KR101268707B1 - 항-ｃｓ1 항체의 치료적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CS1에 결합하거나 CS1의 하나 이상의 생물학적 활성을 중성화하기 위한 CS1의 길항자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 필요 대상자에 있어 자가면역 장애 및 암을 포함하는 질환 상태를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상자에게 유효량의 상기와 같은 길항자를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

항-ＣＳ1 항체의 치료적 용도{THERAPEUTIC USE OF ANTI-CS1 ANTIBODIES}
본 발명은 자가면역 및 암 관련 질환을 포함하는 질환들의 치료에서의 길항자 및 항체의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 질환을 검출, 확인 및 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.
면역글로불린의 증가된 발현은 많은 질환들의 하나의 특징이다. 면역글로불린의 고 수준 분비는 고점도 증후군, 및 피로, 두통, 호흡곤란, 정신착란, 흉통, 신장 손상 및 장애, 시력 문제 및 레이노드 현상(혈액 순환 장애, 특히 손가락, 발가락, 코 및 귀의 혈액 순환 장애)을 초래하는 무기력화 장애를 비롯한 각종 장애들을 유발한다. 한냉 응집소 질환, 혼합 저온형글로불린혈증, 감마글로불린증가증, 쇼그렌 증후군, 점액 수종성 태선, 및 고셔병은 면역글로불린의 증가된 발현과 연관된 질환의 예이다.
자기-단백질에 표적화된 면역글로불린의 증가된 발현은 자가면역 질환의 특징이다. 자가면역 질환은 자체로서 자가항원을 인식하는 면역체계의 장애이다. 자가면역 질환에서, 면역체계는 그 자체, 표적화 세포, 조직 및 장기를 실수로 공격하여, 궁극적으로 생리학적 체계의 파괴를 초래한다. 자가면역성 및 자가면역 질환은 기원적으로 다인자성이며, 유전적 기질, 숙주 인자(예컨대, 면역제어 조절의 약화, 억제자 T 세포의 결함, 또는 조절에 대한 내성을 갖는 B 세포의 폴리클론 자극), 환경 인자들 및 항원-유도 메커니즘은 자가항원에 대한 자가항체의 생산 및 자가면역성의 발달에 연관된다.
위장 장애 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)는 자가면역 질환의 2가지 예이다. 위장 장애의 서브그룹인 염증성 장 질환(IBD)은 전세계적으로 대략 4백만명을 침범한 치료불가능한 장애들의 한 군이다. 재발 염증성 장 질환의 병인은 현재 알려져 있지 않다. 이론은 림프구를 비롯한 위장 세포의 자가면역-매개 파괴를 포함한다. 유전성 염증성 장 질환 모델에서의 비정상 동형 응집은 이미 입증되었고, 자가면역 장애와 연관된 유전자인 NOD2에서의 변이는 환자가 크론씨병에 걸리기 쉽게 하는 것으로 나타났다. [Ni, J. 등, Immunological abnormality in C3H/HeJ mice with heritable inflammatory bowel disease, Cell Immunol. 169:7-15 (1996); Ogura, Y. 등, A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's Disease, Nature 411:603-606 (2001)].
IBD은 가장 종종 소장 및 결장에 침범하나, 위장관의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 미국에서만 IBD로 진단된 사람이 백만명이 넘고, 매년 10,000명 이상이 새롭게 진단되고 있다. IBD 환자에 대한 생활의 질에서의 현저한 영향으로 인해, 매년 수만시간이 소실되는 것으로 매년 주장되어지고 있고, 이는 연간 소실된 작업일로 십억 달러에 달한다.
IBD는 설사, 직장 출혈, 복통, 체중 감소, 피부 및 눈 장애, 및 성장 지연 및 어린이의 성적인 성숙을 비롯한, 한 부류의 위장 및 장외 증세들을 발생시킨다. IBD의 2 유형은 궤양성 대장염 및 크론씨병이며, 이것들은 유사한 증세 및 생리학적 발현을 공유하나, 그것들이 소화관을 침범하는 방식은 상이하다. 궤양성 대장염은, 가장 빈번하게는 직장을 포함하여, 결장 점막의 전부 또는 부분의 궤양성 염증을 특징으로 한다. 그것의 증세는 직장 출혈 및 긴박증, 이급후중, 및 설사를 포함한다. 궤양성 대장염은 심각한 단기 및 장기 합병증을 동반한다. 가장 심각한 단기 합병증은 전격성 대장염, 독성 거대결장 및 천공이다. 심각한 장기 합병증은 골다공증 및 결장(직장) 암을 포함한다.
크론씨병은 입에서 항문에 이르는 위장관의 임의의 부분을 침범할 수 있는 만성 경벽성 염증이다. 크론씨병은 불연속적이고, 비침범 구역이 하나 이상의 관련 구역들 사이에 산재되어 있다. 질환 후기에, 점막은 자갈 모양으로 발달되고, 이는 사이에 낀 정상 점막으로 혼재된 깊은 수직 궤양으로부터 비롯된다.
대부분의 크론씨병 환자는 복통 및 압통, 만성 또는 야행성 설사, 직장 출혈, 체중 감소, 및 고열의 증세를 가진다. 크론씨병은 일차적으로 염증성인 질환에서 2가지 임상적 양상들 중 하나로 경시적으로 진행된다 (즉, 협착(폐색), 투과(누공)). 협착 형태에서, 경벽성 염증은 장벽에 섬유근조직 증식을 가져온 후, 장강이 좁아진다. 패색 증세가 CD가 진행됨에 따라 일반적인 것으로 된다. 투과 형태에서는, 동관이 장관벽을 통해 염증 터널로 형성되고, 장막 표면을 돌파하며, 결합 조직 및 심지어는 피부를 누공한다.
궤양성 대장염 및 크론씨병은 일반적으로 임상적, 내시경검사 및 조직학적 기준을 이용하여 진단된다. 그러나, 지금까지 전통적 진단적 기술은, 하나의 질환 또는 다른 질환에 대해 절대적으로 진단적인 발견이 단 하나도 없음을 확립하였다. 또한, 환자들 중 대략 20%가 크론씨병 및 궤양성 대장염 사이에 해당하는 임상적 상태를 가진다. 이 프로파일에 맞는 환자는 불확정한 대장염을 가진다고 일컬어진다.
IBD 증세는 환자의 안녕, 생활의 질 및 기능 용량에 상당히 영향을 줄 수 있다. 염증 기간은 심각성, 생명 손상에 따라, 지연되고 빈번하다. IBD가 만성이고 통상적으로 연령 30세 이전에 개시되기 때문에, 환자는 일반적으로 평생 치료를 필요로 한다. 잠정적 표적 및 진단적 마커의 동정을 위한 질환 상태에서의 신규 단백질 및 화합물의 역할을 밝혀내는 것은, 염증성 장 질환 환자의 현 치료를 개선하기 위해 중요하다.
SLE는 피부, 신장, 뇌 및 심장을 비롯한 수많은 장기 및 조직들에 대한 손상을 포함하는 병원성 결과를 가질 수 있는 각종 편재성 분자들에 대한 자가항체의 생산을 특징으로 한다. 현재 인정되고 있는 SLE 치료법은 스테로이드, 면역억제성 약물, 면역조절자 및 항-말라리아성 약물을 통한 비-특이적 면역억제 및 증세 조절을 포함한다. 그러나, 이 치료법은 신장 독성 및 조기 사망의 위험을 초래한다. 이에 따라, 림프구 활성화 및 자가항체 생산을 특히 방해하는 신규 방법의 개발이 요망된다.
면역글로불린의 발현의 증가 및/또는 B 세포가 중요한 역할을 하는 다른 자가면역 질환은 특발성 혈소판감소증, 류마티스성 관절염(RA), 자가면역 용혈성 빈혈 및 중증 근무력증을 포함한다. B 세포 및/또는 증가된 면역글로불린의 역할은 스테로이드, 면역억제제, 및/또는 항-CD20 항체(이는 표적 B 세포를 표적화함)로 처리된 환자를 연구함으로써 입증된다. 이 질환에서의 증세의 개선은 B 세포 및/또는 혈청 면역글로불린의 감소와 상관 관계가 있고, 이는 B 세포가 각종 자가면역 질환들에서 중추적 역할을 함을 강조한다.
면역글로불린의 증가된 발현은 또한 악성 질환에서 나타날 수 있다. 자가면역 장애와 마찬가지로, 암의 병인은 유사하게 기원적으로 다인자적이다. 미국의 사망의 두 번째 요인인 암은 세포의 비억제적 성장을 유발하는 DNA의 병인과 연관되어져 왔다. 유전적 기질은 환경 인자들, 예컨대 흡연 및 화학적 변이유발과 함께 많은 암들의 진행에 큰 역할을 한다.
암은 신체의 임의의 조직 또는 장기에서 일어날 수 있다. 다발성 골수종, 뼈의 "독립성" 골수종, 골수외 형질세포종(extramedullary plasmacytoma), 혈장 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증(왈덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 중쇄 질환, 원발성 아밀로이드증, 미결정 유의성 모노클론 감마병증(MGUS)을 비롯한 혈장 세포 종양은 면역글로불린의 증가된 발현과 관련된다. 만성 림프성 백혈병(CLL), 비-혈장 세포 종양은 또한 고 수준의 면역글로불린 발현과 관련된다.
골수종 또는 칼러씨병은 2차 림프구 조직에서 발생한 후, 골수 조직으로 이동하여 거기에 존재하게 되는, 단일 클론에서 유래된 혈장 세포의 종양이다. 골수종은 통상, 골 통증 및 병적인 파손 또는 병변(골융해성 병변), 비정상 출혈, 빈혈 및 증가된 감염 위험성의 일차적 증세로 골수 및 인접 골구조를 통상 침범한다. 질환의 진전된 단계는 신장 장애, 골격 변형, 척수 압박, 및 과칼슘혈증을 포함한다. 골수종은 뼈의 파골세포 재흡수를 유도함으로써 뼈 세포를 침범하고, 이로써 뼈 구조를 해체하고, 혈장 내 칼슘 농도를 증가시키게 된다. 골수종의 병인은 현재 알려져 있지 않다. 방사선 손상, 발암유전자의 변이, 가족성 원인 및 비정상 IL6 발현과 연관되는 것으로 주장되어 왔다.
다발성 골수종은 다수 기원을 갖는 혈장 세포 종양이다. 다발성 골수종은 모든 혈장 세포 악성 종양들 중 거의 10%에 해당하고, 이는 성인의 가장 통상적인 뼈 종양 암이며, 연간 발병율은 100,000명 당, 3 ~ 4건이다. 미국에서, 다발성 골수종은 비-호지킨림프종 다음으로 두 번째로 가장 통상적인 혈액 악성 종양이며, 미국에서만 대략 50,000건이 있으며, 매년 대략 13,500건이 새로 보고된다. 다발성 골수종으로 진단된 환자에 대한 예후 전망은 좋지 않으며, 진전된 형태의 질환을 갖는 환자의 경우 단지 수개월 내지 1년 정도이다.
골수종 및 다발성 골수종(이하 "골수종"이라 칭함)에 대한 전통적 치료 영역은 화학치료법, 방사선치료법 및 수술로 구성된다. 또한, 골수 이식은, 만약 그렇지 않을 경우 양호한 건강한 상태에 있을 환자에게 권장된다. 환자에 대한 치료율은 30%에 달하고, 이는 골수종을 치료할 수 있는 유일한 공지 방법이다. 그러나, 나이가 많거나 골수 이식 절차를 견딜 수 없는 개인에 대해서는, 화학치료법이 가장 적당하다.
현 진단적 절차는 X선, 골수 취입, 혈액 및 소변 검사(벤스 존스 단백질의 존재를 검출함), 및 적혈구 침강율 검정을 포함한다. CD38, CD9, CD10, HLA-DR 및 CD20을 비롯한 골수종 혈장 세포에서의 잠정적 세포 표면 마커도 또한 동정되었다. [Ruiz-Arugelles GJ 및 San Miguel JF, Cell Surface Markers in Multiple Myeloma, Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994)]. 기타 비-B-세포주 마커는 CD2, CD4, CD13, CD14, CD15, CD23, CD 24, CD25, CD33, CD39, CDw40, CD41, CD45R, CD54, CD56 및 CD71, 및 비클러스터형 항원, R1-3, PCA-1, PCA-2, PC1, 62B1, 8A, 8F6 및 MM4을 포함한다. [Ruiz-Arugelles, 이하 상기 기재된 바와 동일함; Leo R 등, Multiparameter analysis of normal and malignant human plasma cells, Ann. Hematol. 64:132-9 (1992)]. 또한, M-단백질로 알려진 비정상 항체의 외관은 다발성 골수종의 지시자이다. M-단백질의 생산 증가는 다발성 골수종의 고점도 증후군과 연관되어, 피로, 두통, 호흡곤란, 정신착란, 흉통, 신장 손상 및 장애, 시력 문제 및 레이노드 현상 (혈액 순환 장애, 특히 손가락, 발가락, 코 및 귀의 혈액 순환 장애)을 비롯한 무기력화 부작용을 유발한다. 한냉글로불린혈증은 혈액 중 M-단백질이 저온 조건 하에서 입자를 형성할 때 일어난다. 이 입자는 저온의 날씨에서 작은 혈관을 막고, 발가락, 손가락 및 기타 사지에 통증을 유발할 수 있다. 예후 지시자, 예컨대 염색체 결실, 증가된 수준의 베타-2 마이크로글로불린, 혈청 크레아티닌 수준 및 IgA 동형화가 또한 연구되었다. [Tricot G 등, Poor prognosis in Multiple Myeloma , Blood 86:4250-2 (1995)].
CS1[SLAMF7, 19A; 유전자은행 수탁번호 NM_021181. 3, Ref. Boles and Mathew (2001)) Immunogenetics 52:302-307; Bouchon 등 (2001) J. Immunol. 167:5517- 5521; Murphy 등 (2002) Biochem. J. 361:431-436)]은 면역글로불린 상과(superfamily)의 CD2 서브세트의 한 원이다. CD2 과의 분자는 광범위의 면역조절 기능, 예컨대 동시-활성화, 증식 분화, 및 림프구의 접착, 및 면역글로불린 분비, 사이토킨 생산, 및 NK 세포 독성과 관련된다. CD2 과의 수개 원들, 예컨대 CD2, CD58 및 CD150은 자가면역 및 염증성 질환, 예컨대 건선, 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증에 역할을 하며, 그러한 역할을 하는 것이 제안되었다.
CS1(CRACC, 19A, APEX-1 및 FOAP12로도 알려짐)은 Boles, K. 등에 의해 단리되고 클로닝된다([Immunogenetics 52:302-307 (2001)] 참고). CS1이 NK 세포-매개 세포독성 및 림프구 접착에 역할을 하는 것으로 보고되었다[Bouchon, A. 등, J. of Immuno. 5517-5521 (2001); Murphy, J. 등, Biochem. J. 361:431-436 (2002)].
PCT 출원 PCT/US00/34963은 APEX-1에 대한 모노클론 항체, 및 APEX-1의 생성 재조합 세포외 도메인의 검출을 위한 상기 항체의 용도를 개시한다. 그러나, B 세포에 의한 면역글로불린 생산, 및/또는 골수종의 증식 및/또는 발달을 억제할 수 있는 항체가 개발되지 못했고, 상기 공보들에 개시되지 못했다. 또한, 자가면역 질환 또는 암에서의 CS-1의 과다발현의 입증이 개발되거나 상기 공보들에 개시되지 못했다.
발명의 개요
잠정적 표적 및 진단적 마커의 동정을 위해 질환 상태에서 신규 단백질 및 화합물의 역할을 밝혀내는 것이, IBD, SLE, RA 및 골수종을 앓는 환자를 비롯한, 자가면역 및 암 환자의 현 치료를 개선하는데 중요하다. 따라서, 본원에서는 이 질환의 치료 및 진단을 위한 분자 표적, 특히 CS1이 제공된다. 부가적으로, 본원에서는 항체, 예컨대 항-CS1 항체와 같은 중성화 항체를 비롯한, CS1에 결합하고 그것 을 중성화하는 길항자가 제공된다
본 발명은 혈소판, 적혈구 세포, 내피 세포(HuVEC), 신장 세포, 기관지 기도세포, 소 기도 세포, 전립선 세포, 간 세포 또는 유방 세포에서 검출되는 상당한 CS1 단백질 발현이 없다는 본인들의 발견에 부분적으로 기초한다. CS1 발현은 림프구에 대해 특이적이고, 다발성 골수종 및 혈장 세포 백혈병 환자로부터의 혈장 세포를 비롯한, 환자의 세포에 대해 검출된다. 발현은 혈장 세포에서만 검출되고, 골수 샘플로부터의 다른 세포 유형에서는 상당한 수준으로 검출가능하지 않다. 따라서, 본 발명은, 혈장 세포 종양, 예컨대 골수종, 다발성 골수종, 뼈의 "독립성"골수종, 골수외 형질세포종, 혈장 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증(왈덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 중쇄 질환, 일차적 아밀로이드증, 미결정 유의성 모노클론 감마병증(MGUS)을 포함하나 이에 제한되지 않는 암을 치료하기 위한 치료제로서 항-CS1 항체를 이용하는 실행가능성을 입증하였다. 또한, 만성 림프성 백혈병(CLL)을 비롯한 면역글로불린의 증가된 발현과 관련된 비-혈장 세포 종양은 또한 항-CS1 치료법으로부터 이익을 얻을 것이다.
또한, 이전 연구들은 생체외 PWM(포크위드 마이토겐)-활성화 말초 혈액 B 세포, 기억/작동자의 서브세트 대 나이브(naive) 말초 혈액 B 및 T 림프구, 또는 말초 혈액의 CD14+ 단핵구/마크로파지에 대한 CS1 단백질의 발현을 밝혀내지 못했다. 이전 연구들은 또한 면역글로불린 생산에서의 CS1의 역할을 밝혀내지 않았다. 그 결과, CS1 및 자가면역 질환 사이의 상관관계가 이전에 확립되지 않았다. 본 발명은 또한 CS1 RNA 및 단백질 발현이 자가항체 생산의 원인이 될 수 있는 세포 서브세트인 활성화 말초 혈액 B 세포에서 강하게 상향제어되고, 자가면역 질환의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다는 본인들의 발견에 부분적으로 기초한다. 또한, 본 발명은 IBD 환자에서뿐만 아니라 연령별 건강한 성인으로부터의 B 세포에 비해, SLE 환자 말초 혈액 B 림프구에서의 CS1 RNA의 발현이 증가한다는 것을 밝혀내었다. 본 발명은 CS-1이 류마티스성 관절염(RA) 윤활막에서의 침투 혈장 세포에 대해 발현된다는 것을 규명한다. 본 발명은 또한 CS1이 항체 생산에 관련되고, CS1에 대한 항체가 건강한 성인 및 루푸스 환자로부터의 B 세포에 의해 분비된 IgM 및 IgG를 감소시킨다는 것을 밝혀내었다. 후속하여, 본 발명의 데이터는 CS1이 자가면역 질환, 특히 SLE, IBD 및 RA의 확립에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 한냉 응집소 질환, 면역유천 질환(유천 포창, 천포창, 포진상 피부염, 선형 IgA 질환, 및 피부 수포 형성 습득 포함), 혼합 저온형글로불린혈증, 감마글로불린증가증, 쇼그렌 증후군, 자가면역 빈혈, 천식, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 심근 또는 심낭 염증, 아토피성 피부염, 건선, 점액 수종성 태선, 및 고셔병을 비롯한, 면역글로불린, B 세포, 및/또는 B 세포 생성물의 증가와 관련된 다른 질환은 또한 항-CS1 치료로부터 이익을 얻을 것이다.
또한, 자가면역 질환 및 혈장 세포 암, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병을 치료하기 위해 항-CS1 항체를 사용하는 실행가능성을 조사하기 위한 연구가 이전에 행해지지 않았다. 한 이상적 치료적 항체는 표적 세포에 일차적으로 결합해야 한다. 다른 세포 및 조직에 대한 결합은 세포 및 조직에 잠정적 손상을 유발하고/하거나 치료적 항체를 고갈시킬 수 있어, 원하는 치료 효능을 달성하기 위해 과량 의 항체가 환자에게 전달되어야 한다. 더욱 중요하게는, 혈소판에 결합하는 항체는 부작용, 예컨대 혈소판 활성화(이는 과도한 응고를 초래할 수 있음), 또는 혈소판 고갈(이는 혈액 응고의 장애를 초래할 수 있음)을 가질 수 있다. 그러므로, 항체가 다수의 세포 및 조직에 결합할 경우, 특히 그것이 혈소판에 결합할 경우, 치료제로서 항체를 사용하는 것은 주로 실행가능하지 않다. 본 발명은 혈소판, 적혈구 세포, HuVEC, 신장 세포, 기관지 기도세포, 소 기도세포, 전립선 세포, 간 세포 및 유방 세포에 대해 검출된 상당한 CS1 단백질 발현이 없다는 본인들의 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 자가면역 질환 및 혈장 세포 암, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병의 치료를 위한 치료제로서 항-CS1 항체를 사용하는 실행가능성을 입증하였다.
그러므로, 본 발명은 CS1에 결합하는 길항자에 관한 것이다. 그러한 구현예의 예시적 구현예는 항-CS1 항체 및 항체 단편을 중성화하는 것을 포함한다. 항체는 CS1의 하나 이상의 생물학적 활성을 중성화하고, 여기에서 상기 항체는 CS1에 결합하고, (a) 림프구에 의한 면역글로불린 분비 및/또는 생산의 억제; 및 (b) CS1를 발현하는 세포의 용해 유도로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체-단편은 서열번호 3-26 중 어느 하나와 85% 이상의 일치도를 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 상기 항체 단편이 서열번호 3-26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체가 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 9, 10, 11, 15, 16, 17, 21, 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 12, 13, 14, 18, 19, 20, 24, 25 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체가 서열번호 27 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 28 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 ATCC 수탁번호 PTA-5091을 갖는 하이브리도마 세포주 Luc90에 의해 생성된 모노클론 항체의 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, ATCC 수탁번호 PTA-5091을 갖는 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클론 항체의 비-중복 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 2004년 5월 6일에 기탁된, 하이브리도마 세포주 Luc63에 의해 생성된 모노클론 항체의 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 하이브리도마 세포주 Luc63에 의해 생성된 모노클론 항체의 비-중복 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 청구된 항체 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 림프구에 의해 면역글로불린 분비를 감소시키는 방법으로서, 백혈구 또는 림프구를 유효량의 항-CS1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CS1 발현 세포의 세포독성을 유도하는 방법으로서, 상기 세 포를 유효량의 CS1에 대한 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 필요 대상자에게 있어 자가면역 질환, 예컨대 SLE 및 IBD, 및 암, 예컨대 골수종을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 길항자, 예컨대 항-CS1 항체 또는 항체 단편을 사용하는 방법으로서, 상기 대상자에게 유효량의 CS1의 길항자를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 이 항체는 명칭 Luc63를 가지거나 ATCC 수탁번호 PTA-5091을 갖는 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클론 항체의 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명은 또한 자가면역 질환 및 암과 관련된 환자에서의 병리학적 세포의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 방법으로서, 환자로부터의 생물학적 샘플에서 표 2에 기재된 서열(이하, CS1로 칭함)에 대한 일치도가 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상인 서열을 포함하는 핵산을 검출하고, 이로써 병적인 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 생물학적 샘플은 mRNA, DNA 또는 기타 핵산일 수 있는 단리된 핵산을 포함한다. 생물학적 샘플은 자가면역 질환, 예컨대 SLE, RA, 및 IBD, 및 암, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병을 비롯한 병리에 의해 침범된 장기로부터의 조직이다. 핵산을 검출하는 단계 이전에, 추가적 단계에 핵산의 증폭이 포함될 수 있다. 검출은 CS1을 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 단백질에 대한 것이다. 검출 단계는 표지된 핵산 프로브를 이용함으로써 수행될 수 있다. 검출 단계는 CS1 서열에 대한 일치도가 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상인 서열을 포함하거나, 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 검출하는 바이오칩을 이용할 수 있다. 생물학적 샘플은 병리를 치료하기 위한 치료적 섭생을 받고 있거나, 자가면역 질환 또는 암 병리, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병을 가진 것으로 의심되는 환자로부터 유래될 수 있다.
예컨대 표지된 CS1 서열을 비롯한 CS1 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터; 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포; CS1 서열을 포함하는 그러한 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드; 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 특별한 구현예들에서, 항체는 작동자 성분에 접합되거나, 검출가능한 표지(예컨대, 형광 표지, 방사성 동위원소, 또는 세포독성 화학물질을 포함함)에 접합되거나, 인간화된 항체이다.
표
표 1은 CS1 모노클론 항체의 패널의 특이적 결합 활성을 나타내는 결과를 제공한다.
표 2는 CS-1에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다.
표 3A 및 3B는 생체외 활성화된 B-세포 림프구에 의한 IgG 생산의 감소에서 항-CS1 처리의 결과를 나타낸다.
표 4는 Luc90의 중쇄 가변 영역(서열번호 3) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 4)의 아미노산 서열; Luc63의 중쇄 가변 영역(서열번호 5) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 6)의 아미노산 서열; 및 Luc34의 중쇄 가변 영역(서열번호 7) 및 경쇄 가변 영 역(서열번호 8)의 아미노산 서열을 제공한다. 서열번호 9, 10 및 11은 Luc90 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다. 서열번호 12, 13 및 14는 Luc90 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다. 서열번호 15, 16 및 17는 Luc63 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다. 서열번호 18, 19 및 20은 Luc63 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다. 서열번호 21, 22 및 23은 Luc34 중쇄CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다. 서열번호 24, 25 및 26은 Luc34 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각기 나타낸다.
표 5는 Luc 63의 중쇄 가변 영역(서열번호 27) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 28)의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 29-37은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR을 가기 나타낸다. 서열번호 33은 Luc 63의 중쇄 가변 영역의 CDR3에서 NYT 내지 NYA(이탤릭체)로부터의 단일 아미노산 변이를 나타낸다.
표 6은 마우스 중쇄 Luc 63(서열번호 37), 인간 중쇄 가변 영역 cDNA(서열번호 39), 인간 JH1 cDNA(서열번호 40) 및 인간화 Luc 63 중쇄 가변 영역(서열번호 41)의 아미노산 서열을 제공한다. 또한, 마우스 경쇄 가변 영역(서열번호 42), 인간 경쇄 가변 영역 cDNA(서열번호 43) 및 인간화 Luc 63 경쇄 가변 영역(서열번호 44)의 아미노산 서열이 제공된다.
표 7은 VH 영역 아미노산 서열의 배열을 제공한다. MuLuc63 및 HuLuc63의 VH 영역의 아미노산 서열(각기 서열번호 45 및 47), 및 인간 cDNA E55 3-14 및 JH1 세그먼트(서열번호 46)이 단일 문자 코드로 나와 있다. CDR 서열은 Kabat의 정의 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기초하고, MuLuc63 VH 서열에 밑줄쳐져 있으며; 넘버링도 또한 Kabat에 따른다. 인간 VH 세그먼트에서의 CDR 서열은 도면에서 생략되어 있다. HuLuc63 VH 서열에서의 한 줄로 밑줄쳐진 아미노산은 CDR 서열과 접촉하고, 이에 따라 상응 마우스 잔기로 치환되는 것으로 예측되었다. 잠정적 N-연결 글리코실화 부위(NYT)의 제거를 위한 CDR2에서 일어난 트레오닌(T)에서 알라닌(A)으로의 변이가 이중 밑줄로 나타내어져 있다.
표 8은 VL 영역 아미노산 서열의 배열을 제공한다. MuLuc63 및 HuLuc63의 VL 영역의 아미노산 서열(각기, 서열번호 48 및 50), 인간 cDNA III-2R 서열(서열번호 49)이 단일 문자 코드로 나와 있다. Kabat의 정의[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기초하는 CDR 서열이 MuLuc63 VL 서열에서 밑줄쳐 있고; 넘버링도 또한 Kabat에 따른다. 인간 VL 세그먼트에서의 CDR 서열은 도면에서 생략되어 있다. HuLuc63 VL 서열에서의 한 줄로 밑줄쳐진 아미노산은 CDR 서열과 접촉하고, 이에 따라 상응 마우스 잔기로 치환되는 것으로 예측된다.
표 9는 HuLuc63 VH 및 VL 유전자의 클로닝에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 열거한다.
도면
도 1A은 주로 혈장 및 기억 B 세포에서의 CS1 발현을 나타낸다.
도 1B는 신장, 심장, 임파절, 간, 소장, 뇌, 골수, 골격근, 비장 및 폐 조직 샘플에서의 CS1 발현을 나타낸다.
도 2A는 백혈구 및 기타 정상 성인 조직에서의 CS1 발현을 나타낸다.
도 2B는 다수의 활성화 백혈구 모집단에서의 증가된 CS1 발현을 나타낸다.
도 3은 항-CS1 모노클론 항체의 경쟁 검정의 결과를 나타낸다.
도 4는 항-CS1 모노클론 항체의 상대적 친화성을 나타낸다.
도 5A는 3개의 항-CS1 모노클론 항체(Luc 23, Luc 38 및 Luc 63)를 이용한 CS1-발현 세포의 면역조직학적 염색을 나타낸다.
도 5B는 항-CS1 및 항-CD 138 모노클론 항체를 이용한 염증 편도선의 면역조직학적 염색을 나타낸다.
도 5C는 항-CS1 및 항-CD138 모노클론 항체를 이용한 류마티스성 관절염 환자로부터의 활막관절 조직의 면역조직학적 염색을 나타낸다.
도 6은 3개의 항-CS1 모노클론 항체(Luc 63, Luc34 및 Luc 38)을 이용한, 포크위드 마이토겐 처리 말초 혈액 단핵 세포 대 비자극 말초 혈액 단핵 세포의 세포 표면 염색을 나타낸다.
도 7은 ELISA-기재의 CS1-결합 검정에서의 인간화 Luc 63(야생형 NYT 대 탈글루코실화 NYA 변이)의 결합 활성을 나타낸다.
도 8은 인간화 Luc 63의 가변 영역의 3차원 모델을 나타낸다.
도 9는 실시간 PCR 분석에 의해 검정된 활성화 말초 혈액 B 및 T 림프구에서의 CS1 발현의 상향제어를 나타낸다.
도 10은 실시간 PCR 분석에 의해 검정된 연령별 건강한 성인 대비의, SLE 환 자 말초 혈액 B 림프구에서의 증가된 CS1 발현을 나타낸다.
도 11은 마이크로어레이 실험에서 정상 성인 결장 상피 세포 대비의, CS-1 발현의 그래프 표시를 나타내고; CS-1 발현은 정상 성인 결장 상피 세포에 비해, 궤양성 대장염(n=4) 및 크론씨병(n=5)이 있는 환자에서 증가된다. 막대 기호 위의 숫자는 각 샘플에 대한 정상 성인 결장 상피 세포에 대한 배(fold) 변화를 가리킨다.
도 12는 실시간 PCR 정량화를 이용한 염증성 장 질환 환자에서의 CS1 발현의 상향제어를 나타낸다. CS-1 발현은 풀링된 정상 성인 대장 조직 샘플에 비해, 궤양성 대장염(n=2) 및 크론씨병(n=3)이 있는 환자에서 증가된다. 막대 기호 위의 숫자는 각 샘플에 대한 정상 성인 대장 조직에 대한 배 변화를 가리킨다.
도 13은 골수종 세포 상의 CS1의 현저한 발현을 나타낸다.
도 14A-14H는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 혈장 세포에서의 CS1의 발현을 나타낸다.
도 14I는 혈장 세포 백혈병이 있는 환자로부터의 말초 혈액 세포 상에서의 CS1의 발현을 나타낸다.
도 15는 골수 세포 서브타입에 대한 CS1의 발현을 나타낸다.
도 16은 항-CS1 모노클론 항체에 의한, 활성화된 PBMC의 생체외 IgM 분비의 억제를 나타낸다.
도 17은 항-CD2 모노클론 항체 대비의, 항-CS1 모노클론 항체에 의한 림프구의 생체외 IgM 분비의 억제를 나타낸다.
도 18은 항-CS1 모노클론 항체에 의한, 건강한 성인 및 자가면역 질환 환자의 림프구의 생체외 IgM 분비의 억제를 나타낸다.
도 19A는 항-CS1 모노클론 항체에 의한, SCID-HuPBMC 마우스 모델에서의 생체내 인간 IgG 생산의 억제를 나타낸다.
도 19B는 항-CS1 모노클론 항체 Luc 90 및 63에 의한, SCID-HuPBMC 마우스 모델에서의 생체내 인간 IgG 생산의 억제의 비교를 나타낸다.
도 19C는 항-CS1 모노클론 항체에 의한, SCID-HuPBMC 마우스 모델에서의 생체내 인간 IgG 생산의 억제의 개요를 나타낸다.
도 20은 항-CS1 모노클론 항체 Luc90 및 Luc63에 의한 항체-의존성 세포의 세포독성의 유도를 나타낸다.
도 21A는 푸코스의 수준 감소로 키메라 항체에 의해 증진되는 항-CS1 키메라 Luc90 모노클론 항체에 의한 항체-의존성 세포의 세포독성의 유도를 나타낸다.
도 21B는 항-CS1 키메라 Luc90 모노클론 항체에 의한 다발성 골수종 OPM2 세포의 항체-의존성 세포의 세포독성의 유도를 나타낸다.
도 21C는 항-CS1 키메라 Luc90 모노클론 항체에 의한 다발성 골수종 L363 세포의 항체-의존성 세포의 세포독성의 유도를 나타낸다.
도 22는 항-CS1 항체 Luc 90 및 Luc 63 대 아형 대조군 항체로 처리된 마우스 이종이식편 다발성 골수종 모델에서의 감소된 종양 부피를 나타낸다.
상기 기술된 목표에 따라, 본 발명은 각종 장애, 예컨대 자가면역 장애 및 각종 한정된 암 상태, 예컨대 각종 형태의 골수종을 처리하기 위한 신규 방법을 제공한다. 또한, 그러한 장애의 진단 및 예후 평가를 위한 방법, 및 그러한 조건을 조절하는 조성물을 선별하기 위한 방법도 제공된다. 본 발명은 또한 상기 장애에서 선택적으로 발현된 마커를 모니터링하고 선별하는 것을 비롯한, 상기와 같은 처리의 치료적 효능을 모니터링하는 방법도 제공한다.
특히, 자가면역 장애, 예컨대 SLE, RA 및 IBD, 및 암 상태, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병에서 선택적으로 발현된 마커의 동정은, 진단적, 예후, 또는 치료적 방법에서 그 발현이 사용될 수 있도록 한다. 이에 따라, 본 발명은 그 마커를 선택적으로 동정하는데 유용한 각종 조성물, 예컨대 핵산, 폴리펩티드, 항체, 및 소분자 작용자/길항자를 정의한다. 마커는 서브세트가 매우 상이한 치료들을 사실상 필요로 할 수 있는 질환의 서브세트의 분자적 특징화에 유용할 수 있다. 또한, 마커는 또한 예컨대 그러한 조건에서와 같이 유사한 조직을 침범하거나, 유도/유지의 유사 메커니즘을 가질 수 있는, 자가면역 장애, 골수종, 및 혈장 세포 백혈병과 관련된 질환에서 중요할 수 있다. 예를 들어, 종양 과정 또는 특징이 또한 표적화될 수 있다. 진단적 및 예후적 사용은, 예컨대 자가면역 장애, 골수종, 또는 혈장 세포 백혈병의 단계들을 분화하거나 그러한 조건의 치료 전략을 결정하기 위해, 질환과 관련되나 그와 구분되는 서브세트에 이용가능하다. 검출 방법은 핵산, 예컨대 PCR 또는 혼성화 기술, 또는 단백질, 예컨대 ELISA, 이미징, IHC 등에 기초할 수 있다. 진단은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 발현 수준의 증가 또는 감소를 검출할 수 있다.
정의
용어 "CS1 단백질" 또는 "CS1 폴리뉴클레오티드" 또는 "CS1-연합 전사체"는, (1) CS1 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 CS1 유전자와 관련된 뉴클레오티드 서열(표 2), CS1 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 CS1 유전자와 관련된 뉴클레오티드 서열(표 2)에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 제기된 결합 파트너, 예컨대 폴리클론 항체에 대한 CS1 유전자(표 2)의 결합, 및 그것의 보존적으로 변형된 변종체에 대해, 바람직하게 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000 이상 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐, 약 60% 초과의 뉴클레오티드 서열 일치도, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 약 92%, 94%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 뉴클레오티드 서열 일치도를 가지거나; (3) 혼성화 조건 하에서 CS1 (표 2)의 핵산 서열, 또는 그것의 상보체, 및 그것의 보존적으로 변형된 변종체에 대해 특이적으로 혼성화하거나; (4) CS1 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 CS1 유전자와 관련된 뉴클레오티드 서열(표 2)에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해, 바람직하게 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐, 약 60% 초과의 아미노산 서열 일치도, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 바람직하게 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열을 가지는, 핵산 및 폴리펩티드 다형성 변종체, 대립유전자, 변이체 및 종간 상동체를 가리킨다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 통상적으로 영장류, 예컨대 인간; 설치류, 예컨대 래트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양 또는 기타 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물의 것이다. "CS1 폴리펩티드" 및 "CS1 폴리뉴클레오티드"는 자연 발생적 또는 재조합 형태를 모두 포함한다.
"전장" CS1 단백질 또는 핵산은 하나 이상의 자연 발생적, 야생형 CS1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 정상적으로 함유된 요소를 포함하는, CS1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 변종체를 가리킨다. "전장"은 후번역 처리 또는 스플라이싱, 예컨대 대안적 스플라이싱의 각종 단계들 전 또는 후일 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 예컨대 CS1 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 전사체의, 핵산 또는 폴리펩티드를 함유하는 생물학적 조직 또는 체액의 샘플을 가리킨다. 그러한 샘플은 영장류, 예컨대 인간, 또는 설치류, 예컨대 마우스, 및 래트로부터 단리된 조직을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 또한 생체검사 및 검시 샘플, 조직학적 목적을 위해 취해진 냉동 구획, 보존 샘플, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 대변, 눈물, 점막, 모발, 피부 등과 같은 조직의 구획들을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 외식편 및 환자 조직으로부터 유래된 일차적 및/또는 형질전환된 세포 배양물을 포함한다. 생물학적 샘플은 통상적으로 진핵 생물, 가장 바람직하게는 포유동물, 예컨대 침팬지 또는 인간; 소; 개; 고양이; 설치류, 예컨대 기니어피그, 래트, 마우스; 래빗; 또는 조류; 파충류; 또는 어류로부터 수득된다. 가축류가 유익하다.
"생물학적 샘플의 제공"은 본 발명에 기재된 방법에 사용하기 위한 생물학적 샘플을 수득하는 것을 의미한다. 가장 종종, 이는 동물로부터 세포의 샘플을 제거함으로써 행해지나, 미리 단리된(예컨대, 다른 한 사람에 의해 다른 한 시간에 및/또는 다른 한 목적을 위해 단리된) 세포를 이용하거나 본 발명의 방법을 생체내 수행함으로써 달성될 수 있다. 처리 또는 성과 내역을 갖는 보존 조직 또는 물질이 특히 유용할 것이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥 내에서 용어 "일치하는" 또는 "일치"도(%)는, 하기 디폴트 파라미터를 가지고, 예컨대 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하거나, 수동 배열 및 가시적 조사에 의해 측정 시에, 동일한(예컨대, 비교 창 또는 표시된 영역에 걸친 최대 일치에 대한 비교 및 배열 시, 특정된 영역에 대해 약 70% 일치도, 바람직하게 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상 일치하는) 특정된 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가지거나, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 가리킨다. 그러한 서열은 이에 "실질적으로 일치하는" 것으로 일컬어진다. 이 정의는 또한, 시험 서열의 상보체에도 관련되거나, 그에 적용될 수 있다. 정의는 또한 결실 및/또는 삽입, 치환 및 자연 발생적, 예컨대 다형성 또는 대립유전자 변종체 및 인조 변종체를 가지는 서열을 포함한다. 후술되는 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 간격 등을 설명할 수 있다. 바람직하게, 일치도는 길이가 적어도 약 25 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 약 50-100 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고, 그에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하여, 필요한 경우 하위서열 좌표가 표시되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 표시된다. 바람직하게, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 표시될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 일치도(%)를 계산한다.
본원에 사용되는 "비교 창"은 통상적으로 약 20 내지 600, 주로 약 50 내지 200, 더욱 주로 약 100 내지 150으로 구성되는 군으로부터 선택되는 인접 위치의 세그먼트를 지칭하는 것을 포함하고, 여기에서 서열은 2개 서열이 최적으로 배열된 후, 동일한 수의 인접 위치들의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 배열 방법이 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은, 예컨대 [Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453]의 상동성 배열 알고리즘, [Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]의 유사성 방법 검색, 이 알고리즘의 컴퓨터처리 이행([위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 575 Science Dr., 미국 위스콘신주 매디슨]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동적 배열 및 가시적 검사(예컨대, [Ausubel 등 (1995년 판 및 부록) Current Protocols in Molecular Biology Wiley] 참고)에 의해 수행될 수 있다.
서열 일치도(%) 및 서열 유사성을 결정하는데 적당한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하고, 이는 [Altschul 등 (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 일치도(%)를 결정하기 위해, BLAST 및 BLAST 2.0이 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어가 [National Center for Biotechnology Information]을 통해 공연히 입수가능하다. 이 알고리즘은, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 배열될 때 일부 양성값의 역치 스코어 T와 매칭되거나 만족하는, 질의 서열(query sequence)에서의 길이 W의 짧은 단어를 규명함으로써 높은 스코어링 서열 쌍(HSP)을 먼저 규명하는 것을 포함한다. T는 인접 단어 스코어 역치를 가리킨다 [Altschul 등, 이하 상기한 바와 동일함]. 이 초기 인접 단어 히트는 그것을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 조사를 개시하기 위한 근원으로서 작용한다. 단어 히트는 누적 배열 스코어가 증가될 수 있는 한, 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 스코어는, 예컨대 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(한 쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 스코어; 항상 >0임) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 <0임)를 이용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 행렬을 사용한다. 각 방향으로의 단어 히트의 확장은, 누적 배열 스코어가 그것의 최대 달성 값에서 X 양만큼 하락될 때; 하나 이상의 음-스코어링 잔기 배열의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 진행될 때; 또는 어느 한 서열의 말단이 도달될 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 배열의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 양 나선의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이, 및 10의 기대치(E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 행렬[Henikoff 및 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-919 참고) 배열(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양 나선의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다. 예컨대, [Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 90:5873-5787]을 참고한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 측정값은 가장 작은 합 확률(P(N))이며, 이는 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 수 있는 확률을 가리킨다. 예를 들어, 핵산은 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소의 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우, 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다. 로그 값은 음의 큰 수, 예컨대 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150, 170 등일 수 있다.
2개 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 것은, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 일어난 항체와 면역학적으로 교차 반응성임을 가리킨다. 이에 따라, 폴리펩티드는 통상적으로 제2 폴리펩티드에 실질적으로 일치하며, 예컨대 이 경우 2개의 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해 상이하다. 또한, 2개 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 것은, 2개 분자 또는 그것의 상보체가 엄격한 조건 하에서 상호 혼성화함을 가리킨다. 또한, 2개 핵산 서열이 실질적으로 일치한다는 것은, 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있음을 가리킨다.
"숙주 세포"는 발현 벡터를 함유하고 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지하는 자연 발생적 세포 또는 형질전환된 세포이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 외식편, 생체내 세포 등일 수 있다. 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 E. 콜라이, 또는 진핵 세포, 예컨대 효모, 곤충, 양서류, 또는 포유동물의 세포, 예컨대 CHO, HeLa 등일 수 있다(예컨대, 미국미생물기탁기관(American Type Culture Collection) 카달로그 또는 웹 사이트).
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견될 때 정상적으로 그것에 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 가리킨다. 순도 및 동종성은 통상적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고 성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석적 화학 기술을 이용하여 결정된다. 제제 내에 존재하는 우세 종인 단백질 또는 핵산이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 핵산은 자연적으로 유전자에 인접하고 유전자에 의해 코딩된 단백질을 코딩하는 일부 개방 해독 프레임으로부터 분리된다. 일부 구현예들에서의 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성시킴을 가리킨다. 바람직하게, 그것은 핵산 또는 단백질의 순도가 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상임을 의미한다. 다른 구현예들에서의 "정제하다" 또는 "정제"는 정제되는 조성물로부터 하나 이상의 오염물질 또는 성분을 제거하는 것을 의미한다. 이 의미에서, 정제는 정제된 화합물이 균질해야 하는 것, 예컨대 순도가 100%이어야 하는 것을 요하지 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 가리키기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 그 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응 자연 발생적 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 및 자연 발생적 아미노산 중합체, 변형된 잔기를 갖는 자연 발생적 아미노산 중합체 및 비-자연 발생적 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생적 및 합성 아미노산, 및 자연 발생적 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 모방체 및 아미노산 동종체를 가리킨다. 자연 발생적 아미노산은 유전적 코드에 의해 코딩된 자연 발생적 아미노산, 후에 변형된 자연 발생적 아미노산, 예컨대 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 동종체는 자연 발생적 아미노산과 동일한 염기성 화학적 구조, 예컨대 α 탄소가 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 구조를 가지는 화합물, 예컨대 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 가리킨다. 그러한 동종체는 변형된 R 기(예컨대, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있으나, 자연 발생적 아미노산으로서 일부 염기성 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적 화학 구조와 상이한 구조를 가지나, 다른 한 아미노산과 유사하게 기능하는 화학적 화합물을 가리킨다.
아미노산은 본원에서 그것의 통상적으로 공지된 3개 문자 기호에 의해, 혹은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 하나의 문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드도 마찬가지로 그것의 통상 수용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변종체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특별한 핵산 서열에 대해, 보존적으로 변형된 변종체는 일치하거나 본질적으로 일치하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 가리키거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 일치하거나 연관된, 예컨대 자연적으로 인접하는 서열을 가리킨다. 유전적 코드의 퇴화로 인해, 수많은 기능적으로 일치하는 핵산이 대부분의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 각기 아미노산 알라닌을 코딩한다. 이에 따라, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 각 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고 상기한 상응 코돈의 다른 하나로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변화는 보존적으로 변형된 한 변종 형태인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산은 또한 핵산의 침묵 변이를 기술한다. 특정 문맥에서, 핵산 중 각 코돈(메티오닌에 대한 보통 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 보통 유일한 코돈인 TGG 제외)은 기능적으로 유사한 분자를 생산시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 침묵 변이는 발현 생성물에 대해 기술된 서열 내에 내재하나, 실제 프로브 서열에 대해서는 반드시 그러하지 않다.
아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 낮은백분율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적 치환, 결실 또는 첨가가 "보존적으로 변형된 변종체"임(여기에서, 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키게 됨)을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변종체는 본 발명의 다형성 변종체, 종간 동종체 및 대립유전자에 부가되는 것으로, 그것을 제외시키지 않는다. 통상적으로 보존적 치환은 서로에 대해, 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)을 포함한다(예컨대, [Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties Freeman] 참고).
폴리펩티드 구조와 같은 거대분자 구조가 조직의 각종 수준에 대해 기술되었다. 이 조직의 일반적 논의에 대해, 예컨대 [Alberts 등 (2001년 판) Molecular Biology of the Cell (제4판) Garland; 및 Cantor 및 Schimmel(1980) Biophysical Chemistry 파트 I: The of Biological Macromolecules Freeman]를 참고한다. "일차 구조"는 한 특별한 펩티드의 아미노산 서열을 가리킨다. "2차 구조"는 폴리펩티드 내의 국소적으로 정렬된 3차원 구조이다. 이 구조는 통상 도메인으로 알려져 있다. 도메인은 폴리펩티드의 조밀한 단위를 종종 형성하는 폴리펩티드의 부분이며, 통상적으로 길이가 25 내지 대략 500 아미노산이다. 전형적인 도메인은 β-시이트 및 α-나선의 펴짐과 같이 보다 적은 조직체의 구획으로 구성된다. "3차 구조"는 폴리펩티드 단량체의 완전한 3차원 구조를 가리킨다. "4차 구조"는 주로 독립 3차 단위의 비공유결합에 의해 형성된 3차원 구조를 가리킨다. 비등방성 용어는 또한 에너지 용어로도 알려져 있다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 문맥상의 동등물은 함께 공유결합된 2개 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 통상적으로 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 이상 뉴클레오티드 내지, 약 100 이하의 뉴클레오티드이다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 보다 긴 길이, 예컨대 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000 등을 비롯한 임의의 길이의 중합체이다. 본 발명의 핵산은, 일부 경우들에서 하나 이상의 상이한 연결기, 예컨대 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결기([Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach 옥스포드대학 출판부] 참고); 및 펩티드 핵산 골격 및 연결기를 가질 수 있는 핵산 동종체가 포함될 수 있으나, 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 가질 것이다. 다른 동종체 핵산은 [U.S. 특허 No. 5,235,033 및 No. 5,034,506, 및 Sanghvi 및 Cook(1994년 판) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS 심포지움 시리즈 580의 제6장 및 제7장]에 기재된 것들을 비롯한, 양성 골격; 비이온성 골격, 및 비-리보스 골격을 갖는 핵산을 포함한다. 하나 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 한 정의 내에 포함된다. 리보스-포스페이트 골격의 변형은 각종 이유들을 위해, 생리학적 환경에서의 그러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해, 또는 바이오칩 상의 프로브로서 행해질 수 있다. 자연 발생적 핵산 및 동종체의 혼합물이 제조될 수 있고; 대안적으로, 상이한 핵산 동종체들의 혼합물, 및 자연 발생적 핵산 및 동종체의 혼합물이 제조될 수 있다.
각종 문헌들은, 예컨대 포스포르아미데이트(Beaucage 등 (1993) Tetrahedron 49:1925-1963 및 그 안에 기재된 참고문헌들; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800-3803; Sprinzl 등 (1977) Eur. J. Biochem. 81:579-589; Letsinger 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487-499; Sawai 등(1984) Chem. Lett. 805, Letsinger 등 (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; 및 Pauvels 등(1986) Chemica Scripta 26:141-149), 포스포로티오에이트(Mag 등 (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437-441; 및 U.S. 특허 No. 5,644,048), 포스포로디티오에이트 (Brill 등(1989) J. Am Chem. Soc. 111:2321-2322), O-메틸포스포로아미다이트 연결기([Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, 옥스포드대학 출판부] 참고), 및 펩티드 핵산 골격 및 연결기([Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897; Meier 등 (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008-1010; Nielsen (1993) Nature 365:566-568; Carlsson 등 (1996) Nature 380:207] 참고, 이는 모두 본원에 참고로 인용됨)를 비롯한, 상기와 같은 핵산 동종체들을 개시한다. 다른 동종체 핵산은 양성 골격(Denpcy 등 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097-101; 비이온성 골격(U.S. 특허 No. 5,386,023, No. 5,637,684, No. 5,602,240, No. 5,216,141, 및 No. 4,469,863; Kiedrowski 등 (1991) Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423-426; Letsinger 등 (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; Letsinger 등 (1994) Nucleoside and Nucleotide 13:1597; [Sanghvi 및 Cook (1994년 판) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS 심포지움 시리즈 580]의 제2장 및 제3장; Mesmaeker 등 (1994) Bioorganic and Medicinal Chem. Lett. 4:395-398; Jeffs 등 (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Horn 등 (1996) Tetrahedron Lett. 37:743) 및 비-리보스 골격을 갖는 것들, 예컨대 U.S. 특허 No. 5,235,033 및 No. 5,034,506 및, [Sanghvi 및 Cook (1994년 판) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS 심포지움 시리즈 580의 제6장 및 제7장 에 기재된 것들을 포함한다. 하나 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 한 정의 내에 포함된다([Jenkins 등 (1995) Chem. Soc. Rev. pp 169-176] 참고). 수가지 핵산 동종체들이 [Rawls (p. 35, 1997년 6월 2일) C & E News]에 기재되어 있다.
특히 바람직한 것은 핵산 동종체를 포함하는 펩티드 핵산(PNA)이. 펩티드 핵산은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로부터 된 골격을 가진다. 상이한 염기(퓨린 및 피리미딘)가 메틸렌 카르보닐 연결기에 의해 골격에 연결된다. 이 골격은 자연 발생적 핵산의 매우 하전된 포스포디에스테르 골격과 대조적으로, 중성 조건 하에 실질적으로 비이온성이다. 이는 2개 이상의 이점들을 초래한다. PNA 골격은 향상된 혼성화 동역학을 나타내고, 이는 PNA 나선 및 DNA 나선 사이보다, PNA/DNA 나선 사이에서 결합 강도가 더 크도록 한다. PNA는 완전히 매칭딘 염기 쌍에 비해, 미스매칭된 것에 대해 융점(Tm) 변화가 더 크다. DNA 및 RNA는 통상적으로 내부 미스매치에 대해 Tm에 있어 2-4℃의 하락폭을 나타낸다. 비이온성 PNA 골격의 경우, 하락폭이 7-9℃에 근접한다. 유사하게, 그것의 비이온성 성질로 인해, 이 골격에 부착된 염기의 혼성화는 비교적 염 농도에 민감하지 않고, 또한 PNA는 세포성 효소에 분해되지 않아, 더 안정할 수 있다.
핵산은 특정된 단일 나선 또는 이중 나선이거나, 이중 나선 또는 단일 나선 서열 모두의 부분을 함유할 수 있다. 단일 나선이라는 묘사는 또한 상보적 나선의 서열을 한정하고; 이에 따라 본원에 기재된 서열은 또한 서열의 상보체를 제공한다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA, 또는 혼성체일 수 있고, 여기에서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌 등을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. "전사체"는 통상적으로 자연 발생적 RNA, 예컨대 프레-mRNA, hnRNA, 또는 mRNA를 가리킨다. 본원에 사용되는 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 동종체, 및 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 아미노 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 또한, "뉴클레오시드"는 비-자연 발생적 동종체 구조체를 포함한다. 이에 따라, 각기 염기를 함유하는, 예컨대 펩티드 핵산의 개별적 단위는 본원에서 뉴클레오시드로 칭해진다.
"표지" 또는 "검출가능한 부분"은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 생리학적, 화학적, 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 일반적으로, 표지는 3가지 부류로 분류된다: a) 방사성 또는 중 동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 항체, 항원 또는 에피토프 택일 수 있는 면역 표지; 및 c) 착색 또는 형광 염료. 표지는 CS1 핵산, 단백질, 및 항체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있어야 한다. 검출가능한 부분은 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32p, 35S 또는 125I, 전자밀집 시약, 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소(예컨대, ELISA에 통상 사용되는 효소), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 헵텐 및 단백질, 또는 검출가능하게 될 수 있는 기타 실체, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 항체를 표지에 접합하기 위한 방법이 알려져 있다. 예컨대, [Hunter 등 (1962) Nature 144:945; David 등 (1974) Biochemistry 13:1014-1021; Pain 등(1981) J. Immunol. Meth. 40:219-230; 및 Nygren (1982) J. Histochem. 및 Cytochem. 30:407-412]를 참고한다.
"작동자" 또는 "작동자 부분" 또는 "작동자 성분"은 링커 또는 화학적 결합을 통해 공유결합으로, 또는 이온 결합, 반 데르 발스 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합을 통해 비공유결합으로 항체에 결합(또는 연결 또는 접합)되는 분자이다. "작동자"는 예컨대, 방사성 화합물, 형광 화합물, 효소 또는 기질, 택, 예컨대 에피토프 택, 독소를 비롯한 검출 부분; 활성화가능한 부분, 화학치료제; 리파제; 항생제; 화학유인 부분, 면역 조절제(micA/B), 또는 방사성 동위원소, 예컨대 방사 "경질" 베타, 방사선을 포함하는 각종 분자들일 수 있다.
"표지된 핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드"는 예컨대 링커 또는 화학적 결합을 통해 공유결합으로, 또는 이온 결합, 반 데르 발스 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합을 통해 비공유결합으로 표지에 결합된 것으로서, 프로브에 결합된 표지의 존재를 검출함으로써 프로브의 존재를 검출할 수 있다. 대안적으로, 높은 친화성 상호작용을 이용하는 방법은 한 쌍의 결합 파트너들 중 하나가 다른 하나, 예컨대 비오틴, 스트렙타비딘에 결합하는 동일한 결과를 달성할 수 있다.
본원에 사용된 "핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 유형의 화학적 결합을 통해, 주로 상보적 염기 쌍 매칭, 예컨대 수소 결합 형성을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 대해 결합할 수 있는 핵산이다. 본원에 사용된 프로브는 자연적(예컨대, A, G, C 또는 T) 또는 변형된 염기(7-데아자구아노신, 이노신 등)을 포함할 수 있다. 또한, 프로브 내의 염기는 포스포디에스테르 결합 이외의 연결기, 바람직하게는 혼성화를 기능적으로 저해하지 않는 연결기에 의해 결합될 수 있다. 이에 따라, 예컨대 프로브는 구성성분 염기가 포스포디에스테르 연결기가 아닌 펩티드 결합에 의해 결합될 수 있는 펩티드 핵산일 수 있다. 프로브는 혼성화 조건의 엄격성에 따라, 프로브 서열에 대한 완전한 상보성이 결여된 표적 서열에 결합할 수 있다. 프로브는 바람직하게 예컨대 동위원소, 발색단, 발광단, 색원체로 직접적으로 표지되거나, 예컨대 후에 스트렙타비딘 착물이 결합할 수 있는 비오틴으로 간접적으로 표지될 수 있다. 프로브의 존재 또는 부재에 대한 검정에 의해, 선택된 서열 또는 하위서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 진단 또는 예후는 게놈 수준, 또는 RNA 또는 단백질 발현의 수준에 기초할 수 있다.
용어 "재조합"은, 예컨대 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었음을, 또는 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래됨을 가리킨다. 이에 따라, 예컨대 재조합 세포는 천연(비-재조합) 형태의 세포 이내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 발현되거나 전혀 발현되지 않는, 만약 그렇지 않을 경우 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현한다. 본원의 "재조합 핵산"은 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태의, 예컨대 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 이용하여, 일반적으로 핵산의 조작에 의해, 생체외 본래 형성된 핵산을 의미한다. 이러한 방식으로, 상이한 서열의 작용적 연결기가 달성된다. 이에 따라, 선형 형태의 단리된 핵산, 또는 정상적으로 결합되지 않은 DNA 분자를 라이게이션함으로써 생체외 형성된 발현 벡터가 모두 본 발명의 목적을 위해 재조합으로 간주된다. 일단 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 생물에 도입되면, 그것은 예컨대 생체외 조작이 아닌 숙주 세포의 생체내 세포 기계작용을 이용하여 비재조합으로 복제되게 됨을 이해하며; 그러나, 그러한 핵산은 일단 재조합으로 생성되면, 비재조합으로 복제될지라도 본 발명의 목적을 위해 여전히 재조합으로 간주된다.
유사하게, "재조합 단백질"은 예컨대, 상기 재조합 핵산의 발현을 통해, 재조합 기술을 이용하여 제조된 단백질이다. 재조합 단백질은 하나 이상의 특성들에 의해 자연 발생적 단백질과 구분된다. 단백질은 그것의 야생형 숙주에서 정상적으로 관련된 단백질 및 화합물의 일부 또는 대부분으로부터 단리거나 정제될 수 있고, 이에 따라 실질적으로 순수할 수 있다. 단리된 단백질은 자연 상태에서 정상적으로 관련된 물질의 적어도 일부를 동반하지 않으며, 그 물질은 주어진 샘플에서의 총 단백질의 바람직하게 약 0.5 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 이상을 구성한다. 실질적으로 순수한 단백질은 총 단백질의 약 75 중량% 이상을 구성하고, 바람직하게는 약 80 중량% 이상, 특히 바람직하게는 약 90 중량% 이상을 구성한다. 정의는 상이한 생물 또는 숙주 세포 내의 한 생물로부터의 CS1 단백질의 생산을 포함한다. 대안적으로, 단백질은 유도성 프로모터 또는 높은 발현 프로모터의 사용을 통해, 정상적으로 나타나는 것보다 상당히 높은 농도에서 제조될 수 있어, 단백질은 증가된 농도 수준으로 제조된다. 대안적으로, 단백질은 이하 논의되는, 에피토프 택의 첨가 또는 아미노산 치환, 삽입 및 결실에서와 같이 정상적으로 자연적 발견되지 않는 형태의 것일 수 있다.
용어 "이종성"은 핵산의 부분과 관련하여 사용될 때, 핵산이 정상적으로 자연적으로 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 가리킨다. 예를 들어, 예컨대 신규 기능적 핵산을 만들기 위해 배치된 비관련 유전자, 예컨대 하나의 원으로부터의 프로모터 및 다른 한 원으로부터의 코딩 영역으로부터, 2개 이상의 서열을 갖는 핵산이 통상적으로 재조합으로 생성된다. 유사하게, 이종성 단백질은 자연적으로 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열(예컨대, 융합 단백질)을 가리킨다.
"프로모터"는 통상적으로 핵산의 전사를 주도하는 핵산 조절 서열의 배열이다. 본원에 사용되는 프로모터는 예컨대, 폴리머라제 II형 프로모터, TATA 요소의 경우에서, 전사의 개시 부위 부근에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한, 전사의 개시 부위로부터 수천개의 염기 쌍들만큼 존재할 수 있는, 말단 인핸서 또는 리프레서 요소를 임의적으로 포함한다. "구조성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 제어 하에서 활성이다. 용어 "작용적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 배열) 및 제2 핵산 서열 간의 기능적 연결기를 가리키고, 예컨대 여기에서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 주도한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포 내의 한 특별한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소들을 갖는, 재조합으로 또는 합성적으로 생성되는 핵산 구축물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 부분일 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 프로모터에 대한 작용성 연결기에서 전사되는 핵산을 포함한다.
표현 "...에 선택적으로(또는 특이적으로) 혼성화하다"는, 서열이 착혼합물(예컨대, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 내에 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건 하에서 한 특별한 뉴클레오티드 서열에 대해 선택적으로 분자에 결합하거나 이중화하거나 혼성화함을 가리킨다.
표현 "엄격한 혼성화 조건"은, 프로브가 통상적으로 핵산의 착혼합물에서, 다른 서열이 아닌 그것의 표적 하위서열에 혼성화하는 조건을 가리킨다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 서열이 길수록, 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높다. 핵산의 혼성화에 대한 광대한 지침이, [Tijssen (1993) Hybridization with Nucleic Probes(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)(제24권) Elsevier의 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"]에 나와 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃가 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브의 50%가 평형 하에 표적 서열에 혼성화하는 (한정된 이온 강도, pH 및 핵 농도 하에서의) 온도이다(Tm에서 표적 서열이 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%가 평형 하에 놓이게 된다). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예컨대, 약 10-50 뉴클레오티드)에서 약 30℃ 이상이고, 및 긴 프로브(예컨대, 약 50 초과의 뉴클레오티드)에서 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 있어, 양성 신호는 통상적으로 2배 이상의 백그라운드, 바람직하게는 10배 이상의 백그라운드 혼성화이다. 예시적 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서의 인큐베이션, 또는 5×SSC, 1% SDS, 0.2×SSC에서의 세척과 함께 65℃에서의 인큐베이션, 및 65℃의 0.1% SDS. PCR에 있어, 낮은 엄격성 증폭을 위해 약 36℃의 온도가 전형적이나, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32-48℃에서 변화할 수 있다. 고 엄격성 PCR 증폭을 위해, 약 62℃의 온도가 전형적이나, 고 엄격성 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라, 약 50-65℃의 범위 내일 수 있다. 고 및 저 엄격성 증폭 모두를 위한 전형적인 사이클 조건은 30-120초 동안의 90-95℃의 변성 상, 30-120 초 지속의 어닐링 상, 및 1-2분 동안의 약 72℃의 확장 상을 포함한다. 저 및 고 엄격성 증폭 반응을 위한 프로토콜 및 지침이, 예컨대 [Innis 등 (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, 미국 뉴욕]에 제공되어 있다.
엄격한 조건 하에서 서로에 대해 혼성화하지 않는 핵산은, 그것들이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 일치하는 경우, 여전히 실질적으로 일치한다. 이는, 예컨대 유전적 코드에 의해 허용되는 최대의 코돈 퇴화를 이용하여 핵산의 복사체가 생성될 때 일어난다. 그러한 경우에, 핵산은 통상적으로 보통 정도로 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다. "보통 정도로 엄격한 혼성화 조건"의 예는 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 37℃의 1% SDS의 완충액에서의 혼성화, 및 45℃의 1×SSC에서의 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 통상적으로 2배 이상의 백그라운드이다. 유사한 엄격성의 조건을 제공하기 위해 대안적 혼성화 및 세척 조건이 이용될 수 있다. 혼성화 파라미터를 결정하기 위한 부가적 지침이 수많은 참고문헌들, 예컨대 [Ausubel 등 (1991년 판, 및 부록) Current Protocols in Molecular Biology Wiley]에 제공되어 있다.
표현 "세포 형태의 변화" 또는 "세포 특성의 변화"는 생체외 또는 생체내 세포 형태 또는 증식 특성, 예컨대 세포 생존능, 세포 성장, 케모킨 인자의 분비, 세포 형태의 변화, 염증-특이적 마커의 득실, 적당한 동물 숙주로의 주입 시, 염증의 유도 또는 억제 능력, 및/또는 적당한 숙주에서의 질환 상태의 유도, 예컨대 자가면역 장애 및 암 상태에서의 임의의 변화를 가리킨다. 예컨대 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique(제2판) Wiley-Liss의 pp. 231-241]를 참고한다.
"질병 세포"는 신규 유전자 물질의 취입을 반드시 필요로 하지 않는 자발적 또는 유도된 표현형의 변화를 가리킨다. 예를 들어, 골수종 형성은 형질변환 바이러스로의 감염, 및 신규 게놈 DNA의 혼입, 또는 외인성 DNA의 취입으로부터 일어나나, 그것은 자발적으로 또는 제제에 대한 노출 후에 일어날 수 있고, 이로써 기존 유전자의 발현 또는 변경을 유도한다. 종양 성장은 표현형 및 단백질 발현 변화, 예컨대 형태학적 변화, 이상 세포 성장, 및/또는 비형태학적 변화와 관련된다. [Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (제4판) Wiley-Liss]을 참고한다. 유사하게, 자가면역 질환 공정에 의해 침범된 세포는 또한 표현형 및 단백질 발현 변화와 관련된다.
"유효" 량의 분자, 또는 항체, 또는 약물 또는 약리학적 활성제 또는 약제학적 제형물은 원하는 효과를 제공하기 위한 충분량의 분자, 항체, 약물, 제제 또는 제형물을 의미한다.
"대상" 또는 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 가리킨다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 mu 불변 영역 유전자, 및 수많은 면역글로불린 가변 V 영역 유전자(이하 기재되는 바, H-중쇄 및 L-경쇄에 대해 V 유전자가 있음)을 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25 Kd 또는 214 아미노산)는 NH2-말단(약 110 아미노산) 가변 영역 유전자, V-카파 또는 V-람다에 의해, 또한 각기 COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 코딩된다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50 Kd 또는 446 아미노산)는 유사하게 하나의 가변 영역 유전자(약 116 아미노산) 및 다른 상기 불변 영역 유전자들 중 하나, 예컨대 감마(약 330 아미노산 코딩)에 의해 코딩된다.
한 형태의 면역글로불린은 항체의 기본 구조 단위를 구성한다. 이 형태는 4량체이고, 면역글로불린 사슬의 2개의 일치하는 쌍들로 구성되며, 그 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가진다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항원에 대해 결합하도록 작용할 수 있고, 불변 영역은 항체 작동자 기능에 작용할 수 있다. 또한 4량체성 항체에 대해, 면역글로불린은 각종 다른 형태들, 가령 예를 들어, Fv, Fab 및 (Fab')2, 및 이관능성 혼성체 항체(예컨대, Lanzavecchia 등, Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))를 포함하는 다양한 형태로, 또한 단쇄로(예컨대, 본원에 참고로 인용되는, [Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)] 및 [Bird 등, Science, 242, 423-426 (1988)] 존재할 수 있다. (일반적으로, 본원에 참고로 인용되는 [Hood 등, "Immunology", Benjamin, N.Y., 제2판. (1984)] 및 [Hunkapiller 및 Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)]를 참고한다).
항체는 또한 예컨대, 각종 펩티다제에 의해 소화되어 생성된 수많은 잘 특징화된 단편으로 존재한다. 이에 따라, 예컨대 펩신은 힌지 영역 내의 디술피드 연결기 아래의 항체를 소화하여, 그 자체가 디술피드 결합에 의해 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생산한다. F(ab)'2는 마일드한 조건 하에서 환원되어, 힌지 영역 내의 디술피드 연결기를 파괴할 수 있고, 이로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킨다. Fab'단량체는 본질적으로 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab이다([Paul (1999년 판) Fundamental Immunology (제4판) Raven]을 참고한다). 각종 항체 단편들이 비변형 항체의 소화의 측면에서 정의되나, 당업자는 그러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법에 의해, 데누보 합성될 수 있음을 인식할 것이다. 이에 따라, 본원에 사용되는 용어 항체는 또한, 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 데누보 합성된 항체(예컨대, 단쇄 Fv), 또는 파지 표시 라이브러리를 이용하여 동정된 항체를 포함한다(예컨대, [McCafferty 등 (1990) Nature 348:552-554]을 참고한다).
"키메라 항체"는 (a) 불변 영역, 또는 그것의 일부분이 변경, 대체 또는 교환되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 부류, 및/또는 종, 또는 키메라 항체에 신규 성질을 부여하는 전체적으로 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물, 작동자 기능, 화학유인물질, 면역 조절자 등의 불변 영역에 연결되거나; (b) 가변 영역, 또는 그것의 일부분이 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경되거나, 그것으로 대체 또는 교환되는 항체 분자이다.
용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화 면역글로불린"은, 인간 틀구조, 비-인간 항체로부터의 하나 이상, 바람직하게는 모든 상보성 결정 영역들(CDR)을 갖는 면역글로불린을 가리키며, 여기에서 존재하는 임의의 불변 영역은 인간 면역글로불린 불변 영역에 대해 실질적으로 일치하며, 이는 즉 약 85-90% 이상, 바람직하게 95% 이상 일치한다. 이와 같이, 가능히 CDR를 제외한, 인간화 면역글로불린의 모든 부분들은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응 부분에 실질적으로 일치한다. 예컨대 [Queen 등, U.S. 특허 No. 5,5301,101; No. 5,585,089; No. 5,693,762; 및 No. 6,180,370]를 참고한다(이 특허들 및 기타 U.S. 특허/특허 출원은 실체적으로 전체적으로 본원에 참고로 인용된다).
항체, 예컨대 재조합, 모노클론 또는 폴리클론 항체의 제조를 위해, 많은 기술들이 공지되어 있다. 예컨대 [Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497; Kozbor 등(1983) Immunology Today 4:72; Cole 등 (1985), Reisfeld 및 Sell (1985) Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy Liss의 pp. 77-96; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Lippincott; Harlow 및 Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; 및 Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (제2판) Academic Press]를 참고한다. 단쇄 항체의 생산 기술(U.S. 특허 4,946,778)는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하기 위해 적용될 수 있다. 또한, 인간화된 항체를 발현시키기 위해, 유전자이식 마우스, 또는 기타 생물, 예컨대 다른 포유동물들을 사용할 수 있다. 대안적으로, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이절성 Fab 단편을 동정하기 위해, 상 표시 기술을 사용할 수 있다. 예컨대 [McCafferty 등 (1990) Nature 348:552-554; Marks 등 (1992) Biotechnology 10:779-783]을 참고한다.
용어 "에피토프"는 면역 반응을 도출하고 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 단백질의 임의의 부분(결정자)를 가리킨다. 에피토프 결정자는 GAG 측쇄 또는 아미노산과 같은 분자의 활성 표면 그루핑으로 구성되고, 주로 특이적 3차원 구조적 특성, 및 특이적 전하 특성을 가진다. 2개의 항체가, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 단백질 내의 아미노산 변이가 또한 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 및/또는 항체가 단백질에 대한 결합을 위해 경쟁하는, 즉 하나의 항체의 단백질에 대한 결합이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 단백질의 에피토프의 실질적으로 동일한 에피토프(또는 단백질의 중복 에피토프)에 결합하는 것으로 일컬어진다. 2개의 항체가 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하는 것은, 당업계에 공지된 방법, 예컨대 경쟁 검정에 의해 달성된다. 대조군 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항-CS1 항체들 중 하나) 및 임의의 시험 항체 간의 항체 경쟁 연구를 수행할 때, 후속 동정이 가능하도록, 먼저 대조군 항체를 검출가능한 표지, 예컨대 비오틴, 효소적, 방사성 표지 또는 형광 표지로 표지할 수 있다. 대조군 (표지된) 항체로서 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 시험 (비표지) 항체는 대조군 항체 결합을 차단해야 하고, 이에 따라 대조군 항체 결합을 감소시킬 수 있어야 한다.
한 예시적 구현예에서, 항체가 Luc 모노클론 항체(Luc 모노클론 항체는 본 발명의 생성된 항-CS1 모노클론 항체를 가리킴)의 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한는 경우, 항체는 Luc 모노클론 항체가 결합하는 CS1 에피토프와 중복되는 CS1의 에피토프에 결합해야 한다. 중복 영역은 하나의 아미노산 잔기 내지 수백개의 아미노산 잔기의 범위 내일 수 있다. 이에 따라, 이 항체는 CS1에 대한 Luc 모노클론 항체의 결합과 경쟁하고/하거나 차단해야 하고, 이로써 CS1에 대한 Luc 모노클론 항체의 결합을, 바람직하게 경쟁 검정에서 적어도 약 50%로 감소시켜야 한다.
용어 "…로부터 유도된"은 "…로부터 수득된", 또는 "…에 의해 생성된" 또는 "… 로부터 감소된"을 의미한다.
CS1 항원 및 항체
서열번호 2는 전장 야생형 인간 CS1의 아미노산 서열을 가리킨다. "기능적으로 활성인" CS1 단편 또는 유도체는 전장의 야생형 CS1 단백질과 관련된 하나 이상의 기능적 활성, 예컨대 항원성 또는 면역원성 활성, 자연적 세포 기질에 대한 결합능 등을 나타낸다. CS1 단백질, 유도체 및 단편의 기능적 활성은 당업자에게 공지된 각종 방법들에 의해 검정될 수 있다(Current Protocols in Protein Science, Coligan 등 편저, John Wiley & Sons, Inc., Somerset, New Jersey (1998)). 본원의 목적을 위해, 기능적으로 활성인 단편은 또한 결합 도메인과 같은 CS1 폴리펩티드의 하나 이상의 구조적 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단백질 도메인은 PFAM 프로그램을 이용하여 동정될 수 있다[Bateman A. 등, Nucleic Acids Res. 27:260-2 (1999)].
CS1 폴리펩티드 유도체는 통상적으로 서열번호 2 또는 그것의 단편과의 일정 정도의 서열 일치도 또는 서열 유사성을 공유한다. CS1 유도체는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 생성될 수 있다. 그것이 생산되도록 하는 조작은 유전자 또는 단백질 수준에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 클로닝된 CS1 유전자 서열(예컨대, 서열번호 1)은 제한 엔도뉴클레아제(들)로 적당한 부위에서 절단된 후(Wells 등, Philos. Trans. R. Sot. London SerA 317:415 (1986)), 추가적으로 효소적 변형되고, 원할 경우 이어서 단리되고 생체외 라이게이션되어, 원하는 유도체를 생산하도록 발현될 수 있다. 대안적으로, CS1 유전자는 변이된 생체외 또는 생체내 변이되어, 번역, 개시, 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나, 코딩 영역의 변화를 가져오고/오거나 신규 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 기존 부위를 파괴하여, 추가의 생체외 변형을 용이하게 할 수 있다. 화학적 변이유발, 생체외 부위-지정 변이유발(Carter 등, Nucl. Acids Res. 13:4331 (1986)), 또는 화이저 인코포레이티드(Pfizer, Inc.)로부터 입수가능한 TAB 링커의 사용과 같은 각종 변이유발 기술들이 당업계에 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 CS1의 하나 이상, 또는 바람직하게는 모든 생물학적 활성을 중성화한다. CS1의 생물학적 활성은: 1) 그것의 세포 기질, 예컨대 그것의 리간드의 결합 활성(예를 들어, 이 중성화 항체는 CS1의 그것의 리간드의 하나 이상, 바람직하게는 모두에 대한 결합과 경쟁하거나 그것을 완전히 차단할 수 있어야 함); 2) 신호 전달 활성; 및 3) CS1에 의해 유도된 세포 반응을 포함한다.
본 발명은 하이브리도마 세포주를 제공한다: Luc2, Luc3, Luc15, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, 또는 Luc90. 하이브리도마 세포주 Luc90은 미국미생물기탁기관(American Type Culture Collection)(ATCC)(P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)에 수탁번호 PTA 5091로 기탁되었다. 이 하이브리도마 세포주의 기탁은 2003년 3월 26일에 ATCC에 의해 접수되었다. 하이브리도마 세포주 Luc63은 또한 상기 주소지의 ATCC에 기탁되었다. Luc63 항체의 기탁은 2004년 5월 6일에 ATCC에 의해 접수되었다.
본 발명은 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클론 항체를 제공한다: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, 또는 Luc90(ATCC 수탁번호 PTA5091). 이 모노클론 항체는 이후, 각기 항체 Luc2, Luc3, Luc15, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, 및 Luc90으로 명명된다.
본 발명은 항체, 바람직하게는 본원에 기재된 Luc 모노클론 항체들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 모노클론 항체를 제공한다.
본 발명은 항체, 바람직하게는 본원에 기재된 Luc 모노클론 항체들 중 하나 이상과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하지 않는 모노클론 항체를 제공한다.
본 발명의 항체의 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 본 발명의 항체의 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 동정하기 위해, 항체 경쟁의 평가를 위한 각종 면역학적 선별 검정이 사용될 수 있다.
대조군 항체 및 임의의 시험 항체(종 또는 아형과 무관)간의 항체 경쟁 연구를 수행함에 있어, 대조군을 검출가능한 표지, 예컨대 비오틴 또는 효소적(또는 심지어 방사성) 표지로 먼저 표지하여, 후속 동정이 가능하도록 할 수 있다. 이 경우에, 비표지 항체를 CS1 발현 세포 단백질과 예비혼합하거나 인큐베이션할 것이다. 이어서, 표지된 항체를 예비인큐베이션된 세포에 첨가한다. 결합된 표지의 강도를 측정한다. 표지된 항체가 중복 에피토프에 결합함으로써 비표지 항체와 경쟁할 경우, 강도는 음성 대조군 비표지 항체(CS1를 결합시키지 않는 공지된 항체)에 의한 결합에 대해 감소될 것이다.
검정은 항체 경쟁에 기초하는 면역학적 검정 부류 중 임의의 한 검정일 수 있고, 대조군 항체는 그것의 표지를 검출함으로써, 예컨대 비오티닐화 항체의 경우에 스트렙타비딘을 이용하거나 효소적 표지(예컨대, 퍼옥시다제 효소와 함께 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질)와 함께 유색 기질을 이용하거나, 혹은 방사성 표지 또는 형광 표지를 단순히 검출함으로써 검출될 것이다. 대조군 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 결합에 대해 효과적으로 경쟁할 수 있고, 이에 따라 결합된 표지의 감소에 의해 증명된 바, 대조군 항체 결합을 상당히 (예를 들어, 50% 이상) 감소시킬 것이다.
완전히 비관련된 항체의 부재 하에서의 (표지된) 대조군 항체의 반응성은 대조 높은 값일 것이다. 경쟁이 일어나고 표지된 항체의 결합을 감소시킬 때, CS1를 발현하는 세포와 함께 비표지 시험 항체를 인큐베이션한 후, 완전히 동일한 유형의 표지된 대조군 항체와 함께 세포/항체 혼합물을 인큐베이션함으로써 대조 낮은 값이 수득될 것이다. 시험 검정에서, 시험 항체의 존재 하에서의 표지된 항체 반응성의 상당한 감소는 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는 시험 항체를 가리킨다.
기원의 모든 종들의 CS1에 대한 항체가 본 발명에 포함된다. 비-제한적인 예시적 자연 항체는, 인간 항체를 생산하도록 유전공학처리된 유전자이식 설치류를 비롯한, 인간, 닭, 염소 및 설치류(예컨대, 래트, 마우스, 햄스터 및 래빗)로부터 유래된 항체를 포함한다(예컨대, 전체적으로 참고로 본원에 인용되는 [Lonberg 등, W093/12227; U.S. 특허 No. 5,545,806; 및 Kucherlapati 등, W091/10741; U.S. 특허 No. 6,150,584]을 참고한다). 자연 항체는 항원, 예컨대 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 폴리펩티드로 면역화된 후에 숙주 동물에 의해 생성된 항체이다. 한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 CS1에 결합하고/하거나 CS1를 중성화하는 단리된 자연 항체이다.
유전적으로 변형된 항-CS1 항체는 상기 자연 항체들과 기능적으로 동등해야 한다. 향상된 안정성 및/또는 치료적 효능을 제공하는 변형된 항체가 바람직하다. 변형된 항체의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 및 항원 결합 유용성을 상당히 저해하여 변경시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가를 갖는 항체들을 포함한다. 치환은 치료적 유용성이 유지되는 한, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키거나 변형시키는 것에서부터 영역의 완전한 재설계에 이르는 범위 내일 수 있다. 본 발명의 항체는 후번역으로 변형되거나(예컨대, 아세틸화, 및/또는 인산화), 합성으로 변형될 수 있다(예컨대, 표지기의 부착). 바람직한 유전적으로 변형된 항체는 키메라 항체 및 인간화된 항체이다.
키메라 항체는, 바람직하게 별도의 종에서 유래된 2개의 상이한 항체들로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 바람직하게, 키메라 항체의 가변 영역은 쥐과 동물로부터 유래되고, 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 쥐과 동물의 가변 영역은 본원에 기재된 모노클론 항체들 중 임의의 하나로부터 유래된다. 키메라 항체를 생산하기 위해, 2개의 상이한 종으로부터 유래된 영역(예컨대, 인간의 불변 영역 및 쥐과 동물의 가변 또는 결합 영역)이 통상적인 기술에 의해 화학적으로 함께 결합되거나, 유전공학 기술을 이용하여 단일 인접 단백질로서 제조될 수 있다. 키메라 항체의 경쇄 및 중쇄 부분 모두의 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 인접 단백질로서 발현될 수 있다. 키메라 항체의 제조 방법이 각각 전체적으로 본원에 인용된, [U.S. 특허 No. 5,677,427; U.S. 특허 No. 6,120,767; 및 U.S. 특허 No. 6,329,508]에 개시된다.
본 발명에 사용된 유전적으로 변형된 항체는 CS1에 결합하고 CS1을 중성화하는 인간화된 항체를 포함한다. 한 구현예에서, 마우스의 도너 면역글로불린의 CDR, 및 중쇄 및 경쇄 틀구조를 포함하는 상기 인간화된 항체 및 인간 어셉터 면역글로불린의 불변 영역. 한 예에서, 인간화된 항체는 본원에 기재된 항체들 중 임의의 하나의 인간화 버전이다. 인간화된 항체의 제조 방법이 전체적으로 본원에 참고로 인용되는, [U.S. 특허 No. 5,530,101; No. 5,585,089; No. 5,693,761; No. 5,693,762; 및 No. 6,180,370]에 개시되어 있다.
항-CS1 완전 인간 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 상기 완전 인간 항체는 본원에 기재된 CS1의 활성을 중성화하는 단리된 인간 항체이다.
CS1에 대한 완전 인간 항체는 각종 기술들에 의해 생성된다. 한 예는 트리오마 방법이다. 기본적 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 한 예시적 세포 융합 파트너, SPAZ-4가 [Oestberg 등, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. 특허 No. 4,634,664; 및 Engleman 등, U.S. 특허 No. 4,634,666(이는 각각 전체적으로 본원에 인용됨)]에 의해 기재되었다.
CS1에 대한 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 위치의 하나 이상의 세그먼트를 코딩하는 유전자이식을 갖는 비-인간 유전자이식 동물로부터 생성될 수 있다. 이 성질을 갖는 동물의 생산 및 성질이 가령 예컨대, 전체적으로 참고로 본원에 인용되는 [Lonberg 등, W093/12227; U.S. 특허 No. 5,545,806; 및 Kucherlapati 등, W091/10741; U.S. 특허 No. 6,150,584]에 상세히 기재되어 있다.
각종 재조합 항체 라이브러리 기술이 또한 완전 인간 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 [Huse 등, Science 246:1275-1281 (1989)]에 의해 기술된 일반적 프로토콜에 따라 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 선별하는 것이다. CS1 또는 그것의 단편을 결합하는 항체가 선택된다. 이어서, 그러한 항체(또는 결합 단편)를 코딩하는 서열을 클로닝하고 증폭한다. Huse에 의해 기재된 프로토콜은 파지-표시 기술과 조합 시에 더욱 효율적으로 된다. 예컨대 [Dower 등, WO 91/17271 및 McCafferty 등, WO 92/01047; U.S. 특허 No. 5,969,108(이는 각각 전체적으로 본원에 인용됨)]를 참고한다. 이 방법에서, 외부 표면 상에 상이한 항체를 표시하는 멤버를 갖는 파지의 라이브러리가 생성된다. 항체는 주로 Fv 또는 Fab 단편으로 표시된다. 원하는 특이성을 갖는 파지 표시 항체는 CS1 또는 그것의 단편에 대한 큰 친화성에 의해 선택된다.
각기 전체적으로 본원에 참고로 인용되는 [Coia G 등, J. Immunol. Methods 1:254 (1-2):191-7 (2001); Hanes J. 등, Nat. Biotechnol. 18(12):1287-92 (2000); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(24):14130-5 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (10):4937-42 (1997)]에 기재되어 있는 바와 같이, 진핵 리보솜은 또한 항체의 라이브러리를 표시하고, 표적 항원, 예컨대 CS1에 대해 선별함으로써 결합 인간 항체를 단리하는 수단으로 사용될 수 있다.
효모 시스템은 또한 포유동물의 세포-표면 또는 분비된 단백질, 예컨대 항체를 선별하는데 적당하다. 항체 라이브러리는 표적 항원에 대한 인간 항체를 수득하기 위한 목적으로 효모 세포의 표면 상에 표시될 수 있다. 이 방법은 각기 전체적으로 본원에 참고로 인용되는 [Yeung 등, Biotechnol. Prog. 18 (2):212-20 (2002); Boeder, E. T. 등, Nat. Biotechnol. 15 (6):553-7 (1997)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체 라이브러리는 세포내 발현되거나 효모 2-혼성체 시스템을 통해 선별될 수 있다(전체적으로 본원에 참고로 인용되는 WO0200729A2).
CS1에 대한 결합 특이성을 보유하는 항-CS1 항체의 단편도 또한 본 발명에 포함된다. 이 항원-결합 단편의 예는 본원에 기재된 임의의 항-CS1 항체들의 일부 또는 전체 중쇄 또는 경쇄, 가변 영역 또는 CDR 영역을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 항체 단편은 (카르복실 말단에서 절단된) 절단 사슬이다. 바람직하게, 이 절단 사슬은 하나 이상의 면역글로불린 활성(예컨대, 상보체 고정화 활성)을 가진다. 절단 사슬의 예는 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된) Fab 단편; (VH 및 CH1 도메인으로 구성된) Fd 단편; (항체의 단쇄의 VL 및 VH 도메인으로 구성된) Fv 단편; (VH 도메인으로 구성된) dab 단편; 단리된 CDR 영역; (Fab')2 단편, (힌지 영역에서 디술피드 연결기에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는) 이가 단편을 포함하나, 이제 제한되지 않는다. 절단 사슬은 통상적인 생화학 기술, 예컨대 당업계에 각기 공지된 효소 절단, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 이 폴리펩티드 단편은 당업계에 공지된 방법에 의해 비변형 항체의 단백질분해 절단에 의해, 또는 예컨대 Fab 단편을 생성하기 위해 CH1 뒤에 또는 (Fab')2 단편을 생성하기 위해 힌지 영역 뒤에, 부위-지정 변이유발을 이용하여 벡터 내의 원하는 위치에 중지 코돈을 삽입함에 의해 생성될 수 있다. 단쇄 항체는 VL 및 VH-코딩 영역을, VL 및 VH 단백질 단편을 연결하는 펩티드 링커를 코딩하는 DNA와 결합함으로써 생성될 수 있다.
면역글로불린-관련 유전자가 각기 하나 이상의 분명한 생물학적 활성을 갖는 분리된 기능적 영역을 함유하기 때문에, 항체 단편의 유전자가 다른 유전자로부터의 기능적 영역(예컨대, 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 U.S. 특허 No. 5,004,692에 기재된 효소)에 융합되어, 신규 성질을 갖는 융합 단백질(예컨대, 면역독소) 또는 접합체를 생성할 수 있다.
본 발명은 면역독소에서의 항-CS1 항체의 용도를 포함한다. 항체를 포함하는 면역독소인 접합체가 당업계에 널리 기재되었다. 독소는 통상적인 커플링 기술에 의한 항체에 커플링되거나, 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소가 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 본 발명의 접합체는 그러한 면역소를 수득하기 위한 한 상응하는 방식으로 사용될 수 있다. 그러한 면역독소의 예는 [Byers, B. S. 등, Seminars Cell Biol 2:59-70 (1991) 및 Fanger, M. W. 등, Immunol Today 12:51-54 (1991)]에 기재된 것들이다.
재조합 DNA 기술은, 재조합 항-CS1 항체, 및 원핵 및 진핵 발현 시스템을 모두 포함하는 임의의 발현 시스템, 예컨대 세균, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물의 세포(예를 들어, NSO 세포) 내의 키메라 또는 인간화 항-CS1 항체 또는 임의의 다른 항-CS1 유전적으로-변경된 항체 및 그것의 단편 또는 접합체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 전체 항체, 그것의 이량체, 개별적 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태는, 일단 생성되면, 암모늄 술페이트 석출, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, [Scopes, R., Protein Purification(Springer-Verlag, 미국 뉴욕, 1982)]를 참고한다). 약제학적 용도를 위해 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 동질성이 가장 바람직하다. 일단 부분적으로, 또는 원하는 균질성으로 정제되면, 폴리펩티드는 치료적으로(신체 외적으로 포함) 또는 검정 절차, 면역형광 염색 등으로 개발하고 수행하는데 사용될 수 있다(일반적으로, [Immunological Methods, 제I 및 II권(Lefkovits 및 Permis, 편저, Academic Press, 미국 뉴욕, 1979 및 1981]을 참고한다). 단리되거나 정제된 항-CS1 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 CS1의 생물학적 활성을 중화하는 그것의 능력에 대해 추가 선별될 수 있다.
CS1 핵산의 사용
상술한 바와 같이, CS1 서열은 표 2의 CS1 서열에 대한 실질적 핵산 및/또는 아미노산 서열 상동성 또는 연결에 의해 초기에 동정된다. 그러한 상동성은 전반적 핵산 또는 아미노산 서열에 기초할 수 있고, 상동성 프로그램 또는 혼성화 조건을 이용하여 일반적으로 결정된다. 통상적으로, mRNA 상의 연결된 서열은 동일한 분자 상에 발견된다.
서열의 일치도(%)는 BLAST와 같은 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 한 바람직한 방법은 중복 스팬 및 중복 분획을 각기 1 및 0.125로 설정하여, 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 이용한다. 배열은 배열되는 서열 내에 간격을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 기술된 핵산의 뉴클레오티드보다 더 많거나 더 적은 뉴클레오티드를 함유하는 서열의 경우, 상동율(%)을 뉴클레오시드의 총 수에 대한, 상동성의 뉴클레오시드의 수를 기초로 하여 결정할 수 있다. 이에 따라, 예컨대 동정된 서열에서보다 더 짧은 서열의 상동성은 더 짧은 서열에서의 뉴클레오시드의 수를 이용하여 결정될 것이다.
한 구현예에서, 핵산 상동성은 혼성화 연구를 통해 결정된다. 이에 따라, 예컨대 높은 엄격성 하에 기술된 핵산, 또는 그것의 상보체에 대해 혼성화하거나 자연 발생적 mRNA 상에서 발견되는 핵산은 상동성의 서열로 간주된다. 다른 한 구현예에서, 보다 덜 엄격한 혼성화 조건이 사용되고; 예컨대, 보통 정도 또는 낮은 엄격성 조건이 사용될 수 있으며; [Ausubel, 이하 상술한 바와 동일함 및 Tijssen, 이하 상술한 바와 동일함]을 참고한다.
본 발명의 CS1 핵산 서열, 예컨대 표 2의 서열은 보다 큰 유전자의 단편일 수 있고, 예컨대 그것은 핵산 세그먼트이다. 본 문맥에서 "유전자"는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 및 코딩 및 비-코딩 영역의 혼합물을 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 서열을 이용하여, 임의의 한 방향으로의 CS1 유전자의 확장된 서열이, 보다 긴 서열 또는 전장 서열을 클론닝하기 위한 공지 기술을 이용하여 수득될 수 있으며; [Ausubel 등, 이하 상술한 바와 동일함]을 참고한다. 많은 것들이 정보과학에 의해 행해질 수 있고, 예컨대 UniGene과 같은 시스템과 같이 많은 서열들이 단일 유전자에 상응하는 다수 서열을 포함하도록 클러스터를 형성할 수 있다.
본 발명의 CS1 핵산이 수가지 방식으로 사용된다. 한 구현예에서, CS1에 대한 핵산 프로브가 제조되어 사용될 바이오칩에 부착되며, 이에 하기 기술되는 바와 같은 선별 및 진단적 방법에, 또는 투여를 위해, 예컨대 유전자 치료, 백신, RNAi, 및/또는 안티센스 용도를 위해 사용된다. 대안적으로, CS1 단백질의 코딩 영역을 포함하는 CS1 핵산이 선별 목적을 위해 또는 환자에게 투여하기 위해 다시 환자에 대한 CS1 단백질의 발현을 위한 발현 벡터에 투입될 수 있다.
다른 한 구현예에서, CS1 핵산(도면에 기술된 핵산 서열 및/또는 그것의 상보체)에 대한 핵산 프로브를 제조한다. 바이오칩에 부착된 핵산 프로브는 CS1 핵산, 예컨대 표적 서열(예컨대, 샌드위치 검정에서의, 샘플의 표적 서열 또는 다른 프로브 서열)에 대해 실질적으로 상보적이도록 고안되어, 표적 서열 및 본 발명의 프로브의 혼성화가 일어나도록 한다. 하기 기술되는 바와 같이, 이 상보성은 완벽할 필요가 없으며; 표적 서열 및 본 발명의 단일 나선의 핵산 사이의 혼성화를 방해할 임의의 수의 염기쌍 미스매치가 있을 수 있다. 그러나, 변이의 수가 커서 가장 엄격하지 않은 혼성화 조건 하에서도 혼성화가 일어나지 않을 수 있을 경우, 서열은 상보적 표적 서열이 아니다. 이에 따라, 본원에서 "실질적으로 상보적"은 프로브가 정상 반응 조건, 특히 하기 기술되는 바와 같은 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화하는 표적 서열에 대해 충분히 상보적임을 의미한다.
핵산 프로브는 일반적으로 단일 나선이나, 부분적 단일 나선 및 부분적 이중 나선일 수 있다. 프로브의 나선성은 표적 서열의 구조, 조성 및 성질에 의해 나타내어진다. 일반적으로, 핵산 프로브의 길이는 약 8-100 염기의 범주 내이고, 약 10-80 염기가 바람직하며, 약 30-50 염기가 특히 바람직하다. 즉, 일반적으로 전체 유전자가 사용되지 않는다. 일부 구현예들에서, 수백개 이하의 염기에 달하는, 훨씬 더 긴 핵산이 사용될 수 있다.
다른 한 구현예에서, 서열 당 하나 초과의 프로브가 사용되고, 표적의 상이한 구획에 대한 프로브, 또는 중복 프로브가 사용된다. 즉, 한 특별한 표적에 대해 과잉성을 구축하기 위해, 2, 3, 4개 또는 그 이상, 바람직하게는 3개의 프로브가 사용된다. 프로브는 중복되거나(예컨대, 일부 공통 서열을 가지거나) 또는 분리될 수 있다. 일부 경우들에서, 보다 높은 감도를 위해 신호를 증복시키기 위해 PCR 프라이머가 사용될 수 있다.
핵산은 매우 다양한 방식으로 고체 지지체 상에 부착되거나 고정화될 수 있다. 본원의 "고정화된" 및 문맥상의 동등물은 핵산 프로브 및 고체 지지체 사이의 연합 또는 결합이, 기술된 바와 같은 결합, 세척, 분석 및 제거의 조건 하에서 안정하기 위해 충분하다는 것을 의미한다. 결합은 통상적으로 공유 또는 비-공유일 수 있다. 본원의 "비-공유 결합" 및 문맥상의 동등물은 정전기적, 친수성 및 소수성 상호작용 중 하나 이상을 의미한다. 비-공유 결합에는 분자, 예컨대 스트렙타비딘의 지지체에 대한 공유 결합, 및 비오티닐화 프로브의 스트렙타비딘에 대한 비-공유 결합이 포함된다. 본원의 "공유 결합" 및 문맥상의 동등물은 2개 부분, 고체 지지체 및 프로브가 시그마 결합, pi 결합 및 배위 결합을 비롯한 하나 이상의 결합에 의해 부착됨을 의미한다. 공유 결합이 프로브 및 고체 지지체 사이에 직접적으로 형성될 수 있거나, 가교제에 의하거나 고체 지지체 또는 프로브 또는 양 분자 모두 상에 특이적 반응기를 포함시킴으로써 형성될 수 있다. 고정화는 또한 공유 및 비-공유 상호작용의 조합을 포함할 수 있다.
일반적으로, 프로브는 매우 다양한 방식으로 바이오칩에 부착될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산이 먼저 합성된 후, 바이오칩에 부착될 수 있거나, 바이오칩 상에 직접적 합성될 수 있다.
바이오칩은 적당한 고체 기질을 포함한다. 본원의 "기재" 또는 "고체 지지체" 또는 기타 문맥상의 동등물은 핵산 프로브의 부착 또는 연합을 위해 변형될 수 있고 하나 이상의 검출 방법에 적응가능한 물질을 의미한다. 종종, 기질은 개별적 분획화 및 동정에 적당한 구별되는 개별적 부위를 함유할 수 있다. 가능한 기질의 수가 매우 크고, 이는 변형되거나 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌 및 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 수지, 실리카 또는, 규소 및 변형 규소를 포함하는 실리카-기재 물질, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 기질은 광학적 검출을 허용하고, 인식가능하게 형광을 발하지 않는다. WO 0055627을 참고한다.
일반적으로, 기재는 평면이나, 기재의 다른 형태도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로브를 유통(flow-through) 샘플 분석을 위해 내부 표면에 두어, 샘플 부피를 최소화할 수 있다. 유사하게, 기재는 예컨대, 특별한 플라스틱으로 된 폐쇄된 세포 발포체를 비롯한 가요성 발포체와 같이, 가요성일 수 있다.
한 구현예에서, 바이오칩 및 프로브의 표면은 2개가 후속하여 부착되도록, 화학적 관능기로 유도화될 수 있다. 이에 따라, 예컨대 바이오칩은 아미노기, 카르복실기, 옥소기 및 티올기를 포함하나 이에 제한되지 않는(이 중, 아미노기가 특히 바람직함) 화학적 관능기로 유도화된다. 이 관능기를 이용하여, 프로브 상의 관능기를 이용하여 프로브가 부착될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유하는 핵산이, 예컨대 링커를 이용하여, 아미노기를 포함하는 표면에 부착될수 있고; 예컨대, 동종- 또는 이종-이관능성 링커가 공지되어 있다([1994 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Company)의 카달로그, 가교제에 관한 기술면, p. 155-200] 참고). 또한, 일부 경우들에서, 부가적 링커, 예컨대 알킬기(치환 및 헤테로알킬기 포함)가 사용될 수 있다.
이 구현예에서, 올리고뉴클레오티드가 합성된 후, 고체 지지체의 표면에 부착될 수 있다. 5' 또는 3'말단이 고체 지지체에 부착될 수 있거나, 연결기를 통해 내부 뉴클레오시드에 부착될 수 있다. 다른 한 구현예에서, 고체 지지체에 대한 고정화는 매우 강하나 비-공유일 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘으로 공유 코팅된 표면에 결합하여 부착이 일어나도록 하는 비오티닐화 올리고뉴클레오티드가 제조될 수 있다.
대안적으로, 표면 상에 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 예를 들어, 광중합 화합물 및 기술을 이용하는 광활성화 기술이 사용된다. 다른 한 구현예에서, 핵산이 공지된 광리소그래픽 기술, 예컨대 WO 95/25116; WO 95/35505; U.S. 특허 No. 5,700,637 및 No. 5,445,934; 및 그 안에 인용된 참고문헌들(이들은 모두 본원에 명백히 인용됨)에 기재된 기술을 이용하여 인-시츄 합성될 수 있고; 이 부착 방법들은 아피메트릭스(Affymetrix) 진칩(GENECHIP)
Figure 112005063973850-pct00001
(DNA 마이크로어레이 칩) 기술의 기초를 형성한다.
종종, CS1-관련 서열의 발현 수준을 측정하기 위해 증폭-기재의 검정이 수행된다. 이 검정은 통상 역전사와 함께 수행된다. 그러한 검정에서, CS1-연합 핵산 서열은 증폭 반응(예컨대, 폴리머라제 사슬 반응, 즉 PCR)에서 주형으로 작용한다. 정량적 증폭에서, 증폭 산물의 양은 원래의 샘플 내의 주형의 양이 비례할 것이다. 적당한 대조군과의 비교는 CS1-연합 RNA의 양의 측정값을 제공한다. 정량적 증폭의 방법이 공지되어 있다. 정량적 PCR을 위한 상세한 프로토콜이 예컨대 [Innis 등 (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press]에 제공되어 있다.
일부 구현예들에서, 발현을 측정하기 위해, 타크만(TAQMAN)
Figure 112005063973850-pct00002
(형광성 올리고뉴클레오티드 프로브) 기재의 검정이 사용된다. 타크만
Figure 112005063973850-pct00003
기재의 검정은 5' 형광 염료 및 3' 켄칭제를 함유하는 형광성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 프로브는 PCR 산물에 혼성화하나, 3' 말단에서 차단제로 인해 그 자체가 확장될 수 없다. PCR 산물이 후속 사이클에서 증폭될 때, 폴리머라제, 예컨대 앰플리타크(AMPLITAQ)
Figure 112005063973850-pct00004
(DNA 폴리머라제)의 5' 뉴클레아제 활성은 타크만
Figure 112005063973850-pct00005
프로브의 절단을 초래한다. 이 절단은 5'형광 염료 및 3' 켄칭제를 분리하고, 이로써 증폭의 함수로서 형광이 증가한다(예컨대, 퍼어킨-엘머(Perkin-Elmer)에 의해 제공된 문헌을 참고함).
다른 적당한 증폭 방법은 리가제 사슬 반응(LCR)([Wu 및 Wallace (1989) Genomics 4:560-569, Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080, 및 Barringer 등 (1990) Gene 89:117-122]을 참고함), 전사 증폭(Kwoh 등(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), 자기-지속 서열 복제(Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 도트 PCR, 링커 어댑터 PCR 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
핵산으로부터의 CS1 단백질의 발현
한 구현예에서, 하기 기술되는 바와 같은 진단적 검정을 위한 시약을 개발하는데 후에 사용될 수 있는 CS1 단백질을 발현하기 위한 각종 발현 벡터를 제조하기 위해, 예컨대 CS1 단백질을 코딩하는, CS1 핵산이 사용된다. 단밸질을 발현시키기 위한 발현 벡터 및 재조합 DNA 기술이 공지되어 있다(예컨대, [Ausubel, 이하 상기 기술한 바와 동일함 및 Fernandez 및 Hoeffler(1999년 판) Gene Expression Systems Academic Press] 참고). 발현 벡터는 자기-복제 염색체외 벡터 또는, 숙주 게놈으로 통합된 벡터일 수 있다. 일반적으로, 이 발현 벡터는 CS1 단백질을 코딩하는 핵산에 작용적으로 연결된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 한 특별한 숙주 생물에서 작용적으로 연결된 코딩 서열의 발현을 위해 사용된 DNA 서열을 가리킨다. 원핵생물에 적당한 조절 서열은, 예컨대 프로모터, 임의적으로는 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 한 핵산 서열과 기능적 관례에 놓이게 될 때, "작용적으로 연결된다". 예를 들어, 프레서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분리에 참여하는 프레단백질로서 발현될 때, 폴리펩티드를 위한 DNA에 작용적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 줄 경우, 코딩 서열에 작용적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하기 위해 위치될 경우, 코딩 서열에 작용적으로 연결된다. 일반적으로, "작용적으로 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우, 인접하고 해독 상에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 통상적으로 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 수행에 따라 사용된다. 전사 및 번역 조절 핵산은 일반적으로 CS1 단백질을 발현하기 위해 사용된 숙주 세포에 적당하다. 각종 숙주 세포에 대한 수많은 유형들의 적당한 발현 벡터 및 적당한 조절 서열이 알려져 있다.
일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 중지 서열, 번역 개시 및 중지 서열, 및 인핸서 또는 액티베이터 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 중지 서열을 포함한다.
프로모터 서열은 구조성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 자연 발생적 프로모터 또는 혼성체 프로모터일 수 있다. 하나 초과의 프로모터의 요소들을 조합하는 혼성체 프로모터가 또한 공지되어 있고, 본 발명에 유용하다.
발현 벡터는 부가적 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 이에 따라 그것이 2개 생물 내에, 예컨대 발현을 위해 포유동물 세포 또는 곤충 세포 내에, 또한 클로닝 및 증폭을 위해 원핵 숙주 내에 유지될 수 있다. 또한, 발현 벡터를 통합하기 위해, 발현 벡터는 종종 숙주 세포 게놈에 상동적인 하나 이상의 서열, 바람직하게는 발현 구축물에 인접하는 2개의 상동성의 서열을 포함한다. 통합 벡터는, 벡터 내에 포함되기에 적당한 상동적 서열을 선택함으로써, 숙주 세포 내의 특이적 위치에 배향될 수 있다. 벡터를 통합하기 위한 구축물이 입수가능하다. 예컨대, [Femandez 및 Hoeffler, 이하 상기 기술한 바와 동일함; 및 Kitamura 등 (1995) Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 92:9146-9150]를 참고한다.
또한, 다른 한 구현예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 선택 유전자가 공지되어 있고, 사용된 숙주 세포에 따라 다양할 것이다.
본 발명의 CS1 단백질은, CS1 단백질의 발현을 유도하거나 유발하는 적당한 조건 하에 CS1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 주로 생성된다. CS1 단백질 발현에 적당한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 다양할 것이고, 일상적 실험 또는 최적화를 통해 용이하게 확인될 것이다. 예를 들어, 발현 벡터 내의 구조성 프로모터의 사용은 숙주 세포의 성장 및 증식의 최적화를 필요로 할 것이나, 유도성 프로모터의 사용은 유도를 위한 적당한 성장 조건을 필요로 할 것이다. 또한, 일부 구현예들에서, 수확 타이밍이 중요하다. 예를 들어, 곤충 세포 발현에 사용된 바큘로바이러스 시스템은 세포용해 바이러스이고, 이에 따라 생성물 수율을 위해 수확 시간 선택이 결정적일 수 있다.
적당한 숙주 세포는 포유동물의 세포를 비롯한, 효모, 세균, 고세균, 진균류, 및 곤충 및 동물 세포를 포함한다. 특별한 유익한 것은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 기타 효모, E. 콜라이, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), Sf9 세포, C129 세포, 293 세포, 붉은 빵 곰팡이, BHK, CHO, COS, HeLa 세포, HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포), THP1 세포(마크로파지 세포주), 및 각종 기타 인간 세포 및 세포주이다.
한 구현예에서, CS1 단백질은 포유동물의 세포에서 발현된다. 포유동물의 발현 시스템이 사용될 수 있고, 이는 레트로바이러스 및 아데노바이러스 시스템을 포함한다. 하나의 발현 벡터 시스템은 일반적으로 [PCT/US97/01019 및 PCT/US97/01048]에 기재된 것들과 같은 레트로바이러스 벡터 시스템이다. 포유동물의 프로모터로 특히 사용되는 것은, 포유동물의 바이러스 유전자로부터의 프로모터이며, 그 이유는 그 바이러스 유전자가 종종 매우 발현되고, 넓은 숙주 범위를 가지기 때문이다. 그 예는 SV40 조기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터, 단순 포진 바이러스 프로모터, 및 CMV 프로모터를 포함한다(예컨대, [Fernandez 및 Hoeffler, 이하 상기한 바와 동일함]을 참고한다). 통상적으로, 포유동물의 세포에 의해 인식된 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열은 번역 중지 코돈에 대해 3'에 위치한 조절 영역이고, 이에 따라 프로모터 요소와 함께 코딩 서열에 인접한다. 전사 종결자 및 폴리아데닐화 신호의 예는, SV40으로부터 유래된 것들을 포함한다.
포유동물의 숙주, 및 기타 숙주에 외인성 핵산을 도입하는 방법이 이용가능하고, 사용된 숙주 세포에 따라 변화할 것이다. 기술은 덱스트란-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 석출, 폴리브렌 매개 트랜스펙션, 원형질체 융합, 전기천공, 바이러스 감염, 리포솜 내의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵으로의 DNA의 직접적 미세주입을 포함한다.
다른 한 구현예에서, CS1 단백질은 세균 시스템에서 발현된다. 박테리오파지로부터의 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 또한, 합성 프로모터 및 혼성체 프로모터도 또한 유용하며; 예컨대, tac 프로모터는 trp 및 lac 프로모터 서열의 혼성체이다. 또한, 세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제에 결합하고 전사를 개시하는 능력을 갖는 비-세균 기원의 자연 발생적 프로모터를 포함할 수 있다. 기능화 프로모터 서열에 부가하여, 효율적인 리보솜 결합 부위가 바람직하다. 발현 벡터는 또한 세균에서 CS1 단백질의 분비를 제공하는 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 단백질은 성장 매질(그람-양성 세균)로, 또는 세포의 내막 및 외막 사이에 위치한 세포막 공간(그람-음성 세균)으로 분비된다. 세균 발현 벡터는 또한 형질전환된 세균 균주의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 적당한 선택 유전자는 세균을 암피실린, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 및 테트라사이클린과 같은 약물에 대한 내성을 가지도록 하는 유전자를 포함한다. 선택가능한 마커는 또한 바이오합성 유전자, 예컨대 히스티딘, 트립토판 및 루이신 바이오합성 경로에서의 바이오합성 유전자를 포함한다. 이 성분은 발현 벡터에 어셈블리된다. 세균을 위한 발현 벡터가 공지되어 있고, 이는 무엇보다 바실러스 섭틸리스, E. 콜라이, 스트렙토코쿠스 크레모리스(Streptococcus cremoris) 및 스트렙토코쿠스 리비단스(Streptococcus lividans)를 위한 벡터를 포함한다(예컨대, Fernandez 및 Hoeffler, 이하 상기한 바와 동일함). 세균 발현 벡터는 칼슘 클로라이드 처리, 전기천공 등과 같은 기술을 이용하여 세균 숙주 세포로 형질전환된다.
한 구현예에서, CS1 단백질은 예컨대 곤충 세포의 형질전환을 위한 발현 벡터, 특히 바큘로바이러스-기재의 발현 벡터를 이용하여, 곤충 세포에서 생성된다.
다른 한 구현예에서, CS1 단백질은 효모 세포에서 생성된다. 효모 발현 시스템이 공지되어 있고, 이는 사카로마이세스 세레비지아에, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 C. 말토사(C. maltosa), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis) 및 K. 락티스(K. lactis), 피치아 길레리몬디(Pichia guillerimondii) 및 P. 파스토리스(P. pastoris), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 야로우이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 위한 발현 벡터를 포함한다.
CS1 단백질은 또한 이용가능한 기술을 이용하여, 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 이에 따라, 원하는 에피토프가 작은 경우, 예컨대 모노클론 항체의 생성을 위해, CS1 단백질이 담체 단백질에 융합되어 면역원을 형성할 수 있다. 대안적으로, CS1 단백질은 발현을 증가시키기 위해, 또는 다른 이유로, 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 예를 들어, CS1 단백질이 CS1 펩티드인 경우, 펩티드를 코딩하는 핵산은 발현 목적을 위해 다른 핵산에 연결될 수 있다. 예컨대 FLAG, His6, myc, HA 등을 이용하여, 검출 에피토프 택과의 융합이 일어날 수 있다.
다른 한 구현예에서, CS1 단백질은 발현 후에 정제되거나 단리된다. CS1 단백질은 샘플 내에 존재하는 다른 성분이 어떤 것인지에 따라, 또한 정제된 산물의 요건, 예컨대 자연적 형태 또는 변성에 따라 각종 방식으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 암모늄 술페이트 석출, 전기영동, 분자, 이온 교환, 소수성, 친화성 및 역상 HPLC 크로마토그래피를 비롯한 면역학적 및 크로마토그래피 기술, 및 크로마토포커싱을 포함한다. 예를 들어, CS1 단백질은 표준 항-CS1 단백질 항체 칼럼을 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 농도와 함께 초여과 및 투석여과 기술이 유용하다. 예컨대 [Walsh (2002) Proteins: Biochemistry and Biotechnology Wiley; Hardin 등 (2001년 판) Cloning, Gene Expression and Protein Purification 옥스포드대학 출판부; Wilson 등 (2000년 판) Encyclopedia of Separation Science Academic Press; 및 Scopes (1993) Protein Purification Springer-Verlag]을 참고한다. 필요한 정제 정도는 CS1 단백질의 용도에 따라 변화할 것이다. 일부 경우들에서는, 정제가 필요하지 않을 것이다.
CS1 단백질 및 핵산은 일단 필요한 경우에 발현되고 정제되면, 수많은 용도들에서 유용하다. 그것은 면역선택 시약, 백신 시약, 선별제, 항체 생산을 위한 치료 물질, 전사 또는 번역 억제제 등으로서 사용될 수 있다.
CS1 단백질의 변종체
CS1 단백질의 한 구현예 내에는, 본원에 결정되는 바와 같은 자연 발생적 서열의 아미노산 변종체가 또한 포함된다. 바람직하게, 변종체는 야생형 서열에 대한 상동성이 바람직하게 약 75% 초과, 더욱 바람직하게는 약 80% 초과, 더욱 더 바람직하게는 약 85% 초과, 가장 바람직하게는 90% 초과이다. 일부 구현예들에서, 상동성은 약 93-95% 또는 98% 정도로 높을 것이다. 핵산의 경우, 본 문맥에서의 상동성은 서열 유사도 또는 일치도를 의미하고, 여기에서 일치도가 바람직하다. 이 상동성은 핵산 상동성에 대해 상기 기술된 바와 같은, 표준기술을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 CS1 단백질은 야생형 아미노산 서열보다 더 짧거나 더 길 수 있다. 이에 따라, 한 구현예에서, CS1 단백질의 정의 내에는 본원의 야생형 서열의 부분 또는 단편이 포함된다. 또한, 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 CS1 핵산은 부가적 코딩 영역, 및 이에 따라 부가적 단백질 서열을 수득하기 위해 사용될 수 있다.
한 구현예에서, CS1 단백질은 야생형 서열과 비교되는 유도체 또는 변종체 CS1 단백질이다. 즉, 하기 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 유도체 CS1 펩티드는 종종 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 것이고, 여기에서 아미노산 치환이 특히 바람직하다. 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 CS1 펩티드 내의 많은 잔기 위치들에서 일어날 수 있다.
본 발명의 CS1 단백질의 한 구현예 내에, 아미노산 서열 변종체가 또한 포함된다. 이 변종체는 통상적으로 하기 3 부류들 중 하나 이상에 속한다: 치환, 삽입 또는 결실 변종체. 이 변종체는 본래 변종체를 코딩하는 DNA를 제조하기 위해 카세트 또는 PCR 변이유발 또는 기타 기술을 이용하여 CS1 단백질을 코딩하는 DNA 내의 뉴클레오티드의 부위 특이적 변이유발, 및 그 후 상기 기재된 바와 같은 재조합 세포 내에서의 DNA의 발현에 의해 제조된다. 그러나, 약 100-150 이하의 잔기를 갖는 변종체 CS1 단백질 단편은 확립된 기술을 이용하여 생체외 합성에 의해 제조될 수 있다. 아미노산 서열 변종체는, CS1 단백질 아미노산 서열의 자연 발생적 대립유전자적 또는 종간 변화로부터 그것이 구분되도록 하는 특성인, 예비결정된 변화 성질을 그 특징으로 한다. 변종체는 통상적으로 자연 발생적 동종체와 유사한 정성적 생물학적 활성을 나타내나, 변형된 특성을 갖는 변종체가 선택될 수도 있다.
아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위 또는 영역이 종종 예비결정되나, 변이 자체는 예비결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 변이의 성능을 최적화하기 위해, 랜덤 변이유발은 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고, 발현된 CS1 변종체는 원하는 활성의 최적의 조합을 위해 선별될 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 예비결정된 부위에서 치환 변이를 일으키는 기술, 예컨대 M13 프라이머 변이유발 및 PCR 변이유발이 공지되어 있다. 변이체의 선별은 CS1 단백질 활성의 검정을 이용하여 종종 행해진다.
아미노산 치환은 통상적으로 단일 잔기의 치환이고; 삽입은 주로 약 1-20 아미노산에서 일어날 것이나, 상당히 보다 큰 삽입도 수용될 수 있다. 결실은 일반적으로 약 1-20 잔기의 범위내이나, 일부 경우들에서는 결실이 훨씬 더 클 수 있다.
최종 유도체에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 일반적으로 이 변화는, 분자의 변경을 최소화하기 위해 수개의 아미노산 상에 일어난다. 그러나, 일부 환경들에서 보다 큰 변화가 수용될 수 있다. CS1 단백질의 특성의 작은 변화가 요망되는 경우, 치환은 일반적으로 기술된 아미노산 치환 관계에 따라 행해진다.
변종체는 통상적으로 본질적으로 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타내고 자연 발생적 동종체와 동일한 면역 반응을 도출하나, 또한 필요한 경우, CS1 단백질의 특성을 변화시키는 변종체가 선택된다. 대안적으로, 변종체는 CS1 단백질의 생물학적 활성이 변경되도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 부위가 첨가되거나 변경되거나 제거될 수 있다.
기능 또는 면역학적 일치도의 실질적 변화는 경우에 따라 상기 것들에 비해 덜 보존적인 치환을 선택함으로써 일어날 수 있다. 예를 들어, 하기 것에 더욱 상당히 영향을 주는 치환이 일어난다: 변형의 구역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어 알파-나선 구조 또는 베타-시이트 구조; 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성; 또는 측쇄의 벌크. 폴리펩티드의 성질의 더 큰 변화를 생성시킬 것으로 일반적으로 예상되는 치환은, (a) 친수성 잔기, 예컨대 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예컨대 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로 치환되는 것; (b) 시스테인 또는 프롤린이 다른 한 잔기로 치환되는 것; (c) 전기양성적 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 전기음성적 잔기, 예컨대 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치환되는 것; (d) 벌크성 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예컨대 글리신으로 치환되는 것; 또는(e) 펩티딜 결합의 회전 자유도를 변화시키는, 프롤린 잔기가 혼입되거나 치환되는 것이다.
변종체는 통상적으로 유사한 정성적 생물학적 활성을 나타내고 자연 발생적 동종체와 동일한 면역 반응을 도출하나, 필요한 경우, CS1 단백질의 특성을 변화시키는 변종체가 선택된다. 대안적으로, 변종체는 CS1 단백질의 생물학적 활성이 변경되도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 부위가 첨가되거나 변경되거나 제거될 수 있다.
CS1 폴리펩티드의 공유 변형이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 공유 변형의 한 유형은, CS1 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 CS1 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 잔기 또는 선택된 측쇄와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 제제를 이용한 유도체화는, 이하 더욱 충분히 기재되는 바와 같이, 예를 들어 항-CS1 폴리펩티드 항체의 정제 방법 또는 선별 검정에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 CS1 폴리펩티드를 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용된 가교제는, 예컨대 1,1-비스(다아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신아미드 에스테르, 예컨대 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 이관능성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-((p-아지도페닐)디티오)프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각의 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세리닐, 트레오닐, 또는 티로실 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 아미노기의 메틸화(예컨대, pp.79-86, Creighton (1992) Proteins: Structure and Molecular Properties Freeman 참고), N-말단 아민의 아세틸화, 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범주 내에 포함되는 CS1 폴리펩티드의 공유 변형의 다른 한 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 본원의 목적을 위해, 나이브 서열 CS1 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄소화물 부분을 결실하는 것, 및/또는 천연 서열 CS1 폴리펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미하도록 의도된다. 글리코실화 패턴은 많은 방식들로 변경될 수 있다. CS1-관련 서열을 발현하는 상이한 세포 유형은 상이한 글리코실화 패턴을 초래할 수 있다.
CS1 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 첨가가 또한, 그것의 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 예컨대, (0-연결 글리코실화 부위를 위한) 천연 서열 CS1 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 그것으로의 치환에 의해 변경이 일어날 수 있다. CS1 아미노산 서열은, 특히 예비선택된 염기에서 CS1 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 변이화하여, 원하는 아미노산으로 변역하는 코돈이 발생되도록 함에 의한 DNA 수준에서의 변화를 통해 임의적으로 변경될 수 있다.
CS1 폴리펩티드 상의 탄소화물 부분의 수를증가시키는 다른 한 수단은 폴리펩티드에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 예컨대 [WO87/05330; Aplin 및 Wriston (1981)의 CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306]를 참고한다.
CS1 폴리펩티드 상에 존재하는 탄소화물 부분의 제거는, 글리코실화를 위한 표적으로 작동하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 변이적 치환에 의해, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술이 적용가능하다. 예컨대 [Sojar 및 Bahl (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52-57 및 Edge 등 (1981) Anal. Biochem. 118:131-137]를 참고한다. 폴리펩티드 상의 탄소화물 부분의 효소적 절단은 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, [Thotakura 등 (1987) Meth. Enzymol. 138:350-359]을 참고한다.
CS1 폴리펩티드의 공유 변형의 다른 한 유형은, U.S. 특허 No. 4,640,835; No. 4,496,689; No. 4,301,144; No. 4,670,417; No. 4,791,192, 또는 No. 4,179,337에 설명된 방식으로, CS1 폴리펩티드를 각종 비단백질성 중합체들 중 하나, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다.
본 발명의 CS1 폴리펩티드는 또한 다른 한 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 CS1 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하기 위한 방식으로 변형될 수 있다. 한 구현예에서, 그러한 키메라 분자는 항-택 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는, 택 폴리펩티드와의 CS1 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 택은 일반적으로 CS1 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 그러한 에피토프-택 형태의 CS1 폴리펩티드의 존재는 택 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 택의 제공은 CS1 폴리펩티드가 항-택 항체 또는 에피토프 택에 결합하는 다른 한 유형의 친화성 매트릭스를 이용하는 친화성 정제에 의해 용이하게 정제될 수 있도록 한다. 한 대안적 구현예에서, 키메라 분자는 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 한 특별한 영역과의 융합을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자를 위해, 그러한 융합은 IgG 분자의 Fc 영역에 대해 일어날 수 있다.
각종 택 폴리펩티드 및 그것의 각각의 항체가 이용가능하다. 그 예는 폴리-히스티딘(폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-his-gly) 택; HIS6 및 금속 킬레이트화 택, flu HA 택 폴리펩티드 및 그것의 항체 12CA5(Field 등 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165); c-myc 택 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan 등 (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D(gD) 택 및 그것의 항체(Paborsky 등 (1990) Protein Engineering 3(6):547-553)을 포함한다. 기타 택 폴리펩티드는 Flag-펩티드(Hopp 등 (1988) BioTechnology 6:1204-1210); KT3 에피토프 펩티드(Martin 등 (1992) Science 255:192-194); 튜불린 에피토프 펩티드(Skinner 등 (1991) J. Biol. Chem. 266:15163-15166); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 택(Lutz-Freyermuth 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397)을 포함한다.
또한, 하기 기술된 바와 같이 클로닝되고 발현된 다른 생물로부터의 CS1 단백질도 포함된다. 이에 따라, 인간 또는 기타 생물로부터 다른 관련 CS1 단백질을 찾기 위해, 프로브 또는 퇴화 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 프라이머 서열이 사용될 수 있다. 특히 유용한 프로브 및/또는 PCR 프라이머 서열은 CS1 핵산 서열의 독특한 구역을 포함한다. 바람직한 PCR 프라이머의 길이는 약 15-35 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20-30 뉴클레오티드이고, 필요한 경우 이노신을 함유할 수 있다. PCR 반응을 위한 조건이 잘 기재되었다(예컨대, Innis, PCR Protocols, 이하 상기한 바와 동일함).
또한, 표 2의 핵산에 의해 코딩된 것보다 긴 CS1 단백질이, 예컨대 확장된 서열의 확인, 에피토프 또는 정제 택의 첨가, 기타 융합 서열의 첨가 등에 의해, 제조될 수 있다.
CS1 단백질은 또한 CS1 핵산에 의해 코딩되어 동정될 수 있다. 이에 따라, CS1 단백질은 본원에 기술된 서열목록의 서열, 또는 그것의 상보체에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된다.
CS1 단백질에 대한 결합 파트너
CS1 항체
본 발명의 CS1 항체는 단백질에 특이적으로 결합한다. 본원에서 "특이적으로 결합한다"는 것은 항체가 약 0.1 mM 이상, 더욱 주로는 약 1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.1 μM 이상, 가장 바람직하게는 0.01 μM 이상의 Kd로 단백질에 결합함을 의미한다. 관련 서열이 아닌, 특이적 표적에 대한 결합 선택성이 종종 중요하다.
한 구현예에서, CS1 단백질이 결합 파트너, 예컨대 면역진단용 항체를 생성시키기 위해 사용될 때, CS1 단백질은 전장 단백질과 하나 이상의 에피토프 또는 결정자를 공유해야 한다. 본원에서 "에피토프" 또는 "결정자"는 통상적으로 MHC의 영역에 있어 항체 또는 T-세포 수용체를 생성하고/하거나 그것에 결합하는 단백질의 일부분을 의미한다. 이에 따라, 대부분의 경우들에서, 보다 작은 CS1 단백질에 대해 제조된 항체는 전장 단백질, 특히 선형 에피토프에 결합할 수 있을 것이다. 다른 한 구현예에서, 에피토프는 독특하고; 즉, 고유한 에피토프에 대해 생성된 항체는 교차반응성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 다른 한 구현예에서, 에피토프는 표에 나와 있는 단백질 서열에서 선택된다.
폴리클론 항체의 제조 방법이 존재한다(예컨대, [Coligan, 이하 상기 기술한 바와 동일함; 및 Harlow 및 Lane, 이하 상기한 바와 동일함]). 폴리클론 항체는 포유동물 내에서, 예컨대 면역화제, 및 필요한 경우 보조제의 한 번 이상의 주사에 의해, 생장될 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및/또는 보조제는 다수의 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에게 주사될 것이다. 면역화제는 표 2의 핵산, 또는 그것의 단편 또는 그것의 융합 단백질에 의해 코딩된 단백질을 포함할 수 있다. 피면역화 포유동물에서 면역원성을 알려진 단백질에 면역화제를 접합하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이용될 수 있는 보조제의 예는 프로인트 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)를 포함할 수 있다. 각종 면역화 프로토콜이 사용될 수 있다.
대안적으로 항체는 모노클론 항체일 수 있다. 모노클론 항체가 하이브리도마 방법, 예컨대 [Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 혼성화 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터, 또는 기타 적당한 숙주 동물은 통상적으로 면역화제로 면역화되어, 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 도출한다. 대안적으로, 림프구는 생체외 면역화될 수 있다. 면역화제는 통상적으로 표의 핵산, 또는 그것의 단편, 또는 그것의 융합 단백질에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요망될 경우에 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물의 원이 요망될 경우에 비장 세포 또는 임파절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구가 적당한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 불멸화 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다(예컨대, [Goding (1986) Monoclonal Antibodies, Principles and Practice의 pp. 59-103, Academic Press). 불멸화 세포주는 주로 형질전환된 포유동물의 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 세포이다. 주로, 래트 또는 마우스 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 포함하는 적당한 배지 내에 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배지는 통상적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 매질")을 포함할 것이며, 이 물질들은 HGPRT-결핍의 세포의 성장을 저해한다.
한 구현예에서, 항체는 2특이적 항체이다. 2특이적 항체는, 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가지거나, 동일한 항원 상의 2개 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 모노클론, 바람직하게 인간 또는 인간화된 항체이다. 한 구현예에서, 결합 특이성들 중 하나는 표의 핵산, 또는 그것의 단편에 의해 코딩된 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 다른 한 항원, 바람직하게 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛, 바람직하게는 CS1 특이성의 것에 대한 것이다. 대안적으로, 4량체-형 기술은 다가 시약을 생성시킬 수 있다.
다른 한 구현예에서, 항체는 푸코스의 수준이 낮거나, 그것이 결여되어 있다. 푸코스 결여의 항체는, 특히 낮은 용량의 항체 하에서, 증진된 ADCC(항체-의존성 세포의 세포독성) 활성과 상관 관계가 있었다. [Shields, R. L. 등, (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa, T. 등, (2003), J. Biol. Chem. 278:3466]. 푸코스-비함유 항체의 제조 방법은 래트 골수종 YB2/0 세포(ATCC CRL 1662)에서의 성장을 포함한다. YB2/0 세포는 폴리펩티드의 푸코실화에 필요한 효소(α 1,6-푸코실트랜스퍼라제)를 코딩하는 낮은 수준의 FUT8 mRNA를 발현한다.
ADDC 활성을 증가시키기 위한 대안적 방법은 CS1 항체의 Fc 부분에서의 변이, 특히 FcγR 수용체에 대한 항체 친화성을 증가시키는 변이를 포함한다. 증가된 FcγR 결합과 변이된 Fc 사이의 상관 관계가 표적화된 세포독성 세포-기재의 검정을 통해 입증되었다. [Shields, R. L. 등 (2001) J. Biol. Chem 276:6591-6604; Presta 등 (2002), Biochem Soc. Trans. 30:487-490]. 특이적 Fc 영역 변이를 통해 ADCC 활성을 증가시키는 방법은 하기 것들로 구성된 군에서 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변종체를 포함한다: 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 및 332(여기에서, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지수의 넘버링이다). 한 바람직한 구현예에서, 상기 Fc 변종체는 하기 것들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다: L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L, F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V,D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, N325Q, N325L, N3251, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y 및 I332A(여기에서, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지수의 넘버링이다). Fc 변종체는 또한 하기 것들로 구성된 군에서 선택될 수 있다: V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F24lY/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L3238M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, 1332D, N297S, N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328VI332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N3251, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, A330Y/I332E, V264VA330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/I332E, L328VI332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, 1332A, S239E/V264VI332E, S239Q/V264VI332E, S239E/V264VA330Y/I332E, S239E/V264VS298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265VN297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, N297D/T299V/I332E, N297D/T299VI332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264VS298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264VI332E, S239D/V264VS298A/I332E, 및 S239D/264VA330L/I332E((여기에서, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 지수의 넘버링이다). 또한 본원에 참고로 인용된 PCT WO 2004/029207(2004년 4월 8일)을 참고한다.
항체-연합 ADCC 활성은 혈장 막에 대한 손상 시에, 급속히 방출되는 상등액 중의 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출량 측정을 통해 모니터링 및 정량화될 수 있다.
항체 처리로 세포의 세포독성을 촉진하기 위한 다른 대안적 구현예는 항체 결합 세포에 세포사멸을 초래하는 신호전달 캐스케이드의 항체-매개 자극을 포함한다. 또한 (예컨대, NK 세포를 통한) 본래의 면역체계의 항체-매개 자극은 또한 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포의 사멸을 초래할 수 있다.
진단적 용도를 위한 CS1 서열의 검출
한 측면에서, 유전자의 RNA 발현 수준이 자가면역 장애 또는 암, 예컨대 골수종, 표현형에서의 상이한 세포 상태에 대해 결정된다. 정상 조직(예컨대, 장애를 겪지 않는 조직) 및 질환 조직 내의 유전자의 발현 수준(및 일부 경우들에서, 하기 기술되는 예후와 관련된 장애의 다양한 심각도에 대해)은 발현 프로파일을 제공하기 위해 평가된다. 한 특별한 세포 상태 또는 발현 시점의 유전자 발현 프로파일은 본질적으로 세포 상태의 "지문"이다. 2 상태가 한 특별한 유전자가 유사하게 발현되도록 할 수 있으나, 수많은 유전자의 평가는 동시에 세포의 상태를 반영하는 유전자 발현 프로파일이 생성되도록 한다. 상이한 상태의 세포들의 발현 프로파일을 비교함으로써, 각각의 이 상태에서 (유전자의 상향제어 및 하향제어를 모두 포함하는) 어떠한 유전자가 중요한지에 관한 정보가 수득된다. 이어서, 조직 샘플이 정상 조직 또는 질환 조직의 유전자 발현 프로파일을 가지는지의 여부를 결정하기 위해 진단을 수행하거나 확인할 수 있다. 이는 관련된 조건의 분자적 진단을 제공할 것이다.
본원에 사용된 "차이 발현" 또는 문맥상의 동등물은 세포 및 조직 간 또는 그 내의 일시적 및/또는 세포 유전자 발현 패턴의 정성적 또는 정량적 차이를 가리킨다. 이에 따라, 차이나게 발현된 유전자는 예컨대 정상 대 질환 조직에서, 활성 또는 불활성을 포함하는, 정성적으로 그것의 발현이 변경될 수 있다. 유전자는 다른 한 상태에 대해, 한 특별한 상태에서 온 또는 오프될 수 있고, 이에 따라 2개 이상의 상태를 비교할 수 있다. 정성적으로 제어된 유전자는 표준 기술에 의해 검출가능한 상태 또는 세포 유형 내의 발현 패턴을 나타낼 것이다. 일부 유전자들은 하나의 상태 또는 세포 유형에서 발현될 것이나, 그 양자 모두에서 발현되지는 않는다. 대안적으로, 발현의 차이는, 예컨대 발현이 증가되거나 감소되고; 예컨대, 유전자 발현이 상향제어되어 전사체 양이 증가되거나, 혹은 하향제어되어 전사체 양이 감소되는 등, 정량적일 것이다. 발현의 차이 정도는 단지 하기 기술된 표준 특징화 기술에 의해, 예컨대 아피메트릭스 진칩
Figure 112005063973850-pct00006
(DNA 마이크로칩 배열) 발현 배열의 이용에 의해 의해 정량화하기에 충분히 크기만 하면 된다. [Lockhart (1996) Nature Biotechnology 14:1675-1680]를 참고한다. 다른 기술은 정량적 역 전사효소 PCR, 노던 분석, 및 RNA 분해효소의 생산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상술된 바와 같이, 바람직하게 발현의 변화(예컨대, 상향제어 또는 하향제어)는 약 50% 이상, 더욱 바람직하게는 약 100% 이상, 더욱 바람직하게는 약 150% 이상, 더욱 바람직하게는 약 200% 이상이고, 300 내지 1000% 이상이 특히 바람직하다.
평가는 유전자 전사체 또는 단백질 수준에서 행해질 수 있다. 유전자 발현의 양은, 예컨대 CS1 단백질에 대한 항체 및 표준 면역검정(ELISA 등), 또는 질량 분광법 검정, 2D 겔 전기영동 검정 등을 비롯한 기타 기술을 이용하여, 유전자 전사체의 RNA 또는 DNA 동등물에 대한 핵산 프로브를 이용하여 모니터링될 수 있고, 유전자 발현 수준의 정량화, 또는 대안적으로, 최종 유전자 생성물 자체(단백질)이 모니터링될 수 있다. CS1에 상응하는 단백질, 예컨대 질환 표현형에 중요한 것으로 확인된 단백질이, 질환 진단적 시험에서 평가될 수 있다. 다른 한 구현예에서, 유전자 발현 모니터링은 수많은 유전자들에 대해 동시에 수행된다. 다수의 단백질 발현 모니터링도 또한 수행될 수 있다.
이 구현예에서, CS1 핵산 프로브는 한 특별한 세포에서의 CS1 서열의 검출 및 정량화를 위해, 본원에 기술된 바와 같은 바이오칩에 부착된다. 검정은 하기 실시예에 더욱 설명된다. 더 큰 감도를 제공하기 위해, PCR 기술이 사용될 수 있다.
한 구현예에서, CS1을 코딩하는 핵산을 검출한다. CS1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA가 검출될 수 있으나, 특히 유익한 것은 CS1 단백질을 코딩하는 mRNA가 검출되는 방법이다. mRNA를 검출하기 위한 프로브는 mRNA에 상보적이거나 그에 혼성화하는 뉴클레오티드/데옥시뉴클레오티드 프로브일 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드, cDNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 프로브는 또한 본원에 한정된 검출가능한 표지를 포함해야 한다. 한 방법에서, 나일론 멤브레인과 같은 고체 지지체 상에서 조사되는 핵산을 고정화하고, 샘플에 프로브를 혼성화한 후, mRNA를 검출한다. 세척하여 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거한 후, 표지를 검출한다. 다른 한 방법에서, mRNA의 검출은 인-시츄 수행된다. 이 방법에서, 프로브가 표적 mRNA와 혼성화되도록 하기에 충분한 시간 동안 투과화된 세포 또는 조직 샘플을 검출가능하게 표지된 핵산 프로브와 접촉시킨다. 세척하여 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거한 후, 표지를 검출한다. 예를 들어, 골수종 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적인 디곡시세닌 표지된 리보프로브(RNA 프로브)는, 디곡시게닌을 항-디곡시게닌 2차 항체와 결합시킴으로써 검출되고, 니트로 블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌 포스페이트로 전개된다.
다른 한 구현예에서, 본원에 기재된 3가지 부류의 단백질들(분비 단백질, 막횡단 단백질, 또는 세포내 단백질)로부터의 각종 단백질들이 진단적 검정에 사용된다. CS1 서열을 포함하는 CS1 단백질, 항체, 핵산, 변형된 단백질, 및 세포가 진단적 검정에 사용된다. 이는 개별적 유전자 또는 상응하는 폴리펩티드 수준으로 수행될 수 있다. 한 구현예에서, 발현 프로파일은, 바람직하게 높은 산출량 선별 기술과 함께 사용되어 발현 프로파일 유전자 및/또는 상응 폴리펩티드가 모니터링되도록 한다.
상기 기재되고 본원에 기재된 바와 같이, CS1 단백질은 자가면역 장애, 예컨대 SLE, RA 및 IBD, 및 암 상태, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병의 질환 마커로서의 용도를 가진다. 부가적으로, CS1은 예후 또는 진단적 목적을 위한 마커로서 용도를 가진다. 잠정적 질환 조직에서의 이 단백질의 검출은 그러한 조건의 검출, 예후 또는 진단, 및 치료 전략의 선택을 가능하게 한다. 한 구현예에서, CS1를 검출하기 위해 항체가 사용된다. 한 바람직한 방법은 겔(이는 통상적으로 변성 및 환원 단백질 겔, 단 다른 한 유형의 겔일 수 있으며, 이는 등전적 포커싱 겔 등을 포함함) 상의 전기영동에 의해 샘플로부터 단백질을 분리한다. 단백질을 분리한 후에, CS1를 예컨대 CS1에 대해 생장된 항체로 면역블로팅함으로써 검출한다.
다른 한 방법에서, CS1에 대한 항체는 인-시츄 이미징 기술, 예컨대 조직학에서의 용도를 가진다. 예컨대, [Asai 등 (1993년 판) Methods in Cellular Biology: Antibodies in Cellular Biology (제37권) Academic Press]을 참고한다. 이 방법에서, 세포는 골수종 단백질(들)에 대한 하나 내지 많은 항체와 접촉된다. 세척하여 비-특이적 항체 결합을 제거한 후, 항체 또는 항체들의 존재를 검출한다. 한 구현예에서, 항체는 검출가능한 표지를 포함하는 2차 항체와 함께 인큐베이션함으로써 항체를 검출한다. 다른 한 방법에서, CS1에 대한 1차 항체는 검출가능한 표지, 예컨대 기질에 대해 작용할 수 있는 효소 마커를 포함한다. 다른 한 구현예에서, 각각의 다수의 1차 항체는 구분되는 검출가능한 표지를 포함한다. 이 방법은 상기 조건들의 다른 마커와 함께 CS1에 대한 동시 선별에서의 특별한 용도를 가진다. 많은 다른 조직학적 이미징 기술도 또한 본 발명에 의해 제공된다.
한 구현예에서, 상이한 파장의 방출을 검출하고 구분하는 능력을 갖는 플루오로미터로 표지를 검출한다. 또한, 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)가 방법에 사용될 수 있다.
다른 한 구현예에서, 항체는 혈액, 혈청, 혈장, 대변, 및 기타 샘플로부터 자가면역 장애, 예컨대 SLE, RA 및 IBD, 및 암, 예컨대 골수종 및 혈장 세포 백혈병을 진단함에 있어 용도를 가진다. 그러므로, 그러한 샘플은 CS1의 존재 하에 프로빙되거나 시험되는 샘플로서 유용하다. ELISA, 면역블로팅(웨스턴 블로팅), 면역석출, BIACORE 기술 등을 비롯한 전술된 면역검정 기술에 의해 CS1을 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다. 반대로, 항체의 존재는 내인성 CS1 단백질에 대한 면역 반응을 가리킬 수 있다.
다른 한 구현예에서, 조직 배열에 대한 표지된 CS1 핵산 프로브의 인-시츄 혼성화가 행해진다. 예를 들어, 질환 조직 및/또는 정상 조직을 포함하는 조직 샘플의 배열이 행해진다. 인-시츄 혼성화(예컨대, [Ausubel, 이하 상기한 바와 동일함]을 참고함)가 이어서 수행된다. 개별 및 표준 간의 지문을 비교할 때, 진단, 예후 또는 예측은 그 발견에 기초할 수 있다. 진단을 가리키는 유전자는 예후를 가리키는 유전자와 상이할 수 있고, 세포의 조건의 분자 프로파일링은 반응 조건 또는 내화성 조건 간에 구분할 수 있도록 할 수 있거나 성과를 예측하는 것일 수 있음을 또한 이해한다.
한 구현예에서, CS1 서열을 포함하는 CS1 단백질, 항체, 핵산, 변형된 단백질, 및 세포가 예후 검정에 사용된다. 상기한 바와 같이, 장기 예후 측면에서 질환 상태, 임상적, 병적인, 또는 기타 정보와 상관 관계가 있는 유전자 발현 프로파일이 생성될 수 있다. 다시, 이는 단백질 또는 유전자 수준에서 행해질 수 있고, 여기에서 유전자의 사용이 바람직하다. 단일 또는 다수의 유전자는 각종 조합으로 유용할 수 있다. 상기한 바와 같이, CS1 프로브는 조직 또는 환자에서의 CS1 서열의 검출 및 정량화를 위해 바이오칩에 부착될 수 있다. 검정은 진단을 위해 상술된 바와 같이 진행된다. PCR 방법은 더욱 민감하고 정확한 정량화를 제공할 수 있다.
예후 검정에 유용한 유전자는, 환자의 병의 상태에 따라 차이나게 발현되는 유전자이다. 한 구현예에서, 유전자는 환자의 상태에 따라 독특하게 발현될 수 있다. 다른 한 구현예에서, 유전자는 환자의 상태에 따라 차이나는 수준으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 골수종에서, 환자는 질환의 정도 및 위치에 따라 3가지 상이한 상태에 처한다: 단계 I, II 및 III. 단계 I에서, 증세는 마일드 내지 비-존재이고, 많은 환자들이 골수종의 증세를 나타내지 않는다. 양성 진단은 종양 세포의 존재이나; 적혈구 세포의 수는 정상이거나 정산 범위에서 약간 아래이며, 혈액 중 칼슘의 검출가능한 증가가 없고, 혈액 또는 소변 중 매우 낮은 수준의 M-단백질이 있으며, X-선으로 검출가능한 뼈 손상을 볼 수 없다. 단계 II에서, 보다 많은 수의 암 세포들이 편재한다. 신장 기능이 저해될 수 있고, 이는 대부분의 환자들의 예후 진단을 악화시킨다. 단계 III은 빈혈, 과칼슘혈증, 진전된 뼈 손상, 및 혈액 및 소변 중의 고 수준의 M-단백질을 초래한다. 단백질 발현의 자가면역 장애에서의 상이한 단계와의 상관 관계는 또한 그러한 장애의 예후를 결정하는데 유용한 것으로 입증될 수 있었다. 독특하게 발현되거나 단계에 따라 차이 발현 수준을 가지는, 상이한 단계에서 발현된 유전자들의 상관 관계는 환자의 진정을 유발하는 생존능을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이는 골수종 환자가 증세를 거의 나타내지 않는, 질환의 보다 조기 상태에서 특히 유용할 것이다. 또한, 장기 합병증의 개시를 가리키는, 발현된 유전자, 예컨대 베타-2 마이크로글로불린(신장 손상의 지시자), 및 고 수준의 혈청 알부민 및 락테이트 탈수소효소도 또한 예후 툴로서 유용할 수 있다.
독특하게 발현되거나 단계에 따라 차이 발현 수준을 가지는, 상이한 단계에서 발현된 유전자들의 상관 관계는, 또한 본 발명에 개시된 치료제를 이용하여 치료 효능을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항자로 처리된 환자를, 예를 들어 CS1, 또는 장애-특이적 마커와 조합된 CS1를 비롯한 마커의 모니터링을 통해 상기 길항자의 치료적 효능에 대해 모니터링(예컨대, 골수종 치료를 위한 M-단백질의 모니터링)할 수 있다. 이 특이적 마커의 모니터링은, 치료 발명의 효능을 결정하고 또한 본 발명의 상이한 징후를 위한 치료 고려사항의 방법 및 용량을 결정하는데 중요할 것이다.
생체내 모델 시스템으로서의 질환 장애의 도입
염증성 장 질환
염증성 장 질환의 병적인 과정을 조사하기 위해 실험적 생체내 모델이 개발되어 왔다. [Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997)]. 예를 들어, 염증성 장 질환 유전자가 파괴되거나 염증성 장 질환 유전자가 삽입된 녹아웃(knock-out) 유전자이식 마우스를 제조할 수 있다. 마커 유전자 또는 기타 이종성 유전자를 상동성의 재조합을 통해 마우스 게놈 내의 내인성 염증성 장 질환 유전자 부위에 삽입함으로써, 놋아웃 유전자이식 마우스를 제조할 수 있다. 그러한 마우스는 또한 내인성 염증성 장 질환 유전자를 변이된 버전의 염증성 장 질환 유전자로 치환하거나, 예컨대 발암물질에의 노출에 의해 내인성 염증성 장 질환 유전자를 변이시킴으로써, 제조될 수 있다.
DNA 구축물을 배아 줄기 세포의 핵에 도입한다. 새로 유전공학처리된 유전적 병변을 포함하는 세포를 숙주 마우스 배(embryo)에 주입하고, 이를 암컷 수용자에 재이식한다. 이 배들 중 하나는 변이체 세포주로부터 부분적으로 유래된 생식 세포를 가지는 키메라 마우스로 발달한다. 그러므로, 키메라 마우스를 생육시킴으로써, 도입된 유전적 병변을 포함하는 마우스의 신규 종을 수득할 수 있다(예컨대, [Capecchi 등 (1989) Science 244:1288-1292] 참고). 키메라 표적화된 마우스는 [Hogan 등 (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual CSH Press; 및 Robertson (1987년 판) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, 미국 워싱턴 D.C.]에 따라 유래될 수 있다.
동물 모델의 비-유전적 조작을 이용하여 다른 모델들이 구축될 수 있다. 한 모델은 특히 소분자 선별에 광대하게 사용되어져 왔다. 이 모델은 합텐 2,4,-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)의 용액으로 단일 결장내 챌린지에 의해 래트 또는 마우스에 대장염을 유도한다. [Morris GP 등, Gastroenterology 96:795-803 (1989); Boughton-Smith NK, Br. J. Pharmacol. 94:65-72 (1988)]. TNBS를 이용한 처리는 2 내지 3일 후에 그것의 최저 상태(nadir)에 도달하는 강한 국소적 염증성 반응을 일으키고, 챌린지의 심각성에 따라, 21일까지 지속될 수 있다.
TNBS 처리에 의해 발생된 염증성 반응은 크론씨병의 많은 거시적, 조직학적 및 면역학적 징후들을 재발하는 것으로 간주된다. [Grisham MB 등, Gastroenterology 101:540-547 (1991); Yamada Y 등, Gastroenterology 102:524-534 (1992); Torres MI 등, Dig. Dis. Sci 44:2523-29 (1999); Neruath M, Fuss I, Strober W, hit. Rev. Immunol. 19:51-62 (2000)]. 경벽성 염증 및 장관벽의 후벽화와 함께 개방 궤양이 관찰된다. 조직학적 특성은 왜곡 소낭성 구조, 소낭성 아트로피, 육아중, 거대 세포, 기저 림프구 응집물, 및 염증성 침윤의 존재를 포함한다.
결장 염증을 연구하고 입증하고, 염증성 장 질환의 측면을 해결하기 위해, 모델을 사용하였다. [Hoffman P 등, Gut 41:195-202 (1997); Jacobson K, McHughK, Collins SM, Gastroenterology 112:156-62 (1997)].
다른 동물 모델은 HLA-B27 유전자이식 래트[Hammer RE 등, Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA- B27 and Human b2M: An animal model of HLA-B27 associated human disorders, Cell 63:1088-1112 (1990)], 유전자이식 IL-2 결핍 마우스[Baumgart DC 등, Mechanisms of intestinal epithelial cell injury and colitis in interleukin 2 deficient mice, Cell Immunol. 187:52-66 (1998)], mdr1a 결핍 마우스[Panwala CM 등, A Novel Model of Inflammatory Bowel Disease: Mice deficient for the multiple drug resistance gene, mdr1a, spontaneously develop colitis, J. Enmunol. 161:5733-44 (1998)], 및 IL 결핍 마우스[Freeman HJ, Studies on the interleukin-10 gene in animal models of colitis, Canadian Gastroenterology (2003)]을 포함한다.
골수종
골수종의 병적인 과정을 조사하기 위해 실험적 생체내 모델이 개발되어져 왔다. [Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997)]. 예를 들어, 골수종 유전자가 파괴되거나 골수종 유전자가 삽입된 녹아웃 유전자이식 마우스를 제조할 수 있다. 마커 유전자 또는 기타 이종성 유전자를 상동성의 재조합을 통해 마우스 게놈 내의 내인성 골수종 유전자 부위에 삽입함으로써, 놋아웃 유전자이식 마우스를 제조할 수 있다. 그러한 마우스는 또한 내인성 골수종 질환 유전자를 변이된 버전의 골수종 질환 유전자로 치환하거나, 예컨대 발암물질에의 노출에 의해 내인성 염증성 장 질환 유전자를 변이시킴으로써, 제조될 수 있다.
DNA 구축물을 배아 줄기 세포의 핵에 도입한다. 새로 유전공학처리된 유전적 병변을 포함하는 세포를 숙주 마우스 배에 주입하고, 이를 암컷 수용자에 재이식한다. 이 배들 중 하나는 변이체 세포주로부터 부분적으로 유래된 생식 세포를 가지는 키메라 마우스로 발달한다. 그러므로, 키메라 마우스를 생육시킴으로써, 도입된 유전적 병변을 포함하는 마우스의 신규 종을 수득할 수 있다(예컨대, [Capecchi 등 (1989) Science 244:1288-1292] 참고). 키메라 표적화된 마우스는 [Hogan 등 (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual CSH Press; 및 Robertson (1987년 판) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, 미국 워싱턴 D.C.]에 따라 유래될 수 있다.
동물 모델의 비-유전적 조작을 이용하여 다른 모델들이 구축될 수 있다. 예를 들어, C57BL/6J 마우스에 B-세포 종양(예컨대, LLC 세포)에 주입함으로써, 폐 전이를 유도할 수 있다. 다른 동물 모델은 SCID 마우스를 이용하고, B-세포 종양주(예컨대, HsSultan 세포(ATCC) 또는 다발성 골수종주(예를 들어, 비제한적으로 L363, LP-1, OPM-2 또는 RPMI8226)를 주입하여, 골수종-형 특성을 유도한다. 또 다른 동물 모델은 인간 태아 뼈(FB)를 NOD/SCID 마우스의 피하 부위에 이식한 후, 다발성 골수종 환자로부터 수득된 1차 골수 단핵 세포를 FB에 접종함으로써 발생된 인간 다발성 골수종에 대한 NOD/SCID 마우스 모델을 포함한다. [Shang-Yi H. 등, Amer. J. Invest. Pathol. 164:747-756 (2004)]을 참고한다. 프리스탄 오일(2,6,10,12-테트라메틸펜타데칸) 처리를 통해 형성이 유도된 마우스 골수종 모델이 또한 사용될 수 있다. 또한, SCID, SCID/베이지 또는 NOD/SCID 마우스의 골수(동소성 주입 모델)에 직접적으로 골수종 세포가 주입된 마우스 모델이 또한 사용될 수 있다.
골수종 세포에서와 같이 형질전환이 행해진 세포는 그것의 정상 짝세포보다 증가된 양의 특정 인자(이하, "골수종 특이적 마커")를 방출한다. 예를 들어, CD38, CD9, CD10, HLA-DR 및 CD20은 골수종 세포에서의 발현이 증가된다. [Ruiz-Arugelles GJ 및 San Miguel JF, Cell Surface Markers in Multiple Myeloma, Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994)].
이 인자의 방출을 측정하는 각종 기술들이 [Freshney(1998), 이하 상술한 바와 동일함]에 기재되어 있다. 또한, [Unkeless 등 (1974) J. Biol. Chem. 249:4295-4305; Strickland 및 Beers (1976) J. Biol. Chem. 251:5694-5702; Whur 등 (1980) Br. J. Cancer 42:305-312; Mihich (1985년 판) Biological Responses in Cancer Plenum 내의, Gullino "Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth" pp. 178-184; Freshney (1985) Caner Res. 5:111-130]을 참고한다.
치료적 방법
자가면역 질환 치료
한 측면에서, 본 발명은 백혈구의 증식, 접착, 분화, 활성화 및/또는 동시-활성화를 감소시키는 방법으로서, 백혈구를 본원에 기재된 CS1의 길항자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 림프구(예컨대, B 세포)에 의한 면역글로불린의 분비(또는 생산)를 감소시키는 방법으로서, 림프구를 본원에 기재된 CS1의 길항자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 길항자는 면역글로불린(예컨대, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE)의 생산을, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또한 50% 감소시킬 수 있다. 변화율(%)을 후투여량 면역글로불린 농도(x일째), 제1 투여량의 항체를 투여하기 전의 면역글로불린 농도(0일째)를 뺀 후, 그것을 제1 투여량의 항체를 투여하기 전의 면역글로불린 농도(0일째)로 나누어 100을 곱함으로써 계산되며, 이는 예컨대 [(x일째-0일째)/0일째]×100이다.
다른 한 측면에 있어서, 본 발명은 CS1를 발현하는 세포의 세포사멸 또는 세포용해를 유도하는 방법으로서, 세포를 본원에 기재된 CS1에 대한 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 구현예에서, 유도는 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 달성된다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 작동자 세포(예컨대, 자연 킬러 세포 또는 마크로파지)의 존재 하에 표적 세포(CS1를 발현하는 세포)의 표면 상의 항원에 결합한다. 작동자 세포 상의 Fc 수용체는 결합된 항체를 인식한다. Fc 수용체의 가교결합은 세포용해 또는 세포사멸에 의해 표적 세포를 사멸하도록 신호를 보낸다. 세포용해는 세포용해된 세포로부터 표지 또는 락테이트 탈수소효소의 방출의 검출, 또는 감소된 표적 세포 생존능의 검출(예컨대, 아넥신 검정)을 통해 검출될 수 있다. 세포사멸에 대한 검정은, 말단 데옥시누클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 디곡시게닌-11-dUTP 닉 말단 표지(TUNEL) 검정에 의해 수행될 수 있다[Lazebnik 등, Nature:371, 346 (1994)]. 세포독성은 또한 당업계에 공지된 검출 키트, 예컨대 로셰 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), Indianapolis, IN)의 세포독성 검출 키트에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 표적 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 80% 세포독성을 유도한다. 백분율은 실시예에 개시된 방법에 의해 계산된다.
길항자는 백혈구와 생체외(예컨대, 길항자를 백혈구가 배양되는 세포 배양 환경에 첨가함으로써), 체외 또는 생체내(예를 들어, 길항자를 대상자에게 투여함으로써) 접촉될 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 백혈구는 a) 활성화된 림프구, 예컨대 B 세포 및/또는 T 세포, 바람직하게 CD19+ B 세포 및/또는 CD3+ T 세포; b) CD14+ 활성화 및/또는 나이브 세포; c) 활성화 및/또는 비활성화 수상 세포; 및/또는 c) CD56+ NK 및/또는 NKT 세포이다.
한 바람직한 측면에서, 본 발명은 필요 대상자에게 있어 B 세포에 의한 면역글로불린의 분비를 감소시키는 방법으로서, 유효량의 CS1의 길항자를 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 한 바람직한 측면에서, 본 발명은 필요 대상자에게 있어 CS1를 발현하는 세포의 세포독성, 세포용해, 및/또는 세포사멸을 유도하는 방법으로서, 유효량의 CS1의 항체를 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 길항자, 바람직하게 항체는, 애디슨씨병, 귀의 자가면역 질환, 눈의 자가면역 질환, 예컨대 포도막염, 자가면역 간염, 크론씨병, 당뇨병(I형), 부고환염, 사구체신염, 갑상선기능항진증, 귈레인-바레 증후군, 하시모토씨병, 용혈성 빈혈, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 백납, 건선, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 피부경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 척추관절염, 갑상선염, 궤양성 대장염 및/또는 혈관염을 포함하나 이에 제한되지 않는 자가면역 질환들의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법으로 예방 및/또는 치료될 수 있는 자가면역 질환은 SLE, RA, 또는 IBD이다. 항-CS1 항체는 SLE, RA 또는 IBD의 증세가 발달한 대상자에게 투여된 후, 증세의 심각성을 감소시킬 수 있어야 한다. 대안적으로, 항-CS1 항체는 대상자의 SLE, RA 또는 IBD의 임의의 임상적 발현이 발달되기 전에, 대상자에게 투여될 수 있다. 항체의 상기와 같은 예방적 투여는, 대상자가 임의의 SLE, RA 또는 IBD 증세를 발달시키는 것으로 완전히 방지하거나, 대상자가 항체 치료가 없는 조건에서와 같은 심각한 증세로 발달시키는 것을 적어도 방지하여야 한다. SLE, RA 또는 IBD의 증세의 심각성은 당업계에 공지된, SLE, RA 또는 IBD, 예컨대 항-DNA 항체의 혈청 수준, 단백뇨, 및 환자의 사망률에 대한 표준 임상적 시험에 의해 측정될 수 있다.
치료적 방법은 주로 인간 환자에게 적용되나, 다른 포유동물에 적용될 수 있다.
암 치료
골수종 세포의 증식을 감소시키기 위한 치료적 방법으로서, 골수종 세포를 골수종 단백질의 길항자, 바람직하게 항체 또는 기타 길항자, 예컨대 본원에 기재된 CS1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법도 또한 포함된다. 예를 들어, 항체는 골수종 세포와 생체외(예컨대, 길항자를 골수종 세포가 배양되는 세포 배양 환경에 첨가함으로써), 체외 또는 생체내(예를 들어, 길항자를 대상자에게 투여함으로써) 접촉될 수 있다. 다른 한 측면에서, 본 발명은 골수종 세포의 증식을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 골수종 단백질 길항자를 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 길항자, 바람직하게는 본 발명의 항체가 골수종의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 항체 또는 길항자는 골수종의 증세가 발달된 대상자에게 투여된 후, 증세의 심각성을 감소시킬 수 있어야 한다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 대상자가 골수종의 임의의 임상적 발현을 발달시키기 전에, 대상자에게 투여될 수 있다. 골수종의 증세의 심각성은 당업계에 공지된 골수종을 위한 표준 임상적 시험, 예컨대 골밀도 X-선 분석, 베타-2 마이크로글로불린 수준 또는 과칼슘혈증에 의해 측정될 수 있다. 치료적 방법은 주로 인간 환자에게 적용되나, 다른 포유동물에 적용될 수 있다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 CS1 발현 세포의 세포사멸 또는 세포용해를 유도하는 방법으로서, 세포를 본원에 기재된 CS1에 대한 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 한 바람직한 구현예에서, 본 유도는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 달성된다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 작동자 세포(예컨대, 자연 킬러 세포 또는 마크로파지)의 존재 하에, 표적 세포(CS1 발현 세포)의 표면 상의 항원에 결합한다. 작동자 세포 상의 Fc 수용체는 결합된 항체를 인식한다. Fc 수용체의 가교결합은 작동자 세포에게 세포용해 또는 세포사멸에 의해 표적 세포를 사멸하도록 신호를 보낸다. 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지 또는 락테이트 탈수소효소의 방출의 검출, 또는 감소된 표적 세포 생존능의 검출(예컨대, 아넥신 검정)을 통해 검출될 수 있다. 세포사멸에 대한 검정은, 말단 데옥시누클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 디곡시게닌-11-dUTP 닉 말단 표지(TUNEL) 검정에 의해 수행될 수 있다[Lazebnik 등, Nature:371, 346 (1994)]. 세포독성은 또한 당업계에 공지된 검출 키트, 예컨대 로셰 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)(Indianapolis, IN))의 세포독성 검출 키트에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 표적 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 80% 세포독성을 유도한다. 백분율은 실시예에 개시된 방법에 의해 계산된다.
길항자는 백혈구와 생체외(예컨대, 길항자를 백혈구가 배양되는 세포 배양 환경에 첨가함으로써), 체외 또는 생체내(예를 들어, 길항자를 대상자에게 첨가함으로써) 접촉될 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 백혈구는 a) 활성화된 림프구, 예컨대 B 세포 및/또는 T 세포, 바람직하게 CD19+ B 세포 및/또는 CD3+ T 세포; b) CD14+ 활성화 및/또는 나이브 세포; c) 활성화 및/또는 비활성화 수상 세포; 및/또는 c) CD56+ NK 및/또는 NKT 세포이다.
한 바람직한 측면에서, 본 발명은 필요 대상자에게 있어 B 세포에 의한 면역글로불린의 분비를 감소시키는 방법으로서, 유효량의 CS1의 길항자를 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. B 세포에 의한 면역글로불린 분비의 그와 같은 감소는 고점도 증후군을 비롯한, 골수종의 합병증을 완화시키는 것을 도울 수 있다.
다른 한 바람직한 측면에서, 본 발명은 필요 대상자에게 있어 CS1를 발현하는 세포의 세포독성, 세포용해, 및/또는 세포사멸을 유도하는 방법으로서, 유효량의 CS1의 항체를 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
치료제의 투여
길항자, 예를 들어 본 발명의 항체를 투여하는 각종 방법들이 있다. 비경구 투여가 바람직하다. 항체는 볼루스로서 정맥내로 또는 일정 시간에 걸쳐 연속적 주입에 의해; 또는 근육내, 피하, 복강내 또는 뇌척수내 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 경구, 국소, 흡입 경로, 또는 기타 당업자에게 공지된 전달 수단들도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상 길항자(예를 들어, 항체), 또는 그것의 칵테일이 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 내에 용해된 용액을 포함한다. 예컨대 주사용수(WFI), 또는 통상적으로 pH 5.0 내지 8.0, 가장 종종은 pH 6.0 내지 7.0으로 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 등으로 완충되고/되거나 등장성이 되도록 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드 등과 같은 염을 함유하는 완충수와 같은 각종 수성 담체가 사용될 수 있다. 담체는 또한 활성 단백질을 보호하기 위해 인간 혈청 알부민, 폴리소르베이트 80, 슈거 또는 아미노산과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 이 제형물 내의 길항자(예를 들어, 항체)의 농도는 약 0.1 내지 100 mg/ml에서 광범위하게 변화하나, 종종은 1 내지 10 mg/ml의 범위 내이다. 제형된 모노클론 항체는 비경구 투여에 특히 적당하고, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해, 또는 정맥내 주입으로서 투여될 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법이 당업자에게 공지되어 있거나 명백하며, 이는 예를 들어 본원에 참고로 인용된 [Remington's Pharmaceutical Science(제15판, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 본 발명은 본원에 기재된 항체들 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
조성물은 CS1 및 그것의 세포 기질 간의 상호작용을 억제하고, 질병 세포의 접착을 억제하거나, 상기 장애의 임상적 증세를 예방 및/또는 치료하는 것을 포함하는 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 이 바람직한 효과들 중 임의의 한 효과를 달성하기 위한 적당량이 "유효량"으로 정의된다. 항체는 단일 또는 다수 투여에 의해 환자에게 전달될 수 있다.
질환의 치료를 위한 목적으로, 길항자(예를 들어, 항체)의 적당한 투여량은 질환의 심각성 및 과정, 환자의 임상적 내역 및 반응, 항체의 독성, 및 참가 의료진의 판단에 의존할 것이다. 길항자는 한 번에 또는 일련의 치료들을 통해 환자에게 적당히 투여된다. 초기 후보물질 투약량이 환자에게 투여될 수 있다. 적당한 투약량 및 치료 섭생은, 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 치료의 진행을 모니터링함으로써 확립될 수 있다.
부가적으로, 길항자(예컨대, 항체)는 실질적으로 순수한 형태로 단독으로, 또는 당업자에게 공지된 자가면역 질환을 위한 치료제와 함께 이용될 수 있다. 항체를 이용한 처리와 함께 사용될 수 있는 다른 치료는 안티센스 핵산 분자 또는 생물학적 물질, 예컨대 부가적 치료적 항체의 투여를 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 처리는 그것이 일련으로, 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 다른 한 제제와 함께 투여될 수 있도록 하는 방식으로 제형화된다. 자가면역 장애 및 골수종의 치료를 위해, 항체는 종종 하나 이상의 다른 면역억제성 약물 및 면역조절자와 함께, 또는 그 후에 투여될 수 있다.
진단 및/또는 예후 용도에 사용하기 위한 키트
키트가 또한 상기 제시된 진단 및 연구 용도에서 사용하기 위해, 본 발명에 의해 제공된다. 진단 및 연구 용도에 있어, 그러한 키트는 하기의 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 검정 시약, 완충액, CS1-특이적 핵산 또는 항체, 혼성화 프로브 및/또는 프라이머, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 우세 음성 CS1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, CS1-연합 서열의 소분자 억제제 등.
또한, 키트는 본 발명의 방법의 수행을 위한 지시사항(예컨대, 프로토콜)을 포함하는 지시적 자료를 포함할 수 있다. 지시적 자료는 통상적으로 쓰여지거나 인쇄된 물질을 포함하나, 그에 한정되지는 않는다. 그러한 지시사항을 저장하고 그것을 최종 사용자에게 전달할 수 있는 매체가 본 발명에 의해 구상된다. 그러한 매체는 전자 저장 매체(예컨대, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예컨대, CD ROM) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 매체는 상기와 같은 지시적 자료를 제공하는 인터넷 사이트로의 주소를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 CS1- 관련된 서열의 조절자를 선별하기 위한 키트를 제공한다. 그러한 키트는 용이하게 입수가능한 물질 및 시약으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 그러한 키트는 하기 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: CS1-연합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 반응관 및 CS1-연합 활성 시험을 위한 지시사항. 임의적으로, 키트는 생물학적으로 활성인 CS1 단백질을 포함한다. 매우 다양한 키트들 및 성분들이, 의도된 키트 사용자, 및 사용자의 특별한 필요에 따라서, 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 진단은 통상적으로 복수개의 유전자들 또는 산물들의 평가를 포함할 것이다. 유전자는 통상적으로, 내역 또는 성과 데이터에 확인될 수 있는 질환의 중요 파라미터와의 상관 관계를 기초로 하여 선택될 것이다.
실시예 1: CS1의 단리 및 동정
CS1은 정상적인 건강한 성인 말초 혈액으로부터 유래된 B-세포 서브세트(나이브(naive) 대 기억 + 형질 (plasma) B 세포)의 cDNA 차감 (substraction) 라이브러리로부터 동정하였다. CS1은 기억 및 형질 B 세포 사이에서 차별적으로 발현되었다. 차감 라이브러리는 후술하는 하기 프로토콜로 제조하였다:
B 세포 서브세트의 단리
말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear Cell, PBMC)를 표준 피콜-하이파크(Ficoll-hypaque) 구배로 9명의 건강한 성인 공여체로부터 단리하였다. B 세포를 하기의 표준 음성 선발 프로토콜로 PBMC로부터 단리하였다. PBMC는 정제된 마우스 항-인간 CD2, CD3, CD4, CD14, CD16, CD56, CD66 및 글리코포린 A의 항 체 칵테일에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 및 세척 후 염소-항-마우스 자성 Dynal 비드를 세포 당 7-10개의 비드로 첨가하였다. 그 후 항체 결합 세포를 표준 Dynal 자성 홀더로 단리하여 풍부화된 B 세포를 상청액에 남겼다. 이어서 수집된 상청액을 RPMI + 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)으로 세척하였다.
B-세포 서브세트(나이브 대 기억 + 형질 B 세포)의 분류:
Dynal-풍부 B 세포를 하기의 표준 염색 프로토콜로 IgD-FITC, CD38-사이크롬, CD19-APC, 및 CD27-PE로 염색하였다. 나이브 B 세포(IgD+CD19+CD38int/-CD27-) 대 기억 및 형질 B 세포(IgD-CD19+CD38int/+CD27+)의 2가지 별개의 집단을 MoFlo 고성능 유세포 분석기-MLS 상에서 분류하였는데, 이 분석기에는 spectra physics의 공기 냉각형 아르곤 레이저 (488 nm) 및 635-nm 다이오드와, 530/40nm에서의 FITC, 580/30 nm에서의 PE, 670/20 nm에서의 APC, 및 670/30 nm에서의 사이크롬 (PE-Cy5)의 검출을 위한 필터가 갖추어져 있다. 분류된 B 세포를 정제를 위하여 MoFlo 세포 분석기 상에서 분석하였으며 이는 97% (기억 및 형질 B 세포) 및 98% (나이브 B 세포)의 순도의 것인 것으로 밝혀졌다. 분류된 세포를 Trizol에 두고 -70℃에서 보관하였다.
cDNA 라이브러리의 제조:
cDNA 차감 라이브러리를 표준의 표현적 차이 분석법(representational difference analysis)인 차감 혼성화 프로토콜의 사용에 의해 분류된 B 세포 서브세트로부터 제조하였다. 차감 라이브러리는 나이브 cDNA를 2회 차감할 경우 기억 + 형질 B 세포 cDNA 라이브러리를 포함하며, 기억 + 형질 cDNA를 2회 차감할 경우 나이브 B 세포 cDNA 라이브러리를 포함한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 cDNA 차감 라이브러리를 표준 플라스미드 벡터 내로 라이게이션하고 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 이. 콜라이(E. coli) (DH-10B) 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이 세포를 선발 항생제의 존재 하에 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 각각이 하나의 특정 인서트를 나타내는 단일 박테리아 콜로니를 표준 콜로니 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
차별적 발현의 스크리닝 및 확인:
cDNA 차감 라이브러리 인서트를 변성시키고 2개의 동일한 나일론 필터 상으로 블로팅하고 2가지의 상이한 표지된 변성 프로브-(기억 + 형질) - 나이브 cDNA (2회 차감) 및 나이브 - (기억 + 형질) cDNA (2회 차감)을 이용하여 개별적으로 혼성화하였다. 차감 라이브러리 cDNA는 인서트가 우선적으로 2가지 프로브 중 하나와 선택적으로 혼성화될 경우 양성인 것으로 간주하였다. CS1의 cDNA 클론은 (기억 + 형질) - 나이브 cDNA 프로브 (2회 차감)와 우선적으로 혼성화되었다.
CS1의 동정:
양성 클론으로 형질전환시킨 박테리아 세포를 배양하고 DNA를 제조자의 프로토콜(Qiagen, Valencia, Cal ifornia)에 따라 Qiagen(등록상표) Mini-Prep 키트로 단리하였다(시험관내 진단용 제제). 정제된 플라스미드의 서열을 결정하고 DNA 서열의 신원(identity)을 NCBI 데이타베이스의 검색으로 결정하였다.
CS1 유전자 발현의 특성화 및 확인:
CS1을 포함하여 선발된 양성 클론의 우선적 발현을 도트 블롯 분석으로 확인하였다. 분류된 나이브 대 기억 + 형질 B 세포로부터 단리한 동량의 (미차감 cDNA (20 ng)를 나일론 필터 상에 스포팅하고 양성 클론의 표지된 cDNA 인서트로 혼성화하였다. 이러한 분석에 있어서 cDNA는 2가지의 별개의 부류로부터 수득한 말초 혈액 B 세포 서브세트로부터 합성하였다 (n=9명의 건강한 성인 및 n=10명의 건강한 성인, 순도는 각각 > 97% 및 > 98%). 필터를 세척하고 혼성화 프로브로부터의 신호는 자가 방사선 사진법으로 검출하였다. 분류된 나이브 대 기억 + 형질 B 세포 두 세트 모두에 걸쳐 cDNA가 기억 + 형질 B 세포 cDNA에 우선적으로 혼성화할 경우 클론을 양성인 것으로 간주하였다. 도 1A에 도시되어 있는 바와 같이 데이타에 의하면 CS1은 형질 및 기억 B 세포에서 주로 발현되는 것으로 나타났다.
CS1은 림프 조직에서 주로 발현된다:
Clontech (Palo Alto, Cal ifornia)로부터 구매하였으며 하기 조직으로부터 제조한 PolyA RNA로부터 합성한 cDNA로부터 도트 블롯을 제조하였다: 비장, 림프절, 골수, 소장, 뇌, 폐, 골격근, 심장, 신장 및 간. 제조자의 권고 사항 (Boehringer-Mannheim DIG 키트)에 따라 도트 블롯을 디그옥시제닌(DIG) 표지된 CS1 DNA로 프로빙하고 화학 발광에 의해 시각화하였다(알칼리성 포스파타제 표지된 항-DIG 항체 및 CDP-Star). 도 1B에 도시되어 있는 바와 같이 결과에 의하면 CS1은 주로 림프 조직에서 발현되며(비장, 림프절, 골수 및 소장-가능하게는 집합 임파소절(Peyer's patches)에서의 잔여 림프구로 인한 것임) 다른 비림프 기관(뇌, 폐, 골격근, 심장, 신장 및 간)에서는 존재하지 않거나 적게 존재한다는 것이 나타났 다.
실시예 2: CS1의 차별적 발현
인간 세포
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 피콜-하이파크 구배로부터의 단리에 의해 수득하였다. 이어서 단리한 PBMC를 신선 배양 배지에 2 x 106개의 세포/ml로 재현탁하였다. PBMC를 3 ㎍/ml 농도의 피토헤마글루티닌(PHA)로 3일 동안, 또는 10 ㎍/ml의 농도의 미국자리공(pokeweed) 미토겐(PWM)으로 8일 동안 자극하였다. 미자극 대조 PBMC는 자극 없이 제조하였다. 세포를 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루코스 첨가물을 함유하는 RPMI 배지에서 7% CO2에서 37℃에서 배양하였다.
마우스 세포:
비장을 2마리의 Balb/c 마우스로부터 수득하였다. 비장을 100 마이크론 필터 상에 두었다. 세포를 PBS로 분해 및 세척하고, 1,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 적혈구 세포를 2 ml의 용해 완충제로 37℃에서 2분 동안 용해시켰다. 세포를 2회 세척하고, 10 ml의 배지에 재현탁하고 카운팅하였다. 미자극 세포의 일부를 직접 냉동시켰다. 나머지 세포를 5 ㎍/ml의 농도의 Con A로 3일 동안, 또는 1 ㎍/ml 농도의 LPS로 3일 동안 자극하였다. 세포를 10% FBS, 항생제 및 글루코스 첨가물을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
루푸스 환자 대 건강한 연령-매치 개체 유래의 B 림프구:
B 세포를, FITC-표지된 항-인간 CD19 항체로 염색함으로써 루푸스 환자 및 건강한 개체의 말초 혈액 단핵 세포로부터 분류하였다. 세포를 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이 MoFLo 고성능 유세포 분석기-MLS 상에서 분류하였다. 세포를 RNA 합성을 위하여 살균 배지 내로 수집하였다.
실시간 PCR을 위한 전체 RNA 단리
세포를 1회 세척하고 Trizol(상표명)(Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)에 두고, 전체 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 단리하였다. 전체 RNA를 RNase가 없는 DNase (GenHunter, Nashville, Tennessee)로 처리하였다. DNase-절단 RNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 하룻밤 침전시켰다. RNA를 75% 에탄올로 세척하고 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켰다. 단리한 RNA를 정량화하고 그의 온전성을 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
실시간 PCR
표준 Taqman 역전사 시약 (Applied Biosystems, Foster City, Cal ifornia)을 사용하여 100 ㎕의 반응 혼합물 중 루푸스 환자 대 건강한 개체의 분류된 B 림프구로부터 전체 RNA (2 ㎍)를 역전사하였다. PCR 반응은 Applied Biosystems로부터의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (master mix)를 사용하여 세팅하였다. CS1 프라이머를 이 믹스에 혼입하여 루푸스 환자 및 건강한 개체의 cDNA에서의 CS1의 발현 수준을 조사하였다. CS1 프라이머는 공개된 서열 (Genbank 등록 번호: XM-001635, AF390894)로부터 디자인하였다. β-액틴 및 18S rRNA 프라이머를 정상화를 위한 대조로 사용하였다. 프라이머는 Applied Biosystems로부터 구매한 Primer Express 소프트웨어를 사용하여 디자인하였다. PCR 증폭 산물은 CS1 프라이머의 경우 85 bp, β-액틴 프라이머의 경우 84bp, 18S rRNA 프라이머의 경우 61 bp였다. 실시간 PCR을, 권고되는 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems로부터의 GeneAmp 5700 SDS 시스템에서 수행하였다.
마우스의 신규한 Ly9의 실시간 PCR:
표준 Taqman 역전사 시약 (Applied Biosystems)을 사용하여 100 ㎕의 반응 혼합물 중의 ConA, LPS 및 미자극 샘플로부터 전체 RNA (2 ㎍)를 역전사하였다. PCR 반응은 Applied Biosystems로부터의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 사용하여 세팅하였다. 마우스의 신규한 Ly9에 특이적인 프라이머를 공개된 서열(Genbank 등록 번호: AF467909)로부터 디자인하고, 이를 상기 믹스에 혼입하여 자극 대 미자극 cDNA 샘플에서의 발현 수준을 조사하였다. 18S rRNA 프라이머를 정상화에 사용하였다. 프라이머는 Applied Biosystems로부터 구매한 Primer Express 소프트웨어를 사용하여 디자인하였다. PCR 증폭 산물은 Ly9 프라이머의 경우 65 bp, 그리고 18S rRNA 프라이머의 경우 61 bp였다. 실시간 PCR을, 권고되는 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems로부터의 GeneAmp 5700 서열 탐지 시스템에서 수행하였다.
마이크로어레이 분석: 샘플 제제, 표지 마이크로칩 및 핑거프린트(fingerprint)
활성화 및 비활성화 백혈구 집단의 발현 프로필을 유전자 칩을 사용하여 결정 및 분석하였다. 통상적인 Affymetrix GeneChip(등록상표) 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 의해 대략 35,000개의 특유한 mRNA 전사체의 조사가 가능해진다.
RNA를 단리하고 유전자 칩 분석을 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다 (본 명세서에 전체 내용이 포함되어 있는 Henshall et al. (2003) Cancer Research 63: 4196-4203; Henshall et al. (2003) Oncogene 22: 6005-12; Glynne, et al. (2000) Nature 403: 672-676; Zhao, et al. (2000) Genes Dev. 14: 981-993 참조).
● 전체 RNA로부터의 Poly A + mRNA의 정제 또는 Qiagen의 RNEASY(등록상표) 키트를 이용한 전체 RNA의 정화 (전체 RNA로부터의 Poly A+ mRNA의 정제)
올리고텍스 현탁물을 37℃로 가열하고 혼합한 직후 RNA에 첨가하였다. 용출 완충제를 70℃에서 인큐베이션하였다. 2 x 결합 완충제는 완충제 중에 침전물이 존재할 경우 65℃에서 가온될 수도 있음을 알기 바란다. 전체 RNA를 DEPC로 처리한 물, 2 x 결합 완충제 및 Oligotex Handbook의 16페이지의 표 2에 따른 올리고텍스와 혼합하였다. 이 혼합물을 65℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
튜브를 14,000 내지 18,000 g에서 2분 동안 원심분리하였다. 원심분리기에 "온건한(soft) 세팅"이 있다면 이것이 사용되어야 함을 알기 바란다. 상청액을 올리고텍스 펠렛을 방해함이 없이 제거하였다. 소량의 용액을 뒤에 남겨 올리고텍스의 손실을 감소시킬 수도 있다. 상청액은 Poly A+ mRNA의 만족스러운 결합 및 용출이 일어났는지를 확신할 때까지 보관하여야 한다.
펠렛을 세척 완충제 OW2에 온화하게 재현탁시키고 스핀 컬럼 상으로 피펫팅하였다. 스핀 컬럼을 전속력으로 (가능할 경우 온건한 세팅) 1분 동안 원심분리하였다. 본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이 원심분리 후 스핀 컬럼을 새로운 수집용 튜브로 옮기고 세척 완충제 OW2에 온화하게 재현탁시키고 재원심분리하였다.
스핀 컬럼을 새로운 튜브로 옮기고 20 내지 100 ㎕의 예비 가열(70℃) 용출 완충제로 용출시켰다. 올리고텍스 수지를 상하로 피펫팅함으로써 온화하게 재현탁시키고 이어서 상기와 같이 원심분리하였다. 용출 절차를 신선한 용출 완충제를 이용하여 반복하였다. 그렇지 않을 경우 적은 용출 부피가 필요하다면 첫번째 용출액만을 사용할 수도 있다.
흡광도는 희석한 용출 완충제를 블랭크(blank)로 사용하여 판독하였다.
● 에탄올 침전
cDNA 합성을 진행하기 전에 mRNA를 침전시켰다. 올리고텍스 정제 절차로부터의 일부의 나머지 성분 또는 용출 완충제 중의 성분은 mRNA의 하류의 효소 반응을 억제할 것이다.
0.4 부피의 7.5 M NH40Ac + 2.5 부피의 냉 100% 에탄올을 용출액에 첨가하였다. 이 용액을 -20℃에서 1시간 내지 하룻밤 (또는 -70℃에서 20-30분) 침전시켰다. 침전 용액을 4℃에서 30분 동안 14,000-16,000 x g에서 원심분리하였다. 펠렛을 0.5 ml의 80% 에탄올(-20℃)로 세척하고 이어서 실온에서 5분 동안 14,000-16,000 x g에서 원심분리하였다. 80% 에탄올 세척을 1회 반복하였다. 펠렛을 후드에서 건조시켰다 (빠른 진공 건조는 하지 말 것). 펠렛을 1 ㎍/㎕ 농도의 DEPC H20에 현탁시켰다.
● Qiagen의 RNeasy 키트를 사용한 전체 RNA의 정화
100 ㎍ 이하의 RNA를 RNeasy 컬럼에 첨가하여야 한다. 샘플 부피는 RNase가 없는 물로 100 ㎕로 조정하고, 350 ㎕의 완충제 RLT, 이어서 250 ㎕의 에탄올(100%)을 샘플에 첨가하였다. 용액을 피펫팅으로 혼합하고 (원심분리하지 말 것) 이어서 샘플을 RNeasy 미니 스핀 컬럼에 적용하였다. 미니 스핀 컬럼을 15초 동안 > 10,000 rpm에서 원심분리하였다. 수율을 우려한다면 플로우쓰루(flowthrough)를 컬럼에 재적용하고 다시 원심분리할 수 있다.
컬럼을 새로운 2-ml의 수집용 튜브로 옮기고 500 ㎕의 완충제 RPE를 첨가하고 > 10,000 rpm에서 15초 동안 원심분리하였다. 플로우쓰루를 버렸다. 500 ㎕의 완충제 RPE를 미니-스핀 컬럼에 다시 첨가하고 > 10,000 rpm에서 15초 동안 원심분리하였다. 플로우쓰루를 다시 버리고, 이어서 최대 속도에서 2분 동안 원심분리하여 컬럼 막을 건조시켰다. 컬럼을 새로운 1.5-ml의 수집용 튜브로 옮기고 30-50 ㎕의 RNase가 없는 물을 컬럼 막 상으로 직접 적용하였다. 컬럼을 > 10,000rpm에서 1분 동안 원심분리하고 용출을 반복하였다.
흡광도를 판독하였다. 필요할 경우 용출액을 아세트산암모늄 및 2.5X 부피의 100% 에탄올로 침전시킬 수도 있다.
Gibco의 "SUPERSCRIP(등록상표) Choice System for cDNA Synthesis" 키트를 사용한 cDNA의 제조
● 제1 가닥 cDNA의 합성
5 ㎍의 전체 RNA 또는 1 ㎍의 PolyA+ mRNA를 출발 물질로 사용하였다. 전체 RNA에 있어서 2 ㎕의 SUPERSCRIPT(등록상표) RT(cDNA 합성용 역전사효소를 포함하는 키트)를 사용하였다(PolyA+ mRNA의 경우 1 ㎕의 SUPERSCRIPT(등록상표) RT를 사 용). 제1 가닥 합성 믹스의 최종 부피는 20 ㎕이어야 한다. RNA는 10 ㎕ 이하의 부피로 존재하여야 한다. RNA를 1 ㎕의 100 pmol T7-T24 올리고와 함께 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 얼음 상에서 4 ㎕의 5X 1st 표준 완충제, 2 ㎕의 0.1 M DTT, 및 1 ㎕의 1O mM dNTP 믹스의 7 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 2분 동안 인큐베이션하고 이어서 SUPERSCRIPT(등록상표) RT를 첨가하였다.
혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
● 제2 가닥 cDNA의 합성
제1 가닥 반응물을 얼음 상에 두었다.
이 혼합물에 하기를 첨가하였다:
91 ㎕의 DEPC H20
30 ㎕의 5X 제2 가닥 완충제
3 ㎕의 1O mM dNTP 믹스
1 ㎕의 10U/㎕의 이. 콜라이 DNA 리가제
4 ㎕의 10U/㎕의 이. 콜라이 DNA 폴리머라제
1 ㎕의 2U/㎕의 RNase H
상기는 2가지 초과의 샘플이 존재할 경우 믹스 내로 제조되어야 한다. 첨가된 혼합물을 16℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
2 ㎕의 T4 DNA 폴리머라제를 첨가하고 16℃에서 5분 동안 더 인큐베이션하였 다. 10 ㎕의 0.5 M EDTA를 첨가하여 반응을 중지시켰다.
● cDNA의 정화
cDNA는 겔 튜브에서 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1) 정제법을 사용하여 정화하였다:
PLG(phase lock gel) 튜브를 최대 속도에서 30초 동안 원심분리하고 새로운 PLG 튜브로 옮겼다. 동일 부피의 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜을 첨가하고 격렬하게 진탕시켰다 (와동시키지 않음). 튜브를 최대 속도에서 5분 동안 원심분리하였다. 상부의 수성 층 용액을 새로운 튜브로 옮겼다. 수성 용액을 7.5X의 5 M NH40ac 및 2.5X 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 에탄올 침전시켰다. 튜브를 실온에서 최대 속도에서 20분 동안 즉시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 펠렛을 냉 80% 에탄올로 2회 세척하였다. 가능한한 많은 에탄올 세척물을 제거하고 이어서 펠렛을 공기 건조시켰다. 펠렛을 3 ㎕의 RNase가 없는 물에 재현탁하였다.
● 시험관내 전사(In vitro Transcription, IVT) 및 바이오틴을 이용한 표지
1.5 ㎕의 cDNA를 얇은 벽의 PCR 튜브 내로 피펫팅하였다. NTP 표지 믹스를 실온에서 PCR 튜브에 첨가하였다.
NTP 표지 믹스:
2 ㎕ T7 1OxATP (75 mM) (Ambion)
2 ㎕ T7 10xGTP (75 mM) (Ambion)
1.5 ㎕ T7 1OxCTP (75 mM) (Ambion)
1.5 ㎕ T7 1OxUTP (75 mM) (Ambion)
3.75 ㎕ 10 mM Bio-11-CTP
0.75 ㎕ 10 mM Bio-16-UTP
2 ㎕ 1Ox T7 전사 완충제 (Ambion)
2 ㎕ 10x T7 효소 믹스 (Ambion)
전체 반응물의 최종 부피는 20 ㎕였다. 튜브를 PCR 기계에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.
IVT 생성물의 RNeasy 정화
절차에 대해서는 상기 참조.
표지된 cRNA를 에탄올 침전시키고 단편화 단계와 상용성인 부피로 재현탁시켰다.
● 단편화
대략 15 ㎍의 표지 RNA를 하기 기술을 이용하여 단편화하였다. 단편화 반응물 부피는 10 ㎕의 부피로 최소화하지만, 혼성화 완충제에서의 마그네슘 침전 문제로 인하여 20 ㎕보다 많게는 하지 않았다.
RNA는 1 x 단편화 완충제에서 94℃에서 35분 동안 인큐베이션함으로써 단편화하였다.
5 x 단편화 완충제:
200 mM 트리스-아세테이트, pH 8.1
500 mM KOAc
150 mM MgOAc
표지된 RNA 전사체를 단편화 전후에 분석하였다. 샘플을 65℃로 15분 동안 가열하고 1% 아가로스/TBE 겔 상에서 전기영동하여 전사체 크기의 범위에 대한 대략적인 아이디어를 얻었다.
● 마이크로칩 어레이
모든 실험에서 사용한 EOS Hu03 마이크로칩 어레이는 인간 게놈의 첫번째 초안에 기초한 공지되거나 FGENESH 예측된 엑손 둘 모두를 포함하여 46,000개의 특유한 서열을 나타내는 59,680개의 프로브 세트를 포함하는 맞추어진 Affymetric GENECHIP (등록상표) 올리고뉴클레오티드 어레이이다. Hu03 프로브 세트는 완벽하게 매치되는 프로브만으로 구성되어 있는데 대부분의 프로브 세트는 6 또는 7개의 프로브를 가진다.
● 마이크로칩 어레이 상에서의 혼성화
200 ㎕(10 ㎍의 cRNA)의 혼성화 믹스를 칩 상으로 피펫팅한다. 다수의 혼성화를 행해야 한다면(예를 들어 5개의 칩 세트를 통한 사이클링) 300 ㎕ 이상의 초기 혼성화 믹스를 제조할 것을 권고한다.
혼성화 믹스: 단편화된 표지 RNA (50 ng/㎕의 최종 농도)
50 pM의 948-b 대조 올리고
1.5 pM BioB
5 pM BioC
25 pM BioD
100 pMCRE
0.1 mg/ml의 청어 정자 DNA
0.5 mg/ml의 아세틸화 BSA
1x MES 혼성화 완충제로 300 ㎕가 되게 함.
혼성화 신호는 피코에리쓰린-콘쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용하여 시각화하였다.
● 유전자 발현 데이타의 정상화
유전자 발현 데이타는 강도의 경험적 누적 분포를 요망되는 γ 분포에 맵핑하기 위하여 역의 γ 함수를 사용하여 각각의 어레이로부터의 프로브-수준 강도 데이타를 고정된 γ-분포에 피팅(fitting)함으로써 정상화하였다. 이 절차는 다른 퍼-칩(per-chip) 정상화 절차, 예를 들어 각각의 칩의 평균 및 SD를 표준 값에 고정하는 것과 유사하되, 단, 이것은 하나 또는 2개의 파라미터보다는 강도의 전체 분포를 고정시킨다는 점에서 보다 엄격하다. 퍼-칩 정상화의 목적은 이것이 비생물학적 인자, 즉, 기술적 노이즈(noise)에 기인한다는 가정 하에 칩간의 변동을 제거하려는 것이다. 분포에 있어서의 스케일 파라미터는 300의 임의 평균 값, 및 0.81의 형상 파라미터를 생성하도록 선택되어 우수한 샘플에서 보여지는 경험적 분포의 전형적인 형성을 재현하였다.
단일한 평균 강도 측정치는 구성 프로브의 강도의 터키 트리민(Tukey's trimean)을 사용하여 각각의 프로브 세트에 대하여 계산하였다. 트리민은 이상치(outlier)의 효과에 대하여 저항성인 중앙 경향의 측정치이다. 마지막으로 배경 차 감을 각각의 평균 강도 측정치에 적용하여 비특이적 혼성화에 대하여 보정하였다. 뒤섞인(scrambled) 서열을 갖는 491개의 프로브 세트로 구성된 "무효(null)" 프로브 세트의 평균 강도 측정치는 칩 상의 다른 프로브 세트 모두로부터 제하였다.
본 발명에서 사용되는 생성물에 대한 지시 매뉴얼은 그의 전체 내용이 본 명세서에 포함되어 있다.
본 발명에서 제공되는 표지 프로토콜
혼성화 반응:
비-바이오티닐화 IVT(RNeasy 컬럼으로 정제)로 출발한다
(조직에서 IVT까지의 단계에 대한 실시예 1 참조)
IVT 안티센스 RNA; 4 ㎍ : ㎕
랜덤 헥사머(1 ㎍/㎕): 4 ㎕
H20: ㎕
총 부피: 14 ㎕
- 70℃에서 10분간 인큐베이션한다. 얼음 상에 둔다.
역전사:
5X의 제1 가닥 (BRL) 완충제: 6 ㎕
0.1 M DTT: 3 ㎕
50X dNTP 믹스: 0.6 ㎕
H20: 2.4 ㎕
Cy3 또는 Cy5 dUTP (1mM): 3 ㎕
SS RT II (BRL): 1 ㎕
총 부피: 16 ㎕
- 혼성화 반응물에 첨가한다.
- 42℃에서 30분간 인큐베이션한다.
- 1 ㎕의 SSII를 첨가하고 추가로 1시간 동안 둔다.
얼음 상에 둔다.
- 50X dNTP 믹스 (25mM의 콜드(cold) dATP, dCTP, 및 dGTP, 1O mM의 dTTP: 25 ㎕의 각각의 100 mM dATP, dCTP, 및 dGTP; 10 ㎕의 100 mM dTTP 내지 15 ㎕의 H20)
RNA 분해:
1.5 ㎕의 1 M NaOH/2 mM EDTA를 첨가하고, 65℃에서 10분간 인큐베이션한다.
H20 86 ㎕
10 N NaOH 10 ㎕
50 mM EDTA 4 ㎕
U-Con 30
500 ㎕의 TE/샘플을 7000 g에서 10분 동안 스핀하고 플로우 쓰루를 정제를 위하여 보관한다.
Qiagen 정제:
- u-con 회수된 물질을 500 ㎕의 완충제 PB에 현탁시킨다.
- 보통의 Qiagen 프로토콜로 진행한다.
DNAse 절단:
- 1 ㎕의 1/100로 희석된 DNAse/30 ㎕의 반응물을 첨가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 95℃에서 5분 동안 효소를 변성시킨다.
샘플 제조:
- 하기를 첨가한다:
Cot-1 DNA: 10 ㎕
50X dNTPs: 1 ㎕
20X SSC: 2.3 ㎕
피로인산나트륨: 7.5 ㎕
10 mg/ml의 청어 정자 DNA를 1/10으로 희석시킨 것 1 ㎕
최종 부피: 21.8 ㎕
- 빠른 진공 하에 건조시킨다.
- 15 ㎕의 H2O에 재현탁시킨다.
- 0.38 ㎕의 10% SDS를 첨가한다.
- 95℃에서 2분간 가열한다.
- 실온에서 20분 동안 서서히 냉각시킨다.
슬라이드 상에 놓고 64℃에서 하룻밤 혼성화한다.
혼성화 후의 세척:
3X SSC/0.03% SDS: 2분. 250ml의 H20 중 37.5 ml의 20X SSC + 0.75 ml의 10% SDS
1X SSC: 5분. 250 ml의 H20 중 12.5 ml의 20X SSC
0.2X SSC: 5분. 250 ml의 H20 중 2.5 ml의 20X SSC
슬라이드를 원심분리기에서 1000 RPM에서 1분 동안 건조시킨다.
적절한 광전자 증폭기 튜브 세팅 및 형광 채널에서 스캐닝한다.
CS1은 백혈구에서는 과다 발현되지만 다양한 유형의 비림프 조직에서는 그렇지 아니하다
CS1의 발현 프로필의 평가를 위하여 백혈구 및 기타 조직으로부터 단리한 mRNA를 실시간 PCR로 분석하였다. 도 2A에 도시되어 있는 바와 같이 mRNA 발현 수준은 대부분의 다른 정상적인 성인의 조직의 수준보다 백혈구에서 훨신 더 높았다. 기저선 수준 이상으로는 CS1 발현을 나타내지 않는 다른 정상적인 성인 조직은 지방, 부신, 대동맥, 대동맥판, 충수, 관상 동맥, 방광, 뼈, 골수, 유방, 기관지, 경부, 뇌, 척수, 횡경막, 자궁 내막, 부고환, 식도, 담낭, 신경절, 심장, 후두, 입술, 간, 폐, 근육, 자궁근층, 미주 신경, 망(omentum), 구강 점막, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두 점막, 태반, 전립선, 망막, 타액선, 피부, 위, 윤활막, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 기관, 탯줄, 요관, 자궁, 질, 또는 정맥을 포함하였다. CS1 mRNA는 결 장(2/11), 신장(1/20), 소장(1/3), 비장, 및 편도선(2/4)의 선택된 샘플에서 발현되었다. 이 결과는 CS1이 백혈구에서 주로 발현되며 자가 면역 질환에 있어서의 우수한 표적임에 틀림없다는 것을 나타낸다.
CS1 발현은 다수의 활성화된 백혈구 집단에서 증가된다
CS1 발현과 백혈구의 활성화 사이의 상관 관계를 평가하기 위하여 CS1 mRNA 발현을 다수의 활성화 및 비활성화 백혈구 집단에서 분석하였다. 도 2B에 도시되어 있는 바와 같이 CS1 발현은 활성화 B 세포, 성숙 DC 세포, 활성화 CD3 세포(낮은 증가 내지는 중간 정도의 증가), 활성화 CD4 세포 (낮은 수준의 증가) 및 활성화 CD8 세포 (공여체에 따라 낮은 증가 내지는 중간 정도의 증가)에서 그의 상응하는 비활성화 대조 집단에 비하여 증가되었다. 이러한 결과는 CS1 과다 발현이 여러 백혈구 서브세트의 활성화와 상관 관계가 있음을 나타낸다.
실시예 3: CS1에 대한 단일클론 항체의 생성을 위한 항원의 제조
클로닝
CS1의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)을 CS1의 세포외 도메인(CS1 ECD)의 측면의 프라이머를 사용하여 Raji 세포로부터 단리하였다. PCR 산물을 겔 정제하고 IgG3의 불변 영역 (인간 Fc-γ3)을 코딩하는 벡터 내로 라이게이션하였다. CS1 ECD-Fcγ3을 포함하는 플라스미드를 대규모로 정제하고 DNA 서열 결정으로 확인하였다.
CS1 ECD-Fcγ3의 안정한 트랜스펙션:
50 ㎍의 CS1 ECD-Fcγ3 플라스미드를 Fsp1 효소로 선형화하고, DNA를 에탄올 에서 침전시키고, 세척하고, 500 ㎕의 살균 PBS에 재현탁하였다. NSO 세포를 냉 PBS로 2회 세척하고, 1 ml의 PBS 당 2 x 107개의 세포로 재현탁하였다. 1 x 107개의 양의 세포를 트랜스펙션에 사용하였다.
500 ㎕의 NSO 세포를 PBS 중 DNA 500 ㎕와 조합하였다. 세포를 BioRad 유전자 펄서 (Gene p㎕ser)로 1.5V 및 3 μF에서 전기 천공하였다. 세포를 100 ml의 DMEM 완전 배지에 첨가하고 이를 10개의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 1 ㎍/ml의 미코페놀릭(Mycophenolic) 선발 배지를 트랜스펙션한지 24시간 후에 첨가하였다. 양성 트랜스펙션체를 10일 후에 스크리닝하고 48-웰 및 24-웰 플레이트 내로 확장시켰다. 양성 트랜스펙션체를 재스크리닝하고 고 생산체를 단백질 정제를 위하여 확장시켰다.
CS1 ECD-Fcγ3 단백질의 정제:
CS1-ECD Fcγ3 융합 단백질을 발현하는 안정한 트랜스펙션체를 글루코스 첨가물을 포함하는 600 ml의 DMEM 완전 배지 내로 5일 동안 확장시켰다. 이 융합 단백질을 단백질 G 세파로스 컬럼 상에서 정제하고 1x PBS에 대하여 투석하였다. 환원 및 비환원 형태의 CS1 ECD-Fcγ3을 쿠마씨(Coomassie)로 분석하였다. CS1 ECD Fcγ3는 항-HuIgG를 사용하여 웨스턴(Western) 블롯으로 또한 분석하고, N-말단의 서열 결정으로 확인하였다. 정제한 CS1-Fc-γ3 융합 단백질을 사용하여 마우스를 면역화하였다.
CS1 ECD-myc-GPI 융합 단백질의 제조:
CS1의 세포외 도메인(ECD)은 CS1의 세포외 도메인의 측면의 프라이머를 사용 하여 Raji 세포로부터 단리하였다. PCR 산물을 겔 정제하고 myc 태그 및 세포 표면 발현을 위한 글리코실 포스파티딜이노시톨 결합체를 발현하는 벡터(myc-GPI 벡터) 내로 라이게이션하였다. CS1 ECD-myc-GPI를 포함하는 플라스미드를 대규모로 정제하고 DNA 서열 결정으로 확인하였다.
CS1 ECD-myc-GPI의 안정한 트랜스펙션:
50 ㎍의 CS1 ECD-myc-GPI 플라스미드를 Fsp1 효소로 선형화하고, DNA를 에탄올에서 침전시키고, 세척하고, 500 ㎕의 살균 PBS에 재현탁하였다. NSO 세포를 냉 PBS로 2회 세척하고, 1 ml의 PBS 당 2 x 108개의 세포로 재현탁하였다. 1 x 108개의 양의 세포를 트랜스펙션에 사용하였다.
500 ㎕의 NSO 세포를 PBS 중 DNA 500 ㎕와 조합하였다. 세포를 BioRad 유전자 펄서로 1.5V 및 3 μF에서 전기 천공하였다. 세포를 1 ㎍/ml의 미코페놀릭 선발 하에 37℃에서 5% CO2에서 배양하고, 후에 96-웰 플레이트 내로 서브클로닝하였다. 양성 트랜스펙션체를 항-myc 항체로 스크리닝하였다. CS1 ECD-myc-GPI 트랜스펙션체의 고 생산체를 시험관내 분석을 위하여 선발 및 확장시켰다.
실시예 3: 항-CS1 단일클론 항체의 제조
인간 CS1의 면역원:
정제된 재조합 인간 CS1 ECD-γ3 융합 단백질을 사용하여 풋패드(footpad)를 통하여 Balb/c 마우스를 면역화하였다 (CS1 ECD는 상기한 CS1의 세포외 도메인을 나타냄). 간략하게는 마우스를 동일 부피의 Ribi 아쥬반트를 포함하며 총 부피가 25 ㎕인 10 ㎍의 단백질로 후방 풋패드에서 면역화하였다. 풋패드 면역화는 4일 또는 5일 간격으로 4회 수행하였다.
a. 세포 융합
CS1 ECD-γ3로 면역화한 2마리의 마우스를 희생시켰다. 무릎 뒤쪽, 대퇴골 및 천골 림프절을 마우스로부터 제거하였다. 림프구를 이 조직으로부터 단리하고, 하이브리도마를 표준 절차로 생성하였다. 간략하게는 하이브리도마를 림프구와 쥐과 골수종 세포주(NSO 세포) 사이의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 1500 매개 융합으로 생성하였다. 융합 세포를 플레이트 당 107개의 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 융합 세포의 선발은 HAT (하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘) 배지를 사용하여 성취하였다.
b. 하이브리도마의 스크리닝
하이브리도마에 의해 분비되는 항체의 특이성은 CS1 발현 세포에의 결합 분석에 기초하여 유세포 분석법(FACS)으로 측정하였다. FACS 분석은 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 표면 CS1 세포외 도메인을 발현하는 안정한 NSO 트랜스펙션체(2 x 105개)를 얼음 상에서 1시간 동안 50 ㎕의 하이브리도마 배양 상청액을 포함하는 50 ㎕의 빙냉 PBS에 재현탁하였다. 광범위한 세척 후 세포를 피코에리쓰린-콘쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG 특이적 항체와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척하고 세포 표면 결합 항체를 Becton Dickinson FACScan을 이용하여 FACS로 검출하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 항체 Luc2, Luc3, Luc15, Luc20, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63, 또는 Luc90은 CS1으로 트랜스펙션시킨 NSO-CS1 세포에 강력하게 결합하였지만 NSO-FcRn에는 그러하지 못하였다. 항-인간 CS1 항체는 K562 및 Daudi 세포(이는 천연 CS1을 발현하는 것으로 알려져 있음)에 결합하였지만 음성 대조 Jurkat 세포에는 그러하지 못하였다. 데이타에 의하면 생성된 항-CS1 항체는 CS1에 특이적으로 결합할 수 있음이 나타났다. 표에는 또한 CS1-γ3 융합 단백질 대 음성 대조 AR-G3 (γ3 융합 단백질)에 대한 Luc 항체의 결합을 (ELISA로) 분석한 것으로부터의 결과가 예시되어 있다. Luc 항체는 CS1-γ3에는 특이적으로 결합하였지만 음성 대조 AR-γ3 융합 단백질에는 그러하지 못하였다.
[표 1]
융합 342로부터 생성되는 항-인간 CS1 MAB
Figure 112005063973850-pct00007
생성된 항- CS1 단일클론 항체의 아미노산 서열
항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 표준 기술을 사용하여 클로닝하였다. 간략하게는, SMART RACE cDNA 증폭 키트(BD Biosciences Clontech)를 이용하여 1-5 x 106개의 세포 유래의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하고 가변 영역은 마우스 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 상보성인 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.
항체 Luc90, Luc63, 및 Luc34의 성숙 중쇄 및 성숙 경쇄의 아미노산 서열이 표 4에 예시되어 있다.
실시예 4: CS1 항체의 특성화
유세포 분석 경쟁 분석법을 사용하여 15종의 상이한 항-CS1 단일클론 항체의 에피토프 특이성을 측정하였다. 표면 CS1을 발현하는 안정한 NSO 트랜스펙션체 (2 x 105개)를, Luc23, Luc29 Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc 63, 및 Luc90의 쌍별(pairwise) 조합을 포함하여 50 ㎕의 항-CS1 항체와 함께 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 이와 동시에 이소타입 대조 항체 (AIP-13)을 음성 대조로 사용하였다. 바이오티닐화 항-CS1 단일클론 항체(Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63, 및 Luc90)를 1 ㎍/ml로 세포/항체 혼합물과 함께 추가로 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후 세포를 피코에리쓰린-콘쥬게이션된 스트렙타비딘과 함께 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 세포 표면 결합 바이오티닐화 항체를 Becton Dickinson FACScan을 사용하여 FACS로 검출하였다.
미표지 항체 Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63, 및 Luc90을 15 ㎍/ml, 3 ㎍/ml, 및 0.6 ㎍/ml의 농도에서 서로와 경쟁하는 능력에 대하여 실험하고 경쟁 또는 차단 항체를 1 ㎍/ml로 첨가하였다. AIP-13을 음성 대조로 사용하였는데, 이는 상기 항체가 CS1에 결합하거나 임의의 Luc 항체와 경쟁하지 않기 때문이다. 바이오티닐화 항체의 형광성 수준(평균 형광 강도(mean flourescence intensity, MFI))가 도면에 도시되어 있다. MFI의 유의한 감소는 바이오티닐화 항-CS1, Mab 대 미표지 항-CS1 Mab에 의한 세포 표면 CS1에 대한 경쟁이 대조 항체의 MFI에 비하여 50% 이상임을 나타낸다.
도 3은 차단 Luc 단일클론 항체를 15 ㎍/ml 및 3 mg/ml의 농도로 사용할 경우 Luc 항체들 사이의 경쟁 분석의 예시적 결과를 도시하고 있다. 경쟁 분석에 의하면 여러 Luc 항체가 독특한 에피토프와 접촉한다는 것이 나타났다. Luc38은 Luc37, 23, 90, 및 63의 에피토프와는 다른 에피토와 접촉한다. Luc63은 Luc37, 23, 90, 및 38의 에피토프와는 다른 별개의 중복되지 않는 에피토프와 접촉한다. Luc90은 Luc37, 23, 63, 및 38의 에피토프와는 다른 상이한 중복되지 않는 에피토프와 접촉한다. Luc23은 Luc90, 63, 및 38의 에피토프와는 다른 또다른 중복되지 않는 에피토프와 접촉한다. Luc37은 Luc90, 63, 및 38이 접촉하는 에피토프와는 다른 추가의 중복되지 않는 에피토프와 접촉한다. Luc63은 Luc34와 중복되는 에피토프와 접촉하며, 반면 Luc90은 Luc34와 중복되는 에피토프와 접촉한다. Luc37은 Luc23의 에피토프와 중복되는 에피토프와 접촉한다. Luc34는 모든 Luc 항체들의 결합을 차단하거나 유의하게 감소시키며, 노출된 넓은 에피토프와 접촉할 수도 있거나 CS1에 대하여 보다 큰 친화도를 가질 수도 있다. Luc37, Luc23, 및 Luc38은 Luc34 항체에 의한 CS1에의 결합을 차단하지 않는다. Luc37, Luc23, 및 Luc38의 에피토프는 CS1 이차 구조 내에 "묻혀(buried)" 있을 수 있거나, CS1에 대한 친화도는 Luc34 항체의 친화도보다 낮을 수 있다.
3종의 단일클론 항체의 상대적인 친화도를 Biacore 분석으로 또한 시험하였다. 인간 CS1-Fc 융합 단백질과 항-인간 CS1 단일클론 마우스 항체인 Luc34.1, 63.2, 및 90H1 사이의 SPRKinetics 측정에 의한 CS1 MAb의 동력학적 분석은 BIAcore 2000(BIAcore, Sweden)을 사용하여 수행하였다. 재생 조건은 상이한 유세포 상으로의 10 000 RU 초과의 각각의 항체의 고정화 및 표면 위의 CS1-Fc의 주입, 이어서 최상의 것이 발견될 때까지 일련의 상이한 완충제의 시험에 의해 각각의 항체로부터의 CS1-Fc의 청소율을 최적화함으로써 확립하였다. pH 2.0의 1O mM 글리신 완충제가 최적의 재생 완충제인 것으로 밝혀졌으며 이를 CS1-Fc 주입 및 완충제 재생의 10회의 사이클에 걸친 그의 재현성에 대하여 즉시 시험하였다. 이 완충제는 항체 표면을 재현할 수 있게 재생하는 데에 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서 pH 2.0의 10 mM 글리신을 CS1-Fc 및 항체 BIAcore 실험을 위한 재생 완충제로 선정하였다.
BIAcore 아민 커플링 시약 (N-에틸-N'-디메틸아미노프로필카르보디이미드, EDC; N-히드록시숙신이미드, NHS; 및 에탄올아민 HCl, pH 8.5)로 연구 등급의 CM5 센서 칩 상에 99.4 RU (응답 단위(response unit)) 내지 133.7 RU 범위의 낮은 응답 단위 (RU)를 갖는 사내(in-house) 제조된 CS1 항체를 고정화하였다. 분석은 실온에서 30 ㎕/분의 유속으로 실행하였다. CS1-Fc의 3분간의 결부 시기에 이어 주행 완충제(running buffer) (1O mM Hepes, 300 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.05% P-20, pH7.4)를 10분간 주입하여 사이클 당 상이한 CS1-Fc의 농도로 각각의 결합 사이클에 있어서의 해리를 모니터링하였다. 재생 표면은 pH 2.0의 1O mM 글리신으로 재생하였다. 각각의 CS1-Fc 및 항체 쌍의 결합 동력학은 BIAevaluate 프로그램을 이용하여 이중의 12가지의 상이한 농도의 CS1-Fc (1024 nM, 512 nM, 256 nM, 128 nM, 64 nM, 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM)로부터 수집된 센서그램(sensorgram) 데이타의 포괄적 분석치로부터 계산하였다. 이중 참조치를 각각의 분석에서 적용하여 참조 표면 및 완충제 단독의 대조로부터의 배경 응답을 제거하였다. 결합 친화도(KD)는 BIAevaluate 소프트웨어로부터의 이가 분석물 모델을 사용하여 분석물 농도 시리즈로부터의 결합 및 해리 상의 센서그램의 동시 피팅(fitting)으로 수득하였다. 실험을 3회 수행하여 데이타의 표준 편차를 연구하였다.
Luc 90.H1, Luc63.2, 및 Luc43.1의 결합 친화도가 도 4에 요약되어 있다. Luc90.H1의 결합 친화도가 3종의 항체 중에서 가장 높았다. Luc90.H1의 결합 친화도는 Luc63.2의 것보다 5.5배, 그리고 Luc34.1의 것보다 28배 더 높다.
항- CS1 항체를 이용한 면역조직학적 염색:
CS1-트랜스펙션된 세포에 있어서 항-CS1 항체를 이용한 면역조직학적 염색을 또한 조사하였다. 10 ㎍/ml의 양의 일차 단일클론 항-CS1 항체를 CS1으로 트랜스펙션된 세포에 첨가하였다. 이어서 이 세포를 혈청으로 차단하고 바이오틴-항-마우스-Ig와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 아비딘-퍼옥시다제를 세포와 혼합하고 AEC(표준 퍼옥시다제 시약)으로 발색시켰다. AEC의 적색은 양성 염색을 나타내며 반면 시험 세포의 핵은 헤마톡실린으로 대비 염색되었다 (청색). 데이타에 의하면 CS1으로 트랜스펙션된 세포는 항-CS1 항체로 양성 염색되었음이 나타났는데, 이는 생성된 항-CS1 항체가 세포 표면에서 발현되는 CS1에 결합할 수 있음을 보여준다 (도 5A). 따라서 항-CS1 항체는 용액 중에서 말초 혈액 세포의 표면 상에서의 발현 탐 지 뿐만 아니라 면역 조직 화학 (IHC)에 의한 탐지 - 이는 조직 절편(예를 들어 환자의 림프절 또는 조직 생검체)의 분석에 일반적으로 사용됨 - 에 있어서도 사용하기에 적합하다.
도 5B에는 2종의 항-CS1 항체, Luc90 및 Luc63을 이용한 염증이 생긴 편도선의 면역조직학적 염색이 도시되어 있다. 도 5B에 있어서의 패널 C 및 D에는 형질 세포 및 상피 세포를 염색하는 CD138을 이용한 염색이 도시되어 있다. 상부 패널 (도 5B, 패널 A 및 B)에는 항-CS1 항체를 이용한 연속 절편 염색이 도시되어 있다. 중복되는 염색 패턴으로부터, CS1 항체가 염증이 생긴 편도선에 있어서 형질 세포를 염색시키는 것이 명백하다.
도 5C에는 항-CS1 Luc63을 이용한, 류마티스성 관절염 환자의 관절로부터의 활액 조직의 면역조직학적 염색이 도시되어 있다. 형질 세포는 CD138을 이용한 염색에 의해 보여지는 바와 같이 활액막에 침윤되어 있다 (우측, 상부 패널). 중복되는 염색 패턴으로부터 (우측 상부 패널과 좌측 상부 패널을 비교), 항-CS1 항체는 류마티스성 관절염 환자의 관절의 형질 세포를 염색시킨다는 것이 명백하다.
CS1 단백질 발현 패턴:
CS1 단백질 발현을 FACS 분석을 통하여 생성된 Luc 항체로 더 조사하였다 (도 6). PBMC는 표준 피콜 하이파크 구배 원심분리 절차로 건강한 개체 및 루푸스 환자로부터 단리하였다. PBMC를 하기 표준 절차에 나타낸 바와 같이 항체로 염색하였다. PBMC의 미국자리공 미토겐 (PWM) 활성화에 있어서, PWM은 1:100으로 희석시켜 PBMC에 첨가하고, 그 후 이를 37℃, 7% CO2에 8일 동안 두었다. PWM-자극 세포를 수확하고 세척한 후 항체 염색을 하였다. 본 발명에서 사용한 마우스 항-CS1 항체는 Luc90(IgG2b), Luc63, Luc38 및 기타 생성된 항-CS1 Luc 항체이다. 이소타입 대조 항체는 이소타입 매칭 마우스 IgG 항체였다.
결과에 의하면 CS1은 활성화 B 세포, CD8+ T 세포 (둘 모두 활성화 및 나이브 세포), NK 세포 (CD3-CD56+), NKT 세포 (CD56+CD3+), CD14+/lo 백혈구 (단구 및/또는 대식 세포), 및 CD4+ T 세포 (시험관내 활성화 세포 상에서 낮은 수준) 상에서 양성 발현됨이 나타났다. CS1은 건강한 성인 및 루푸스 환자 둘 모두로부터 유래된 상기 세포 집단 상에서 발현되었다. 건강한 성인으로부터의 미활성화 CD4+ T 세포, 혈소판, HuVEC, 신장 세포, 기관지 기도 세포, 소기도 세포, 전립선 세포, 간세포, 및 유방 세포 상에서는 유의한 CS1 단백질 발현이 전혀 검출되지 않았다.
활성화 B 세포의 샘플 염색이 도 6에 도시되어 있는데, 여기서 PWM-활성화 PBMC의 염색은 굵은 선으로 나타내어져 있으며, 반면 이소타입 대조 염색 및 미활성화 PBMC는 아래의 (underlaid) 점선으로 나타내어져 있다. CS1 발현 패턴은 중요한데, 이는 치료적 항체가 표적 세포에 주로 결합하며 다른 세포 및 조직, 특히 혈소판에는 결합하지 않는 것이 이상적이기 때문이다. 데이타는 항-CS1 항체가 적합한 치료적 항체 후보임을 시사한다.
실시예 5: CS1 항체의 인간화
본 실시예에는 쥐과 항-CS1 단일클론 항체 Luc63 (mulUC63)의 인간화가 기술 되어 있다. MuLuc63의 인간화는 본질적으로 Queen, C. 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989))의 절차에 따라 실시하였다. 먼저, 각각 MuLuc63 VH 및 VL의 아미노산 서열에 대한 상동성이 큰 인간 VH 및 VL 절편을 동정하였다. 다음, CDR 서열을, CDR의 구조를 유지하는 데에 중요한 뼈대 (framework) 아미노산과 함께 선택된 인간 뼈대 서열 내로 그래프팅하였다. 생성된 인간화 단일클론 항체 (HuLuc63)를 마우스 골수종 세포주 NSO에서 발현시켰다. ELISA 분석에 있어서 인간화 HuLuc63 항체는 70.1 ng/ml의 EC50 값으로 재조합 인간 CS1에 결합하였으며 이는 동일한 분석에서 MuLuc63DP 대하여 측정된 66.1 ng/ml의 EC50 값과 유사하였는데, 이는 HuLuc63이 인간 CS1에 대하여 높은 결합 친화도를 보유한다는 것을 나타낸다.
MuLuc63 가변 영역 cDNA 의 클로닝 및 서열 결정
전체 RNA를 TRIzol 시약 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD)을 사용하여 MuLuc63을 생산하는 대략 5 x 107개의 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 이중 가닥 cDNA는 공급자의 프로토콜에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 합성하였다. 중쇄 및 경쇄에 있어서의 가변 영역 cDNA는 각각 마우스 γ 및 κ 사슬 C 영역에 어닐링하는 3' 프라이머, 및 SMART RACE cDNA 증폭 키트에 제공되어 있는 5' 유니버셜(universal) 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)로 증폭시켰다. VH PCR에 있어서, 3' 프라이머의 서열은 5'-AGCTGGGAAGGTGTGCACAC-3' (서열번호 51)이다. VL PCR에 있어서, 3' 프라이머의 서열은 5'-TTCACTGCCATCAATCTTCC-3' (서열번호 52)이다. VH 및 VL cDNA를 서열 결정을 위하여 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 내로 서브클로닝하였다. DNA 서열 결정은 제조자의 지시에 따라 형광성 디데옥시 사슬 종결자(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 PCR 사이클 서열 결정 반응으로 실시하였다.
4개의 플라스미드 클론을 중쇄 및 경쇄 각각에 대하여 서열 결정하였다. 전형적인 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 상동성인 특유한 서열을 동정하였다. MuLuc63의 중쇄 및 경쇄 V 영역의 cDNA 서열이 추론된 아미노산 서열과 함께 표 5 및 6에 예시되어 있다.
HuLuc63 V 영역의 디자인
항체 V 영역의 인간화는 Queen, C. 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989))에 의해 약술된 바와 같이 실시하였다. 먼저, MuLuc63 가변 영역의 분자 모델을 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD의 도움으로 제작하였다 (Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)). 다음, 인간 항체 cDNA 서열에 대한 상동성 검색에 기초하여, 인간 VH 서열 E55 3-14 (Cuisinier et al, Eur. J. Imm. 23: 110-118 (1993)) 및 J 절편 JH1 (Ravetch, J. V. et al., Cell 27: 583-591 (1981))을 선택하여 HuLuc63 중쇄 가변 영역의 뼈대를 제공하였다. HuLuc63 경쇄 가변 영역에 있어서는 cDNA VL 서열 III-2R (Manheimer-Lory et al, J. Exp. Med. 174: 1639-1652 (1991))을 사용하였다. MuLuc63 VH와 수용체 인간 뼈대 사이의 뼈대 아미노산의 동일성은 81.6% (71/87)였으며, 반면 MuLuc63 VL과 수용체 인간 뼈대 사이의 동일성은 76.3% (61/80)였다.
컴퓨터 모델이 CDR과의 유의한 접촉을 시사한 뼈대 위치에서 MuLuc63 V 영역으로부터의 아미노산은 원래의 인간 뼈대 아미노산으로 대체하였다. 이는 중쇄의 잔기 28, 48, 49, 66 및 68에서 행해졌다 (표 7). 경쇄에 있어서, 대체는 잔기 60에서 행해졌다 (표 8). 여기서 사용되는 넘버링 시스템은 Kabat의 것임을 알아야 한다 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)).
또한, MuLuc63 아미노산 서열의 검사에 의하면 VH 영역의 CDR2에서 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위가 나타났다. 이러한 N-결합 글리코실화 부위는 일반 서열 N-X-T/S (여기서, N = 아스파라긴, X = 임의의 아미노산, 및 S/T= 세린 또는 트레오닌)을 가진다. 가변 도메인에 N-결합 글리코실화가 존재한다는 것은 HuLuc63를 치료 항체로 개발하는 동안 바람직하지 못한 효과를 가질 수 있기 때문에 CDR2(N-Y-T)에서의 잠재적인 글리코실화 부위는 인간화 디자인에서 트레오닌을 알라닌으로 치환하는 돌연변이 (N-Y-A)로 제거하였다.
VH 및 VL에 있어서의 MuLuc63, HuLuc63, 및 인간 수용체 아미노산 서열의 정렬이 각각 표 7 및 8에 예시되어 있다.
HuLuc63 VH 및 VL 유전자의 제작
각각의 HuLuc63 VH 및 VL을 코딩하는 유전자를, 신호 펩티드, 스플라이스 공여 신호, 및 포유류 발현 벡터 내로의 이후의 클로닝을 위한 적절한 제한 효소 부위를 포함하는 미니-엑손으로서 디자인하였다. VH 및 VL 미니-엑손에 있어서의 스플라이스 공여 신호는 각각 상응하는 인간 배선 (germline) JH6 및 JK4 서열에서 유래되었다. HuLuc63 VH 및 VL 미니-엑손에 있어서의 신호 펩티드 서열은 각각 상응하는 MuLuc63 VH 및 VL 서열로부터 유래되었다. Luc63 VH 및 VL 유전자의 뉴클레오티드 서열은 추론 아미노산 서열과 함께 표 5 및 6에 예시되어 있다.
HuLuc63 VH 및 VL 유전자를 길이가 33 내지 43개의 염기 범위인 중복되는 합성 올리고뉴클레오티드의 연장 및 PCR 증폭으로 제작하였다 (Stemmer et al, Gene 164: 49-53 (1995)). HuLuc63 VH 및 VL 유전자의 합성을 위한 올리고뉴클레오티드가 표 9에 열거되어 있다.
PCR-증폭 단편을 Qiaquick PCR 정제 키트 (Qiagen)로 정제하고 MluI 및 XbaI 으로 절단하였다. HuLuc63 VH 유전자를 pHuHCg1.D 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pHuHCg1.D-HuLuc63을 생성하였다. HuLuc63 VL 유전자는 카파 경쇄 발현 벡터 pOKT3.Vk.rg의 유도체인 pHuCkappa.rgpt.dE 내로 서브클로닝하여 (Cole, M. S. et al., J. Immunol. 159: 3613-3621 (1997)) 플라스미드 pHuCkappa.rgpt.dE- HuLuc63을 생성하였다.
HuLuc63 의 발현
HuLuc63 IgG1/κ 항체는 조직 배양 세포의 일시적 트랜스펙션으로 제조하였다. 인간 배아 신장 세포주 293-H (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 10% FBS (HyClone, Logan, UT) 및 비-필수 아미노산 (Invitrogen)을 포함하는 DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD)에서 유지하였다. 293-H 세포를 통상적인 배지(DMEM + 10% FBS + 비-필수 아미노산)를 사용하여 트랜스펙션 전날에 웰 당 1 x 106개의 세포로 6-웰 플레이트에 2.5 ml의 부피로 플레이팅하였다. 트랜스펙션일에 웰 당 4 ㎍의 플라스미드 DNA를 250 ㎕의 Hybridoma-SFM (H-SFM, Invitrogen)에 희석시켰다. 웰 당 10 ㎕의 리포펙타민 2000 시약 (LF2000, Invitrogen)을 250 ㎕의 H-SFM에 희석시켰다. 희석 DNA를 희석 LF2000과 합하고 20분 동안 인큐베이션하여 DNA-LF2000 복합체가 형성되도록 하였다. 500 ㎕의 DNA-LF2000 복합체를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 앞뒤로 기울임으로써 혼합하였다. 세포를 5일 동안 인큐베이션한 후 분석용 상청액을 수확하였다.
HuLuc63의 발현을 샌드위치 ELISA로 측정하였다. Immulon 4 HBX 플레이트 (Thermo Labsystems, Franklin, MA)를 4℃에서 100 ㎕/웰의 0.2 M 소듐 카르보네이트/디카르보네이트 완충제, pH 9.4 중 1.8 ㎍/ml의 염소 항-인간 IgG Fcγ-사슬 특이적 다중클론 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA)로 하룻밤 코팅하고, 세척 완충제 (0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS)로 세척하고, 실온에서 150 ㎕/웰의 TBS 중 SuperBlock 차단 완충제 (Pierce Chemical Company, Rockford, IL)로 30분 동안 차단하였다. 세척 완충제로 세척한 후 HuLuc63을 함유하는 샘플을 ELISA 완충제 (1% BSA 및 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS)로 적절하게 희석시키고 100㎕/웰을 ELISA 플레이트에 적용하였다. 표준물로서, 인간화 항-CD33IgG1/κ 단일클론 항체 HuM195 (Co, M. S. et al., J. hnmunol., 148: 1149-1154 (1992))를 사용하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하고 세척 완충제로 세척한 후, 결합된 항체를 100 ㎕/웰의 1:1000 희석의 HRP-콘쥬게이션된 염소 항-인간 카파 사슬 다중클론 항체 (Southern Biotech, Birmingham, AL)를 사용하여 검출하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 세척 완충제로 세척한 후, 100 ㎕/웰의 ABTS 기질 (KPL, Inc., Gaithersburg, MD)을 첨가하여 발색을 수행하였다. 발색은 100 ㎕/웰의 2% 옥살산을 첨가하여 중지시켰다. 흡광도는 VersaMax 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)를 사용하여 415 nm에서 판독하였다.
MuLuc63 및 HuLuc63 의 결합 특성
MuLuc63 및 HuLuc63의 인간 CS-1에의 친화도는 직접 결합 ELISA로 분석하였다. 96-웰 ELISA 플레이트 (Immulon 4 HBX 플레이트, Thermo Labsystems, Franklin, MA)의 웰을 PBS 중 1 ㎍/ml의 용해성 인간 CS1-인간 Fcγ3 융합 단백질 100 ㎕로 실온에서 하룻밤 코팅하였다. 세척 완충제로 세척한 후 웰을 150 ㎕의 Superblock 차단 완충제로 실온에서 30분 동안 차단하였다. 일시적 발현 HuLuc63 항체 또는 정제 MuLuc63 항체를 ELISA 완충제에서 적절하게 희석시키고 ELISA 플레이트에 적용하였다 (웰 당 100 ㎕). ELISA 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 웰을 세척 완충제로 세척하였다. 이어서 ELISA 완충제 중에 1:1000으로 희석시킨 100 ㎕의 HRP-콘쥬게이션된 염소-항-인간 Cκ 항체 또는 HRP-콘쥬게이션된 염소-항-마우스 Cκ 항체 (둘 모두 Southern Biotech제)를 각각 HuLuC및 MuLuc63 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충제로 세척한 후 100 ㎕의 ABTS 기질 (KPL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발색은 웰 당 100 ㎕의 2% 옥살산의 첨가로 중지시켰다. 흡광도는 VERSAmax 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 415 nm에서 판독하였다. ELISA 결합 실험의 결과가 도 7에 도시되어 있다. MuLuc63 및 HuLuc63은 농도에 의존적인 방식으로 인간 CS-1-Fc γ3에 결합한다. 컴퓨터 소프트웨어 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., SanDiego, CA)을 사용하여 수득되는 HuLuc63의 EC50 값은 70.1 ng/ml이었다. 이는 MuLuc63에 대하여 수득되는 66.1 ng/ml의 EC50 값과 유사한데, 이는 마우스 항-CS1 단일클론 항체 MuLuc63의 인간화가 성공적임을 나타내며, HuLuc63이 인간 CS1에 대한 높은 결합 친화도를 보유한다는 것을 나타낸다. 인간화 Luc63 가변 영역 모델이 도 8에 도시되어 있다.
실시예 6: 자가면역 질병에 있어서의 CS1 의 역할
CS1 은 미자극 세포에 비하여 자극된 T 및 B 세포에서 고도로 발현된다
CS1의 발현의 측정을 위하여, 미국자리공 미토겐 (PWM) 및 피토헤마글루티닌 (PHA) 자극체의 사용에 의해 시험관내 분석을 세팅하여 말초 혈액 B 및 T 림프구를 자극하였다. 미자극 대조 말초 혈액 단핵 세포를 자극 없이 동시에 제조하였다. 표준 기술을 사용하여 상기 샘플로부터 PolyA+ mRNA를 단리하고 cDNA를 합성하였다. CS1-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 CS1 유전자를 PCR로 증폭시키고 (상기 참조) 발현을 Biorad Gel Doc 2000을 이용하여 정량화하였다. 신호 강도는 대조 인간 β-액틴에 대하여 정상화하였다. 실시간 PCR 분석에 의하면 CS1은 미자극 세포에 비하여 활성화된 말초 혈액 B 세포에 있어서 약 23배의 상향 조절, 그리고 활성화된 말초 혈액 T 림프구에 있어서 약 30배의 상향 조절을 보인다는 것이 나타났다 (도 9).
CS1 은 연령이 매치되는 건강한 성인의 말초 혈액 B 림프구에 비하여 루푸스 환자의 말초 혈액 B 림프구에서 상향 조절된다
건강한 개체와 비교하여 루푸스 환자에 있어서의 CS1 발현을 평가하기 위하여, 말초 혈액 B 림프구를, 루푸스 환자 대 건강한 성인 풀로부터의 CD19+ 세포의 세포 분류로 단리하였다. 표준 기술을 이용하여 PolyA+ mRNA를 단리하고 cDNA를 합성하였다. CS1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 CS1 발현을 실시간 PCR로 평가하였다. 실시간 PCR 데이타에 의하면 CS1은 건강한 개체에 비하여 루푸스 환자로부터 유래된 B 림프구에서 약 2배 상향 조절된다. β-액틴을 이용한 정상화시 CS1 유전자는 건강한 개체의 cDNA에 비하여 루푸스 환자의 B 림프구 cDNA에서 2.3배 증가하였다. 18S rRNA 프라이머로 정상화할 경우 CS1은 개개의 cDNA 샘플에서 1.8배 증가하였다 (도 10).
활성화 B 및 활성화 T 세포에 있어서의 마우스의 신규한 Ly9 의 상향 조절:
마우스의 신규한 Ly9은 인간 CS1의 제안된 오르토로그 (orthologue)이다 (Tovar et al., Immunogenetics 54: 394-402 (2002)). 활성화된 B 세포 및 활성화된 T 세포에 있어서의 마우스의 신규한 Ly9의 발현은 실시간 PCR로 조사하였다. 데이타에 의하면 마우스의 신규한 Ly9은 활성화된 B 세포 및 활성화된 T 세포에서 상향 조절됨이 나타났다.
마우스의 신규한 Ly9의 발현은 ABI GeneAmp 5700 서열 탐지 시스템으로 분석하였다 (실시예 2 참조). 18S rRNA 프라이머를 이용한 정상화시 Ly9 유전자는 미자극 비장 cDNA에 비하여 conA-자극 cDNA에 있어서는 3배 증가하였으며, LPS-자극 cDNA에 있어서는 6배 상향 조절되었다.
염증성 장 질환 조직에 있어서의 CS1 의 상향 조절
IBD 조직 (크론병 및 궤양성 대장염 둘 모두) 대 정상 조직에 있어서의 IBD 조정 단백질(들)의 발현을 상기한 바와 같이 마이크로칩 어레이 상에서 측정하였다. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 다수의 조직으로부터 유래되는 cRNA로 심문하였다. 더 구체적으로는 cRNA를 9가지의 IBD 및 9가지의 매치되는 인접하는 정상 장 표본과, 24가지의 결장 상피 샘플로부터 시험관내 전사 분석 (in vitro transcription assays, IVT)으로 생성하였다. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 대한 cRNA의 혼성화를 평균 형광 강도 (AI)로 측정하였는데, 이는 이 유전자의 발현 수준에 직접적으로 비례한다.
데이타는 IBD에서의 유전자 발현 수준을 비-병원성 성인 조직 및 장기와 비교함으로써 분석하였다. 정상 조직에 비하여 염증성 장 질환 조직에서 유전자 발현이 유의하게 증가되는 것으로 동정되는 유전자 중 하나는 CS1이다. 도 11은 마이크로어레이 분석의 대표적인 그래프인데, 이는 CS1 유전자 발현이 건강한 성인 결장 상피 세포에 비하여 궤양성 대장염 및 크론병에서 증가됨을 보여준다. 건강한 개체에 비하여 염증성 장질환 환자에 있어서의 CS1 발현을 추가로 평가하기 위하여, 2명의 크론병 환자 및 3명의 궤양성 대장염 환자로부터의 질환에 걸린 대장 절편 대 3명의 건강한 성인으로부터의 정상적인 대장 샘플을 분해하고, 세척하고 TRIAZOL(등록상표)에 두었다. 전체 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 단리하였다. 전체 RNA를 Rnase가 없는 Dnase (GenHunter)로 처리하였다. Dnase 절단 RNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 하룻밤 침전시켰다. RNA를 75% 에탄올로 세척하고 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켰다. RNA를 정량화하고 RNA의 온전성을 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 실시간 PCR 데이타 (도 12)에 의하면 CS1은 건강한 개체 (n=3)로부터 풀링한 정상 장에 비하여 크론병 환자 (n=2)로부터 유래된 질환에 걸린 대장에서는 7배 및 6배, 그리고 궤양성 대장염 환자 (n=3)로부터 유래된 질환에 걸린 대장에서는 13배, 14배 및 46배 상향 조절된다는 것이 나타났다.
실시예 7: 암세포에서의 CS1 의 발현
CS1 단백질 발현 패턴:
CS1 단백질 발현은 FACS 분석을 통하여 생성된 Luc 항체로 더 조사하였다. 세포주를 항-CS1 Luc90.H1 항체 또는 마우스 IgG2b 이소타입 대조 항체와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척하고 피코에리쓰린 (PE)-콘쥬게이션된 항-마우스-Ig를 세포에 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 FACS Caliber (Becton Dickinson) 상에서의 유세포 분석으로 분석하였다. 도수 분포도가 도 13에 도시되어 있는데, 여기서 Luc90.H1 항체로부터의 신호는 중복된 굵은 선으로 나타내어져 있다. 밑줄 형태의 (underlining) 선은 음성 대조 (미염색 세포, 이차 항체 (일차 항체를 포함하지 않는 항-마우스 Ig-PE) 또는 이소타입 대조 항체)를 포함한다. 상기 데이타는 CS1이 ARH-77 백혈병 세포주, CESS 및 IM9 B 림프양 (lymphoblastoid) 세포주, 및 L363, LP1, 및 OPM2 골수종 세포주에서 발현됨을 보여준다.
다발성 골수종 환자 (n=21, 골수 샘플), MGUS 환자 (의미불명 단일클론 감마병증 (monoclonal gammopathy of unknown significance); n=1), 형질 세포 백혈병 환자 (n=1), 골수로부터 기동된 (mobilized) CD34+ 줄기 세포 (n=5), 정상 골수 세포 (n=3), 정상 림프절 조직 (n=1), 만성 림프성 백혈병 환자 (CLL; n=15), 급성 골수성 백혈병 환자 (AML; n=11), 비호지킨 림프종 환자 (NHL; n=1), 및 호지킨 림프종 환자 (n=1)로부터의 샘플을 CS1 (Luc90 또는 Luc63), CD45-PerCP, CD38-PE, 및/또는 CD138-PE에 대한 FITC 콘쥬게이션된 항체와 함께 인큐베이션하고 골수종 세포의 FACS 분석에 대하여 상기에 상세하게 설명한 바와 같이 진행하였다 (도 14 참조). 본 발명에서 사용되는 마우스 항-CS1 항체는 Luc90 (IgG2b), Luc63 (IgG2a), Luc38 (IgG2b) 및 기타 생성된 항-CS1 Luc 항체이다. 이소타입 대조 항체는 이소타입 매치되는 마우스 IgG 항체였다.
골수 흡인물을 Cleveland Clinic으로부터 다발성 골수종 환자로부터 수득하였다. 골수종 세포주 (LP1, L363, OPM2, NCI-H929, RPMI 8226, 및 U266B1), 백혈병 세포주 ARH-77, B 림프양 주 (IM9, CESS), 및 골수 세포를 표준 염색 프로토콜에 따라 항-CS1 단일클론 항체 대 이소타입 대조 항체 (Becton Dickinson)로 염색하였다. 세포를 세척하고, 염색 완충제 (인간 세포의 경우 RPMI, 10% FBS, 또는 DMEM, 10% FBS)에 두고, 항-CS1 대 이소타입 대조 항체를 백만개의 세포 당 0.5-1 ㎍의 항체로 0.1 ml의 최종 부피로 첨가하였다. 환자 샘플에 있어서는 적혈구 세포를 용해시키고 세포를 원심분리기에서 펠렛화하고 염색 완충제에 재현탁시켰다. FITC에 직접 콘쥬게이션되지 않은 항체에 있어서는 제2 단계의 항체를 백만개의 세포 당 0.5-1 ㎍의 항체로 0.1 ml의 최종 부피로 첨가하였다. 세포를 세척하고 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 Becton Dickinson FACSCaliber 상에서 FACS 분석을 하기 위 한 염색 완충제에 재현탁하였다. 형질 세포의 구분을 위하여 다발성 골수종 골수 세포를 항-CD45, 항-신데칸(syndecan)-1 (CD138), 및 항-CD38 단일클론 항체로 염색하였다. 항-신데칸-1 (CD138)은 형질 세포를 특이적으로 염색시키며 다른 백혈구는 염색시키지 않는다.
결과에 의하면 CS1은 다중 골수종 환자로부터 유래된 형질 세포 (예를 들어 CD138+ 세포) (도 14A-14H), 백혈병 환자 형질 세포로부터 유래되는 형질 세포 (도 14I), 및 여러 골수종 세포주 (L363, LP1, 및 OPM2; 도 13 참조)에서 고도로 발현된다는 것이 나타났다. 다발성 골수종 환자로부터 유래되는 총 21가지의 상이한 골수 샘플을 흐름에 의해 분석하였으며 21가지의 샘플 중 21가지 샘플 모두에 있어서 실질적으로 모든 골수 형질 세포는 CS1을 발현한다. CS1은 ARH-77 백혈병 세포 및 B 림프양 세포주 (IM9 및 CESS)에서도 발현된다 (도 13 참조).
실시예 8 - 골수종 환자로부터 유래되는 형질 세포 상에서의 CS1 의 발현
다발성 골수종 환자로부터 유래되는 골수 샘플을 CD138-PE, CD45PerCP, Luc90-FITC, 및/또는 IgG2b-FITC (이소타입 대조 항체)로 염색하고 상기한 바와 같이 FACS로 분석하였다 (실시예 5 참조). 게이티드 세포는 하기와 같다: 게이트 R1은 림프구를 포함하며 ("R1"), 게이트 R2는 단구를 포함하며 ("R2"), 게이트 R3은 과립구를 포함하며 ("R3"), 게이트 R4는 적혈구 세포를 포함하며 ("R4"), 게이트 R5는 형질 세포를 포함하며 ("R5"), 게이트 R6은 모세포 (blast)를 포함한다 ("R6"). 도 15는 CS1이 다발성 골수종 환자로부터 유래되는 형질 세포 (예를 들어 CD138+ 세포) 상에서 발현된다는 것을 도시하고 있다.
실시예 9: 항- CS1 단일클론 항체는 활성화된 말초 혈액 B 세포에 의한 IgM 분비를 감소시킨다
정상 성인으로부터 유래되는 말초 혈액 단핵 세포를 표준 피콜 구배로 단리하고, 10 ㎍/ml의 미국자리공 (GIBCO/BRL, England, the United Kingdom)과 함께 인큐베이션하고 1 ml의 총 부피로 24-웰 플레이트에 두었다. 단일클론 항체 (마우스항-인간 CS1 (Luc63) 또는 마우스 IgG 이소타입 대조)를 100 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml로 샘플 웰에 첨가하였다. 세포 및 항체를 37℃, 7% CO2에서 8일 동안 인큐베이션하였다. 배양물로부터의 상청액을 단리하고 상기한 바와 같이 IgM을 ELISA로 분석하였다. 도 16에 도시되어 있는 바와 같이, 100 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml의 항체 Luc63 (각각 PwLuc100 및 PwLuc10)은 100 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml의 이소타입 대조 (각각 PwIg100 및 PwIg10)과 함께, 또는 항체 없이 (Pw(-)) 인큐베이션한 세포에 의한 IgM 분비에 비하여 말초 혈액 단핵 세포의 IgM 분비를 감소시켰다.
항- CS1 단일클론 항체는 자가면역 질환 환자의 활성화 말초 혈액 B 세포에 의한 IgM 분비를 감소시킨다:
말초 혈액 단핵 세포의 세포 배양물로부터의 상청액을 상기에 상세하게 설명한 바와 같이 단리하고 ELISA로 분석하였다. Immunolon-1 플레이트를 PBS 중 1 ㎍/ml의 마우스 항-인간 IgM 단일클론 항체 (카탈로그 번호; 05-4900, Zymed Laboratories, Tnc., South San Francisco, California) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 ELISA 완충제 ('EB'= PBS + 0.1% BSA + 0.05% 트윈 20)로 1시간 동안 차단하였다. 배양 상청액을 100 ㎕/웰로 다양한 희석물 (EB 중)로 첨가하였다. 상청 액 및 표준 인간 IgM (카탈로그 번호: 009-000-012, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)을 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 포획된 인간 IgM을 염소 항-인간 IgM-HRP 다중클론 항체 (카탈로그 번호: 2020-05, Southern Biotech Association, Birmingham, Alabama) 및 HRP 기질로 발색시켰다. 결합된 IgM을 표준 ELISA 플레이트 판독기 상에서 분광 광도법 (405 nm OD)으로 시각화하였다. 도 17에 도시되어 있는 바와 같이 루푸스 환자 PBMC의 IgM 분비량은 이소타입 대조에 비하여 항-CS1 항체 (Luc90H1)를 이용한 처리에 의해 감소되었다. 양성 대조 항-CD2 항체 (GLO1)은 IgM 생성의 감소에서 항-CS1이 항-CD2 항체보다 훨씬 더 양호하다는 것을 보여주었다.
항- CS1 단일클론 항체는 건강한 성인 및 자가면역 질환 환자로부터 유래되는 말초 혈액 B 세포에 의한 IgG 생성을 감소시킨다.
건강한 성인 및 자가면역 질환 (루푸스) 환자로부터 유래되는 말초 혈액 B 세포에 의한 IgG 생성을 IgM 생성과 동일한 방식으로 분석하였다. 도 18에 도시되어 있는 바와 같이 항-CS1 항체 (Luc90H.1)로 처리한지 9일 후 건강한 성인의 말초 혈액 단핵 세포에 의한 총 생성량은 IgG2b 이소타입 대조에 비하여 약 23% 감소하였다. 항-CS1 항체 (Luc90H.1)로 처리한지 9일 후 루푸스 환자의 말초 혈액 단핵 세포에 의한 IgG의 총 생성량은 IgG2b 이소타입 대조에 비하여 약 56% 감소하였다. 표 3A 및 B에는 다수의 생성된 항-CS1 항체에 의한 IgG 생성의 억제율이 요약되어 있다. 표 3A에 예시되어 있는 바와 같이 Luc90.H1은 리포폴리사카라이드 또는 미국자리공 미토겐으로 활성화된 PBMC에 의한 IgG 생성량을 약 40% 감소시켰다. Luc34.1은 미국자리공 미토겐으로 활성화된 PBMC에 의한 IgG 생성량을 약 38% 감소시켰다. 표 3B에 예시되어 있는 바와 같이, Luc 90.H1은 건강한 성인 및 성숙 B 세포주 (IM9 세포)의 PBMC의 IgG 생성량을 약 48% 감소시켰다. Luc 34.1은 건강한 성인의 PBMC의 IgG 생성량을 약 53% 감소시켰다. Luc 63.2는 PBMC 및 IM9 세포의 IgG 생성량을 약 47% 감소시켰다. 이러한 실험으로부터, Luc 90H.1, Luc34.1, 및 Luc 63.2가 가장 우수한 기능성 항체임이 명백하다. 에피토프 맵핑에 의하면 Luc90 및 Luc63은 중복되지 않는 에피토프를 가진다.
[표 3A]
시험관내 활성화 B 세포에 의한 Ig 생성량을 감소시키는 항-CS-1
Figure 112005063973850-pct00008
[표 3B]
항-CS-1 항체 패널을 이용한 Ig 생성 분석의 요약
Figure 112005063973850-pct00009
실험 결과에 의하면 항-CS1 항체는 시험관 내에서 말초 혈액 B 세포에 의한 IgG 및 IgM 둘 모두의 생성을 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 10: SCID-HuPBMC 마우스 모델에 있어서의 CS1 단일클론 항체에 의한 IgG의 생체내 감소
SCID-HuPBMC 마우스 모델
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 표준 피콜-파크 (Amersham Biosciences) 밀도 구배로 단리하고 포스페이트 완충 용액 (PBS) 중에 2 X 107개의 PBMC/ml로 재현탁하였다. 재현탁한 PBMC (1 ml)를 C.B-17 SCID 마우스 내로 복강내 주사하였다 (i.p.). PBMC를 주사한지 2 내지 3주 후에 혈청 샘플을 마우스로부터 취하고 ELISA로 인간 IgG에 대하여 분석하였다. 착생된 (Engrafted) 마우스 ( > 1 ㎍/ml의 혈청 중 인간 IgG를 생성)를 처리군으로 랜덤화하고 이어서 마우스 항-인간 CS-1 단일 클론 항체 (Luc90.H1 또는 Luc63.2.22), 마우스 이소타입 대조 항체 (각각 IgG2b 또는 IgG2a), 또는 PBS로 처리하였다. 마우스에 500 ㎕ PBS 중 200 ㎍의 항체를 매 3-4일마다 3 또는 4회의 항체 투여로 투여하였다. 마우스 혈청을 표준 프로토콜을 사용하여 ELISA로 인간 IgG에 대하여 분석하였다.
혈청 인간 IgG에 있어서의 변화 퍼센트는 투여 후 (x일) 인간 IgG 농도로부터 첫번째 항체 투여 이전 (0일)의 인간 IgG 농도를 제하고, 첫번째 투여 이전 (0일)의 인간 IgG 농도로 나누고, 100을 곱함으로써, 예를 들어 [(x일 - 0일) / 0일] X 100으로 각각의 마우스에 대하여 계산하였다. 데이타는 각각의 마우스군에 있어서 평균 변화 퍼센트를 표준 오차와 함께 예시하였다. 인간 IgG 농도는 각각의 마우스군에 있어서의 표준 오차와 함께인 평균 농도이다. 웰치 2 표본 t-검정 (Welch 2 sample t-test)을 이용하여 처리군에 걸친 인간 IgG에 있어서의 변화 퍼센트를 비교하였다.
항-CS1 항체는 생체내에서 인간 IgG의 생성을 감소시킨다
데이타에 의하면 본 발명의 항-CS1 항체는 실질적으로 SCID-HuPBMC 이전(transfer) 모델에서 인간 면역글로불린 생성을 감소시킨다는 것이 나타났다. 도 19A에 도시되어 있는 바와 같이 Luc90.H1은 4일만큼 이른 시기에 (항체의 첫번째 투여로 처리한지 4일 후) 이소타입 대조 및 PBS 중 IgG 생성에 있어서의 증가를 억제하였다. 이러한 감소는 7주 (32일)의 시험 기간 내내 계속되었다. 예를 들어 18일에는 인간 IgG 생성이 IgG2b 이소타입 대조에 있어서는 225%, PBS 대조에 있어서는 181% 증가한 반면, 인간 IgG 생성은 Luc90H.1을 처리하면 14% 감소하였다. Luc90H.1은 대조 군에 있어서 인간 IgG 생성에 있어서의 181-225% 증가를 무효로 할 뿐만 아니라 IgG 생성에 있어서 추가의 14%의 감소로 이어졌다. 25일에는 Luc90H.1은 대조 군에 있어서 인간 IgG 생성에 있어서의 3배 증가를 무효화할 뿐만 아니라 인간 IgG 생성에 있어서 추가로 24% 감소시키기도 하였다.
Luc 63.2는 또한 생체 내에서 IgG 생성을 효과적으로 감소시켰다. 도 19B에 도시되어 있는 바와 같이 Luc63.2는 대조 군 (PBS 및 IgG2a 이소타입 대조)에 있어서 인간 IgG 생성에 있어서의 37-46% 증가를 무효화하였으며 IgG 생성에 있어서 추가의 59% 감소를 일으켰다. 이와 동일한 연구에 있어서 Luc90.H1을 Luc63.2와 비교하였으며 Luc90.H1은 대조 군 (PBS 및 IgG2b 이소타입 대조)에 있어서 37-114% 증가를 무효화하였으며 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 착생된 마우스에 의한 IgG 생성을 추가로 14% 감소시켰다.
도 19C에는 SCIDHuPBMC 모델에 있어서 Luc90 및 Luc63 처리에 의한 Ig 생성의 감소율이 요약되어 있다. 이소타입 및 PBS 대조로 처리한 마우스에 있어서의 IgG 생성 증가는 무효화하는 반면, Luc90은 IgG 생성을 14%, 22%, 24%, 및 39% 추가로 감소시켰으며 Luc63은 추가로 40% 및 59% 감소시켰다. 따라서 본 발명자들은 인간 PBMC로 착생된 SCID 마우스 (SCID-HuPBMC)의 항-Luc 처리에 의해 상기 동물의 혈청에서 보통 관찰되는 인간 면역글로불린의 증가가 완전히 무효화될 뿐만 아니라 처리전 수준에 비하여 추가로 감소시키기도 한다는 것으로 결론을 내릴 수 있었다.
실시예 11: 항-CS1 항체의 ADCC 활성
작동자(effector) 세포의 제조:
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (작동자 세포)를 표준 피콜-파크 (Amersham Biosciences) 구배를 사용하여 전혈로부터 단리하였다. 세포를 세척하고 1% 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충된 RPMI 배지에 재현탁하였다.
표적 세포의 제조:
세포 표면 CS-1을 발현하는 안정한 트랜스펙션 세포 (표적 세포)를 세척하고 1% BSA가 보충된 RPMI에 재현탁하였다. 세포를 100,000개의 세포/웰로 50 ㎕의 총 부피로 플레이팅하였다. 마우스 항-인간 CS-1 단일클론 항체 (Luc90.H1 또는 Luc63.2.22) 또는 이소타입 대조 항체 (각각 마우스 IgG2b 또는 IgG2a)를 다양한 농도로 최종 100 ㎕의 부피로 표적 세포에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후 100 ㎕의 작동자 PBMC를 표적 세포에 20:1의 비로 200 ㎕의 최종 부피로 첨가하였다. 표적 및 작동자 세포를 37℃에서 5시간 동안 또는 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 350 X g에서 5분 동안 원심분리하고 100 ㎕/웰의 상청액을 수집하고 시각적으로 투명한 96-웰의 평평한 바닥의 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다.
락테이트 데히드로게나제 분석:
상청액에 포함된 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 활성의 측정을 위하여 세포 독성 검출 키트 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)로부터의 100 ㎕의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고, 샘플을 15-25℃에서 최대 30분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 기간 동안 마이크로타이터 플레이트를 광으로부터 보 호하였다. 샘플의 흡광도는 ELISA 판독기를 사용하여 490 nm에서 측정하였다.
세포 매개 세포 독성의 퍼센트의 결정을 위하여, 하기 등식을 사용하여 샘플의 평균 흡광도를 계산하고 배경 대조를 제하였다:
Figure 112005063973850-pct00010
실험 대조는 표적 세포 단독 또는 작동자 세포 단독의 자발적인 방출량이었다. 표적 세포는 2% 트리톤-X 100 (1:1) 용액 중에서 분석하였다.
항-CS1 항체는 항체-유도되는 세포 독성 (antibody-derived cytoxicity, ADCC)을 유발한다
실험에 의하면 항-CS1 항체 Luc63.2 및 Luc90은 PBMC의 존재 하에 CS1을 발현하는 세포 (작동자 세포)의 항체-유도되는 세포 독성 (ADCC)을 유발하는 것으로 나타났다. 도 20에 도시되어 있는 바와 같이 Luc90은 투여량-의존적 방식으로 세포 독성을 유발한다. 50 ㎍/ml의 양의 Luc90은 거의 50%의 표적 세포 세포 독성을 유발하였다. Luc63.2는 일반적으로 10-50 ㎍/ml의 용량 범위에서 60-80%의 표적 세포 세포 독성을 유발하였다. 유사한 결과가 추가의 두 공여체에서 행해진 실험으로부터 수득되었다.
실시예 12: 저 푸코스 CS1 항체에서의 ADCC 활성
Luc90 가변 영역 cDNA의 클로닝
쥐과 가변 영역 (서열번호 3 및 4)을 표준 방법으로 Luc90 하이브리도마 세 포주로부터 클로닝하였다. 간략하게는, 공급자의 프로토콜에 따라 SMART 5'-RACE cDNA 증폭 키트 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고 이중 가닥 cDNA를 합성하였다. 가변 영역 cDNA의 PCR 단편을 서열 결정을 위하여 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하였다. 여러 플라스미드 클론에 있어서 각각의 중쇄 및 경쇄의 서열을 결정하였다. 전형적인 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 상동성인 특유한 서열을 동정하였다.
키메라 Luc90 VH 및 VL 발현 벡터의 제작
각각의 Luc90 VH 및 VL을 코딩하는 유전자를 신호 펩티드, 스플라이스 공여 신호, Kozak 개시 서열 및 포유류 발현 벡터 내로의 이후의 클로닝을 위한 적절한 제한 효소 부위를 포함하는 미니-엑손으로서 디자인하였다. 프라이머는 VH 또는 VL 유전자 중 하나를 포함하는 TOPO 벡터로부터 PCR을 위하여 적절한 제한 효소 부위 및 상보성을 포함하도록 디자인하였다. PCR-증폭 단편을 Qiaquick PCR 정제 키트 (Qiagen)로 정제하고 MluI 및 XbaI으로 절단하였다. Luc90 VH 유전자를 pHuHCg1.D (야생형) 또는 pHuHCg1.D.AA (BS 돌연변이체) 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pChiHuHCg1.D-MuLuc90VH 및 pChiHuHCg1.D.AA-MuLuc90VH를 각각 생성하였다. BS 돌연변이체는 IgG1의 CH2 영역에서 2개의 아미노산 변화를 포함하여 (L234A/L235A), Fc 수용체에의 결합이 무효화되어 있다 (Xu et al., (2000) Cell Immunol. 200: 16-26). Luc90 VL 유전자는 pVk 내로 서브클로닝하여 플라스미드 ChiVk-MuLuc90VL을 생성하였다. 단일 플라스미드 발현 벡터를 생성하여 중쇄 및 경쇄 유전자가 단 일 플라스미드로부터 발현될 수 있도록 하였다. 중쇄 벡터를 EcoRI으로 절단하여 전체 중쇄 영역을 제거하고 경쇄 벡터 중의 단일 EcoRI 부위 내로 서브클로닝하였다. BS 돌연변이체의 중쇄는 pChiVk-MuLuc90VL 벡터 단편과 조합하여 플라스미드 pChiLuc90-BSK를 생성하고 반면 야생형 중쇄는 pChiVk-MuLuc90VL 벡터 내로 서브클로닝하여 플라스미드 pChiLuc90-g1K를 생성하였다.
키메라 Luc90의 발현
키메라 Luc90IgG1/κ 야생형 및 BS 항체는 각각 pChiLuc90-g1K 및 pChiLuc90-BSK 벡터를 이용한 Sp2/0 세포의 안정한 트랜스펙션에 의해 제조하였다. 저-푸코스 항체는 pChiLuc90-g1K 벡터를 이용한 YB2/0 세포의 안정한 트랜스펙션에 의해 제조하였다. 양성 클론을 미코페놀산 배지에 대하여 선발하고 ELISA로 스크리닝하였다. 야생형 클론 AH4, BS 돌연변이체 HG12 및 저-푸코스 클론 5E4를, 2%의 저 Ig 소 태아 혈청을 포함하는 Gibco 하이브리도마 무혈청 배지에 적응되는 고 발현에 대하여 선발하였다. 2리터의 배양물을 정제를 위하여 롤러 병에서 배양하였다. 항체는 표준 단백질-G 친화 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 도 21A-C에는 CS1 발현 세포 (안정한 트랜스펙션체 및 인간 다발성 골수종 세포주)를 항-CS1 Luc90 키메라 항체 (야생형 및 푸코스 수준이 감소된 변형 항체 둘 모두)로 처리한 세포 독성 분석에 있어서의 저 푸코스 항체의 영향에 대한 데이타가 도시되어 있다. 항-CS1 Luc90 키메라 항체는 CS1을 발현하는 세포의 항체-의존적 세포 독성을 촉진한다. (도 21A에는 인간 CS1을 발현하는 안정한 세포주의 세포 독성이 도시되어 있으며; 도 21B 및 21C에는 2가지 인간 골수종 세포주, OPM2 (도 21B) 및 L363 (도 21C)의 세포 독성이 도시되어 있음). 각각의 경우에 있어서, 세포 독성은 (상기에 상세하게 설명한 바와 같이 YB2/0 세포에서의 배양을 통하여) 저수준의 푸코스를 갖는 항체에 의해 유의하게 증강된다.
실시예 13: 항-CS1 항체를 이용한 골수종의 처리
생체 내에서 항-CS1 항체를 이용한 처리를 항체를 시험 대상 내로 복강내 주사함으로써 골수종 마우스 종양 모델 상에서 수행하였다. 도 22에 도시되어 있는 바와 같이 항-CS1 항체 처리 (Luc63 및 Luc90)는 이소타입 대조 처리 동물에 비하여 종양 크기를 감소시킨다. 이 연구에 있어서, 1 X 107개의 골수종 세포 (L363 골수종 세포주)를 CB.17 SCID 마우스 내로 i.p. 주사하였다. 2주 후에 종양 크기가 ~80 mm3에 도달했을 때 마우스를 군 당 8마리의 마우스로 4개의 군으로 랜덤화하였다. 마우스를 항-CS1 항체 (Luc63 또는 Luc90) 또는 이소타입 대조 항체 (마우스 IgG2a 또는 마우스 IgG2b)로 처리하였다. 마우스에 마우스 당 200 ㎍의 항체를 8회의 투여 동안 주 당 3회의 투여로 투여하였다. 결과에 의하면 항-CS1 항체로 처리한 마우스는 종양 부피가 이소타입 대조 항체 처리 마우스에 비하여 유의하게 감소되었음이 나타났다. 연구 25일에는 (5회의 투여 후) Luc 63 처리 마우스는 IgG2a 이소타입 대조 항체 처리 마우스 (평균 종양 크기: ~800 mm3)에 비하여 ~100 mm3의 평균 종양 크기를 나타내었다. Luc 90 처리 마우스는 IgG2b 이소타입 대조 항체 처리 마우스 (평균 종양 크기가 ~950 mm3임)에 비하여 ~400 mm3의 평균 종양 크기를 나타낸다. 항-CS1 Luc63으로 처리한 마우스에는 처리 후 최대 2.5주 동안 측정가능 한 종양이 전혀 없었는데, 이는 종양 생성 세포의 제거에서의 이 항체의 두드러진 효능을 가리키는 것이다.
골수종의 추가의 모델 시스템은 형광 표지 또는 미표지 골수종 또는 성숙-B 세포 주, 예를 들어 ARH77, CESS, IM9, L363, LP1 및 OPM2로 뼈 내로 정맥내 (i.v.), 복강내 (i.p.) 또는 직접 주사된 (정통적으로 국소적으로 (orthotopically)) 이식된 SCID 마우스를 포함한다. 상기 주는 골수종 동물 모델 시스템에 있어서 길항자 처리의 효과의 시험을 위하여 사용된다. 상기 세포주는 항-인간 CS1 항체에 의해 인식되는 항원을 발현한다. 동물을 군으로 랜덤화하고 항-인간 CS1 항체 또는 대조 항체 (예를 들어 이소타입 대조 항체)를 이용한 처리 섭생에 처한다. 항체를 여러 투여량 수준, 예를 들어 복강내로 매 3-4일마다 주어지는 총 9-10회의 투여에 있어서 1-10 mg/kg의 용량으로 투여한다. 종양 크기는 각각의 처리군에 있어서 35-40일 동안 매주 2회 측정한다. 골수종의 임상적인 발현이 나타난다. 사망일을 각각의 마우스에 대하여 기록한다.
동물 연구를 항-CS1 항체 처리와 화학요법 사이의 잠재적인 상승 작용의 측정을 위해서 또한 시작한다. 이종 이식 종양을, 이들이 대략 50-100 mm3의 크기에 도달할 때까지 성장시키고, i.v., i.p. 또는 정통적으로 국소적으로 주사된 마우스에 있어서는 암세포가 동물에서 착생되게 한다. 그때에 동물을 군으로 랜덤화하고 항-인간 CS1 항체 또는 대조 항체 (예를 들어 이소타입 대조 항체)를 이용한 처리 섭생에 처한다. 대안적으로는 동물을, 프레드니손 및 멜팔란 또는 기타 알킬화제 (예를 들어 시클로포스파미드 또는 클로람부실)의 조합을 포함하는 표준 화학 요법 제와 조합된 항-인간 CS1 항체 또는 대조 항체 (예를 들어 이소타입 대조 항체)의 처리, 또는 빈크리스틴, 독소루비신 및 고용량의 덱사메타손 (VAD) 처리, 또는 당업계의 숙련자에게 공지된 기타 화학요법 섭생에 처할 수 있다. 항체는 여러 투여량 수준, 예를 들어 매 3-4일마다 복강내로 주어지는 총 9-10회의 투여에 있어서 1-10 mg/kg의 용량으로 투여한다. 화학 요법제는 매 3-4일마다 유효한 농도, 예를 들어 1 mg/kg 또는 당업계의 숙련자에게 공지된 기타 유효 용량으로 복강내로 투여된다. 종양 크기 (예를 들어 s.c. 주사된 동물)은 각각의 처리군에 있어서 35-40일 동안 매주 2회 측정한다. 인간 면역글로불린을 분비하는 세포주 (IM9, CESS, ARH-77, 및 LP-1)를 주사한 마우스에 있어서의 혈청내 면역글로불린을 포함하는 골수종의 임상적인 발현이 나타난다. 화학요법의 존재 및 부재 하에서의 항체의 효능이 평가될 것이다.
상기 실시예는 본 발명의 진정한 범주를 한정하려는 것이 결코 아니며, 오히려 예시적 목적으로 제시됨을 알아야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 출판물, 등록 번호의 서열, 및 특허 출원은, 각각의 개개의 출판물, 등록 번호 또는 특허 출원이 참고로 포함된다는 것을 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내는 바와 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.
[표 2]
서열번호 1
PDL 프라임키(primekey): 433671 DNA 서열
핵산 등록 번호: NM021181
GI:19923571|ref|NM_021181.3| 호모 사피엔스 (Homo sapiens) SLAM 패밀리 멤버 7 (SLAMF7), mRNA
Figure 112005063973850-pct00011
서열번호 2
아미노산 서열 - CS1
GI:19923571|ref|NM_021181.3| 호모 사피엔스 SLAM 패밀리 멤버 7 (SLAMF7)
Figure 112005063973850-pct00012
[표 4]
CS1 항체의 아미노산 서열
Figure 112005063973850-pct00013
[표 5]
항-CS1 Luc63 가변 중쇄 영역의 추정 글리코실화 부위
Figure 112005063973850-pct00014
[표 6]
Luc63 (NYA)의 인간화 - MuLuc63 (서열번호 37), 인간 가변 영역 cDNA (서열번호 30), 인간 JH1 cDNA (서열번호 40), 및 HuLuC63 (서열번호 41)의 VH 영역과, MuLuc63 (서열번호 42), 인간 가변 영역 cDNA (서열번호 43) 및 HuLuC63 (서열번호 44)의 VL 영역의 정렬. HuLuc63 VH의 CDR2는 서열 번호 95이다.
Figure 112005063973850-pct00015
[표 7]
MuLuc63 (서열번호 45), E55 3-14 (서열번호 46), HuLuc63 (서열번호 47)의 VH 영역의 정렬
Figure 112005063973850-pct00016
[표 8]
MuLuc63 (서열번호 48), III-2R (서열번호 49) 및 HuLuc63 (서열번호 50) 항체의 VL 영역의 아미노산 서열의 정렬
Figure 112005063973850-pct00017
[표 9]
HuLuc63 VH 및 VL 유전자의 합성에 사용되는 올리고뉴클레오티드
HuLuc63 VH 유전자
Figure 112005063973850-pct00018
HuLuc63 VL 유전자
Figure 112005063973850-pct00019
SEQUENCE LISTING <110> PDL BioPharma, Inc. <120> THERAPEUTIC USE OF ANTI-CS1 ANTIBODIES <130> 115 US UT01 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2672 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cttccagaga gcaatatggc tggttcccca acatgcctca ccctcatcta tatcctttgg 60 cagctcacag ggtcagcagc ctctggaccc gtgaaagagc tggtcggttc cgttggtggg 120 gccgtgactt tccccctgaa gtccaaagta aagcaagttg actctattgt ctggaccttc 180 aacacaaccc ctcttgtcac catacagcca gaagggggca ctatcatagt gacccaaaat 240 cgtaataggg agagagtaga cttcccagat ggaggctact ccctgaagct cagcaaactg 300 aagaagaatg actcagggat ctactatgtg gggatataca gctcatcact ccagcagccc 360 tccacccagg agtacgtgct gcatgtctac gagcacctgt caaagcctaa agtcaccatg 420 ggtctgcaga gcaataagaa tggcacctgt gtgaccaatc tgacatgctg catggaacat 480 ggggaagagg atgtgattta tacctggaag gccctggggc aagcagccaa tgagtcccat 540 aatgggtcca tcctccccat ctcctggaga tggggagaaa gtgatatgac cttcatctgc 600 gttgccagga accctgtcag cagaaacttc tcaagcccca tccttgccag gaagctctgt 660 gaaggtgctg ctgatgaccc agattcctcc atggtcctcc tgtgtctcct gttggtgccc 720 ctcctgctca gtctctttgt actggggcta tttctttggt ttctgaagag agagagacaa 780 gaagagtaca ttgaagagaa gaagagagtg gacatttgtc gggaaactcc taacatatgc 840 ccccattctg gagagaacac agagtacgac acaatccctc acactaatag aacaatccta 900 aaggaagatc cagcaaatac ggtttactcc actgtggaaa taccgaaaaa gatggaaaat 960 ccccactcac tgctcacgat gccagacaca ccaaggctat ttgcctatga gaatgttatc 1020 tagacagcag tgcactcccc taagtctctg ctcaaaaaaa aaacaattct cggcccaaag 1080 aaaacaatca gaagaattca ctgatttgac tagaaacatc aaggaagaat gaagaacgtt 1140 gacttttttc caggataaat tatctctgat gcttctttag atttaagagt tcataattcc 1200 atccactgct gagaaatctc ctcaaaccca gaaggtttaa tcacttcatc ccaaaaatgg 1260 gattgtgaat gtcagcaaac cataaaaaaa gtgcttagaa gtattcctat agaaatgtaa 1320 atgcaaggtc acacatatta atgacagcct gttgtattaa tgatggctcc aggtcagtgt 1380 ctggagtttc attccatccc agggcttgga tgtaaggatt ataccaagag tcttgctacc 1440 aggagggcaa gaagaccaaa acagacagac aagtccagca gaagcagatg cacctgacaa 1500 aaatggatgt attaattggc tctataaact atgtgcccag cactatgctg agcttacact 1560 aattggtcag acgtgctgtc tgccctcatg aaattggctc caaatgaatg aactactttc 1620 atgagcagtt gtagcaggcc tgaccacaga ttcccagagg gccaggtgtg gatccacagg 1680 acttgaaggt caaagttcac aaagatgaag aatcagggta gctgaccatg tttggcagat 1740 actataatgg agacacagaa gtgtgcatgg cccaaggaca aggacctcca gccaggcttc 1800 atttatgcac ttgtgctgca aaagaaaagt ctaggtttta aggctgtgcc agaacccatc 1860 ccaataaaga gaccgagtct gaagtcacat tgtaaatcta gtgtaggaga cttggagtca 1920 ggcagtgaga ctggtggggc acggggggca gtgggtactt gtaaaccttt aaagatggtt 1980 aattcattca atagatattt attaagaacc tatgcggccc ggcatggtgg ctcacacctg 2040 taatcccagc actttgggag gccaaggtgg gtgggtcatc tgaggtcagg agttcaagac 2100 cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaga tacaaaaatt tgctgagcgt 2160 ggtggtgtgc acctgtaatc ccagctactc gagaggccaa ggcatgagaa tcgcttgaac 2220 ctgggaggtg gaggttgcag tgagctgaga tggcaccact gcactccggc ctaggcaacg 2280 agagcaaaac tccaatacaa acaaacaaac aaacacctgt gctaggtcag tctggcacgt 2340 aagatgaaca tccctaccaa cacagagctc accatctctt atacttaagt gaaaaacatg 2400 gggaagggga aaggggaatg gctgcttttg atatgttccc tgacacatat cttgaatgga 2460 gacctcccta ccaagtgatg aaagtgttga aaaacttaat aacaaatgct tgttgggcaa 2520 gaatgggatt gaggattatc ttctctcaga aaggcattgt gaaggaattg agccagatct 2580 ctctccctac tgcaaaaccc tattgtagta aaaaagtctt ctttactatc ttaataaaac 2640 agatattgtg agattcaaaa aaaaaaaaaa aa 2672 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Trp Gln 1 5 10 15 Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro Val Lys Glu Leu Val Gly Ser 20 25 30 Val Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys Ser Lys Val Lys Gln Val 35 40 45 Asp Ser Ile Val Trp Thr Phe Asn Thr Thr Pro Leu Val Thr Ile Gln 50 55 60 Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Val Thr Gln Asn Arg Asn Arg Glu Arg 65 70 75 80 Val Asp Phe Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys 85 90 95 Lys Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Val Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Gln Pro Ser Thr Gln Glu Tyr Val Leu His Val Tyr Glu His Leu 115 120 125 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10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly 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100 105 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 51 agctgggaag gtgtgcacac 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 52 ttcactgcca tcaatcttcc 20 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 53 tttacgcgtc caccatggat tttgggctga ttt 33 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 54 tttttattgt tgctctttta aaaggggtcc agtgtgaggt 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 55 gcagcttgtc gagtctggag gtggcctggt gcagcctgga 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 56 ggatccctga gactctcctg tgcagcctca ggattcgatt 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 57 ttagtagata ttggatgagt tgggtccggc aggctccagg 40 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 58 gaaagggcta gaatggattg gagaaattaa tccagatagc 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 59 agtacgataa actatgctcc atctctaaag gataaattca 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 60 tcatctccag agacaacgcc aaaaatagcc tgtacctgca 40 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 61 aatgaacagc ctcagagctg aggacacagc cgtttattac 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 62 tgtgcaagac cggacggaaa ctactggtac ttcgatgtct 40 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 63 ggggccaggg gaccctcgtc accgtctcct caggtaagaa 40 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 64 ttttctagag gccattctta cctgaggaga cggt 34 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 65 gacgagggtc ccctggcccc agacatcgaa gtaccagtag 40 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 66 tttccgtccg gtcttgcaca gtaataaacg gctgtgtcct 40 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 67 cagctctgag gctgttcatt tgcaggtaca ggctattttt 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 68 ggcgttgtct ctggagatga tgaatttatc ctttagagat 40 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 69 ggagcatagt ttatcgtact gctatctgga ttaatttctc 40 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 70 caatccattc tagccctttc cctggagcct gccggaccca 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 71 actcatccaa tatctactaa aatcgaatcc tgaggctgca 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 72 caggagagtc tcagggatcc tccaggctgc accaggccac 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 73 ctccagactc gacaagctgc acctcacact ggaccccttt 40 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 74 taaaagagca acaataaaaa aaatcagccc aaaatccatg 40 <210> 75 <211> 43 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 75 tttacgcgtc caccatggag acacattctc aggtctttgt ata 43 <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 76 catgttgctg tggttgtctg gtgttgaagg agacattcag 40 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 77 atgacccagt ctccttcatc actttccgca tcagtaggag 40 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 78 acagagtcac tatcacctgc aaggccagtc aggatgtggg 40 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 79 tattgctgta gcctggtatc aacagaaacc agggaaagta 40 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 80 cctaaactat tgatttactg ggcatccacc cggcacactg 40 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 81 gagtccctga tcgattctca ggcagtggat ctgggacaga 40 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 82 tttcactctc accattagct cactacagcc tgaagacgtg 40 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 83 gcaacttatt actgtcagca atatagcagc tatccataca 40 <210> 84 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 84 cgttcggaca ggggaccaag gtggaaatca aacgtaagtg 40 <210> 85 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 85 ttttctagat taggaaagtg cacttacgtt tgatttccac 40 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 86 cttggtcccc tgtccgaacg tgtatggata gctgctatat 40 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 87 tgctgacagt aataagttgc cacgtcttca ggctgtagtg 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 88 agctaatggt gagagtgaaa tctgtcccag atccactgcc 40 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 89 tgagaatcga tcagggactc cagtgtgccg ggtggatgcc 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 90 cagtaaatca atagtttagg tactttccct ggtttctgtt 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 91 gataccaggc tacagcaata cccacatcct gactggcctt 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 92 gcaggtgata gtgactctgt ctcctactga tgcggaaagt 40 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 93 gatgaaggag actgggtcat ctgaatgtct ccttcaacac 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 94 cagacaacca cagcaacatg tatacaaaga cctgagaatg 40 <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 95 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp

Claims (51)

  1. 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질에 결합하고 다음의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편:
    (i) 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20, 또는
    (ii) 서열 번호 15, 서열 번호 95, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20, 또는
    (iii) 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 14, 또는
    (iv) 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25 및 서열 번호 26.
  2. 제1항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편이 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편이 서열 번호 15, 서열 번호 95, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, VH 영역은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하며, VL 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편이 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, VH 영역은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하고 VL 영역은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, ATCC 수탁번호 PTA-5091을 보유한 하이브리도마로부터 얻을 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편이 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역과 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제1항, 제4항, 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간화된 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, IgG1인 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 작동자 부분(effector moiety) 및 검출가능한 표지 중 하나 이상에 연결된 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 접합체 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 검출가능한 표지에 접합되는 접합체 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 검출가능한 표지는 방사성 화합물, 형광 화합물, 효소, 기질, 에피토프 태그 또는 독소인 접합체 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 검출가능한 표지는 세포독성제인 접합체 화합물.
  17. 제13항에 있어서, 작동자 부분은 검출 부분, 활성화가능한 부분, 화학치료제, 리파제, 항생제, 화학유인성 부분, 면역 조절제 또는 방사성 동위원소인 접합체 화합물.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 다발성 골수종을 치료하기 위한 약학 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 암은 혈장 세포 종양인 항체, 항원 결합 단편 또는 접합체 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 혈장 세포 종양은 다발성 골수종 또는 뼈의 골수종인 항체, 항원 결합 단편 또는 접합체 화합물.
  22. 제19항에 있어서, 암은 비-혈장 세포 암인 항체, 항원 결합 단편 또는 접합체 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 비-혈장 세포 암은 만성 림프구성 백혈병인 항체, 항원 결합 단편 또는 접합체 화합물.
  24. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고점도 증후군을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 자가면역 질환을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환(IBD), 혈소판감소증, 류마티스성 관절염(RA), 자가면역 용혈성 빈혈, 또는 중증 근무력증인 항체, 항원 결합 단편 또는 접합체 화합물.
  27. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 면역억제성 약물 및 면역조절제와 조합하여, 또는 이후 투여하기 위한 골수종을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역조절제와 조합하여, 또는 이후 투여하기 위한 골수종을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  29. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 면역억제성 약물 및 면역조절제와 조합된 골수종을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  30. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역조절제와 조합된 골수종을 치료하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  31. 제18항에 있어서, 하나 이상의 면역억제성 약물 및 면역조절제와 조합하여, 또는 이후 투여하기 위한 약학 조성물.
  32. 제18항에 있어서, 면역조절제와 조합하여, 또는 이후 투여하기 위한 약학 조성물.
  33. 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편을 포함하는 다발성 골수종 치료용 약학 조성물로서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 약학 조성물.
  34. 작동자 부분에 연결된 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편을 포함하는 접합체 화합물을 포함하는 다발성 골수종 치료용 약학 조성물로서, 단일클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질에 결합하는 것인 약학 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 면역글로불린 분비를 억제하는 것인 약학 조성물.
  36. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 인간화된 것인 약학 조성물.
  37. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 상기 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포의 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 유도하는 것인 약학 조성물.
  38. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 상기 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포의 세포독성을 40% 이상 유도하는 것인 약학 조성물.
  39. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 상기 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포의 세포독성을 60% 이상 유도하는 것인 약학 조성물.
  40. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 IgG1인 약학 조성물.
  41. 제33항 또는 제34항에 있어서, 모노클론 항-CS1 항체 또는 항-CS1 항원 결합 단편은 푸코스의 수준이 낮거나 푸코스가 결여되어 있는 것인 약학 조성물.
  42. 제33항 또는 제34항에 있어서, 하나 이상의 면역억제성 약물을 투여하기 전이나 후에 투여하기 위한 약학 조성물.
  43. 제33항 또는 제34항에 있어서, 하나 이상의 면역조절제를 투여하기 전이나 후에 투여하기 위한 약학 조성물.
  44. 제34항에 있어서, 작동자 부분은 세포독성제인 약학 조성물.
  45. 제34항에 있어서, 작동자 부분은 검출 부분, 활성화가능한 부분, 화학치료제, 리파제, 항생제, 화학유인물질, 면역 조절제 또는 방사성 동위원소인 약학 조성물.
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