KR101226499B1 - 며느리배꼽 추출물을 함유하는 항균용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 며느리배꼽 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 피부 상재균 및 기타 세균에 의한 피부질환의 발생을 감소시켜 피부를 보호할 수 있는 항균 효과를 제공할 수 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

며느리배꼽 추출물을 함유하는 항균용 화장료 조성물{Antibacterial cosmetic composition containing Persicaria perfoliata}

본 발명은 며느리배꼽 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 피부 상재균 및 기타 세균에 의한 피부질환의 발생을 감소시켜 피부를 보호할 수 있는 항균 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

최근 미용을 목적으로 한 기능성 천연 소재 개발 연구가 다양하게 이루어지고 있고, 특히 이러한 여러 가지 천연 물질들의 항균, 항산화, 미백, 보습 및 피부노화 억제 효과 등이 과학적으로 입증되면서 이들에 대한 연구가 주목받고 있다.

한편, 여러 종류의 피부 질환은 주로 피부 상재균에 의해서 발생되며 여드름균, 비듬균 등이 대표적이다. 여드름의 발병은 여드름균이 염증 반응을 유발하는 주된 요인으로 보고되고 있으며, 비듬균은 등, 목덜미와 같은 피부에서 이상적으로 증식하여 지루성 피부염을 유발시킨다. 아토피성 피부염의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, 발병 원인균으로서 포도상 구균이 보고되고 있다. 이러한 피부 상재균 및 기타 세균에 의한 피부질환의 발생을 감소시키고 피부를 보호하기 위해 방부제 및 항균제의 사용은 필수적이지만 기존에 사용되고 있는 합성물질들은 피부에 알러지를 유발할 수 있으므로 비교적 인체에 무해한 물질을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 항균 효과를 가진 천연 소재 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다.

며느리배꼽(Persicaria perfoliata)은 원산지가 아시아지역인 마디풀과의 한 종류이다. 며느리배꼽은 전통적으로 해독제, 해열제, 이뇨제 등으로 사용되어 왔으며, 기침이나 백일해 등 호흡기 질환에도 사용되어 왔다. 며느리배꼽 추출물의 주요 성분으로는 퀘르세틴(quercetin), 카페산(caffeic acid) 등이 함유되어 있다고 알려져 있다. 또한 저자들은 이전 연구에서 며느리배꼽의 항산화 효능을 바탕으로 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토한 바 있다. 보고된 논문에서 며느리배꼽 추출물은 자유 라디칼 소거활성, 총 항산화능 및 활성산소에 대항한 세포보호 활성이 매우 크게 나타났고, 피부 미백에 관여하는 티로시나아제에 대한 IC₅₀이 68.10μg/mL(deglycosylated fraction)으로, 이는 피부 미백제로 알려진 알부틴(IC₅₀ 226.88μg/mL) 보다 큰 효과를 갖는 것을 확인하였다.

그러나 며느리배꼽 추출물을 이용하여 피부 상재균에 대한 피부 항균 작용에 대한 연구는 아직 이루어진 바가 없었다.

이에 본 발명자들은 국가연구개발사업(과제고유번호: A092055, 그린코스메틱 연구개발센터)의 일환으로 천연 항균 소재를 개발하고자 하였으며, 며느리배꼽 추출물에 대하여 항균 활성을 측정한 결과 우수한 항균 효과를 제공할 수 있음을 밝혀내어 항균 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 며느리배꼽 추출물을 함유함으로써 항균 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 며느리배꼽 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 며느리배꼽 추출물을 함유하는 조성물은 천연 소재를 사용하여 인체에 무해하면서도 우수한 항균 효과를 제공할 수 있다. 또한 우수한 항균 작용으로 인한 천연 방부제로서의 사용도 기대할 수 있다.

도 1은 며느리배꼽 추출물의 에틸 아세테이트 분획 및 참고 성분의 TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 여기에서 사용한 용리 시스템은 에틸 아세테이트 : 클로로포름 : 포름산 : 물 = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v)이고, ①은 카페산, ②는 퀘르세틴, ③은 에틸 아세테이트 분획, ④는 이소퀘르시트린, ⑤는 퀘르세틴-3-o-글루쿠로니드 및 ⑥은 캠퍼롤을 나타낸다.
도 2는 며느리배꼽 추출물의 탈글리코실화 분획 및 참고 성분의 TLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 여기에서 사용한 용리 시스템은 n-헥산 : 에틸 아세테이트 : 아세트산 = 25 : 14 : 5 (v/v)이고, ①은 캠퍼롤, ②는 퀘르세틴, ③은 에틸 아세테이트 분획, 및 ④는 카페산이다.
도 3은 며느리배꼽 추출물의 에틸 아세테이트 분획의 λ=320nm에서의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 며느리배꼽 추출물의 탈글리코실화 분획의 λ=260nm에서의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 여기에서 1은 카페산, 2는 퀘르세틴이고 3은 캠퍼롤이다.

본 발명은 며느리배꼽 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물 뿐만 아니라 약학 조성물로서도 사용가능하며, 또한 천연 방부제 또는 항균제로서도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 특히 여드름 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 며느리배꼽 추출물은 당업계에 잘 알려진 통상적인 추출 방법에 의해 추출할 수 있으며, 바람직하게는 건조된 며느리배꼽과 용매를 중량으로 1:10~1:20의 비율로 일주일동안 침적시킨 후 여과시켜 추출물을 제조할 수 있다. 또한 사용가능한 용매의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 50% 에탄올을 사용할 수 있으며, 50% 에탄올로 추출한 후 비극성 성분을 제거하고 얻은 에틸아세테이트 분획물을 본 발명의 며느리배꼽 추출물로 사용함이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 사용되는 며느리배꼽 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.25∼1.0중량%의 양으로 함유된다. 며느리배꼽 에틸아세테이트 분획물의 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)를 고려하여 볼 때, 함량이 0.25중량% 미만이면 항균 효과가 충분하지 않고, 1.0중량% 초과이면 함량 증가에 따른 효능의 증가 수준이 미미하다.

본 발명에서 사용되는 며느리배꼽 추출물은 우수한 항균작용이 있어, 피부 상재균 및 기타 세균으로부터 피부를 보호할 수 있다. 또한 이러한 항균작용으로 인하여 천연 방부제 또는 항균제로서도 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물이 피부 외용제 조성물로 사용될 경우에 그 제형은 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양 크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[기기 및 시약]

자외선-가시광선 분광 광도계(UV-visible spectrophotometer)는 Varian(호주)사의 Cary 50, pH 미터는 Istek(Korea)사의 기계를 사용하였고 고성능 액체 크로마토그래피는 Dionex(미국)사의 기계를 사용하였다. pH 표준용액 및 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), 아세트산, 아세토니트릴 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 플라보노이드의 분석에 사용한 박층 크로마토그래피(TLC)는 알루미늄 시트 실리카겔 60 F254(0.2 mm)로 Merck(미국)사에서 구입하였다. 비교물질로 사용한 퀘르세틴, 이소퀘르시트린, 이소비텍신, 아피제닌, 캠퍼롤, 카페산은 Sigma Chemical Co.(미국)에서 구입하였다. 또한 실험에 사용한 며느리배꼽은 2008년 12월 청량리 경동시장에서 구입하여 사용하였다.

[실시예 1] 며느리배꼽의 50% 에탄올 추출물의 제조

건조된 며느리배꼽 500g을 잘게 자른 후 50% 에탄올 5L를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하고 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻었다.

[실시예 2] 며느리배꼽의 에틸 아세테이트 분획물의 제조

건조된 며느리배꼽 500g을 잘게 자른 후 50% 에탄올 5L를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하여 얻은 여액을 감압 농축한 후 물과 n-헥산을 이용하여 클로로필 등의 비극성 성분을 제거하고 이후 에틸 아세테이트 분획물을 감압 농축하여 파우더를 얻었다.

[실시예 3] 탈글리코실화 분획물(아글리콘)의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 에틸 아세테이트 분획물로부터 하기의 방법으로 탈글리코실화 분획물(아글리콘)을 제조하였다.

에틸 아세테이트 분획으로부터 얻은 파우더 일정량(0.1g)에 황산 및 아세톤 용액(황산 : 아세톤 : 증류수 = 0.5 : 5 : 4.5) 10mL을 넣고, 4시간 동안 중탕 가열하면서 환류 냉각시켰다. 환류시킨 용액을 5% KOH-MeOH 용액으로 중화 적정하였다. 중화 적정 후 다시 에틸 아세테이트 층을 분획하고 이를 감압 농축하여 탈글리코실화 분획물(아글리콘 파우더)을 얻었다.

[시험예 1] TLC 및 HPLC를 이용한 며느리배꼽 추출물의 플라보노이드 분석

며느리배꼽 추출물 중 상기 실시예 2의 에틸 아세테이트 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, 실린지 필터(Milipore 0.45μm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. 또한, 상기 실시예 3의 탈글리코실화 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, 실린지 필터(Milipore 0.45μm)를 이용하여 여과하고 이 여액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다.

TLC 분석에서 에틸 아세테이트 분획물의 전개용매는 에틸 아세테이트 : 클로로포름 : 포름산 : 물 = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v)을 사용하여 분석하였고, 탈글리코실화 분획물의 전개용매는 n-헥산 : 에틸 아세테이트 : 아세트산 = 25 : 14 : 5 (v/v)을 사용하여 분석하였다.

성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준물질의 Rf 값과 자외선 및 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다. HPLC 분석은 2% 아세트산 수용액과 0.5% 아세트산을 함유한 50% 아세토니트릴 수용액을 기울기 용리법으로 분리하였고, 에틸 아세테이트 분획물과 탈글리코실화 분획물의 각각의 HPLC 분리조건은 하기 표 1에 나타내었다.

며느리배꼽 추출물의 에틸 아세테이트 분획물과 탈글리코실화 분획물의 HPLC 분리조건

컬럼	Luna 5 μ C18 (L: 250 nm, LD: 4.6 mm)
검출기	UVD 170 s DIONEX
유속	1.0 mL/분
이동상	H2O 내 2 % 아세트산 : 50 % 아세토니트릴 용액 내 0.5 % 아세트산
	에틸 아세테이트 분획에 대하여, (70 : 30 ~ 10 : 90, 구배)
	탈글리코실화 분획에 대하여 (50 : 50 ~ 0 : 100, 구배)

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다. 에틸 아세테이트 분획물과 탈글리코실화 분획물의 TLC를 이용한 성분 분석 결과는 각각 도 1 및 도 2에 나타내었고, HPLC를 이용한 성분 분석 결과는 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 1은 50% 에탄올로 추출한 며느리배꼽 추출물로부터 얻은 에틸 아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램이며, 에틸 아세테이트 분획물은 5개의 띠로 분리되었다. 공통적으로 확인된 5개의 띠들은 자외선 및 발색법, 황산발색으로 확인한 결과, R_f 값이 0.90인 PP1은 캠퍼롤로 나타났고, R_f 값이 0.88인 PP2는 퀘르세틴으로, 0.80인 PP3은 카페산으로, R_f 값이 0.32인 PP4는 이소퀘르시트린으로 그리고 R_f 값이 0.30인 PP5는 퀘르세틴-3-o-글루쿠로니드로 나타났다. 이 중에서도 PP5의 농도가 가장 진한 것으로 나타났다.

도 2는 며느리배꼽 추출물의 에틸 아세테이트 분획물에서 당제거한 탈글리코실화 분획물(아글리콘 분획물)의 TLC 크로마토그램으로서, 띠는 3개로 분리되었다. R_f 값이 0.68인 PPA1은 카페산으로, R_f 값이 0.62인 PPA2는 캠퍼롤로 나타났고, 그리고 농도가 가장 진한 PPA3은 R_f 값이 0.48이며 이것은 퀘르세틴으로 확인되었다.

며느리배꼽 추출물 중 에틸 아세테이트 분획물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도 3을 보면, 크로마토그램은 8개의 피크로 나타났다.

구체적으로 각각의 피크를 동정하기 위하여, 도 1에 있는 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출여과하고 용매를 감압 건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 하여 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과 며느리배꼽 추출물 중 에틸 아세테이트 분획물에 대한 도 1의 TLC(정상(normal phase)) 크로마토그램에서 R_f 값이 가장 큰 띠인 PP1(R_f 0.90)은 도 3의 HPLC(역상(reverse phase)) 피크 7로, PP2(R_f 0.88)는 피크 5로, PP3(R_f 0.80)은 피크 1과 일치함을 확인하였고, PP4(R_f 0.32)는 피크 3으로, PP5(R_f 0.30)는 피크 2로 일치함을 확인하였다. 또한 도 1과 함께 표준물질을 사용하여 피크 6(13.81%)은 아피제닌임을 확인하였다(도 3). HPLC로 밝혀낸 각각의 성분에 대한 정량적인 데이터를 표 2에 정리하여 나타내었다.

며느리배꼽의 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 정량 분석 데이터

번호	유지 시간(분)	피크 이름	부분 mAU (분)	상대 비율 (%)
1	6.79	카페산	43.214	9.45
2	10.47	퀘르세틴-3-o-글루쿠로니드	103.507	22.6
3	11.96	이소퀘르시트린	114.202	24.99
4	20.48	미확인	20.613	4.51
5	31.75	퀘르세틴	35.278	7.72
6	39.28	아피제닌	60.240	13.18
7	40.63	캠퍼롤	62.655	13.71
8	45.7	미확인	17.340	3.79
전체			457.049	100.00

며느리배꼽 추출물 중 탈글리코실화 분획물의 HPLC 크로마토그램은 도 4와 같다. 크로마토그램은 3개의 피크로 나타났다. 구체적으로, 각각의 피크를 통정하기 위하여, 도 2에 있는 TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 긁어서 추출, 여과하고 용매를 감압 건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 하여 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과, 탈글리코실화 분획물에 대한 도 2의 TLC(정상(normal phase)) 크로마토그램에서 R_f 값이 가장 큰 띠인 PPA1(R_f 0.68)은 도 4의 HPLC(역상(reverse phase)) 피크 1(7.33 %)로, PPA2 (R_f 0.58)는 피크 3(76.93 %)으로, PPA3(R_f 0.45)은 피크 2(6.24 %)와 일치함을 확인하였다.

[시험예 2] 며느리배꼽 추출물의 항균 활성 측정

<사용균주>

본 실험에서 균주로는 한국 미생물 보존센터에서 분양 받은 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes(P. acnes) ATCC6919와 호기성 그램 양성(Gram(+)) 균주인 Staphylococcus aureus(S. aureus) ATCC6538, 호기성 그램 음성(Gram(-)) 균주인 Escherichia coli(E. coli) ATCC23736을 사용하였다.

<배지 및 배양조건>

P. acnes의 배양 배지는 레인포스드 클로스트리디얼(Reinforced clostridial, RC) 배지(Merck, 독일)를 사용하였으며 P. acnes는 4℃에서 보관하면서 실험 72시간 전에 활성화시켰고 균을 배양 배지에 접종한 후 무산소 배양통에서 Gaspack system(Merck Anaerocult Gaspack system, 독일)을 이용하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 균주인 S. aureus와 E. coli는 Mueller- Hinton 배지(Merck, 독일)를 사용하였으며 균을 접종한 후 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하면서 사용하였다.

최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)는 한천 확산법(agar diffusion)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 각각의 분획물들을 2mL씩 함유한 배지 20mL를 페트리디쉬에 주입하였고, 시험균을 평판 배지 위에 0.1mL 접종하였다. P. acnes는 37℃에서 72시간 후에, S. aureus와 E. coli는 37℃에서 24시간 후에 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.

모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.

다양한 박테리아에 대한 며느리배꼽 추출물과 분획및 참고물질의 최소억제농도(MIC, %)

균주	며느리배꼽 추출물 (실시예 1)	며느리배꼽 추출물 (실시예 2)	메틸 파라벤	퀘르세틴
E. coli	0.5	0.25	0.13	0.06
P. acnes	0.5	0.25	0.25	0.30
S. aureus	-	0.25	0.25	0.15

상기 표 3을 보면, 여드름균인 P. acnes에 대한 며느리배꼽 추출물 중 실시예 1의 50% 에탄올 추출물의 MIC는 0.5%, 실시예 2의 에틸아세테이트 분획물의 MIC는 0.25%로 나타남을 확인할 수 있다. 이 때 에틸아세테이트 분획물의 경우는 합성 방부제인 메틸 파라벤(0.25%)과 비교하여 항여드름균 활성이 동일한 정도이고, 천연 플라보노이드 성분인 퀘르세틴(0.3%)과 비교하였을 경우 항여드름균 활성이 보다 우수함을 알 수 있다. 이러한 결과는 며느리배꼽 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 여드름에 유효한 소재 및 화장품 개발에 응용가능성이 높음을 시사한다.

또한 여드름 균처럼 특정 세균의 기능이나 생리활동을 약화 또는 억제시키거나 세균자체를 사멸시키기 위한 목적의 항균제 이외에도, 화장품에서는 제품의 변질이나 오염을 막기 위해 다양한 종류의 방부제나 항균제가 사용되고 있다. 일반적으로 세균의 세포막을 파괴하여 세균을 사멸시키는 기작을 응용하여 화장품에 응용되고 있는 방부제나 항균제들은 직접적으로 인체 피부와 접촉하여 반응하게 되므로 인체 피부에 영향을 주지 않는 가능한 한 최소량을 사용하여 최대의 효과를 얻을 수 있는 물질을 선택하여 사용하는 것이 중요하다. 이런 관점에서 살펴보면 본 실험에 대조군으로 사용된 호기성 균주인 S. aureus 와 E. coli에 대한 며느리배꼽 추출물의 항균활성 측정 결과, E. coli 에 대해서는 비교물질인 메틸 파라벤, 퀘르세틴에 비하여 낮은 활성을 나타내었지만, S. aureus에 대한 항균활성은 며느리배꼽 추출물 중 에틸아세테이트 분획물의 MIC는 0.25%로 메틸 파라벤(MIC: 0.25%)과 비교하여 동일한 항균활성을 나타내고 있음을 알 수 있다.

따라서, 현재 사용되고 있는 방부제나 항균제가 평균적으로 0.2 ∼ 0.4% 정도의 농도 범위 내에서 사용하고 있는 것을 감안하면 천연 방부제, 항균제로서의 며느리배꼽 추출물의 역할을 충분히 기대할 수 있다.

Claims (6)

1. 며느리배꼽 추출물을 유효성분으로 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 며느리배꼽 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.25~1.0중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 항균용 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 며느리배꼽 추출물은 50% 에탄올로 추출한 후 비극성 성분을 제거하고 얻은 에틸아세테이트 분획물임을 특징으로 하는 항균용 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 삭제

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