KR101203501B1 - 교란된 막에 결합하는 화합물 및 그 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정상적인 세포막의 구조가 교란된 상태이거나 변형된 세포에, 예컨대 세포자살 진행중인 세포, 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합하는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단 및 치료학적 목적으로 상기 화합물을 의료 실무에 활용하는 방법을 제공한다.
세포자살성 세포, 선택적 결합
Description
본 발명은 정상적인 세포막의 구조가 교란된 상태이거나 변형된 세포, 즉 세포 사멸 진행중인 세포, 세포자살성 세포 또는 활성화된 혈소판에 선택적으로 결합하는 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단 및 치료학적 목적으로 상기 화합물을 의료 실무에 활용하는 방법을 제공한다.
무손상 진핵 세포의 세포막(외막)은 고도로 조직화된 구조로 이루어져 있다. 고도의 막 조직성은 그중에서도 특히 막을 구성하는 특이 지질의 분자 구조, 막을 구성하는 다양한 지질종간의 비율, 막의 외측과 내측 사이의 인지질 분포 및 막 단백질 조성에 의해 결정된다.
고도의 막 조직성 유지는 정상적인 세포 생리현상에 근간이 되지만, 여러 생리학적 및 병리학적 조건하에서는 실질적으로 정상적인 세포막 조직성의 교란 및 변형(PNOM)이 발생되고 있으며, 이는 다수 질환들에서 나타난다. 이러한 변형 및 교란은 형태학적인 수준(세포자살중인 세포에서 발견되는 막 수포화(blebbing))과 분자적 수준 모두에서 확인할 수 있다. PNOM는 특히 아미노포스포리피드, 정상적으로는 세포 이중막의 내측에 거의 국한되어 있는 주로 포스파티딜세린(PS) 및 포 스파티딜에탄올아민(PE)의 세포 표면으로의 이동과, 막의 외측에서 내측으로의 스핑고마이엘린(SM) 및 포스파티딜콜린(PC)의 상호 이동을 이용한, 막 인지질의 뒤섞기(scrambling) 및 재분포를 포함한다. 이러한 재분포는 본원에서 세포막의 지질 비대칭성(cell membrane lipid asymmetry, CMLA)의 소실로 언급한다. PNOM는 CMLA 소실 뿐만 아니라, 막내 인지질 함유율(packing level) 감소 및 막 유동성(fluidity) 증가와 관련있다.
이러한 변형은 세포 표면이 여러가지 응혈 인자 복합체, 예컨대 테나제(tenase) 및 프로트롬비나제 단백질 복합체의 조합에 촉매적 기반을 제공하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, 혈소판 활성화는 PNOM 상태의 혈소판 막과 연관되며, 이러한 변형은 정상적인 혈액 응고 뿐만 아니라 수많은 질환들에서의 비정상적인 혈액 과다 응고의 개시 및/또는 확대에 있어서, 중요한 인자를 구성한다. 상기 질환으로는, 특히 동맥 또는 정맥 혈전증이나 혈전 색전증(예, 뇌졸증, 심근 경색, 심부 정맥 혈전증(DVT), 파종성 혈관내 응고증(DIC), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 등), 불안정 동맥 경화반, 겸상 적혈구 질환, 베타-지중해 빈혈, 항-인지질 항체 증후군(특히 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)) 및 막 미세입자의 탈피(shedding) 관련 질환, 예컨대 심폐 바이패스(cardiopulmonary bypass)와 관련된 신경학적 장애가 있다.
세포자살은 세포막의 변형/교란을 발생시키는 또다른 주된 현상이다. 세포자살은 세포 고유의 자가-파괴 또는 "자살" 프로그램으로, 모든 진핵 세포에 내재되어 있다. 촉발성 자극에 대한 반응으로, 세포는 세포 수축(cell shrinkage), 세 포막의 수포화(blebbing of cell membrane), 염색질 응축 및 단편화, 세포의 막-결합성 입자 클러스터로의 변환 종결(아포토우시스체(apoptotic body))로 진행되며, 이후 대식세포에 의해 포식된다. PNOM은 세포자살의 보편적인 현상으로, 세포자살 발생 초기에, 아마도 세포가 사멸 과정으로 넘어가는 시점에 발생하며, 대식세포에 의한 인지 및 세포자살 세포의 제거에 중요한 인자인 것으로 확인되었다.
PNOM과 세포자살 세포의 강력한 응고 활성간의 밀접한 관련성이 최근 제시되고 있다. 동맥경화반에서 발생되는 PNOM와 같은 세포자살성 내피 세포에서의 PNOM은, 혈전성 혈관 질환 발병에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
세포자살 또는 혈전증은 각각의 의학적 장애 대부분에서 주된 역할을 수행하므로, 이러한 생물학적 과정을 검출하고 관련 세포를 표적화하는 방법이 있는 것이 바람직하다. PNOM-막에 선택적으로 결합하여 이후 이러한 PNOM-막을 가지는 세포(PNOM-세포)내로 잠재적으로 도입될 가능성이 있는 화합물은, 따라서 손상 또는 사멸 과정, 특히 세포자살에 의한 손상 또는 사멸 과정이 진행중인 세포나 또는 활성화중인 혈소판을 검출하고 이미지화 물질 또는 약물을 표적화하기 위한 중요한 수단으로 제공할 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 측면은 PNOM 진행중인 세포(PNOM-세포)에 선택적으로 결합하지만 정상적인 세포막 조직성을 유지하고 있으며, 본원에서 "정상 세포"로 정의한 세포에는 보다 낮은 수준으로 결합하는 화합물을 제공한다. 본 발명의 일 예에서, PNOM-세포는 사멸 과정중인 세포이다. 본 발명의 예에서, 세포는 세포자살성 세포이고, 다른 예에서, 세포는 활성화된 혈소판일 수 있다. 또한, 본 발명은 PNOM-세포에 선택적으로 결합하는 이러한 화합물을 이용함으로써 PNOM-세포를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 예에서, 화합물은 식I-XIV에 나타낸 구조로 표시되는 화합물을 제공한다.
용어 "교란된 막에 결합하는 화합물(PMBC)"은 PNOM-세포를 선택적으로 표적하며, 정상 세포에는 낮은 수준으로 결합하는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 있어서, PMBC의 PNOM-세포 결합력은 정상 세포에 대한 결합력에 적어도 30% 이상이어야 한다.
용어 "선택적으로 표적화하는(selective targeting)"는 본 발명에서 화합물과 PNOM-세포와의 선택적 결합, 즉 정상 세포과의 결합에 비해 적어도 30% 이상의 수준으로의 PNOM-세포 결합성을 지칭한다.
용어 "진단학적인 교란된 막에 결합하는 화합물(진단학적 PMBC)"은 PMBC-세포를 선택적으로 표적화할 수 있는 화합물을 지칭하며, 화합물은 마커를 포함하거나 마커에 연결되어 있으며, 상기 마커는 당업자에게 공지된 방법으로 검출가능하다.
용어 "치료학적인 교란된 막에 결합하는 화합물(치료학적 PMBC)"은 전술한 바와 같이 질병 치료에 유용한 약물을 포함하는 PMBC를 지칭한다.
용어 "고형 지지체"는 본 발명에서 고형 기질, 불용성 기질 또는 불용성 지지체를 의미한다. 본 발명에 따른 고형 지지체는 미세-입자, 미세-필터 또는 미세-모세관의 스텍(stack)과 같은 여러가지 구조로 형성할 수 있다.
본 발명의 일 예에서는 PNMO-세포를 선택적으로 표적화하기 위한 물질 제조에 PMBC를 사용한다.
일 측면에서, 본 발명은 PNOM-세포(즉, PMBC)를 선택적으로 표적하는, 하기 식I로 표시되는 화합물, 약리학적으로 허용가능한 그의 염, 그의 금속 킬레이트, 그의 용매화물, 그의 수화물, 상기 염의 용매화물 또는 상기 염의 수화물을 제공하며,
(식I)
상기 식I에서,
R 및 R'기는 각각 독립적으로, 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴이나 헤테로아릴, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
n 및 m은 각각 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이며;
n 및 m은 동일하거나 상이할 수 있으며;
M은 존재하지 않거나, 수소, -0-, -S- 및 -N(U) 중에서 선택되며;
U는 수소이거나, C1, C2, C3 또는 C4의 알킬이며;
x 및 z는 각각 독립적으로, 0, 1 또는 2의 정수이고, x와 z는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며;
y는 0, 1 또는 2의 정수이고, y가 2일때 치환기 R'은 각 경우에 동일하거나 상이할 수 있으며;
D는 진단용 마커, 수소, 하이드록실 또는 약물이며;
상기 진단용 마커는 F와 같은 이미지화를 위한 마커 중에서 선택되며, F 원자는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며;
이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 PNOM 세포에 표적화되는 약물이다.
약물은 특정 질환의 예방, 완화 또는 치료용으로 의학적으로 유용한 물질일 수 있으며, 예컨대, 비제한적으로, 세포자살 저해자(예, 카스파제 저해자, 항산화제, Bcl-2 시스템의 모듈레이터); 세포 사멸 활성자(예, 항암제); 또는 항응고제, 항혈전제 또는 혈전 용해제일 수 있는 혈액 응고 모듈레이터가 있다. 이러한 예에서, 약물은 바람직하기로는 항혈소판 물질, 헤파린, 저분자량의 헤파린, 당단백질 IIb/IIIa의 길항제, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 혈전 저해제나 인자 Xa 저해제와 같은 응고 인자 저해제, 또는 항염증 약제 또는 면역 조절성 약제들 중에서 선택된다. 본 발명의 일 예에서, 종양내에서 자발적으로 또는 치료에 대한 반응으로 세포자살이 이루어지는 부위로 약물을 표적화함으로써, 항암제를 종양에 표적화함에 의한 항암 치료법의 개선 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 예에서, 응고를 예방, 감소 또는 중지시키기 위해, 혈전에 항응고제를 표적화하는 혈전증 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, D는 고형 지지체일 수 있다.
본 발명의 다른 예로, 하기 식II의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식II의 구조로 표시되며, PNOM 세포를 선택적으로 표적화하는 화합물을 제공하며;
(식II)
상기 식II에서,
R은 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원이나 2원의 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이며;
n 및 m은 각각 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
n 및 m은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
M은 무존재하거나, 또는 수소, -0-, -S- 및 -N(U) 중에서 선택되며;
U는 무존재하거나, 또는 수소, C1, C2, C3, 또는 C4의 알킬이며;
D는 수소 또는 진단용 마커이다.
본 발명의 일 예에서, 진단용 마커는 F와 같은 이미지화를 위한 마커일 수 있으며, 상기 F는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며; 이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 PNOM 세포에 표적화되는 약물이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식III의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식III의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식III)
상기 식III에서,
R3은 하이드록실 또는 F이고;
R4는 C4, C5, C6, C7, C8, C9 또는 C10의 선형 또는 분지형의 알킬이고; 및
k는 0, 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택되는 정수이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식IV의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식IV의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 NST200으로 지칭된다.
(식IV)
다른 예에서, 본 발명은 하기 식V의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식V의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식V)
상기 식V에서,
J는 -F이거나 -OH이고; 및
r은 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다.
r이 4이고 J가 -F인 경우, 화합물은 NST2O1로 지칭된다. r이 5이고 J가 -F인 화합물은 NST-ML-l0로 지칭된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VI의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VI의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VI)
상기 식VI에서,
J는 수소, -F 및 -OH 중에서 선택된다.
J가 -F인 화합물은 NST205로 지칭된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VII)
상기 식VII에서,
Q는 테크네튬, 옥소-테크네튬, 레늄 및 옥소-레늄 중에서 선택되며;
R4는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, 및 C6의 선형 또는 분지형의 알킬이며; 및
p는 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택된 정수이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VIII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VIII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VIII)
상기 식VIII에서,
Q는 테크네튬, 옥소-테크네튬, 레늄 및 옥소-레늄 중에서 선택된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식IX의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식IX의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식IX)
상기 식IX에서,
R5는 수소, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 알킬, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 및 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬 중에서 선택되며;
q는 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택된 정수이며; 및
Y는 형광 마커이다. 본 발명의 예에서, Y는 단실-아민기 및 플루오레세인 중에서 선택된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식X의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식X의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 NST203으로 지칭된다.
(식X)
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XI의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XI의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XI)
상기 식XI에서,
R는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XII)
상기 식XII에서,
F는 18F 또는 19F일 수 있다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XIII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XIII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XIII)
상기 식XIII에서,
R는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이며;
m은 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이고;
D는 본 발명의 일예로 F와 같은 이미지화를 위한 마커일 수 있는 진단용 마커로, 상기 F는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며; 이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 전술한 바와 같이, PNOM 세포에 표적화되는 약물이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XIV의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XIV의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XIV)
상기 식XIV에서,
F는 18F 또는 19F일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 환자의 세포자살 또는 혈액 응고 부위에 약물을 표적화하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 환자는 인간이거나 또는 인간을 제외한 포유류일 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 식I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, Xl XII, XIII, 또는 XIV의 구조로 표시되는 화합물을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함하거나 또는 약물에 연결되어있다.
본 발명의 일 측면은 세포 집락내 PNOM 세포로 의학적으로 유용한 화합물을 선택적으로 표적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV중 어느 하나로 기재된 구조로 표시되는 화합물을 세포 집락에 접촉시켜, 세포 집락내 PNOM 세포로 의학적으로 유용한 화합물을 선택적으로 표적화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, (i) 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV 중 어느 하나로 기재된 구조로 표시되는 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 금속 킬레이트, 용매화물, 수화물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 세포 집락에 접촉시키는 단계, 및 (ii) 세포에 결합된 화합물의 양을 결정하여, 세포에 유의 양의 화합물이 결합한 경우 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 세포 집락내 PNOM-세포를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, (i) 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV 중 어느 하나로 기재된 구조로 표시되는 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 금속 킬레이트, 용매화물, 수화물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 환자나 동물에게 투여하는 단계, 및 (ii) 세포에 결합된 화합물의 양을 결정하기 위해 실험 환자 또는 동물을 촬영하여, 세포에 유의 양의 화합물이 결합한 경우 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 환자나 동물에서 PNOM-세포를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV의 구조에 따른 화합물을 포함하며, 상기 화합물은 약물을 포함하거나 또는 약물에 연결되어있는 것을 특징으로 하는, 환자 또는 동물에서 세포자살 부위나 응혈 부위의 활성화된 혈소판으로 약물을 표적화하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 (i) 하기 식I로 표시되는 화합물, 약리학적으로 허용가능한 그의 염, 그의 금속 킬레이트, 그의 용매화물, 그의 수화물, 상기 염의 용매화물 또는 상기 염의 수화물이나, 또는 이를 포함하는 접합체를 실험 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 환자의 실험 종양에 결합된 화합물의 양을 결정하여, 종양내 세포에 유의 양의 화합물이 결합한 경우 상기 종양 세포는 사멸 과정 진행중인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 실험 대상의 종양내에서 사멸 과정 진행중인 세포를 검출하는 방법을 제공한다:
(식I)
상기 식I에서,
R 및 R'기 중 어느 하나는 수소이고, 다른 하나는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴이나 헤테로아릴, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군이며;
n 및 m은 각각 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이며;
n 및 m은 동일하거나 상이할 수 있으며;
M은 무존재하거나, 또는 수소, -0-, -S- 및 -N(U) 중에서 선택되며;
U는 수소이거나, C1, C2, C3 또는 C4의 알킬이며;
x 및 z는 각각 독립적으로, 0, 1 또는 2의 정수이고, x와 z는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며;
y는 0, 1 또는 2의 정수이고, y가 2일때 치환기 R'은 각 경우에 동일하거나 상이할 수 있으며;
D는 진단용 마커이다.
진단용 마커는 본 발명의 일예에서, F와 같은 이미지화를 위한 마커일 수 있으며, F는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며, 이미지화를 위한 마커는 형광 표지, 방사능-표지, X-레이용 마커, MRI를 위한 마커, PET 스캔을 위한 마커 및 검출가능한 색을 발현시키는 효소학적 반응을 형성할 수 있는 표지물을 포함하는 군 중에서 선택된다.
다른 예에서, 본 발명은 (i) 이미지화를 위한 마커 또는 표지된 금속 킬레이트를 포함하거나 또는 이에 연결된, 하기 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV로 기재된 구조에 따른 화합물을, 실험 대상에게 투여하는 단계; 및 (ii) 종양내 세포에 결합된 화합물의 양을 결정하여, 종양내 세포에 결합된 화합물의 양이 현저하게 검출되는 경우 상기 종양 세포는 사멸 과정 진행중인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 실험 대상의 종양내에서 사멸 과정 진행중인 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 세포독성 약물을 포함하거나 세포독성 약물에 연결되어 있는, 하기 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV로 기재된 구조에 따른 화합물을, 투여하여, 종양내의 세포 사멸 부위로의 약물 표적화를 실현시키는 단계를 포함하는, 항암제를 세포자살 세포 부위가 있는 종양으로 표적화하는 방법을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 항응고제 또는 섬유소 분해성 물질을 포함하는, 하기 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV로 기재된 구조에 따른 화합물을, 투여하여, 응혈 부위로의 약물의 표적화를 실현시키는 단계를 포함하는, 항응고제나 섬유소 분해제를 응혈 부위로에 표적화하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 정상적인 세포막 조직성을 유지하는 세포에 낮은 수준으로 결합하지만 PNOM 중인 세포(PNOM-세포)에 선택적인 결합을 수행할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 상기 PNOM-세포는 사멸 진행중인 세포, 세포자살성 세포 및 활성화된 혈소판 중에서 선택된다. 또한, 본 발명은 PNOM-세포에 선택적으로 결합하는 화합물을 이용하는, PNOM-세포 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 PNOM-세포에 대한 선택적인 표적화 수행에 활성인 이점을 가지며, 또한 비교적 저분자량을 가지며, 잠재적으로 이로운 약물동역학적 프로파일을 가진다.
본 발명의 일 예는 PNOM-세포(즉, PMBC)를 선택적으로 표적하는, 하기 식I로 표시되는 화합물, 약리학적으로 허용가능한 그의 염, 그의 금속 킬레이트, 그의 용매화물, 그의 수화물, 상기 염의 용매화물 또는 상기 염의 수화물을 제공하며;
(식I)
상기 식I에서,
R 및 R'기는 각각 독립적으로, 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴이나 헤테로아릴, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
n 및 m은 각각 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이며;
n 및 m은 동일하거나 상이할 수 있으며;
M은 존재하지 않거나, 수소, -0-, -S- 및 -N(U) 중에서 선택되며;
U는 수소이거나, C1, C2, C3 또는 C4의 알킬이며;
x 및 z는 각각 독립적으로, 0, 1 또는 2의 정수이고, x와 z는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며;
y는 0, 1 또는 2의 정수이고, y가 2일때 치환기 R'은 각 경우에 동일하거나 상이할 수 있으며;
D는 진단용 마커이며;
본 발명의 일 예에서, 상기 진단용 마커는 F와 같은 이미지화를 위한 마커일 수 있으며, F는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며, 이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 PNOM 세포에 표적화되는 약물이다.
약물은 특정 질환의 예방, 완화 또는 치료용으로 의학적으로 유용한 물질일 수 있으며, 예컨대, 비제한적으로, 세포자살 저해자(예, 카스파제 저해자, 항산화제, Bcl-2 시스템의 모듈레이터); 세포 사멸 활성자(예, 항암제); 또는 항응고제, 항혈전제 또는 혈전 용해제일 수 있는 혈액 응고 모듈레이터가 있다. 이러한 예에서, 약물은 바람직하기로는 항혈소판 물질, 헤파린, 저분자량의 헤파린, 당단백질 IIb/IIIa의 길항제, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 혈전 저해제나 인자 Xa 저해제와 같은 응고 인자 저해제, 또는 항염제 또는 면역 조절성 약제들 중에서 선택된다. 본 발명의 일 예는 종양 세포의 사멸시키기 위해 종양내의 세포자살 부위와 같이 원하는 부위에 약물을 표적화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 예는 응고를 예방, 감소 또는 중지시키기 위해, 혈전 부위에 항응고제 또는 섬유소 분해 물질을 표적화하는 혈전증 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, D는 고형 지지체일 수 있다.
본 발명의 다른 예로, 하기 식II의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식II의 구조로 표시되며, PNOM 세포를 선택적으로 표적화하는 화합물을 제공하며;
(식II)
상기 식II에서,
R은 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원이나 2원의 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이며;
n 및 m은 각각 0, 1, 2, 3 또는 4이며;
n 및 m은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
M은 무존재하거나, 또는 수소, -0-, -S- 및 -N(U) 중에서 선택되며;
U는 무존재하거나, 또는 수소, C1, C2, C3, 또는 C4의 알킬이며;
D는 수소 또는 진단용 마커로, 18F와 같은 이미지화를 위한 마커나 표지된 금속 킬레이트 중에서 선택되며, 이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 전술한 바와 같이, PNOM 세포에 표적화되는 약물이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식III의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식III의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식III)
상기 식III에서,
R3은 하이드록시 또는 F이고;
R4는 C4, C5, C6, C7, C8, C9 또는 C10의 선형 또는 분지형의 알킬이고; 및
k는 0, 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택되는 정수이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식IV의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식IV의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 NST200으로 지칭된다.
(식IV)
다른 예에서, 본 발명은 하기 식V의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식V의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식V)
상기 식V에서,
J는 -F이거나 -OH이고; 및
r은 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다.
r이 4이고 J가 -F인 경우, 화합물은 NST2O1로 지칭된다. r이 5이고 J가 -F인 화합물은 NST-ML-l0로 지칭된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VI의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VI의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VI)
상기 식VI에서,
J는 수소, -F 및 -OH 중에서 선택된다.
J가 -F인 화합물은 NST205로 지칭된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VII)
상기 식VII에서,
Q는 테크네튬, 옥소-테크네튬, 레늄 및 옥소-레늄 중에서 선택되며;
R4는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, 및 C6의 선형 또는 분지형의 알킬이며; 및
p는 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택된 정수이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식VIII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식VIII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식VIII)
상기 식VIII에서,
Q는 테크네튬, 옥소-테크네튬, 레늄 및 옥소-레늄 중에서 선택된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식IX의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식IX의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식IX)
상기 식IX에서,
R5는 수소, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 알킬, C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 및 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬 중에서 선택되며;
q는 1, 2, 3, 4 및 5 중에서 선택된 정수이며; 및
Y는 형광 마커이다.
본 발명의 예에서, Y는 단실-아민기 및 플루오레세인 중에서 선택된다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식X의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식X의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 NST203으로 지칭된다.
(식X)
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XI의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XI의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XI)
상기 식XI에서,
R는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XII)
상기 식XII에서,
F는 18F 또는 19F일 수 있다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XIII의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XIII의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XIII)
상기 식XIII에서,
R는 수소, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, 선형 또는 분지형의 알킬, 선형 또는 분지형의 하이드록시-알킬, 선형 또는 분지형의 플루오로-알킬, 1원 또는 2원 고리로 구성된 아릴 또는 헤테로아릴, 또는 이들의 조합이며;
m은 0, 1, 2, 3 또는 4의 정수이고;
D는 본 발명의 일예로 F와 같은 이미지화를 위한 마커일 수 있는 진단용 마커로, 상기 F는 18F 또는 19F 중 어느 하나이거나 방사능 표지된 금속 킬레이트일 수 있으며; 이미지화를 위한 마커는 색상, 형광, X-레이, CT-스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 SPECT(single photon emission tomography)나 PET(positron emission tomography)와 같은 방사능-동위원소 스캔으로 검출할 수 있다. 대안적으로, D는 전술한 바와 같이, PNOM-세포를 표적화하는 약물이다.
다른 예에서, 본 발명은 하기 식XIV의 구조로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 금속 킬레이트, 상기 염의 용매화물 및 상기 염의 수화물을 포함하는, 식XIV의 구조로 표시되는 화합물을 제공하며;
(식XIV)
상기 식XIV에서,
F는 18F 또는 19F일 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 식I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 또는 XIV로 표시되는 각 화합물은 예컨대 비제한적으로 Tc, Tc=O, In, Cu, Ga, Xe, Tl, Re 및 Re=O, 123I, 131I, Gd(III), Fe(III), Fe2O3, Fe3O4, Mn(II), 18F, 150, 180, 11C, 13C, 124I, 13N, 75Br, Tc-99m 또는 In-111과 같은 진단용 마커를 포함하거나, 또는 상기 마커에 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, (i) 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV 중 어느 하나로 기재된 구조로 표시되는 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 금속 킬레이트, 용매화물, 수화물, 및 상기 염의 용매화물 및 수화물을 세포 집락에 접촉시키는 단계, 및 (ii) 세포에 결합된 화합물의 양을 결정하여, 세포에 유의 양의 화합물이 결합한 경우 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 세포 집락내 PNOM-세포를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "세포에 결합된 화합물의 양이 현저한"은 정상 세포에 결합하는 양에 비해 적어도 30% 이상의 양으로 PNOM-세포에 결합하는, 진단용 마커를 포함하거나 또는 이에 부착되어 있는 본 발명에 따른 화합물의 양을 의미한다. 다른 예에서, 상기 양은 50%로 더 많을 수 있다. 본 발명의 다른 예로, 양은 75%로 더 많을 수 있다. 본 발명의 예로, 양은 150%로 더 많을 수 있다. 본 발명의 다른 예로, 양은 약 2배로 많을 수 있다. 다른 예로, 양은 적어도 2배 이상을 초과할 수 있다. 다른 예로, 양은 적어도 5배를 초과할 수 있다. 다른 예로, 양은 적어도 10배로 많을 수 있다.
본 발명의 일 예는, PET 또는 PECT에 의한 방사능-핵종 영상을 통해 환자에서 사멸 진행중인 세포의 영상을 수득함에 있어서의 본 발명에 따른 화합물을 용도에 관한 것으로, PNOM-세포에 결합한 화합물의 양과 정상 세포에 결합한 화합물의 양 사이의 비는, 사멸 과정이 진행된 조직으로부터 수득한 신호의 크기 또는 강도를 사멸 과정이 진행되지 않은 기관으로부터 수득한 신호의 크기/세기와 비교함으로써, 계산할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 (i) 18F와 같은 이미지화를 위한 마커를 포함하는 하기 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV로 기재된 구조에 따른 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 금속 킬레이트, 용매화물, 수화물, 상기 염의 용매화물, 또는 수화물을 환자나 동물에게 투여하는 단계; 및 (ii) 세포에 결합된 화합물의 양을 결정하기 위하여, 실험 환자나 동물의 이미지를 수득하여 세포에 결합된 화합물의 양이 현저하게 검출되는 경우 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 환자나 동물에서 PNOM-세포를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물의 작용 메카니즘은, 적어도 부분적으로, 일반식XV를 가지는 모든 화합물에서 공통적인 모듈 활성을 포함하며, 이는 식XV의 NST-ML-작용 모티프라 하며;
(식XV)
상기 식XV에서,
R은 알킬이다. 본 발명의 일 예에서, R은 부틸이다.
상기 NST-ML-작용 모티프는 건강한 세포의 막과 구별되는 세포자살성 세포의 세포막에서 발생되는 구조적 변형에 상응하도록 설계된 것이다. 이러한 복수의 막 변형으로는 하기가 있다:
(i) 포스파티딜에탄올아민(PE)과 음으로 하전된 포스파티딜세린(PS)이 세포 표면으로 노출되고, 인지질막의 뒤섞기(Scrambling of membrane phospholipid). 세포 표면의 PS 노출로 표면은 음전위를 띄게되고 벌크로부터 막 인터페이스로의 프로톤 유입이 유도된다.
(ii) 막의 바깥판(outer leaflet)내부의 아미노포스포리피드의 분획의 증가로 막의 바깥판의 인터페이스내의 프로톤 전류(interfacial proton current, IPC)가 강화된다. 이러한 강화는 막의 바깥판내 PE 및 PS가 포스파티딜콜린(PC)와 스핑고마이엘린(SM)으로 대체됨으로써, 프로톤 수송 반응에 참여할 수 있는 관능기의 실질적인 수적 증가로 인한 것이다. PE는 1급 아민으로 구성되지만, PE는 1급 아민과 카르복실기를 포함하고 있다. 이와는 대조적으로, PC 및 SM은 각각 항구적인 양전하를 띄는 4급 암모늄을 포함하고 있어, 프로톤 수송 반응에 관여할 수 없다.
(iii) 또한, 세포자살 세포의 막은 구성물의 충진율(packing) 감소 및 막 유동성 증가의 특징을 가진다.
NST-ML-작용 모티프의 작용 형태에 대한 비제한적인 가정에 따르면, 이는 스위치 모이어티(switch moiety)를 포함하고 있으며, 상기 모이어티는 전술한 특징들을 나타내는 막, 즉 세포자살성 세포의 세포막에 접근하면 선택적으로 활성화된다(도 1). 상기 작용 모티프는 2개의 음전하를 띄는 카르복실레이트기(알킬말로네이트의 pKa는 약 5.6 및 2.8임)를 가지고 있어, 따라서, 생리학적 조건에서 겉보기 전하(formal charge)가 -2이므로, 생리학적 pH에서 용해가능하다. 그러나, 세포자살성 세포에 접근하면, 보다 더 산성인 표면과, 카르복실기의 pKa 값을 상승시키도록 작용하는 인터페이스 환경의 유전상수(dielectric constant) 감소로 인해, 프로톤은 말로네이트 모이어티에 포착된다.
말로네이트기에 의해 포착된 프로톤은 하나의 음성 전하를 중화시켜, 분자는 총 전하 -1로 더욱 소수성으로 된다. 더욱이, 프로톤 포착으로 다음과 같이 매우 독특한 상태가 형성된다:
(i) 프로톤화된 카르복실기와 프로톤화되지 않은 카르복실기간에 매우 강한 소수 결합이 형성되는, 산-음이온 결합이 형성된다. 수소 결합은 강하고, 대칭적이며 공명 및 호변이성화(tautomerization)에 의해 안정화된다.
(ii) 이는 4개의 카르복실 원자가 음전하를 띄게, 즉 부분적으로 비편재되게 한다.
(iii) 강한 산-음이온 수소결합은 벌키하고, 단단하며, 납작한 6원 고리를 형성하며, 부분적으로 비편재된 음전하를 띄며, 카르복실 이중결합상의 pi-전자구름을 포함하는 분자를 견고하게 한다. 본 발명에 따른 화합물의 작용 메카니즘에 대한 비제한적인 가정에 따라, 이러한 요소는 막 인터페이스로의 투과에 비교적 우호적일 수 있다. 그러나, 그것의 벌키하고 단단한 구조는 느슨하게 패킹된 막, 즉 세포자살성 막과 선택적으로 결합되도록 하지만, 건강한 세포의 세포막과 같이 고도로 패킹된 막과의 결합은 불가능하다. 따라서, 이러한 공간적 특징은 세포자살 세포 막과의 결합성에 대한 선택성을 부여한다.
하나의 프로톤이 부가된 말로네이트가 세포자살성 세포의 막 인터페이스로 선택적으로 통과하면, 인터페이스의 프로톤 전류가 증가되고, 인터페이스의 증가된 수소결합 네트워크내에 통합되게 된다. 이러한 환경하에서 말로네이트 모이어티에 의한 2번째 프로톤의 획득 가능성이 현저하게 증가된다. 이는 또한 전하의 중성화와 근접한 인지질 분자와의 산-음이온 쌍 형성을 유도한다. 이로써, 상기한 일들은 분자의 세포자살성 막의 인터페이스와의 결합을 안정화시키도록 작용할 것이다.
프로톤이 부가된 말로네이트 모이어티의 막 인터페이스 투과와, 그것의 인터페이스내에서의 결합 안정성은 알킬 체인 R이 막 인터페이스를 선회하여 최적 결합 환경, 즉 막의 탄화수소 코어에 도달을 허용하며, 그 결과 소수성 작호작용을 통하여 화합물 결합시 자유 에너지 획득에 기여할 것이다.
NST-ML-작용 모티프는 탄화수소 링커[식I 또는 II의 (CH2)m]를 통한 이미지화를 위한 마커나 치료 약제(식I에서 모이어티 D)와의 그것의 결합으로, 진단 또는 치료 목적에 유용하게 활용된다. 이러한 방식에 따른 NST-ML-작용 모티프는 표적 모이어티로서 작용하여, 이미지화를 위한 마커나 또는 그것에 부착된 약물이 세포 사멸, 특히 세포자살이 부과된 세포 및 조직, 또는 혈소판 활성화 및 혈전증이 부과된 조직으로 선택적으로 표적화되는 것을 허용한다.
도 1은 NST200(식IV)를 도시하고 있으며, 생리학적 환경에서 3단계의 PNOM 접근 과정과 결합을 나타내고 있다:
A: 화합물은 수용액내에 있어 양쪽 카르복실기가 탈프로톤화, 즉 음으로 하전되며, 화합물은 매우 잘 용해된다.
B: 음으로 하전된 세포자살 세포막에 접근하면, 화합물은 프로톤을 획득한다. 음이온-산 이량체가 형성되고, 이로 인해 안정한 6원의 공명-안정화된 고리가 만들어져 막 인터페이스에 침투한다. 벌키하고 단단한 고리 구조의 입체적인 특징은 건강한 세포의 매우 잘 패킹된 세포막과의 결합에 비해 보다 느슨하게 패킹된 세포자살 세포의 세포막과의 결합에 우호적이므로, 선택성을 보조한다.
C: 화합물이 막의 인터페이스에 침투하면, 인터페이스의 수소결합 네트워크와 세포자살성 막의 인터페이스에 형성된 증강된 인터페이스 프로톤 전류에 접하게 된다. 그 결과 프로톤 획득 및 수소결합이 이루어지며, 이는 화합물과 인터페이스(화살표)의 결합을 안정화시키도록 작용한다. 나아가, 이러한 침투는 알킬 체인이 막내에서 최적 위치에 도달하게 하여, 막의 탄화수소 코어와의 소수성 상호작용을 형성함으로써 결합 에너지에 기여하게 된다.
본 발명의 화합물은 본 발명의 3가지의 다른 방식으로 PNOM-세포를 포함하는 조직 및 기관에 의학적으로 유용한 물질을 선택적으로 표적화하는데 사용할 수 있다:
(i) 첫번째, 이하 "검출적 접근법"으로 기재한 방법에서는, 선택적 결합을 활용하여 이미지화를 위한 마커를 PNOM-세포로 표적화한다. 이러한 방법은 하기에 개시된 세포가 출현하는 질환을 진단하기 위해, 생체내, 생체외 또는 시험관내 임상적인 실무에 사용할 수 있다.
(ii) 이하 "치료 측면에서의 접근법"으로 칭한 두번째 방법에서는, PNOM-세포가 출현한는 신체 조직 및 기관, 예컨대 세포 사멸, 혈전 형성 또는 염증 부위에 치료제를 선택적으로 표적화하는데, 선택적 결합 특성을 이용한다.
(iii) 이하 "소거 측면에서의 접근법(clearance approach)"으로 칭한 세번째 방법에서는, 본 발명에 따른 화합물의 PNOM-세포와의 선택적 결합을 고체 지지체에 상기 화합물을 부착하여 혈액과 같은 체액에서 전구응고( pro-coagulant) 특징으로 인해 해로울 수 있는 PNOM-세포를 제거하는데 사용한다.
검출적 접근법에 있어서, 본 발명은 활성 성분으로서 이미지화용 마커를 포함하거나 그것에 연결된 PMBC를 포함하는, 시험관내, 생체외 또는 생체내 PNOM-세포 검출용 조성물에 관한 것이다. PMBC는 분석된 샘플내에 존재하는 POM-세포에 대한 선택적 결합을 수행할 수 있다. 이후, 상기 결합은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 확인할 수 있다. 본 발명의 진단성 PMBC는 PMBC에 의한 선택적 수단으로 마커를 PNMO-세포로 표적화할 수 있다. 검출가능한 표지는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 예컨대 형광, 방사능 방사 또는 발색, MRI, x-레이 등에 사용되는 특이적인 표지물을 이용하여 검출할 수 있다. 일 예로, 진단성 PMBC는 공유 결합 또는 비공유 결합(예, 정전기적 결합)으로 검출가능한 표지물에 연결된다.
일 예에서, 검출가능한 표지물로는 Tc, 옥소-Tc, In, Cu, Ga, Xe, Tl 및 Re, 옥소-Re 및 공유 결합된 원자의 금속 원자 각각의 방사능 동위원소; SPECT와 같은 방사능-동위원소 스캔용 123I 및 131I; MRI용 Gd(III), Fe(III) 또는 Mn(II) for MIRI; 및 PET 스캔용 18F, 15O, 18O, 11C, 13C, 124I, 13N 및 75Br 중 어느 것일 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 PMBC는 PET 스캔을 통한 세포자살의 임상적인 이미지화를 목적으로 하며, PMBC는 18F 원자를 포함한다.
18F과 같은 이미지화하기 위한 마커로서 사용되는 일부 방사능-동위원소의 반감기가 짧아, 임상적 PET 이미지화를 위한 상기 마커는 환자에게 진단 화합물을 투여하기 바로 전에 부착시킬 수 있다. 따라서, 환자에게 투여하기 전에 18F과 같은 방사능-동위원소로 치환되어지는 모이어티를 포함하는 PMBC-PET 전구체를 합성하는 것이 유용할 수 있다. 일 예에서, 18F로 치환되는 모이어티는 하이드록실기, 니트로기 또는 브롬이나 염소와 같은 할로겐 원소 중에서 선택된다. 또한, 이러한 PBMC-전구체 PMBC-PET 전구체도 본 발명의 범위에 포함된다.
PET 이미지화를 위해, 전술한 구조의 임의 PMBC일 수 있는 PMBC를 18F로 표지하는 방법은, PMBC에 18F를 부착하여 상기 PMBC가 PET 이미지화를 위한 18F로 방사능 표지되는 단계를 포함한다. 선택적으로 PMBC의 관능기는 18F 원자 부착 단계 이전에 적정 보호기로 보호될 수 있다. 상기 보호기는 따라서, 18F의 부착 단계 이후에 선택적으로 제거된다.
마커가 금속 원자(예, MRI 또는 SPECT에 대해 각각 Gd, 99mTc 또는 옥소-99mTc)인 경우에, PMBC는 금속 킬레이터를 포함한다. 킬레이터의 금속 배위 원자는 질소, 황 또는 산소 원자일 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 킬레이터는 디아민디티올, 모노아민-모노아미드-비스티올(MAMA), 트리아미드-모노티올 및 모노아민-디아미드-모노티올이다. 상기 경우에서, 킬레이터에 부착되거나 또는 킬레이터를 포함하는 PMBC이며 금속 원자와 복합체를 형성하기 전인 PMBC-킬레이트 전구체와 금속 원자를 포함하는 복합체인 PMBC-킬레이트 전구체 둘다 본 발명의 범위에 포함된다.
형광 검출에서, 진단성 PMBC는 당업계에 공지된 임의의 형광 프로브들 중에서 선택된 형광 그룹을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 예로는 5-(디메틸아미노)나프탈렌-1-설포닐아미드(단실-아미드) 및 플루오레세인이 있다.
본 발명의 화합물은 PNOM-세포 형성을 특징으로 하는 매우 다양한 의학적 증상을 검출 및 진단하기 위해 사용할 수 있다. PNOM-세포 형성을 특징으로 하는 임상 증상의 예는 다음과 같다:
퇴행성 질환, 신경퇴행성 질환(예, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병), AIDS, ALS, 프리온 질환(Prion Disease), 골수이형성 증후군, 허혈성 또는 독성 상해, 이식 거부 반응중의 이식 세포 소실; 종양 및 특히 악성 종양/ 침윤성 종양과 같이, 조직의 과다 증식 뿐만 아니라 세포자살 증강으로 특징화되는, 세포자살의 과다 발생을 특징으로 하는 질환.
본 발명의 실시예 3 및 도 2는 본 발명의 화합물을 이용한 사멸 과정중인 뇌세포 검출을 예시한다. 세포 사멸의 촉발자는 허혈증/재관류이다. 손상된 뇌 반구는 손상되지 않은 반대쪽 반구에 비해 트리튬-표지된 NST200을 현저하게 다량 흡수하였다.
혈소판 활성화 및/또는 다른 세포 성분(예, 내피 세포 활성화 또는 그것이 손상되는 중에 PNOM가 발생되는, 과다 응혈로인한 질환. 이러한 질환으로는, 특히 동맥 또는 정맥 혈전증, 혈전 색소증, 예컨대 심근 경색, 뇌졸증, 심부 정맥 혈전증, 파종성 혈관내 응고(DIC), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP), 지중해성 빈혈(YYP), 겸상 적혈구, 항인지질 항체 신드롬, 홍반성 전신 루푸스가 있다.
염증성 질환 및/또는 면역 매개성 병인 또는 발병, 항인지질 항체 증후군, 홍반성 전신 루푸스와 간은 자가면역 질환, 류마티스 관절염과 같은 결합조직 장애, 갑상선염; 수포창 또는 결절성 홍반과 같은 피부 질환; 자가면역성 혈액 장애; 근무력증과 같은 자가면역성 신경 질환; 다발성 경화증; 궤양성 대장염과 같은 염증성 과민 질환; 맥관염.
동맥 경화반 및 특히 세포자살성 대식세포, 세포자살성 평활근세포, 세포자살성 내피세포 및 활성화된 혈소판과 같이, PNOM-세포를 특징으로 하는 불안정하고 취약하고 탈장되기 쉬운, 반. 상기 활성화된 혈소판은 종종 불안정한 동맥 경화반과 관련있는 혈전에서 만난다.
또한, 검출은 각각의 질환을 가지는 것으로 사전 확인된 환자에게서, 질환의 중증도를 평가하기 위한 목적으로, 질병의 추이 및/또는 여러가지 치료적 양상에 대한 반응을 관찰하기 위해, 수행할 수 있다. 상기 관찰의 비제한적인 예는 항암치료에 대한 반응 평가이다. 화학치료 또는 방사능치료와 같은 대부분의 항암 치료는 세포자살 유도에 의해 그 효과를 나타내므로, 치료에 의한 세포자살을 진단성 PMBC로 검출함으로써 항종양 물질에 대한 종양의 민감성 정도를 알 수 있다. 이는 항암제 투여 시기와 그 효능을 적절히 평가하는 시기 사이의 잠복 간격(lag period)을 실질적으로 단축시킬 수 있다.
또한, 검출을 통하여 항암제의 부작용을 관찰할 수 있다. 대부분의 부작용은, 위장의 상피 세포 또는 골수 조혈계와 같이 정상적이지만 민감한 세포에서의 원하지 않은 치료로 인한 세포자살 발생에 의한 것이다.
또한, 검출은 종양의 침습(tumor aggressiveness) 정도와 관련있는 종양내 내재된 세포자살 정도를 확인하는 것을 목적으로 할 수 있으며, 또는 전이암내부에서 흔히 발생되는 내재적 세포자살을 검출하여 전이암을 검출하는 것을 보조할 수 있다.
유사하게, 세포자살은 이식편 거부 반응시 세포 소실에 중요한 작용을 하므로, 본 발명의 진단성 PMBC는 기관 이식 이후에 이식편의 생존성을 관찰하는데 사용할 수 있다.
또한, 검출은 세포-보호성 치료제에 대한 반응을 관찰하는 것을 목적으로 할 수 있으며, 따라서, 세포 사멸을 측정할 수 있게 함으로써 다양한 질환(예, 전술한 질환)에서의 세포 소실을 저해할 수 있는 약물의 스크리닝과 개발을 돕는다.
또한, 그것을 취약하고 탈장하기 쉬운 혈전증 및 색전 폐색되게 하는 동맥 경화반의 불안정성은 세포자살성 세포(세포자살성 대식세포, 평활근 세포 및 내피 세포) 및 활성화된 혈소판을 포함한 여러가지 PNOM-세포 타입의 관여를 특징으로 하므로, 검출은 동맥 경화반의 검출에 유용할 수 있다.
이러한 접근법에 있어서, 본 발명은 (i) 본 발명의 예중 어느 하나에 따른 진단성 PMBC와 세포 집락을 접촉시키는 단계; 및 (ii) 세포 집락에 결합된 PMBC의 양을 결정하여, 집락의 세포에 결합된 화합물의 양이 현저한 것으로 검출되면 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 전신, 기관, 조직, 조직 배양물 또는 그외 모든 세포 집락으로부터 선택된 세포 집락에서의 PNOM-세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.
실시예 부분에서는 트리튬으로 표지된 NST200, NST203 및 NST205가 대조군인 비-세포자살 세포에 비해 다량으로 세포 자살 세포에 결합할 수 있는 능력이 있으며, 본 발명에 따른 화합물들의 세포 자살 세포에 대한 선택적 결합과 검출 수행 능력을 나타낸다.
다른 예로, 또한 본 발명은 (i) 진단성 PMBC을 실험 환자나 동물에게 비경구(예, 정맥내) 또는 경구 투여와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법으로 투여하는 단계, 및 (ii) 세포에 결합된 진단성 PMBC의 양을 검출 및 결정하기 위하여, 당업계에 공지된 임의의 방법(예, PET 스캔, SPECT, MRI)으로 실험 환자 또는 동물을 촬영하여, 세포에 결합된 진단성 PMBC의 양이 현저한 경우 상기 세포를 PNOM-세포인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 환자나 동물에서 PNOM-세포를 검출하는 생체내 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 (i) 본 발명에 개시된 임의의 PMBC 화합물일 수 있는 진단성 PMBC을 진단성 PMBC이 PNOM-세포의 생물학적 막에 결합할 수 있는 조건하에서 조직 또는 세포 배양물 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 세포에 결합된 진단성 PMBC의 양을 검출하여, 결합된 진단성 화합물의 양이 현저한 경우 이는 조직 또는 세포 배양물내에 PNOM-세포가 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포 배양물 샘플에서의 PNOM-세포를 검출하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
시험관내 또는 생체외 연구에서 검출 단계는, 예컨대 본 발명의 형광 표지된 화합물의 경우, 상업적으로 널리 이용가능한 장치상에서 세포를 가시화하는 유세포 분석의 이용에 의한 것일 수 있다. 세포를 가시화하기 위해 형광물질을 이용하는 경우에, 하나의 15 mW의 아르곤 이온 레이저빔(488 nm)을 사용하여 FITC 형광물질을 여기시키고, 형광 데이타는 530 nm 밴드의 통과 필터로 수집하여 막대그래프로 제시한다. 형광 세포 %는 예컨대 라이시스 II 소프트웨어나 그외 다른 소프트웨어를 이용하여 계산할 수 있다. 검출 방법은 본 발명의 예에서 항암제와 같은 치료제를 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유의 양(significant amount)"은 PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양이 비-PNOM-세포에 결합된 양에 적어도 30% 이상의 양이라는 것을 의미한다. 실제 양은 이미지화 방법과 사용 장비 및 실험한 기관이나 조직에 따라 변경될 수 있다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양에 비해 적어도 50% 초과하는 양이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양에 비해 적어도 75% 초과하는 양이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양의 적어도 2배이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양의 적어도 4배이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양의 적어도 6배이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양의 적어도 8배이다. 다른 예에서, PNOM-세포에 결합된 PMBC의 양은 비-PNOM-세포에 결합된 양의 적어도 10배이다.
결합 작용은 본래 결합 차이를 측정하는 방법에 의존적이다. 본 발명의 방법은 PNOM-세포 발생을 특징으로 하는 질환, 예컨대 비제한적으로 전술한 임의의 질환의 진단에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 질환이나 또는 의학적 증상 치료에 이용되거나, 또는 전술한 바와 같은 기초 과학 연구를 위해 사용되는 여러가지 치료 양상의 효과 관찰에 사용할 수 있다.
본 발명의 두번째 접근법, "치료 측면에서의 접근법"에 있어서, 본 발명은 활성 약물이나 프로드럭의 PNOM-세포로의 표적화에 사용되는 PMBC를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 치료적 PMBC는 의학적으로 유용한 물질에 접합되어 있는 약물이나 PMBC를 포함하는 PMBC를 의미한다. 용어 "접합되다"는 두개의 분자가 당업계에 공지된 임의의 방법으로 함께 연결되어있는 것을 의미한다.
치료적 PMBC에 포함되거나 또는 연결된, 의학적으로 유용한 약물과 PMBC는 공유 결합, 비공유 결합(예, 정전기적 힘), 또는 약물을 포함하며 표면에서 복합체를 PNOM-세포로 표적화하는 PMBC를 가지고 있는 담체 입자(예, 리포좀) 형성에 의해, 조합될 수 있다. 약물이 표적 부위에 도달하면, 여전히 PMBC-접합체의 일부분인 경우에 PMBC 유니트에서 (예컨대 천연 효소의 절단, 파괴 등의 활성에 의해) 분리된 후, 막에 PMBC를 가지는 약물 함유 리포솜의 식균 작용에 의해, 또는 그외 공지된 임의의 메카니즘에 의해 그것의 생리학적 활성을 나타낼 수 있어야 한다.
약물은 조성물이 의도한 특정 질환에 따라 선택되어야 한다.
약학적 조성물 뿐만 아니라 본 발명의 진단 조성물은 공지된 임의의 경로, 특히 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 설하, 안내, 비내 또는 국소 투여나 뇌내 투여로 투여할 수 있다. 담체는 적합한 투여 모드에 따라 선택하여야 하며, 공지된 임의의 성분, 예컨대 용매, 유화제(emulgator), 부형제, 탈크, 향료, 색소 등을 포함한다. 약학적 조성물은, 필요에 따라 또한 질환치료, 부작용 제거 또는 활성 성분의 활성 증대를 위해 사용되는 그외 약학적으로 활성인 화합물을 포함할 수 있다.
이러한 측면에 있어서, 본 발명은 또한 치료가 필요한 개체에게 질병에 대한 치료제로서 활성인 약물 또는 표적 부위에서 활성 약물로 변환되어지는 프로드럭을 포함하는 치료적 PMBC를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, PNOM-세포가 나타나는 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 치료적 PMBC는 PNOM-세포를 포함하는 조직으로 약물을 선택적으로 표적화하여, 그것의 국소 농도를 증대시키고, 표적 부위에서의 치료 효과를 잠재적으로 강화한다. 이러한 의학적 질환들은 전술한 바와 같다.
다른 예로, 본 발명은 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 및 XIV 중 어느 하나로 기재된 구조로 표시되는 화합물 및 세포독성 약물을 포함하는 치료적 PMBC를 투여함으로써, 종양내 세포자살 세포를 표적화하여 종양 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는 종양내 암 세포의 사멸 방법을 제공한다. 일 예에서, 종양 세포의 사멸 방법은 "자동촉매 메카니즘"을 수반하며, 이에 의해 종양을 표적화하는 세포독성 물질의 양은 세포독성 효과를 위해 각각의 투여량으로서 연속 투여에 따라 증가되며, 종양내 세포자살 세포의 하중은 증강되고, 따라서 치료적 PMBC의 다음 투여가 표적화하는 부위가 보다 넓어진다. 이러한 전략은 항암 치료 효과를 증가시킬 수 있으며, 종양 소거 기회를 증대시킬 수 있다.
용어 치료적 PMBC의 "유효량"은 질병의 적어도 한가지 이상의 유해한 증상을 측정가능한 수준으로 감소시킬 수 있는 양으로, 사용된 약물, 투여 모드, 환자의 나이 및 체중, 질환의 심각도 등에 따라 선정하여야 한다.
다른 예에서, 본 발명의 치료적 PMBC는 치료 효과를 가지는 방사능 동위원소를 포함하거나, 이에 연결되어 있다. 비제한적인 방사능 동위원소의 예로는 이트륨 90, 요오드 131, 레늄 188, 홀뮴 166, 인듐 111, 루테튬 177 또는 치료 목적으로 이용가능한 그외 방사능을 방사하는 임의의 방사능동위원소가 있다.
다른 예에서, 본 발명은 항응고제 또는 섬유소분해제가 연결되어 있는 식I, II, III, IV, V, VI, VII,, VIII, IX, X, XI, XII, XIII 및 XIV 중 어느 하나로 기재된 구조로 표시된 화합물을 포함하는 치료적 PMBC를 투여하여, 응혈시 치료제를 활성화된 혈소판으로 표적화하여 혈전 형성을 경감/방지하는 것을 특징으로 하는, 응혈을 경감/방지하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 PNOM이 혈소판 활성화중에 및/또는 그외 세포 요소(예, 내피 세포)를 활성화 또는 손상시 발생되는, 과도한 응혈을 수반하는 질병을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 질환으로는 특히 동맥 또는 정맥 혈전증, 혈전 색소증, 예컨대 심근 경색, 뇌졸증, 심부 정맥 혈전증, 파종성 혈관내 응고(DIC), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP), 지중해성 빈혈(YYP), 겸상 적혈구, 항인지질 항체 신드롬, 홍반성 전신 루푸스가 있다.
본 발명의 3번째 접근법, "소거 측면에서의 접근법"에 있어서, PNOM-세포에 특이적으로 결합ㅎ하는 본 발명의 PMBC의 특성은 세포의 체액을 정화하는데 이용된다. 본 발명의 일 예에서, 체액은 혈액 또는 혈액 산물이다.
체외 순환이 필요한 많은 외과적 또는 의학적 개입은 외부 인공적인 환경으로 혈액 요소를 노출시킨다. 이는 종종 뇌혈관내 미세 색전 존재시, 신경 부전과 같은 심각한 임상적 결과로 귀착될 수 있는 혈액 세포의 활성화 및 손상, 전신 염증 및 혈전 색전 현상을 유도한다. 그러므로, 혈액으로부터 손상된, 활성화된 또는 세포자살성 세포를 검출하여 제거하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 고체 지지체상에 고정된 PMBC를 제공한다. 고정은 직접적인 부착, 공유 또는 비공유 결합, 또는 스페이서(spacer)를 통한 부착에 의한 것일 수 있다. 고정된 PMBC는 PNOM-세포포부터 혈액을 정화하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 예에서, 고형 지지체는 PMBC에 결합된 복수개의 비드를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 비드는 수지-코팅된 비드이다. 대안적으로, 상기 비드는 자기 비드일 수 있다.
고체 지지체가 체액이 흐르는 복수개의 파이버 또는 미세-모세관인 경우, 내면 및/또는 외면은 PMBC로 덮혀져있다.
고체 지지체상에 고정된 화합물은 필터 장치의 일부를 형성한다. 따라서, 소거 측면에서의 접근법에 있어서, 본 발명은 또한 고체 지지체상에 고정된 PMBC를 포함하는 하우징과 유입구 및 유출구를 포함하는 필터 장치를 제공한다. 혈액 또는 혈액 산물과 같은 체액은 입구를 퉁해 하우징으로 유입되어 하우징내에 함유된 고정된 PMBC와 접촉 및 부착한다. 따라서, 체액내 손상되거나 사멸한 세포와 같인 교란된 막을 가지고 있는 순환 세포가 제거되거나, 또는 PNOM 막을 가진 색전과 같은 거대 구조체가 제거된다. 따라서, 출구로 배출되는 유액내의 PNOM-세포의 함량은 감소되거나 또는 본질적으로 제거된다.
필터 장치는 교체가능하거나, 영구적이거나, 또는 외부 순환 장치의 주변기기를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 외부 순환 장치를 통한 혈액 순환시 상기 필터 장치를 통하여 흐르는, 필터 장치를 포함하는 외부 순환 장치를 제공한다.
이러한 외부 순환 장치의 예로는 심폐 우회 장치, 혈액 투석 장치, 혈장 사혈 장치 및 수혈백과 같은 수혈 장치가 있다.
도 1은 본 발명의 화합물 NST-ML-작용 모티프의 작용 기작을 도시한 것이다.
도 2(A 및 B)는 트리튬 표지한 NST200의 CD95에 의해 유도된 세포자살이 진행중인 배양한 Jurkat 세포와의 선택적 결합성(A) 및 트리튬 표지한 NST205의 CD95에 의해 유도된 세포자살이 진행중인 배양한 Jurkat 세포와의 선택적 결합성(B)을 나타낸다.
도 3(A 및 B)는 NST203의 세포자살이 진행중인 배양한 HeLa 세포와의 선택적 결합성을 나타낸, 형광 현미경 사진이다(도 3A). NST-ML-작용 모티프가 없으며 동일한 형광발색단(fluorophore)을 가진 대조군 화합물인 n-부틸-단실아미드(BDA)는 상기한 선택성을 나타내지 않았다(도 3B).
도 4(A 및 B)는 마우스에서 화학치료로 인한 세포 사멸을 겪고 있는 세포에 대한 NST203의 생체내 선택적 결합성을 나타낸 형광 현미경 사진이다: (A). 흑색종 세포의 세포자살; (B). 위장관의 상피 세포의 세포자살.
도 5A-C는 트리늄으로 표지한 NST200으로 검출한, 암종의 세포 사멸에 대한 화학치료 효과를 나타낸다.
도 6은 대장암 세포가 있는 마우스의 화학치료시 NST200에 의한 오토라디오그래피이다.
도 7은 화학 치료 전 및 후에 암종 종양과 그외 신체 기관에서의 흡수 비율을 나타낸 표이다.
도 8(A 및 B)은 트리튬으로 표지한 NST200의 대장암으로의 흡수 및 이의 화학치료 효과를 나타낸다(도 8A). 도 8B는 대장 중량 변화를 나타낸다.
도 9(A 및 B)는 뇌(A)와 H&E 염색(B)에서 트리튬으로 표지한 NST200의 세포사멸 부분으로의 표적화를 나타낸 오토라디오그래피의 이미지 분석 결과이다.
도 10(A 및 B)는 랫의 신장 허혈성 재관류에서 트리튬 표지한 NST200에 의한 오토라디오그래피이다; (A) 손상된 신장; (B) 무손상 신장.
도 11(A 및 B)은 랫의 방사능 조영제 유발성 급성 신세뇨관 괴사(radiocontrast-induced acute distal tubular necrosis) 모델에서의 트리튬 표 지한 NST200에 의한 오토라디오그래피이다; (A) 손상된 신장; (B) 무손상 신장.
도 12는 자가면역 뇌척수염의 뇌와 척수에 대한 오토라디오그래피에 의한 3H-200 이미지화한 것이다.
본 발명을 이해하고 실제 어떤 방식으로 실행될 수 있는지를 보이기 위해, 하기 실시예들을 기술한다: 본 발명의 화합물의 합성에 대한 실시예 및 본 발명의 화합물의 사멸 과정 진행중에 세포와의 선택적인 결합 실행에 대한 실시예. 본 발명의 화합물을 검사하기 위해, 이들을 트리튬으로 방사능 표지하였고, 손상된 부위에서의 유입량을 측정하거나 또는 방사능 사진 촬영으로 검출하였다. 몇몇 실시예에서, 화합물을 형광 표지물, 즉 단실아미드기를 부착하여 표지한 다음 형광 현미경으로 검출하였다. 화합물의 세포자살 세포에 대한 선택적 결합성은 조직 배양물에서 시험관내 실험으로, 그리고 중간대뇌동맥 폐색으로 세포가 사멸되는 뮤라인 뇌졸중 모델, 뮤라인 신장 허혈 및 독성 손상 모델(ischemic and toxic insult model), 뮤라인 흑색종 모델, 뮤라인 대장암 모델, 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)및 뮤라인 다발 경화증에서 생체내 실험으로 입증하였다.
실시예 1:
NST-ML-F-4(2-부틸-2(3-플루오로프로필)-말론산); (반응 1):
메틸 포름아미드(DMF) 내에서 NaH 1 당량을 이용하여 Di-t-부틸 말로네이 트(5 mL)를 탈프로톤화하였고, 수소 발생이 종료된 후 n-부틸 요오드화물 1 당량을 첨가하였다. 반응 혼합물은 14시간동안 50 ℃에서 가온하였다. 컬럼 크로마토그래피로, 5.8 g의 di-t-부틸, 부틸 말로네이트(2)를 95% 수율로 수득하였다. 2(3.8 g)를 톨루엔 내에서 NaOCH3(0.05 당량, cat.)와 아크롤레인(1.1 당량)으로 처리하여 30% 수율의 알데하이드(3) 1.26 g을 회수하였다. 이후, 화합물 3은 에테르/물(8:1 v/v) 혼합물내에서 NaBH4(1.05 당량)와 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후 플래쉬 크로마토그래피를 수행하여, 순수한 알콜 4를 수득하였다(93%). 제조된 산물은 메탄설포닐 클로라이드(MsCl) 1.1 당량 및 트리에틸 아민(Et3N) 2.2 당량로 처리하여, 97% 수율로 메실레이트 화합물 5를 수득하였다. 이 산물은 본질적으로 순수하였으며, 다른 정제 광정 없이 다음 반응에 사용하였다.
아세톤니트릴 2 mL내의 KF(5 당량), 크립토픽스(5 당량) 및 K2C03(2.5 당량) 혼합물을 질소 기류하에 4번 탈수하였다. 여기에 아세토니트릴 2 mL내의 메실레이트 화합물 5(167 mg)을 첨가하였다. 반응물은 10분간 120 ℃의 모래조내에서 교반하였다. 종료 후, 조산물을 1H NMR한 결과 목적 산물 6과 크립토픽스의 혼합물인 것으로 확인되었다.
di-t-부틸 에스테르 6의 탈프로톤화는 (474 mg)과 트리플루오로아세트산(TFA)(17 mL)을 이용하여 30분간 10 ℃에서 수행하였고, 이후 증발시켜 건조하였다. 잔류 물질은 클로로포름으로 2회 더 증발시키고, 진공 라인상에서 건조하여, 백색 고체의 NST-ML-F-4(312 mg, 99%)을 회수하였다.
화합물의 NMR 데이타: 1H NMR(300 MHz, CDC13) δ 4.41 (dt, Jt = 5.9 Hz, Jd = 47.4 Hz, 2H), 1.97-1.91 (m, 2H), 1.89-1.83 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 1H), 1.58-1.52 (m, 1H), 1.33 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.25-1.14 (m, 2H), 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ 175.8, 86.2, 84.1, 58.6, 34.1, 30.1, 30.0, 27.9, 27.3, 27.0, 24.5, 14.6; 19F NMR (282 MHz, CD3OD) δ-220.9; MS (El) m/z 219 (M-H).
반응 1:
실시예 2:
NST-ML-F: 2-메틸-2(3-플루오로프로필)-말론산 합성(반응 2):
4-브로모-1-부탄올(1) 3 g을 1.5 당량의 3,4-디하이드로-2H-피란과 0.1 당량의 피리디늄 파라 톨루엔설포네이트(PPTS)으로 CH2C12 135 mL 내에서 처리하였다. 완료 후 정제하여, 1.45 g (33%)의 산물 2를 수득하였다. 1.0 당량의 디에틸메틸말로네이트를 1 당량의 NaH로 탈프로톤화하고, 1.0 당량의 브로마이드 2를 촉매 함량의 KI와 함께 50 ℃에서 첨가하였다. 10시간후 변환 완료를 관찰하였으며, 90% 수율이었다. 에탄올내에서 PPTS를 이용한 테트라하이도 피란(THP)의 탈보호화는 55 ℃에서 원활하게 진행하였다. 종료 후, 알콜 4의 정량적 수율을 구하여 메실레이션 반응(전술한 바와 동일)에 직접 사용하였다. 메실레이트 5를 이용하여, 크립토픽스 반응을 전술한 바와 같이 적용하였다. 68%의 수율로 화합물 6을 회수하였다. 화합물 6(233 mg)을 2 N NaOH / EtOH (30 mL/ 5 mL)로 50 ℃에서 처리하여 99% 수율로 NST-ML-F(190 mg)를 수득하였다.
상기 화합물의 NMR 데이타는 다음과 같다: 1H NMR(300 MHz, CDC13) δ 11.89 (bs, 2 H), 4.46 (dt, Jt = 5.9 Hz, Jd = 47.2 Hz, 2H), 1.99-1.92 (m, 2H), 1.82-1.64 (m, 2H), 1.50 (s, 3H), 1.50-1.40 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 178.6, 85.1, 82.9, 54.2, 35.5, 31.0, 30.8, 20.8, 20.7, 20.2; 19F NMR (282 MHz, CDC13) δ -219.0; MS (EI).
반응 2:
실시예 3
CD95에 의해 유도된 세포자살이 진행중인 배양한 Jurkat 세포에 대한 트리튬 표지된 NST200 및 NST205의 선택적 결합성
실험 과정
배양한 Jurkat 세포(인간 성체 T 세포 백혈병 세포)를 10% 소태아 혈청(FCS), 2mM의 L-글루타민, 1 mM의 소듐 피루베이트, 1 mM HEPES 및 항생제(100 units/ml 페니실린; 100 ㎕/ml 스트렙토마이신 및 12.5 units/ml 니스타틴)이 보강된 RPMI 배지(Beit-Haemek, Israel)내에서 현탁배양하였다. 세포자살 유도전에, 배지를 HBS 완충액(10 mM HEPES; 140 mM NaC1, 1 mM CaC1)로 교환하였다. 이후 CD95(0.1 ㎍/ l07 cells / ml)을 처리하여 세포자살을 촉발시켰다. 그 결과, 세포가 현저한 비율로 세포자살하였다. 비처리 세포는 대조군으로 사용하였다. 대조 군 세포와 세포자살 세포는 이후 실온에서 40분간 둔 다음 (2 μCi / 107 cells / 0.5 ml) 트리튬-표지된 NST200와 NST205를 처리하여 얼음위에서 30분간 두었다.
세포를 2회 세정한 다음, SOLVABLETM 시약(GNE9100, Packard Biosciences) l ml을 펠렛에 첨가하였다. 60 ℃에서 한시간 배양한 다음 추출물을 유리 신틸레이션 바이얼내로 이동시킨 다음 각 바이얼에 신틸레이션 용액(Ultima gold 6013329, Packard Biosciences) lO ml을 첨가하였다. 방사능은 실온으로 1시간 냉각시키고 암순응시킨 후 측정하였다. 방사능 수치는 측정하여 첨가한 총 방사능 표지된 NST200 및 NST205 비율로 나타내었다.
실험 결과
도 2A에서 명확하게 알 수 있는 바와 같이, 세포자살 세포는 비세포자살 세포에 비해 NST200(8배 이상)을 매우 다량으로 흡수하였다. 일 실험에서는 NST200이 세포자살 세포에 대해 선택적 결합을 할 수 있으며, 세포자살 세포 검출에 마커로서 제공할 수 있음을 보인 것이다. 이와 유사하게, 도 2B에서, 세포자살 세포는 비세포자살 세포보다 다량의 NST2O5를 흡수하였으나, 이에 카스파제 저해제인 ZVAD(카스파제의 플루오로메틸 케톤 펩티드(V-발린, A-알라닌, D-아스파르테이트) 저해제)를 첨가하는 경우 그 효과가 완전히 역위되었다.
실시예 4
세포자살 진행중인 배양한 HeLa 세포에 대한 NST203의 선택적 결합성
HeLa S3 세포를(ATCC CCL-2.2) L-글루타민 2 mM; 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 니스타틴 12.5 units/ml 및 10 % 소태아 혈청(FCS)이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)내에서 배양하였다. 10 ml의 10 cm3 배양판상에 5x106 세포/배양판의 밀도로 세포를 접종하여, 배양 배지 교환없이 96시간 배양하여 노화되도록 하였다. 그 결과, 세포의 상당 비율이 세포자살하였다. 세포 스크랩퍼를 이용하여 세포를 회수하고, 18G 바늘이 장착된 주사기를 통과시켜 단일 세포로 분리하였고, pH7.4의 PBS 완충액내에 106 세포/ml로 재현탁하였다. 전술한 바와 같이, 단실아미드기를 함유하고 있는 NST203은 단일 세포의 형광을 가시화할 수 있다. NST203의 세포자살 세포의 선택적 결합은 도 3A에 나타내었는데, 이는 NST203가 세포자살 세포 집단으로 흡수됨을 입증하고(푸른빛, 빨간 색상의 세포, 대표적인 것은 화살로 표시함) 있지만, 비세포자살 세포에서는 형광이 관찰되지 않았다(하늘빛, 빨간 색상의 세포는 없음, 화살촉으로 표시함).
이와는 반대로, 동일한 형광발색단을 가지지만 NST-ML-작용 모티프는 없는 대조군 화합물인 n-부틸-단실아미드(BDA)는 선택성을 나타내지 않았으며, 따라서, 세포자살 세포의 선택적 결합에 대한 NST-ML-작용 모티프의 활성을 발휘하지 못하였다(도 3B). 그러므로, NST2O3는 세포자살 세포에 대해 선택적인 결합을 수행하는 마커로서 제공할 수 있다.
실시예 5
마우스의 생체내 실험으로 화학요법으로 유발된 사멸 과정이 진행중인 흑색종 세포에 대한 NST203의 선택적 결합성
실험 과정
마우스(c57/black; 8 주령의 수컷)에 뮤라인 흑색종으로부터 유래된 B16-F10 세포(ATCC CRL-6475; 100 ㎕내 l05 세포/마우스)를 좌우 측면으로 피하 주사하였다. 주사전, 세포주는 L-글루타민 4 mM, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 니스타틴 12.5 units/ml 및 10 % 소태아 혈청(FCS)이 보충된 DMEM 내에서 유지시켰다. 10일 후, 종양의 직경이 5-7 mm에 도달하면, 마우스에 화학치료제(탁솔 20 mg/Kg + 사이클로포스포미드, 300 mg/Kg, 200 ㎕로 복막내 주사)를 주사하였다. 24시간 후에, NST-203를 10 % 발색단을 첨가한 트리스-베이스 완충액으로 투여량 2.8 mg/마우스로 정맥 주사하였다. 2시간 후, 마우스를 죽여 종양과 다른 기관을 회수하여 즉시 액체 질소내에서 동결시켰다. 종양이나 그외 다른 기관에 의해 흡수된 NST-203은 각 조직의 동결 단편에 대한 형광 현미경 관찰로 분석하였다.
실험 결과
도 4A는 종양의 형광 현미경 사진이다. NST2O3의 세포자살중인 다수의 종양 세포에 대해 광범위한 결합성을 관찰할 수 있다. 또한, 세포자살 세포내로의 현저한 흡수로 해설되는, 화합물의 세포내 축적(우측)과 고선택성이 입증되었지만, 주변의 살아있는 종양제포는 염색되지 않았다(도의 좌상단부).
화학요법은 종종 표적 종양 조직 뿐만 아니라 위장관의 상피세포와 같이 비표적 조직에서도 세포 사멸을 유발한다. 도 4B는 NST203의 세포자살중인 세포를 선택적으로 검출할 수 있는 능력을 나타낸다(화살표시). 종양에서 보여진 결과와 유사하게, 위장관내 살아있는 세포는 NST203를 흡수하지 않았으며, 어두운 상태로 남아있었다.
따라서, 이러한 결과는 본 발명의 화합물, NST203의 생체내 세포자살 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 증명하는 것으로, 상기 사멸 과정은 화학요법에 의해 유발된 것이다. 세포자살 세포는 관련 조직과 무관하게 보편적인 방법으로 검출된다. 대조적으로, 상기 조직의 살아있는 세포는 결합하지 않는다.
실시예 6
3
H-NST200를 이용한 오토라디오그래피에 의한 마우스 대장암 모델에서 화학요법에 대한 반응의 이미지화
실험 과정
대장암 모델을 Balb/c 수컷 마우스의 복부에 만들었다. 종양 크기가 직경 6-8 mm이 된 12-14일째에, 대장암의 종양에 독소루비신을 2회(20 mg/kg, 72 시간마다) 정맥내 주입하여, 종양내 NST200의 흡수를 측정하였다. 화학요법후 48시간이 경과하였을때 무처리 대조군과 화학요법 처리 동물 모두에 방사능 표지한 NST200(80 μCi/animal)을 정맥내 주사하였다. 4시간 후, 동물을 죽였다. 10 ㎛의 동결 단편을 준비하여 공기중에 건조시킨 다음 트리튬 감응 필름에 노출시켰다. 필름에 7주간 노출시켜 현상한 다음 밀도측정으로 분석하였다. 허혈성 수치 대 반대쪽 대뇌 신호에서 광학적 세기/mm2으로 3H-DDC 세기를 측정하여, TINA 소프트웨어로 평가하였다. 신호는 마이크로스케일의 방사능 측정 표준물에 따라 변이시켜, nCi/mg unit로 나타내었다.
실험 결과
무처리 종양에서는 NST200를 흡수하지 않아, 오토라디오그래피으로 이미지를 얻을 수 없었다(도 5A). 그러나, 화학요법에 의한 세포 사멸 유발시, NST200 흡수가 급격하게 증가되어, 방사능 조사로 인한 세포 사멸이 대규모로 이루어짐을 시사하였다(도 5B 및 C).
매우 어두운 부분을 형성하는 종양의 표면상에서 다수 부위에서 NST200 흡수를 검출할 수 있었다. NST-200 표지된 것은 종양내부의 세포자살 부위의 특정 위치에 위치되었으며, 종양 전체로 확대되지 않았다. 처리 종양의 살아있는 종양 조직인 다른 부위는 표지되지 않았다. 이러한 관찰 결과는 죽은 세포내에서만 다량 선택적으로 축적되고, 살아있는 세포에서는 축적되지 않는, NST200의 표적 분자로서 이점을 강조한다(도 5B). 동일한 종양내에서의 치료요법에 대한 이질적인 반응 특성은 도 5C에 나타나있다: NST200의 흡수는 세포사멸 증가를 나타낸 넓은 종양 부위에서만 축적되며, 그외 화학요법에 반응하지 않는 다른 종양에서는 축적되지 않는다.
실시예 7
대장암 모델의 3H-NST200 흡수: 화학치료 효과
실험 과정
대장암 모델
뮤라인 대장암 세포(CT-26)(ATCC CRL-2638)는 L-글루타민 2 mM, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 니스타틴 12.5 units/ml 및 10% 열처리한 불활화 FCS가 첨가된 RPMI(Gibco, LIX)에서 유지시켰다. 실험은 8-10주령의 Balb/C 수컷 마우스(20-25 gr)에서 수행하였다.
종양 접종
세포를 트립신으로 처리하여 HBS(140 mM NaCl; 0.5 M Hepes, PH 7.4)로 2회 세정한 다음 원심분리하여(5분, l000rpm, 4℃) (2%) 메틸 셀룰로스 및 염수(1:3)의 혼합물내에 2 x 106 cells/ml로 농축하였다. 상기 용액 0.2 m1(4x105 cells/dose 함유)을 마취된 마우스의 복부 양측에 피하 주사하였다. 마취 원액은 1:10으로 희석한 0.85 ml 케타민(100 mg/ml) + 0.15 m1 실라진(2%)으로 준비하였다. 체중 10 g 당 희석액 0.1 ml을 복막내 주사하였다.
종양 추적 조사:
촉진가능한 종양의 형성을 매일 검사하였다 종양 주사후 7-10일 경과하였을때 작은 종양이 관찰되었다.
3
H-NST200의 대장암 종양으로의 흡수 평가
대장암 종양에 독소루비신(20 mg/kg, 72시간 마다 주사)을 2회 정맥내 주사한 다음, 종양내 3H-NST200의 흡수를 측정하였다. 2차 주사후 48시간 경과시, 마우스에 3H-NST200(10 μCi/animal)을 정맥내 주사하였다. 4시간 후에, 종양을 회수하여 칭량한 다음, 조직을 처리하였다: 종양을 SOLVABLETM 시약(GNE9100, Packard Bioscience)으로 종양 조직 150 mg당 1 ml 비율로 60 ℃에서 20 m1의 신틸레이션 유리 바이얼내에서 라이시스하였다. 2-4시간 후, 각 조직 추출물 1 ml을 유리 신틸레이션 바이얼로 이동시켰다. 색상을 소멸시키는 문제점을 교정하기 위해, 샘플을 0.066 M EDTA내에서 30% H202 0.4 ml로 처리하였다. 실온에서 15분간 반응시킨 후, 추출물은 60 ℃에 1시간 둔 다음 실온에서 15분간 더 두었다. 신틸레이션 용액(Ultima gold, 6013329, Packard Bioscience) 10 ml을 각각의 바이얼에 첨가하였다. 이 바이얼은 실온에서 1시간 둔 다음 베타-카운터(TRT-CARB 2100TR, liquid scintillation analyzer, Packard Bioscience)에서 분석하였다. 모든 샘플을 3번, 측정하였고, 주입한 투여량에 대한 백분율(% ID/g 조직)을 각각의 샘플마다 계산하였다.
실험 결과
3H-NST200의 정량적 분석으로, 무처리 대조군 종양에 비해, 독소루비신 처리한 대장암 종양에 48시간 후 3H-NST200이 다량 축적되는 것으로 밝혀졌다. 대조군에서는, 종양 모두 유사한 수준으로 3H-NST200을 저량 축적하였지만, 화학요법을 수행한 종양에서의 축적 수치는 대조군에 40-50배였으며, 이는 축적된 종양들에서 매우 가변적이었다. 처리군의 평균 흡수값은 1.28 % ID/g이며, 이는 대조군의 평균 흡수값의 12.1배이다(도 6).
넓은 스펙트럼을 형성하는 3H-NST200 축적값은 상이한 종양의 항암치료에 대 해 개별적인 반응을 나타낸다. 상기 실험은, 3H-NST200이 암종 검출 및 암종 세포에 대한 세포독성 약물의 효과를 검사하는데 사용할 수 있음을 명확하게 입증한다.
실시예 8
대장암의 종양을 가지고 있는 마우스에서의
3
H-NST200의 생체 분포
실험 과정
상기 실시예에 개시된 바에 따라 Balb/c 수컷 마우스의 복부에 대장암 모델을 수립하였고, 상기 동물에 독소루비신과 3H-NST200(lO μCi)를 주사하였다. 4시간후, 동물을 죽여 여러 기관/조직을 회수 및 처리하여, 각각에 축적된 3H-NST200을 측정하였다. 각 기관의 흡수율은 주입 양(ID)의 %로 나타내었으며, 종양과 그외 기관간의 흡수 비율은 도 7의 표에 나타낸 바와 같이 계산하였다.
실험 결과
독소루비신에 의한 종양 조직 손상은 심장 및 소장을 포함한 그외 비표적 기관에 대한 손상보다 현저하였다. 표에서 종양 대 모든 기관에서의 흡수 비율은 >1로, 이는 종양에서의 세포자살 증가 및 표적 조직 대 비표적 조직에서의 선택적 3H-NST200 축적을 나타내는 것이다.
실시예 9
3
H-NST200은 종양 크기 축소전에 BiCNU-처리 종양내에서 발생되는 세포 사멸을 검출 할 수 있다.
실험 과정
상기 실시예 10에 개시된 바에 따라 Balb/c 수컷 마우스의 복부에 대장암 모델을 수립하였다. 종양 크기가 직경 6-8 mm이 되는 12-14일째에, 독소루비신을 마우스에 정맥내 주사하였다. 독소루비신은 3일 간격으로 총 2번 (1회당 20 mg/Kg) 주사하였다. 2차 독소루비신 주사후 2일째에, 마우스에 0.2 ml 염수내의 3H-NST200 10 μCi를 정맥내 주사하였다. 3H-NST200 주사후 4시간이 지난 후,펜탈 과다투여로 마우스를 죽였다. 에펜도르프 튜브에 종양을 수집하여 칭량한 다음 -20 ℃에서 냉동하였다.
SOLVABLETM 시약(GNE9100, Packard Bioscience)을 종양 조직 150 mg당 1 ml의 비율로 사용하여, 20 ml의 신틸레이션 유리 바이얼내에서 60 ℃에서 종양을 라이시스하였다. 2-4시간 후, 각 조직 추출물 1 ml을 유리 신틸레이션 바이얼에 넣었다. 색상을 소멸시키는 문제점을 교정하기 위해, 샘플을 0.066 M EDTA 존재하에서 30% H202 0.4 ml로 처리하였다. 실온에서 15분간 반응시킨 후, 추출물은 60 ℃에 1시간 둔 다음 실온에서 15분간 더 두었다. 신틸레이션 용액(Ultima gold, 6013329, Packard Bioscience) 10 ml을 각각의 바이얼에 첨가하였다. 이 바이얼은 실온에서 1시간 둔 다음 베타-카운터(TRT-CARB 2100TR, liquid scintillation analyzer, Packard Bioscience)에서 분석하였다. 주입한 투여량에 대한 백분율(% ID/g 조직)을 각각의 샘플마다 계산하였다. NST200 흡수와 종양 용적을 비교하여 나타내었다. 각 투여량을 종양 용적과 관련시킨 후 NST200의 흡수값을 식(구형 종양으로 추정) V=πD3/6, D는 평균 종양 직경으로 계산하였다.
실험결과
독소루비신을 처리하는 동안(5일간), 종양의 중량은 감소되지 않았다(도 8A). 반대로, 종양은 계속 성장하여 처리한 종양보다 5일 일찍 수집한 무처리 대조군 종양에 비해 50%로 부피가 증가하였다. 이러한 증가는 유의적이지 않은 것으로 확인되었다. 이러한 종양의 유의적이지 않는 부피 변화는 독소루비신 2회 처리후 발생되었지만, 3H-NST200 흡수율이 18.5배로 현저하게 증가한 것으로 확인되었는데, 이는 3H-NST200이 종양 중량의 축소가 관찰되지 않는 경우에서도 종양내의 세포 사멸을 감작할 수 있는 민감한 도구임을 시사하는 것이다(도 8B).
실시예 10
마우스에서의 중간대뇌동맥 폐색에 따른 세포자살성 상해의 오토라디오그래피 방법에 의한 검출에 있어서의, 트리튬 표지된 NST200의 용도
실험 과정
현저한 허혈성 상해로 인한 증상을 가지고 있는 Balb/C 마우스에서 측두골하 접근법(subtemporal approach)을 통하여 p-MCA를 유도하였다. p-MCA 후 22시간이 경과하였을때, 동물의 신경학적 수치를 (임상적 증상이 없는 0에서 반신마비, 돌기 및 긴장병의 3으로) 평가하였고, 방사능 표지한 NST200(80 μCi/animal)를 2시간동 안 연속하여 정맥내 주입한 다음 동물을 죽였다. 10 ㎛의 동결 단편을 준비하여, 공기중에 건조시킨 다음 트리튬 감응 필름(Hyperflm-3h, RPNS35B Amersham-Pharmacia, Eu)에 노출시켰다. 필름은 7주간 노출시킨 다음, 현상하여(GBX Developer & Fixer, Kodak, USA), 농도 측정기로 분석하였다. 3H-DDC 강도는 광학적 강도/mm2으로 허혈성 코어 대 반대측 대뇌 신호에 대해 측정하여, TINA 소프트웨어로 평가하였다. 신호는 마이크로스케일 오토라디오그래피 표준체(RPN510 Ammersham-Phanmacia, Eu)에 따라 변환하였고 nCi/mg unit로 나타내었다.
실험 결과
3H-NST200의 축적(a) 및 H&E 염색(b)을 나타낸 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 오토라디오그래피 이미지 분석으로, 세포자살/세포괴사성 세포 사멸부위내 상해를 3H-NST200가 표적화하는 특이성이 밝혀졌다. 이 결과는 H & E 염색으로 더욱 확인하였다. 따라서, 3H-NST200은 오토라디오그래프 이미지 분석에서 뇌의 세포자살 손상에 대한 마커로서 사용할 수 있다.
실시예 11
랫 허혈성 재관류(I/R)의
3
H-방사능 표지한 NST200에 의한 오토라디오그래피
실험 과정
수술은 케타민(80 mg/kg) 및 크실라진(10 mg/kg)을 복막내 병용 투여하여 유 도한 일반적인 마취상태하의 랫을 대상으로 수행하였다. 작은 비외상성 혈관 클램프를 이용하여 일측성 좌측 신동맥을 45분간 클램프하여 신허혈증을 유도하였다. 동일한 실험 동물의 반대쪽 무처리 신장은 모의 조작한 대조군 신장으로 두었다. 클램프를 제거하여 재관류를 개시하였다. 신장 재관류 시간은 24시간이다. 재관류를 하는 동안, lOO μCi의 3H-NST205를 정맥내 주사한 다음 한시간 후 양쪽 신장을 적출하여 질소 액체에서 동결시킨 후 사용하기 전까지 -70 ℃에 보관하였다. 10 ㎛의 동결 단편을 준비하여 공기중에 건조한 다음, 트리튬 감응 필름(Hyperflm-3h, RPNS35B Amersham-Pharmacia, Eu)에 노출시켰다. 필름은 7주간 노출시킨 다음, 현상하여(GBX Developer & Fixer, Kodak, USA), 농도 측정기로 분석하였다. 3H-DDC 강도는 광학적 강도/mm2으로 허혈성 신장 대 반대쪽의 신장 신호에 대해 측정하여, TINA 소프트웨어로 평가하였다. 신호는 마이크로스케일 오토라디오그래피 표준체(RPN510 Ammersham-Phanmacia, Eu)에 따라 변환하였고 nCi/mg unit로 나타내었다.
실험 결과
도 10에 나타낸 바와 같이, 랫 신장에서 허혈증-재관류 상해시, 피질-수질 부위와 외측 수질(OM)의 원위세관(distal tubule)에서 세포자살이 관찰되었으나, 심각한 세포괴사는 외측 수질의 근위직세관(proximal straight tubule)에서 관찰되었다. 피질에서는 손상이 거의 관찰되지 않았다. 반대쪽 모의 신장의 세관에서는 손상이 관찰되지 않았다. 오토라디오그래피 이미지 분석으로, 세포자살/세포괴사 성 세포 사멸부위내 손상을 3H-NST200가 표적화하는 특이성이 밝혀졌으며, 형태학적 분석으로도 검증되었다. 반대로, 반대측 신장내 3H-NST200 흡수는 관찰되지 않았으며, 이는 손상된 신장으로만 3H-NST205가 특이적으로 흡수됨을 나타내는 것이다.
실시예 12
방사능 조영제로 인해 유발된 급성 원위세관 괴사(ATN)의 랫 모델에서
3
H-NST205에 의한 오토라디오그래피
실험 과정
인도메타신(Sigma Chemical Co.) 10 mg/kg, i.v., Nω니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME, Sigma Chemical Co.), 10 mg/kg, i.v., 및 방사능조영제인 소듐-이오탈라메이트 80%(Angio-Conray, Mallinckrodt Inc), 6 mL/kg, i.a을 조합 투여하여, 수질 저산소성 세뇨관에 선택적 손상(selective medullary hypoxic tubular damage)이 있는 신증(Nephropathy)을 유발하였다. 다른 랫에는 비히클을 투여하여 대조군으로 사용하였다. 상해후 24시간 경과하였을때, 대조군 및 실험 동물 모두에 lOO μCi의 3H-NST2O5를 정맥내 주사하고, 1시간 후 신장을 적출하여 액체 질소에서 동결시켰다.S
실험 결과
도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 신장의 형태 분석 결과 수질(즉, 외측 수 질의 외부 및 내부 스트립)의 넓은 면적이 노출되었다. 3H-NST205의 흡입은 주로 외측 수질내 손상된 부위로만 한정되었다. 형태학적 손상이 없는 특정 부위에서는 3H-NST205의 흡입이 관찰되지 않았다.
실시예 13
3
H-200에 의한 자가면역성 뇌척수염(EVE)의 이미지화; 오토라디오그래피
실험 과정
6-8주령의 C3H.SW/C57/bl 암컷 마우스를 면역화하여, EAE를 유도하였다. 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG)의 35-55 아미노산을 포함하는 펩티드로, 동물을 면역화하였다. 상기 펩티드는 펩티드 합성기상에서 고상 기법으로 합성하였다. 마우스의 옆구리 한 부위에, 완전 프레운드스 보강체(CFA)내의 MOG 펩티드 75 ㎕와 미코박테리움 튜베르쿨로시스 200 ㎍을 함유하는 에멀젼 200 ㎕을 피하 주사하였다. 동일한 접종을 1주일후 다른 옆구리에 주사하였다. 뇌척수염 유발후, 마우스를 매일 관찰하여, EAE의 임상적인 증상을 (임상적인 증상이 없는 0에서 다리 4개가 모두 마비되는 5점으로) 수치화하였다. 특정 질병 단계에서(전증상기 또는 마지막 단계), 동물에 방사능 표지된 NST200 (100 μCi/animmal)를 주사하여 한시간 둔 다음 동물을 죽였다. 10 ㎛의 동결 단편을 준비하여, 공기중에 건조시키고 트리튬 감작성 필름에 노출시켰다. 필름은 7-9주간 노출시킨 다음, 현상하여 농도 측정기로 분석하였다. 3H-DDC 강도는 광학적 강도/mm2으로 허혈성 코어 대 반 대측 대뇌 신호에 대해 측정하여, TINA 소프트웨어로 평가하였다.
실험 결과
다발성 경화증의 EAE 동물 모델은 중추신경계의 백색질을 표적화하는 만성 무력성 자가면역 신경성 질환(chronic disabling autoimmune neurological disorder)을 모방한다. 도 12의 오토라디오그래피에서 실험 동물의 백색질의 심각한 손상이 관찰되었다. 뇌의 관상면(coronal section)에서 뇌 하부 추체로(pyramidal tract)에 진한 염색과, 전체 뇌에서의 과잉의 방사능-리간드 축적이 나타났으며, 이는 면역화하지 않은 대조군 마우스의 연한 염색과는 대조적이었다. 방사능 표지한 3H-200의 강한 축적은 또한 척추에서도 관찰되었다. 척추의 종단면도에서, 무처리한 대조군 동물의 척추에 비해 면역화한 마우스 백색질의 외측로(lateral tract)가 보다 높은 수준으로 표지되었다.
Claims (27)
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- 삭제
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- 하기 식(V)로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 및 용매화물을 포함하는, 하기 식(V)로 표시되는 화합물:식(V)
상기 식(V)에서,J는 18F이고;r은 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다. - 제4항에 있어서, r은 4 또는 5의 정수인 화합물.
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Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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