KR101179166B1 - 백시니아 바이러스로부터 유래된 신규한 항암 바이러스 ｓｌｊ－４９６ - Google Patents

백시니아 바이러스로부터 유래된 신규한 항암 바이러스 ｓｌｊ－４９６ Download PDF

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스로부터 유래된 신규한 항암 바이러스 SLJ-496에 관한 것으로, 보다 자세하게는 종양 조직을 가진 숙주 동물의 면역 억제 조건하에서 생존 가능한, 백시니아 바이러스 유래의 항암 바이러스 SLJ-496, (1) 면역 억제 조건하에서 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 백시니아 바이러스를 주입하는 단계와 (2) 상기 동물의 종양 크기가 감소하면서 혈액에서 바이러스 검출될 때 혈액에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 항암 바이러스 SLJ-496의 제조방법 및 상기 항암 바이러스 SLJ-496을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

Description

백시니아 바이러스로부터 유래된 신규한 항암 바이러스 ＳＬＪ－４９６{Novel oncolytic virus derived from vaccinia virus}
본 발명은 신규한 항암 바이러스에 관한 것으로, 보다 자세하게는 백시니아 바이러스로부터 유래된 신규한 항암 바이러스 SLJ-496, 상기 바이러스의 제조방법 및 상기 바이러스를 포함한 항암용 조성물에 관한 것이다.
정상 조직 항상성은 세포 증식 및 세포 사멸의 고도로 조절된 과정이다. 세포 증식 또는 세포 사멸의 불균형은 암성 상태로 발전될 수 있다. 예를 들면, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 췌장암, 직장결장암 및 뇌암은 생성될 수 있는 많은 암들 중 단지 몇몇 예일 뿐이다. 사실, 암의 발생은 매우 높아서 미국에서만 암으로 인해 매년 500,000 이상의 사망자가 발생한다.
세포 증식 및 세포 사멸의 유지는 적어도 부분적으로 원종양유전자 및 종양 억제자에 의해 조절된다. 원종양유전자 또는 종양 억제자는 세포성 증식을 유도하는 단백질 (예를 들어, sis, erbB, src, ras 및 myc), 세포성 증식을 억제하는 단백질 (예를 들어, Rb, p16, p19, p21, p53 및 NF1 및 WT1) 또는 예정된 세포 사멸을 조절하는 단백질 (예를 들어, bc1-2)을 코딩할 수 있다. 하지만, 이러한 원종양유전자 및 종양 억제자의 유전적 재배열 또는 돌연변이는 원종양유전자를 강력한 암유발 종양유전자로 전환시키거나 또는 종양 억제자를 비활성 폴리펩티드로 전환시키는 결과를 가져온다. 종종, 단일 점 돌연변이는 형질전환을 달성하기에 충분하다. 예를 들면, p53 종양 억제자 단백질에서의 점 돌연변이는 야생형 p53 기능을 완전히 상실시킨다.
현재, 많은 일반적인 암 유형의 치료에 대한 효과적인 선택 방법은 거의 없다. 개인에 대한 치료 과정은 진단, 질병의 발달 단계 및 환자의 나이, 성 및 일반적인 건강과 같은 인자에 따른다. 암 치료의 가장 통상적인 선택방법은 수술, 방사선 요법 및 화학요법이다. 수술은 암의 진단 및 치료에 중심적인 역할을 한다. 통상적으로, 수술적 접근은 생검 및 암 성장의 제거에 필요하다. 하지만, 암이 전이되었거나 널리 퍼졌을 경우, 수술을 통해 치료되지 못할 것이며, 또 다른 접근법을 선택해야만 한다.
방사선 요법 및 화학요법은 암의 수술적 치료에 대한 가장 보편적인 대안책이다. 방사선 요법은 고에너지 방사선을 정확히 조준하여 암 세포를 파괴하는 것을 수반하며, 수술과 마찬가지로, 전이되지 않은 국소적 암 세포의 치료에만 주로 유효하다. 방사선 요법의 부작용은 피부 자극, 연하의 어려움, 구강 건조, 구역, 설사, 탈모 및 에너지의 손실을 포함한다. 항암제로 암을 치료하는 것은 암 치료의 또 다른 양식인데, 대부분의 화학요법은 많은 다양한 암에 대한 반응 속도를 증가시키는 것으로 입증된 1 이상의 항암제의 병용을 포함한다. 하지만, 화학요법 약물의 주요 부작용은 이들이 정상 조직 세포에도 또한 영향을 미치는데, 몇몇 경우에 가장 많이 영향을 받을 가능성이 있는 세포들은 빠르게 분열하는 세포들이다 (예를 들어, 골수, 위장관, 생식기 계통 및 모낭). 화학요법 약물의 다른 독성 부작용은 구내염, 연하의 어려움, 구강 건조, 구역, 설사, 구토, 피곤, 출혈, 탈모 및 감염을 포함할 수 있다.
복제-선택성 종양 살상형 바이러스는 암의 치료에 대해 희망을 가져왔다. 이들 바이러스는 직접 복제-의존성 종양살상 작용 및/또는 바이러스 유전자 발현-의존성 종양살상 작용을 통해 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 나아가, 바이러스는 숙주내의 세포-매개 항종양 면역의 유도를 향상시킬 수 있다. 또한 이들 바이러스를 종양 내에서 발현되는 치료학적 형질전환 유전자로 조작하여 항종양 효율을 향상시킬 수 있다. 하지만, 이러한 치료학적 접근에 대해 많은 제한들이 존재한다.
백시니아 바이러스는 야생형 자체로서 암세포에 선택성을 가지고 있지만, JX-594를 비롯하여 유전적 변형을 통해 항종양능이 개선된 항암 바이러스의 개발이 진행되고 있다. JX-594는 와이에쓰 주(Wyeth strain) 백시니아 바이러스에서 티미딘 키나제(Thymidine kinase) 유전자를 결손시키고 hGM-CSF 유전자를 삽입시켜 종양세포에서 선택적으로 복제되어 종양세포를 선택적으로 파괴하면서 전신적인 항종양 면역반응을 자극하도록 만든 항암 바이러스이다.
현재 JX-594는 간암, 대장암, 피부암에서 국소적 투여에 의한 다국적 임상 2상 시험이 진행 중이다. 그러나, JX-594는 혈관 주사시 상대적으로 효능이 떨어지고, 반복 전신 투여 시 중화 항체 형성으로 약물 효능이 감소하기 때문에 전신 투여 시 더욱 효과적으로 암세포 증식능을 가진 항종양 바이러스가 필요하다.
한편, JX-963은 웨스턴 리저버 (Western Reserve) 백시니아 바이러스 원형 바이러스에서 TK (Thymidine Kinase)와 VGF (vaccinia growth factor) 를 제거한 후 GM-CSF를 삽입시킨 항암 바이러스로, 전임상 약리 시험에서 혈관 주사시 JX-594 보다 향상된 항암 효능을 보였으며, 현재 초기 임상시험 중이다.
다른 종류의 원형 바이러스에서 유래한 항암 바이러스와 마찬가지로, 백시니아 원형 바이러스에서 유래한 다양한 종류의 항암 바이러스가 개발 중이며, 각각의 유전적 특징에 따라 특징적인 종양 형태에 효과적인 항암 효능을 나타낸다. 따라서, 유전적 재조합법에 의한 방법, in vitro에서 진화된 형태의 바이러스 선별 등의 방법에 따라 다양한 종류의 항암 바이러스가 개발되고 있다.
본 발명은 기존의 항암 바이러스 제조와 달리 VX2 토끼 종양 모델에서 면역 억제하에서 종양반응과 관련된 진화 바이러스를 생물학적으로 선택해서 증식해서 개발하고자하였다.
본 발명은 JX-594 혹은 JX-963 보다 종양 살상능과 종양 특이성이 개선된 항암 바이러스를 제공하고자 한다.
이를 위해, 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 다양한 면역 억제 조건을 제공하면서 저농도의 백시니아 바이러스를 주입하였고, 특정한 면역 억제 조건에서 저농도의 백시니아 바이러스가 혈액에서 감지되면서 종양의 크기가 감소됨을 확인하였다. 그리고, 상기 혈액으로부터 분리된 바이러스가 백시니아 바이러스와는 상이한 유전자 구조를 가지고 있으며, 시험관내 및 생체내 실험을 통해 JX-594 및 JX-963 보다 우수한 종양 살상능과 종양 특이성을 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명의 한 관점은 종양 조직을 가진 숙주 동물의 면역 억제 조건하에서 생존 가능한, 백시니아 바이러스 유래의 항암 바이러스 SLJ-496에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 (1) 면역 억제 조건하에서 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 백시니아 바이러스를 주입하는 단계와 (2) 상기 동물의 종양 크기가 감소하면서 혈액에서 바이러스 검출될 때 혈액에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 항암 바이러스 SLJ-496의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 항암 바이러스 SLJ-496을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 항암 바이러스 SLJ-496(KCTC 11704BP)은 면역 억제 조건하에서 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 백시니아 바이러스를 주입한 후 상기 동물의 종양 크기가 감소하면서 혈액에서 바이러스 검출될 때 혈액으로부터 분리된 항암 바이러스이다.
상기 '백시니아 바이러스' 주(strain)는 웨스턴 리저브(Western Reserve), 코펜하겐(Copenhagen), 와이에쓰(Wyeth) 일 수 있으나, 와이에쓰 주가 특히 바람직하다. 상기 백시니아 바이러스는 자연형 또는 유전적으로 변형된 것일 수도 있다.
상기 '숙주 동물'은 백시니아 바이러스의 숙주 동물 (포유동물, 조류)이면 어떠한 종류의 동물일 수 있으나, 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스, 래트가 바람직하며, 토끼가 특히 바람직하다.
상기 '종양 조직'은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 피부암, 결장암 또는 자궁경부암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 양태로서, '종양 조직을 가진 숙주 동물'은 VX2 암세포를 가진 토끼인 것이 바람직하다. 이 토끼는 JX-594의 전임상 독성 및 전임상 약리 시험이 행해졌던 숙주동물이며, 백시니아 바이러스의 증식이 사람과 유사한 것으로 알려져 있다.
상기 '면역 억제 조건'은 숙주 동물과 면역 억제제의 종류에 따라 다양하게 설정할 수 있다. 당해 숙주 동물에게 1종 이상의 면역 억제제를 투여함으로써 면역 억제 조건을 유도할 수 있다. 본 발명에서는 사이클로스포린(cyclosporine)과 프레드니손(prednisone)을 복합 투여하여 면역 억제 조건을 유도할 수 있으며, 이 경우 3~5 mg/kg/2d의 사이클로스포린과 0.5~1.5 mg/kg/2d의 프레드니손에 의해 유도하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 항암 바이러스를 제조하기 위해 종양 조직을 가진 숙주 동물에 저농도의 백시니아 바이러스를 주입하는 것이 바람직하며, 107~9의 농도로 주입하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 항암 바이러스는 숙주 동물의 종양 조직을 비롯하여 바이러스가 검출되는 모든 조직으로부터 분리할 수 있으나, 혈액으로부터 분리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 항암 바이러스, 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-594 바이러스가 여러 암세포주에서 형성하는 플라그(plaque)의 크기를 비교한 결과, 본 발명의 바이러스에 의해 형성된 플라그의 크기가 가장 크다는 것을 확인하였다. 일반적으로 항암 바이러스에 의한 플라그의 크기는 항암 바이러스의 방관자 효과(bystander effect)와 유관하므로 본 발명의 항암 바이러스가 백시니아 바이러스 및 JX-594에 비해 항종양 효능이 개선된 것이다(도 2 참조).
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 항암 바이러스, 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-963 바이러스의 흑색종에 대한 항종양 효능을 비교한 결과, 본 발명의 항암 바이러스가 종양의 크기가 가장 크게 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항암 바이러스는 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-963 바이러스에 비해 항종양 효능이 개선된 것이다. 일반적으로 JX-963은 JX-594에 비해 항종양 효능이 높은 것으로 알려져 있다(도 3a 참조).
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 항암 바이러스와 와이에쓰 주 백시니아 바이러스의 간암에 대한 항종양 효능을 비교한 결과, 본 발명의 항암 바이러스가 와이에쓰 주 백시니아 바이러스에 비해 항종양 효능이 개선되었음을 확인하였다(도 3b 참조).
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 항암 바이러스, 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-963 바이러스의 조직 분포를 확인한 결과, 모든 바이러스가 종양 세포와 난소 조직을 제외한 다른 조직에서는 거의 검출되지 않았으며, 특히 암 세포에서 바이러스를 정량한 결과 SLJ-496> JX-963> 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 순으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항암 바이러스는 백시니아 바이러스 및 JX-594, JX-963에 비해 종양 특이성이 개선된 것이다(도 3c 참조).
한편, 본 발명의 SLJ-496 바이러스와 이의 모바이러스(parental virus)인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스로부터 DNA를 분리한 후 HindIII 처리하고, 전기영동을 실시한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 SLJ-496와 와이에쓰 주 백시니아 바이러스의 유전자 지도가 상이함을 확인하였다. 즉, 본 발명의 SLJ-496 바이러스와 이의 모바이러스는 상이한 유전 정보를 가진, 서로 다른 바이러스이다.
이상과 같이, 본 발명의 SLJ-496 바이러스는 이의 모바이러스인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스와 유전 정보가 상이하고, 종래의 항암 바이러스인 JX-963 및 JX-594에 비해 항종양 효능 및 종양 특이성이 개선된 신규한 균주이므로 KCTC(Korean Collection for Type Culture)에 2010년 5월 27일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 11704BP를 부여받았다.
본 발명의 다른 관점은 (1) 면역 억제 조건하에서 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 백시니아 바이러스를 주입하는 단계와 (2) 상기 동물의 종양 크기가 감소하면서 혈액에서 바이러스 검출될 때 혈청에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 항암 바이러스 SLJ-496의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 SLJ-496을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유전자 요법에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 약제학적 조성물은 바이러스가 사람을 포함한 포유동물에 대해 하루에 체중 1kg 당 1ng 내지 100㎍, 바람직하게는 10ng 내지 10㎍의 양으로 투여되도록 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 결정되어야 하는 것이므로 상기 투여량을 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 실온에서 안정성을 증가시키고, 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명(self-life)을 연장하기 위해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 이차 건조 공정은 압력을 강하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계를 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.
동결건조된 제제에는 부형제(excipient) 및 동결건조보호제(lyoprotectant)가 포함될 수 있다. 부형제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 0.9% NaCl과 10mM 인산나트륨 (pH 7.0) 또는 10mM 나트륨 시트레이트 (pH 7.0)의 완충액이 포함된다. 동결건조보호제는 동결 및 건조 공정 동안에 생물학적 분자를 보호하고 최종 산물에 기계성(mechnical support)을 부여하는 역할을 하며 이들의 예로는 PBS(pH 7.0), PBS/4%, 12% 또는 15% 트레할로스 등을 들 수 있다.
본 발명의 항암 바이러스 SLJ-496은 종래의 항암 바이러스인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-594 보다 개선된 항종양 효능을 보유한다.
또한, 본 발명의 항암 바이러스 SLJ-496은 종래의 항암 바이러스인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 및 JX-963 보다 개선된 종양 특이성을 보유한다.
도 1a는 본 발명의 항암 바이러스 SLJ-496의 제조방법을 간략하게 나타낸 것이다.
도 1b는 바이러스의 약동학과 VX2 종양 크기 변화를 나타낸 것으로, 종양 크기가 줄어드는 시점에서 혈액내 바이러스의 양이 지수 함수적으로 증가하고 있음을 보여준다.
도 2(A)는 BSC 세포에서 와이에쓰 주 백시니아 바이러스, JX-594, SLJ-496 바이러스가 형성한 플라그 크기를 나타낸 것이고(좌: 육안 관찰, 우: 현미경 관찰), 도 2(B)는 상기 바이러스에 의해 A2780 세포주, HeLa 세포주, PC3 세포주, BSC 세포주에 형성된 플라그 크기의 평균값을 나타낸 것이다.
도 3a는 흑색종 동물 모델에서 와이에쓰 주 백시니아 바이러스, JX-963, SLJ-496 바이러스의 항종양 효능을 나타낸 것이다.
도 3b는 간암 동물 모델에서 와이에쓰 주 백시니아 바이러스, SLJ-496 바이러스의 항종양 효능을 나타낸 것이다.
도 3c는 와이에쓰 주 백시니아 바이러스, JX-963, SLJ-496 바이러스의 종양 특이성을 나타낸 것이다.
도 4는 SLJ-496 바이러스와 이의 모바이러스(parental virus)인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스에서 DNA를 분리하고 HindIII 처리 후 유전자 지도를 나타낸 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: VX2 암세포 토끼 모델의 확립
VX2 암세포 토끼 모델은 New Zealand White rabbits (Samtako, Oh San, South Korea)의 근육에 1~2 mm의 암조직 3 조각을 1㎖의 PBS에 용해시킨 뒤 18-gauge 바늘을 이용하여 주사하여 확립하였다. 암세포 식립 14일 후, 3마리의 실험군 토끼의 귀 정맥에 3 x 107 (total volume of 10 ml (virus suspension mixed with PBS up to the desired volume))의 와이에쓰 주 백시니아 바이러스(ATCC)를 5분에 걸쳐 1회 투여하였다. 면역 억제를 위해 사용한 사이클로스포린 A(Cyclosporine A, 4mg/kg/2day)는 근육 주사 하였고, 프레드니손(prednisone, 1mg/kg/2day)은 구강내로 투여하였다.
실시예 2: SLJ-496의 제조
본 발명의 항암 바이러스인 'SLJ-496'은 상기한 VX2 암세포 토끼 모델에서 얻은 혈장(300 ㎕ in 270 ㎕ DMEM)으로부터 유래하였다. 4 x 105 세포/웰의 BSC-1 세포(원숭이 유래 상피세포)가 담겨져 있는 6웰 플레이트(left overnight)에 상기 혈장을 가한 뒤, 바이러스 감염이 완전하게 일어나도록 2시간을 기다렸다. 2시간 경과 후 2% 아가로스와 2x DMEM이 1 : 1로 혼합된 배지로 교체하고, 48시간 동안 정치배양시켰다. 단일 플라그를 분리한 후, 감염 3일 후 세포가 용해되면, 균질화(Homogenize), 초음파처리(Sonicate)한 뒤 SLJ-496을 증폭시키기 위해 Hela 세포주에 재감염시켰다.
실시예 3: 플라그 분석(plaque assay)
사람의 난소암 세포에서 유래한 A2780 세포주를 4 x 105 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 접종하고, 이튿날, 1.0 PFU/세포 농도의 바이러스(와이에쓰주 백시니아 바이러스, JX-594 또는 SLJ-496 바이러스)를 가하고 감염이 완전하게 일어나도록 2시간 기다렸다. 2시간 경과 후 3% 카르복시메틸셀룰로스와 2x DMEM이 1 : 1로 혼합된 배지로 교체하고 48시간 동안 배양시켰다.
이와 동일한 플라그 분석이 Hela 암세포주, PC3세포주, BSC 세포주에 대해서도 수행되었다.
플라그의 크기와 형태는 바이러스의 종류와 세포주의 종류에 따라 다르게 나타나므로 일차적 특징을 지을 수 있는 수단이 될 수 있다. 따라서 와이에쓰 주 백시니아 바이러스, JX-594, SLJ-496 바이러스가 A2780 세포주, Hela 암세포주, PC3 세포주, BSC 세포주에서 형성하는 플라그의 형태와 크기를 비교하였다. 도 2(A)의 좌측 사진은 6웰에 나타난 플라그 형태를 일반 사진기로 촬영한 것이고 (상: 와이에쓰 주, 중: JX-594, 하: SLJ-496) 도 2(A)의 우측 사진은 40배 현미경하에서 단일 플라그를 촬영한 대표적 사진이다. 도 2(B)는 각 세포주에서 서로 다른 바이러스에 의해 형성된 플라그 크기를 평균 내어 그래프로 나타낸 것이다. 이때 별개로 실험한 3개의 플레이트에서 무작위적으로 플라그를 선택하여 플레이트당 30개의 플라그 크기 평균을 나타내었다 (n=90 for each).
특히, BSC 세포에서 상기 세 종류의 바이러스에 의해 형성된 플라그 크기를 분석한 결과, SLJ-496에 의해 형성된 플라그의 크기가 가장 큰 것으로 확인되었다. 항암 바이러스에 의한 플라그의 크기는 항암 바이러스의 bystander effect와 유관할 수 있으며, 따라서 SLJ-496이 와이에쓰 주 백시니아 바이러스와 JX-594에 비해 우수한 항종양 활성을 나타냄을 유추할 수 있다.
실시예 4: 혈액 분석법
VX2 토끼의 귀에서 혈액을 채취한 뒤, 백혈구로부터 DNA를 얻어 바이러스의 DNA collection kit(QIAGEN)을 이용하여 분석하였다.
또한, 바이러스를 방출시키기 위해 혈액의 냉동/해동을 3회 수행한 뒤 플라그 분석법을 통해 전체 혈액에서 감염성 바이러스 단위(infectious viral units)를 계측하였다.
실시예 5: 마우스 종양 모델에서 항종양 효능 및 종양 특이성 분석
(1) 흑색종 동물 모델
흑색종 세포주인 B16F1 세포를 in vitro에서 배양한 뒤 5 x 105 세포(in 100㎕의 PBS)의 농도로 C57Bl/6 마우스(Samtako사)의 옆구리 부근(flank)의 피하에 식립하였다. 그리고, 자연형 와이에쓰 주 백시니아 바이러스 [SLJ-496의 모바이러스(parental virus)], JX-963, SLJ-496을 각각 107pfu의 농도로 단회 전신 투여하였다.
흑색종 동물 모델에서 백시니아 항암 바이러스간의 항종양 효능을 비교한 결과, SLJ-496을 투여한 모델에서 항종양 효능이 가장 높은 것으로 규명되었다(도 3a).
도 3a에 나타낸 바와 같이 생리 식염수를 투여한 대조군에 비해 자연형 와이에쓰 바이러스 자체도 전신 투여시 유의한 항암 효능을 나타내었으며, 마우스 모델에서 전신 투여시 강력한 항암 효능을 나타내는 것으로 알려진 JX-963보다 SLJ-496이 보다 강한 항암 효능을 보였다. 바이러스의 항 종양 효능은 바이러스의 전신 투여 후 종양의 부피를 측정하여 비교하였다 [(너비)2 x 길이].
(2) 간암 동물 모델
간암 세포주인 TIB-75도 in vitro에서 배양한 뒤 5 x 105 세포(in 100㎕의 PBS)의 농도로 7-8주 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리 부근에 피하 주사하였으며, 암의 직경이 5mm에 이르렀을 때 1 x 107 ~ 2 x 107 pfu 농도의 SLJ-496을 전신 투여하였다. 대조군으로 SLJ-496 바이러스의 모바이러스 인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스가 동일하게 처리되었다.
간암 동물 모델에서 SLJ-496과 이의 모바이러스인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스의 항암 효과를 비교한 결과, 뚜렷한 SLJ-496의 항암 효과가 규명되었다. 도 3b에서 화살표는 SLJ-496 또는 와이에쓰 백시니아 바이러스를 투여한 시점이다.
실시예 6: 종양 특이성 분석
간암 세포주 TIB-75를 식립한 종양 마우스 모델에 세 가지 종류의 바이러스를 106pfu의 농도로 정맥 투여한 후 9일째 희생시켜 각 기관을 제거한 후, 조직에서 DNA를 분리하여 QPCR로 백시니아 바이러스를 정량하였다. 자연형 백시니아 바이러스인 와이에쓰 주 바이러스를 포함하여 JX-963, SLJ-496 바이러스는 종양 세포와 난소 조직을 제외하고 거의 대부분의 조직에서는 검출되지 않았으며, 암세포에서 바이러스의 정량 결과는 SLJ-496 > JX-963 > 와이에쓰 주의 순으로 나타났다. 즉, 다른 백시니아 바이러스에 비해 SLJ-496의 종양세포 특이성이 높다는 것이 규명되었다(도 3c).
실시예 7: SLJ-496 바이러스의 유전적 특성 분석
SLJ-496 바이러스와 이의 모바이러스인 와이에쓰 주 백시니아 바이러스로부터 DNA를 분리한 후 HindIII 처리하고, 전기영동을 실시하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 SLJ-496와 와이에쓰 주 백시니아 바이러스의 유전자 지도가 상이함을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11704BP 20100527

Claims (11)

  1. 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 피부암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 기저편평상피암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 종양 조직을 가진 숙주 동물에 면역 억제제를 투여함으로써 유도된 면역 억제 조건 하에서 생존 가능한, 백시니아 바이러스 유래의 항암 바이러스 SLJ-496(KCTC 11704BP).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 와이에쓰 주(Wyeth strain)인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 종양 조직을 가진 숙주 동물은 간암(VX2) 세포를 가진 토끼인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 억제제를 투여함으로써 유도된 면역 억제 조건은 3~5 mg/kg/2d의 사이클로스포린과 0.5~1.5mg/kg/2d의 프레드니손에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 바이러스.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 바이러스는 숙주 동물의 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 바이러스.
  6. (1) 면역 억제제를 투여함으로써 유도된 면역 억제 조건하에서 제 1항의 종양 조직을 가진 숙주 동물에게 백시니아 바이러스를 주입하는 단계;
    (2) 상기 동물의 종양 크기가 감소하면서 혈액에서 바이러스 검출될 때 혈청에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 항암 바이러스 SLJ-496 (KCTC 11704BP)의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 백시니아 바이러스는 와이에쓰 주(Wyeth strain)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 종양 조직을 가진 숙주 동물은 간암(VX2) 세포를 가진 토끼인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 면역 억제제를 투여함으로써 유도된 면역 억제 조건은 3~5 mg/kg/2d의 사이클로스포린과 0.5~1.5 mg/kg/2d의 프레드니손에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 백시니아 바이러스는 107~9의 농도로 주입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스를 포함하는 항암용 조성물.
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