M 아세트산칼륨(potassium acetate) 0.1㎖ 그리고 80% 에탄올 4.3㎖ 을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 쿼세틴(quercetin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.

(3) DPPH 라디칼 소거능 측정

자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법이다. JC 추출물은 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150㎕와 JCHA 추출물을 각각 100㎕ 씩 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액의 대조군은 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로써는 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다. DPPH 자유라디칼 소거율은 아래의 계산식 1에 따라 계산하였다.

[계산식 1]

(4) ABTS 라디칼 소거능 측정

*ABTS 분석 방법은 기존에 보고된 방법을 96 웰 플레이트에 맞게 수정하여 실시하였다. JC 추출물은 최종 농도가 1, 10, 100, 1,000 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulphate)을 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온 (ABTS+)을 형성시킨 다음 734㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS+ 용액 150㎕ 와 JCHA 추출물을 각각 5㎕ 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 734㎚에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 증류수를 대조군으로 하여 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다(수학식 2).

[수학식 2]

(5) 세포내 활성산소종(ROS) 생성 측정

RAW 264.7 세포에서 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)를 측정하기 위하여 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCF-DA: 2,7-dichlorofluorescin diacetate)를 이용하였다. 12 웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 2X10⁵세포/웰이 되게 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, JC 추출물을 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고, LPS 1㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, DCF-DA은 10μM 이 되도록 첨가하여 15분 동안 암소, 상온에 두었다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400㎕를 부유시켜 유세포 분석기를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.

3) 항염증 효능 측정

(1) 산화질소(NO: Nitric oxide) 측정

NO의 농도는 배양액 내의 산화질소 농도를 그리이스 시약 시스템(griess reagent system)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 2X10⁴세포/웰로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 JC 추출물을 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도와 LPS 1㎍/㎖의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 완충제 50㎕를 각 웰에 처리하여 10분간 상온에서 반응한 후, N2 완충제 50㎕를 각 웰에 처리하고 10분간 반응시켰다. 반응 후 540㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 질산염 표준물(Nitrite standard)의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

(2) 사이토카인 및 케모카인 생성량 측정

세포 내에서 염증성 사이토카인을 12 웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 2X10⁵세포/웰이 되게 분주하여 24시간 동안 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고, JC 추출물을 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고, LPS 1㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 원심분리 후 상청액으로 IL-1β, IL-6, TNF-α는 루미넥스(Luminex)를 이용하여 측정하였으며, IL-17, IL-21, MCP-1, GM-CSF는 효소면역측정 판독기(ELISA Reader)를 이용하여 측정하였다.

4. 생체 내 실험(In vivo)

(1) 류마티스 관절염 유발 및 약침 처리

5주령의 DBA/1 생쥐를 2주간 안정기를 거친 뒤 7주령이 된 생쥐에 2mg/mL 농도의 보빈(Bovine) 제2형 콜라겐 용액을 동일한 농도의 완전 프룬트 부형제(CFA: complete Freund adjuvant)와 11의 비율로 혼합하며, 혼합액 0.1 mL (제2형 콜라겐 100g)을 꼬리의 기저부에서 1.53 cm 아래쪽의 피내를 통해 천천히 주입하여 1차 유발을 하였다. 1차 유발 후 2주 후에 1차 시기와 동일하게 CFA 대신 불완전 프룬트 부형제(IFA: incomplete Freund adjuvant)와 혼합하여 한쪽 발바닥에 주사하여 유발하였다. 실험은 4개의 군으로 나누었으며 매일 1회, 오후 2시에 정상군, 양성대조군인 인도메타신(이하, 'Indo'라고 표기함) 200㎕ (200㎎/㎏) 경구투여군, 대조군인 증류수 약침군과 JCHA 그룹은 각각 50㎕를 족삼리(足三里)에 실시하였다. 실험이 진행되는 동안 자유 식이를 하였다.

2) 류마티스성 관절염 지수(AI: Rheumatoid Arthritis Index(AI) 측정

RA 지수 (Rheumatoid Arthritis index score) 확인을 위하여 2차 주사 이후에 DBA/1 생쥐의 각 4개의 발 (paw)에서 각 발마다 0 내지 4점 (총 0 내지 16점)의 임상점수, 발목 두께의 변화, 발생률 등을 측정하였다. 측정은 9주차부터 13주차까지 매주 마다 기록하였으며 기준은 다음과 같다(표 2).

류마티스성 관절염 지수	염증-유발 정도
0	염증 없음
1	작은 정도의 염증
2	경증 팽윤(light swelling)
3	중등 팽윤(medium swelling)
4	중증 팽윤(severe swelling)

3) 혈액 내 면역세포 및 hs-CRP 측정

실험 종료 후, DBA/1 생쥐에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 후 전혈과 6,500 rpm에서 20분간 원심 분리한 혈청을 통해 백혈구 및 호중구, 림프구, 단핵구의 함량 및 고감도 C 반응성 단백검사법 고감도 C 반응성 단백검사법(hs-CRP: high-sensitivity C-reactive Protein)을 서울의과학 연구소에 분석 의뢰 하였다.

4) 혈청 내 사이토카인, 케모카인 및 면역 글로불린 측정

실험 종료 후 에테르로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 6,500 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α 농도는 주문-제작(custom-made) 6-원 사이토카인 밀리플렉스 패널(6-plex cytokine Milliplex panel)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 각 웰에 50배 희석한 혈청 25㎕ 씩 분주하고 분석완충제(assay buffer) 및 기질완충제(matrix buffer), 항체-부동화 비드(antibody-immobilized beads)를 각 25㎕씩 가하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응시키고 세척완충제(washing buffer)를 이용하여 2회 세척하였다. 이를 다시 25㎕의 검출항체(detection antibody)를 가하여 1시간 동안 실온에서 암소 반응시키고 추가로 25㎕의 스트렙타비딘-파이코에리쓰린(Streptavidin-Phycoerythrin)을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 세척완충제를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150㎕ 넣고 5분간 진탕(shaking)한 후 루미넥스를 이용하여 측정하였다.

IL-17, IL-21, MCP-1, GM-CSF는 효소면역측정 킷트를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 마이크로웰(Microwell)에 코팅완충제(coating buffer) 100㎕를 분주시킨 후 4℃에서 밤새 정치시킨 후 세척완충제로 3회 세척하였다. 블록완충제(Block buffer)를 웰 당 200㎕ 씩 분주 한 후 1시간 동안 실온에서 방치하고 세척완충제로 세척한 후 50배 희석한 혈청을 100㎕씩 분주한 후 2시간을 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 그 후 검출항체를 100㎕ 씩 처리하고 1시간 후 세척한 뒤 아비딘-서양고추냉이과산화효소(Avidin-HRP)를 100㎕를 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 세척완충제를 이용하여 7회 세척하였다. 기질용액(Substrate Solution)을 100㎕ 가한 후 15분 후에 정지액(Stop solution)을 50㎕ 넣고 효소면역측정 판독기로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

IgM과 IgG 생성량의 측정은 효소면역측정 킷트를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 항체를 코팅완충제에 희석하여 마이크로웰에 코팅한 후 4℃에서 밤새 정치시켰다. 각 웰은 3회 세척완충제로 세척한 후 50배 희석한 혈청을 100㎕씩 분주하였다. 이를 1시간 동안 실온에서 반응하고 세척완충제로 2회 세척한 다음, avidin-HRP 공액 항체(conjugated antibody) 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 반응 시킨 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 반응시킨 다음 50㎕의 정지액을 처리한 후 효소면역측정 판독기로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

5) 유전자 발현 측정

(1) RNA 추출

실험 종료 후 비장조직에서 발현된 류마티스 관절염 유발 인자를 측정하기 위해 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 시행하였다. 분리한 비장조직을 동결시킨 뒤 균질화기(homogenizer)로 조직을 파쇄하여 이지블루(easy blue) 1㎖을 넣고 혼합한 후 클로로포름(CHCl₃) 200㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 4℃ 원심분리기를 이용하여, 13,000rpm에서 원심분리한 후 약 400㎕의 상청액을 회수하여 결합완충제(binding buffer) 400㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 컬럼에 용액을 주입하였다. 이를 다시 4℃ 원심분리기로 13,000rpm에서 원심분리한 후 세척완충제를 넣어주고 또 다시 원심분리 한 후 세척완충제를 다시 넣어 수세한 후 용리완충제(elution buffer) 50㎕을 넣고 1분간 암소하여 RNA를 추출하였다.

(2) cDNA 합성

역전사(reverse transcription) 반응은 역전사 프리믹스 킷트(RT premix kit)의 혼합물(반응완충제, dNTPs 혼합물, 리보핵산분해효소 억제제(RNase inhibitor), 안정화제(stabilizer), 올리고 dT₁₅ 프라이머(oligo dT₁₅ primer))를 사용하여 총 RNA 1㎍이 되게 디에틸파이로카보네이트(DEPC: diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수에 최종 부피가 20㎕가 되도록 하여 첨가하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심 침강하여 45℃ 가열블럭(heating block)에서 60분 동안 반응시켜 제1 가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 합성하였다. 이를 다시 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용하였다.

(3) 비장 조직에서의 유전자 발현 측정

RT-PCR은 DNA 중합효소 1U/튜브(tube)에 250mM dNTPs 혼합물, RT 완충제(10mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 9.0, 30mM KCl, 1.5mM HCl₂)를 포함한 혼합물에 각 샘플과 프라이머(primer)를 넣고 중합효소연쇄반응을 시행하였다. IL-1β는 56℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, IL-6는 60℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, IL-17는 57℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, IL-21는 53℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 10초, TNF-α는 58℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 10초, MCP-1은 56℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, GM-CSF는 55℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초 동안 각각 35 내지 40회전(cycles) 조건으로 PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머는 아래와 같다(표 3). 1% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동 후 유전자발현의 여부를 자외선으로 촬영하여 각 그룹별로 밴드(band)를 확인하고, RNA 발현을 나타내었다.

프라이머	F/R	염기서열	회전	어닐링(℃)
IL-1β	F	GTT GAC GGA CCC CAA AAG AT	40	56
	R	AAG GTC CAC GGG AAA GAC AC
IL-6	F	CCT ACC CCA ATT TCC AAT GC	35	60
	R	CGC ACT AGG TTT GCC GAG TA
IL-17	F	AAC CAA AAC CAG GGC ATT TC	35	57
	R	GAT TTC TTG CTG AAT GGC GA
IL-21	F	GAA AGC CTG TGG AAG TGC AA	35	53
	R	GGA AAG GAT GTG GGA GAG GA
TNF-α	F	CTA CTC CTC AGA GCC CCC AG	35	58
	R	AGG CAA CCT GAC CAC TCT CC
MCP-1	F	GCT CAT AGC AGC CAC CTT CA	35	56
	R	GGG GTC AGC ACA GAT CTC CT
GM-CSF	F	CCT TGA ACA TGA CAG CCA GC	35	55
	R	AGG GCT ATA CTG CCC TCC AA

5. 방사선 검사 및 구조적 매개변수(Structural Parameter) 측정

5주간 실험 종료 후 동물을 희생하여 각 그룹별로 후족부를 분리하였다. 분리한 후족부의 시편을 사후 경직이 일어나기 전 최대한 발가락을 편 후, 10% 포름알데히드 용액에 고정한 뒤 대한민국 경기도 소재 주식회사 라온바이오에 미세단층촬영(Micro-CT) 및 구조적 매개변수(Structural Parameter) 측정을 의뢰하였다. 미세단층촬영은 후족부 전체를 촬영한 후 3차원(3D) 작업을 실시하였으며, 구조적 매개변수 측정은 가운데 발가락을 기준으로 골용적(BV: bone volume)과 골표면(BS: bone surface)에 대한 비율을 산출하여 관절의 염증정도를 나타내었다.

6. 조직 염색 관찰

에틸에테르(C₂H₅OC₂H₅)로 마취하여 후족부를 잘라내어 각 실험군 별로 적출한 조직을 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 조직들을 흐르는 수돗물에서 12시간 수세한 뒤 조직 내의 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 탈수하고, 자일렌(xylene)에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박편절단기 (microtome)를 이용해 3 내지 4㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 헤마톡실린과 에오신(H&E: hematoxyline and eosin) 염색과 마송-트리크롬(masson-trichrome) 염색을 각각 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다(도 1).

7. 통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 미대응 스튜던트 t-검정(unpaired student's T-test) 및 아노바(ANOVA)를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

실험결과

1. 안전성(safety) 검사

(1) 간 기능에 미치는 영향

1) 아스파르트산염 아미노전이효소(AST) 함량

간 기능 측정의 지표 성분인 AST를 측정한 결과, 정상군은 135.0±21.2U/L, 대조군은 192.0±13.3U/L, 양성 대조군은 114.0±26.2U/L, JCHA 투여군은 96.0±15.9U/L로 나타나, 정상군과 비교하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다(도 2). 도 2에서, JCHA의 투여 후 5주간 DBA/1 생쥐 모델을 추적하였다. 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

2) 알라닌 아미노전이효소(ALT) 함량

간 기능 측정의 지표 성분인 ALT를 측정한 결과, 정상군은 28.0±9.2U/L, 대조군은 63.0±4.2U/L, 양성 대조군은 24.0±10.3U/L, JCHA 투여군은 21.0±4.2U/L로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다(도 3). 도 3에서, JCHA의 투여 후 5주간 DBA/1 생쥐 모델을 추적하였다. 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(2) 신 기능에 미치는 영향

1) 크레아티닌(Cr) 함량

신 기능 측정의 지표 성분인 크레아티닌을 측정한 결과, 정상군은 1.6±0.3(㎎/㎗), 대조군은 1.2±0.6(㎎/㎗), 양성 대조군은 1.6±0.3(㎎/㎗), JCHA 투여군은 1.2±0.7(㎎/㎗)로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다(도 4). 도 4에서, JCHA의 투여 후 5주간 DBA/1 생쥐 모델을 추적하였다. 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

2) 혈중 요소 질소(BUN: Blood urea nitrogen) 함량

신 기능 측정의 지표 성분인 BUN을 측정한 결과, 정상군은 30.0±3.3㎎/㎗, 대조군은 36.0±2.7㎎/㎗, 양성 대조군은 36.03±4.8㎎/㎗, JCHA 투여군은 30.0±4.4㎎/㎗로 나타나, 정상군에 비하여 차이를 나타내지 않아 안전한 것으로 나타났다(도 5). 도 5에서, JCHA의 투여 후 5주간 DBA/1 생쥐 모델을 추적하였다. 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

3) 세포 독성

RAW 264.7 세포에서 세포 독성을 측정한 결과, 대조군을 100.0%로 나타냈을 때 JC 추출물의 1, 10, 100(㎍/㎖) 농도에서 99.8%, 91.2%, 85.9%의 세포 생존율을 나타내었다(도 6). 도 6에서, 각 세포를 24시간 동안 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 세포독성을 MTT 분석을 사용하여 측정하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터의 평균±표준편차로 나타내었다.

1) 항산화 효능에 미치는 영향

(1) 총 페놀(phenol) 함량

JC 추출물에 존재하는 총 페놀 함량을 갈산을 표준물질로 하여 측정한 결과, 표 4와 같이 페놀 함량이 317.9±2.6㎎/g으로 나타났다.

샘플	총 페놀 함량(㎎/g 추출물)
JC	371.9±2.6

2) 총 플라보노이드 함량

JC 추출물에 존재하는 총 플라보노이드 함량을 갈산을 표준물질로 하여 측정한 결과, 표 5과 같이 플라보노이드 함량이 46.15±1.70㎎/g으로 나타났다.

샘플	총 플라보노이드 함량(㎎/g 추출물)
JC	85.0±0.7

3) DPPH 라디칼 소거능에 미치는 영향

JC 추출물의 DPPH 소거율을 측정한 결과, 1㎍/㎖ 농도에서 13.6±1.1%, 10㎍/㎖ 농도에서 26.7±2.0%, 100㎍/㎖ 농도에서 83.5±3.3%, 1,000㎍/㎖ 농도에서 89.4±0.6% 로 나타나 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가함을 보였다(도 7). 도 7에서, 추출물을 37℃에서 30분간 DPPH 용액과 함께 배양하였다. 517㎚에서 흡광도를 측정하는 것에 의하여 활성을 결정하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터의 평균±표준편차로 나타내었다.

(4) ABTS 라디칼 소거능에 미치는 영향

JC 추출물의 ABTS 소거율을 측정한 결과, 1㎍/㎖ 농도에서 6.3±2.1%, 10㎍/㎖ 농도에서 8.4±1.3%, 100㎍/㎖ 농도에서 53.5±1.5%, 1,000㎍/㎖ 농도에서 93.9±0.1% 로 나타나 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가함을 보였다(도 8). 도 8에서, 추출물을 37℃에서 10분간 ABTS 용액과 함께 배양하였다. 732㎚에서 흡광도를 측정하는 것에 의하여 활성을 결정하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터의 평균±표준편차로 나타내었다.

(5) 활성산소종(ROS) 생성량에 미치는 영향

JC 추출물의 ROS 생성 저해 활성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±3.0%로 나타냈을 때 정상군은 22.1±1.8%, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 89.1±0.9%, 10㎍/㎖ 농도에서 79.8±5.4%, 100㎍/㎖ 농도에서 71.7±5.1%로 나타나, 1, 10, 100(㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (*** : p<0.001) 감소를 나타내었다(도 9). 도 9에서, 각 세포를 24시간 동안 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물 및 LPS(1㎍/㎖)로 처리하였다. 유세포분석기에 의하여 상기 ROS 생성을 분석하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01).

2) 항염증 효능에 미치는 영향

(1) 산화질소(NO)의 생성량에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±6.3%로 나타냈을 때 정상군은 53.4±1.6%, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 93.4±8.7%, 10㎍/㎖ 농도에서 72.8±3.9%, 100㎍/㎖ 농도에서 69.0±4.2%로 나타나, 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (*** : p<0.001) 감소를 나타내었다(도 10). 도 10에서, RAW 264.7 세포를 24시간 동안 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물 및 LPS(1㎍/㎖)로 처리하였다. 상청액 중의 질소산화물의 양을 그리이스시약을 사용하여 측정하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01, * : p<0.05).

(2) 사이토카인 및 케모카인에 미치는 영향

1) IL-1β에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군이 14.5±1.0pg/㎖, 정상군이 4.8±1.8pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 8.5±1.0pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 6.8±1.8pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 4.3±0.3pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 11). 도 11에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다.

2) IL-6에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군이 4519.8±644.3pg/㎖, 정상군이 41.5±5.5pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 3230.5±652.5pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 2836.0±387.5pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 1651.0±747.0pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 12). 도 12에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01).

3) IL-17에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 IL-17 생성량을 측정한 결과, 대조군이 20.7±2.6pg/㎖, 정상군이 4.7±0.9pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 14.8±1.3pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 13.3±2.2pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 13.0±1.0pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 13). 도 13에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01, * : p<0.05).

4) IL-21에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 IL-21 생성량을 측정한 결과, 대조군이 0.7±0.1pg/㎖, 정상군이 0.3±0.1pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 0.3±0.1pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 0.3±0.1pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 0.2±0.1pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 모든 농도에서 감소를 나타내었다(도 14). 도 14에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다.

5) TNF-α에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군이 15097.8±1098.8pg/㎖, 정상군이 3095.0±1100.0pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 14602.3±718.8pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 13203.5±605.8pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 9547.8±1150.5pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 15). 도 15에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01).

6) MCP-1에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 MCP-1 생성량을 측정한 결과, 대조군이 507.7±59.1pg/㎖, 정상군이 203.7±47.3pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 458.9±48.8pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 424.6±51.1pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 420.3±47.8pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 10, 100 (㎍/㎖)의 농도에서 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 16). 도 16에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, * : p<0.05).

7) GM-CSF에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 JC 추출물의 GM-CSF 생성량을 측정한 결과, 대조군이 70.2±6.6pg/㎖, 정상군이 23.9±5.4pg/㎖, JC 추출물은 1㎍/㎖ 농도에서 48.1±4.7pg/㎖, 10㎍/㎖ 농도에서 45.8±4.7pg/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 39.9±5.5pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 17). 도 17에서, RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 LPS(1㎍/㎖)의 존재 중에서 1, 10 및 100(㎍/㎖)의 JC 추출물로 처리하였다. 결과들을 3회의 독립 실험들로부터 평균±표준편차로 나타내었다(유의성 있는 결과들, ** : p<0.01, * : p<0.05).

1) DBA/1 생쥐의 육안적 관찰 및 AI 측정

양성 대조군과 JCHA 그룹을 실험이 실시되는 5주 동안 육안적으로 관찰한 결과, Fig. 15 는 9주, 11주, 13주의 RA 개선 정도를 나타내주는 사진으로, 대조군에서 발 (paw)과 발목 및 마디 등에 부종이 지속되는 반면, 양성 대조군과 JCHA 그룹은 점차 감소되어 13주차에 대조군에 비하여 큰 감소를 나타내었다(도 18). 이와 같은 결과는 AI에 반영되어 나타났다. AI 지수는 RA를 유발한 후 9주차부터 13주차까지 매주 사진촬영을 한 후에 RA 심화 정도를 관능적 방법에 의하여 측정한 결과로, 대조군은 9주차에서 12.2±0.3, 10주차에서 14.3±0.4, 11주차에서 13.5±0.3, 12주차에서 11.9±0.4, 13주차에서 11.4±0.3의 결과가 나타났으며, 양성 대조군은 9주차에서 12.1±0.1, 10주차에서 11.0±0.4, 11주차에서 8.7±0.3, 12주차에서 7.9±0.5, 13주차에서 5.9±0.4의 결과를 나타났으며, JCHA 그룹은 9주차에서 12.0±0.4, 10주차에서 12.4±0.3, 11주차에서 11.9±0.3, 12주차에서 10.7±0.3, 13주차에서 8.8±0.1로 대조군에 비하여 모두 유의성 있는 (*** : p<0.001, ** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 19). 도 19에서, 류마티스성 관절염 지수는 0(관절염 없음), 1(작은 정도의 관절염), 2(경증 팽윤), 3(중등 팽윤), 4(중증 팽윤)으로 등급된 개별 점수들의 합계료 정의되었다. 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, *** : p<0.001, ** : p<0.01).

2) 혈액 내 면역세포에 미치는 영향

(1) 백혈구에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈액 내 백혈구를 측정한 결과, 정상군은 2.3±0.7(X10³세포/㎕), 대조군은 5.9±0.4(X10³세포/㎕), 양성 대조군은 2.7±1.0(X10³세포/㎕), JCHA 그룹은 3.2±0.8(X10³세포/㎕)로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 20). 도 20에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(2) 호중구에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈액 내 호중구를 측정한 결과, 정상군은 3.5±0.7(X10³세포/㎕), 대조군은 8.2±2.3(X10³세포/㎕), 양성 대조군은 5.4±1.3(X10³세포/㎕), JCHA 그룹은 6.0±1.1(X10³세포/㎕)로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 21). 도 20에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(3) 림프구에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈액 내 림프구를 측정한 결과, 정상군은 1.5±0.6(X10³세포/㎕), 대조군은 3.9±0.1(X10³세포/㎕), 양성 대조군은 1.4±0.4(X10³세포/㎕), JCHA 그룹은 1.8±0.4(X10³세포/㎕)로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 22). 도 22에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(4) 단핵구에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈액 내 단핵구를 측정한 결과, 정상군은 0.3±0.1(X10³세포/㎕), 대조군은 0.7±0.1(X10³세포/㎕), 양성 대조군은 0.2±0.1(X10³세포/㎕), JCHA 그룹은 0.3±0.1(X10³세포/㎕)로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 23). 도 23에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

3) 혈청 내 hs-CRP에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 hs-CRP를 측정한 결과, 정상군은 0.2±0.1㎎/ℓ, 대조군은 0.9±0.1㎎/ℓ, 양성 대조군은 0.2±0.1㎎/ℓ, JCHA 그룹은 0.2±0.1㎎/ℓ로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 24). 도 24에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

4) 혈청 내 면역글로불린 생성량에 미치는 영향

(1) IgM 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IgM을 측정한 결과, 정상군은 10.4±5.9pg/㎖, 대조군은 49.7±9.3pg/㎖, 양성 대조군은 18.1±7.7pg/㎖, JCHA 그룹은 33.7±7.0pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 25). 도 25에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, ** : p<0.01, * : p<0.05).

(2) IgG 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IgG를 측정한 결과, 정상군은 54.4±7.8pg/㎖, 대조군은 127.3±10.5pg/㎖, 양성 대조군은 89.6±8.8pg/㎖, JCHA 그룹은 91.3±9.5pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 26). 도 26에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, ** : p<0.01).

5) 혈청 내 사이토카인 및 케모카인 생성량에 미치는 영향

(1) IL-1β 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IL-1β 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 217.5±74.1pg/㎖, 대조군은 755.0±68.4pg/㎖, 양성 대조군은 472.9±45.5pg/㎖, JCHA 그룹은 462.3±44.2pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 27). 도 27에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, ** : p<0.01).

(2) IL-6 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IL-6 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 423.4±88.8pg/㎖, 대조군은 675.9±107.5pg/㎖, 양성 대조군은 373.1±79.0pg/㎖, JCHA 그룹은 334.5±97.0pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 28). 도 28에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, * : p<0.05).

(3) IL-17 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IL-17 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 9.7±0.4pg/㎖, 대조군은 13.4±1.4pg/㎖, 양성 대조군은 10.3±0.3pg/㎖, JCHA 그룹은 10.90.4±pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 29). 도 29에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(4) IL-21 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 IL-21 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 88.8±10.4pg/㎖, 대조군은 193.2±13.9pg/㎖, 양성 대조군은 101.5±12.2pg/㎖, JCHA 그룹은 153.3±13.1pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01, * : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 30). 도 30에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, ** : p<0.01, * : p<0.05).

(5) TNF-α 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 TNF-α 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 134.3±31.7pg/㎖, 대조군은 274.4±37.2pg/㎖, 양성 대조군은 204.8±25.5pg/㎖, JCHA 그룹은 90.9±40.0pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 31). 도 31에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, * : p<0.05).

(6) MCP-1 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 MCP-1 케모카인을 측정한 결과, 정상군은 437.8±43.5pg/㎖, 대조군은 1037.6±134.5pg/㎖, 양성 대조군은 661.1±108.9pg/㎖, JCHA 그룹은 633.2±88.2pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 나타내었다(도 32). 도 32에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, * : p<0.05).

(7) GM-CSF 생성량에 미치는 영향

JCHA 투여 종료 후 혈청 내 GM-CSF 케모카인을 측정한 결과, 정상군은 90.5±27.8pg/㎖, 대조군은 288.9±87.5pg/㎖, 양성 대조군은 124.5±21.9pg/㎖, JCHA 그룹은 156.6±43.6pg/㎖로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (*** : p<0.001, ** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 33). 도 33에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, *** : p<0.001, ** : p<0.01).

6) 유전자 발현 정도에 미치는 영향

(1) IL-1β

*JCHA 투여 종료 후 IL-1β의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±11.1%로 나타내었을 때 정상군은 34.3±6.4%, 양성 대조군은 48.2±13.3%, JCHA 그룹은 58.2±10.2%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 34). 도 34에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(2) IL-6

JCHA 투여 종료 후 IL-6의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±6.6%로 나타내었을 때 정상군은 34.3±5.9%, 양성 대조군은 49.8±3.2%, JCHA 그룹은 44.1±5.8%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 35). 도 35에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(3) IL-17

JCHA 투여 종료 후 IL-17의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.7%로 나타내었을 때 정상군은 10.4±3.7%, 양성 대조군은 64.4±4.8%, JCHA 그룹은 72.0±5.9%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(Fig. 36). 도 36에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(4) IL-21

JCHA 투여 종료 후 IL-21의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±6.0%로 나타내었을 때 정상군은 35.6±5.1%, 양성 대조군은 37.2±5.6%, JCHA 그룹은 68.3±8.9%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 37). 도 37에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(5) TNF-α

JCHA 투여 종료 후 TNF-α의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±12.2%로 나타내었을 때 정상군은 21.9±6.4%, 양성 대조군은 44.3±9.9%, JCHA 그룹은 72.8±8.8%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 38). 도 38에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(6) MCP-1

JCHA 투여 종료 후 MCP-1의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±6.3%로 나타내었을 때 정상군은 32.7±7.1%, 양성 대조군은 57.3±7.2%, JCHA 그룹은 73.5±8.1%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 39). 도 39에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

(7) GM-CSF

JCHA 투여 종료 후 GM-CSF의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, 대조군을 100.0±8.6%로 나타내었을 때 정상군은 44.3±9.6%, 양성 대조군은 74.2±8.0%, JCHA 그룹은 74.9±6.8%로 나타나, 대조군에 비하여 감소를 나타내었다(도 40). 도 40에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

4. 관절에 미치는 영향

1) 관절 상태에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 미세단층촬영(micro-CT)으로 촬영하여 3차원(3D)으로 변환한 결과, 대조군에서는 정상군에 비하여 관절의 변형 및 파괴가 크게 일어났으나(도 41의 A, B 사각형), JCHA 그룹에서는 양성 대조군과 더불어 관절의 변형 및 파괴가 적게 나타났음을 확인할 수 있었다(도 41의 C, D 사각형). 도 41에서, A는 정상 생쥐군, B는 화학요법-유발 류마티스성 관절염군, C는 인도메타신으로 치료된 화학요법-유발 류마티스성 관절염군, D는 JCHA로 치료된 화학요법-유발 류마티스성 관절염군이다.

2) 골밀도에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 3차원 단층촬영(3D CT)으로 분석하여 골용적(BV: bone volume)에 대한 비율을 산출하여 골밀도를 측정한 결과, 정상군은 0.36±0.03(U^3), 대조군은 0.21±0.05(U^3), 양성 대조군은 0.37±0.10(U^3), JCHA 그룹은 0.38±0.01(U^3)로 나타나, 대조군에 비하여 증가를 나타내었다(도 42). 도 42에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다.

3) 관절 염증에 미치는 영향

실험 종료 후 후족부를 3차원 단층촬영으로 분석하여 골 표면적(BS: bone surface)과 골용적(BV: bone volume)에 대한 비율을 산출하여 관절의 염증정도를 측정한 결과, 정상군은 17.10±0.5(1/U), 대조군은 26.9±4.7(1/U), 양성 대조군은 17.0±1.7(1/U), JCHA 그룹은 17.6±1.0(1/U)로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : p<0.01) 감소를 나타내었다(도 43). 도 43에서, 결과들을 평균±표준편차로 나타내었다. 스튜던트 t-검정으로 대조군과 비교하는 것에 의하여 통계학적으로 유의미한 값들을 산출하였다(유의미한 결과들, ** : p<0.01).

5. 조직 변화에 미치는 영향

생쥐의 후족부에서 헤마톡실린 및 에오신(H&E: hematoxylin & eosin)과 마송-트리크롬(M-T: masson-trichrome) 염색을 하여 25배율(25x)로 측정한 결과, 대조군은 면역세포의 침투와 연골의 침하 및 활막세포의 손상이 심하게 일어난 반면, JCHA 그룹은 대조군에 비하여 면역세포의 침투나 연골의 침하, 그리고 활막세포의 손상이 상대적으로 감소되었음을 관찰할 수 있었다(도 44). 도 44에서, A는 정상 생쥐군, B는 화학요법-유발 류마티스성 관절염군, C는 인도메타신으로 치료된 화학요법-유발 류마티스성 관절염군, D는 JCHA로 치료된 화학요법-유발 류마티스성 관절염군이다.

Claims (1)

1. 정공등, 계혈등, 희렴 및 우슬의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 화장료 조성물로서,
   상기 조성물은 계혈등 29 내지 33중량%, 희렴 21 내지 25중량%, 우슬 13 내지 17중량% 및 잔량으로서 정공등을 포함하는 정공등복합방을 분쇄하여 분말로 만들어, 증류수를 가하여 환류추출 후, 여과액을 여과지로 3회 여과한 후, 회전증발기(rotary evaporator)에 감압 농축하고, 농축액에 90% 에틸알코올을 가하여, 실온에서 교반한 후 방치하여 침전물이 생성되게 한 다음 여과 후 여과액을 회전증발기로 감압농축한 후, 농축액을 다시 여과하고, 여과액에 80% 에틸알코올을 가하여 교반 후 방치하여, 침전물이 생성되게 한 후 여과하고, 여과액에 70% 에틸알코올을 가하고 교반한 후 방치하였다가 다시 여과하는 조작을 2회 반복하고, 여과액 중의 에틸알코올 성분을 회전증발기로 감압 제거하고, 수분을 제거 후 얻은 분말을 1N 수산화나트륨(NaOH)를 이용하여 농축액을 pH 6.8이 되도록 조절하고, 4℃에서 12시간 방치한 후, 침전물을 제거하기 위해 주사여과(syringe filtering)하고, 여과된 농축액에 인산염완충염수(PBS)를 첨가하여 5%로 희석하여 얻은 것임을 특징으로 하는 항산화 화장료 조성물.

Images