KR20220112537A - 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 CD55 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 제1뉴클레오티드 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질이 연결되어 발현되도록 이루어진 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트, 이 게놈 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포, 이 항암 바이러스의 생산 방법 및 이 방법으로 생산된 항암 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 사용하면 혈중 보체 시스템에 대한 저항성을 가져 혈관 투여 시 안정적인 항암 활성을 나타낼 수 있는 항암 바이러스를 생산할 수 있다. 또한 본 발명 항암 바이러스의 혈중 안정성으로 인해, 보다 용이하고 효과적인 항암 치료가 가능하며, 기존에 비해 투여량을 줄일 수 있으므로 부작용의 발생 가능성을 낮출 수 있다.

Description

항암 바이러스 게놈 컨스트럭트{Anti-cancer virus gene construct}

본 발명은 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 CD55 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 제1뉴클레오티드 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제1뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질이 연결되어 발현되도록 이루어진 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트, 이 게놈 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포, 이 항암 바이러스의 생산 방법 및 이 방법으로 생산된 항암 바이러스에 관한 것이다.

항암 바이러스 치료제는 치료가 어려운 악성 종양을 가진 환자의 상태를 개선할 수 있는 최신의 암 치료 방법이다. 항암 바이러스는 암세포를 투과하여 암세포 내에서 증식하고, 증식한 바이러스들은 세포를 파괴하고 방출됨으로써 암세포를 사멸시키고 인체의 면역시스템을 통해 암세포를 공격하도록 만드는 기전으로 작동한다.

항암 바이러스를 혈관으로 투여하여 혈액을 통해 암세포에 전달되도록 함으로써 신체 곳곳에 퍼져 있는 암세포에 대해 효과적인 항암 작용을 나타내도록 하는 것이 바람직하지만, 혈액 내 다양한 바이러스 불활성화 인자 또는 옵소닌 작용으로 인해 항암 바이러스가 빠르게 제거되는 문제로, 현재로써는 극히 제한적인 효과에 그치고 있다. 따라서 현재의 항암 바이러스 투여는 암세포와의 접근효율을 높이기 위해 표적 암 조직에 직접 주사하는 방식이 사용되고 있다.

암 조직에 직접 주사하는 방법은 흑색종, 유방암, 두경부암 등 접근이 용이한 암에서 대체로 유효하게 적용되지만, 유효 용량의 투여가 투여자의 기술적인 역량에 의존적이며 시술과정이 매우 침습적이므로 반복적으로 투여해야 하는 항암치료 방법으로서는 혈관 내 투여와 비교하여 불리하다.

이에 혈액에서 항암 바이러스가 빠르게 제거되는 문제를 개선하여 혈관 투여로도 효과적인 항암 효과를 나타낼 수 있는 항암 바이러스 기술의 개발이 필요하다.

한국등록특허 제10-1179166호 한국등록특허 제10-1605176호

따라서 본 발명의 주된 목적은 혈액에서 항암 바이러스가 빠르게 제거되는 문제를 개선하여 혈관 투여로도 효과적인 항암 효과를 나타낼 수 있는 항암 바이러스 기술을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 CD55 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 제1뉴클레오티드 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 제1뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질이 연결되어 발현되도록 이루어진 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 제공한다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트에 있어서, 상기 제1뉴클레오티드 서열은 CD55 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트에 있어서, 상기 막관통 도메인은 H3L 단백질의 막관통 도메인인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 숙주 세포에서 상기 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및 숙주 세포에 의해 생성된 항암 바이러스를 포집하는 단계;를 포함하는 항암 바이러스 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항암 바이러스 생산 방법으로 생산된 항암 바이러스를 제공한다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 사용하면 혈중 보체 시스템에 대한 저항성을 가져 혈관 투여 시 안정적인 항암 활성을 나타낼 수 있는 항암 바이러스를 생산할 수 있다. 또한 본 발명 항암 바이러스의 혈중 안정성으로 인해, 보다 용이하고 효과적인 항암 치료가 가능하며, 기존에 비해 투여량을 줄일 수 있으므로 부작용의 발생 가능성을 낮출 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 항암 바이러스를 도시한 것으로, 바이러스의 표면에 CD55가 발현된 상태를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 도시한 것으로, hCD55는 인간 CD55의 성숙형(mature form) 단백질을 암호화하는 서열 영역, SP hCD55는 인간 CD55의 신호 펩티드(signal peptide)를 암호화하는 서열 영역, TM은 막관통 도메인을 암호화하는 서열 영역, GFP는 녹색형광단백질(Green flourscent protein)을 암호화하는 서열 영역을 나타낸다.

항암 바이러스 제제가 혈관으로 투여되었을 때, 선천성 면역시스템에 의해 항암 바이러스가 빠르게 제거되는데, 이는 인체 내 보체에 의한 면역작용으로 인한 것이다.

암 세포를 포함하여 숙주세포 내에서 증식된 바이러스(예를 들어, 항암 바이러스)는 세포 밖으로 방출될 때 극히 일부(10% 미만)가 숙주세포의 세포막에 둘러싸인 형태(세포외피막 바이러스, EEV)로 방출되는 경우가 있다. 이러한 세포외피막 형태의 바이러스들은 혈중 생존기간이 긴 것으로 알려져 있고, 이들의 긴 혈중 생존기간은 보체 조절 단백질에 의한 것이다.

일반적으로 항암 바이러스를 생산할 때 얻어지는 대다수의 형태는 이러한 세포외피막 바이러스(EEV)가 아닌 세포내성숙 바이러스(IMV) 형태로, 표면에 보체 조절 단백질을 발현하지 않는다. 따라서 보체에 의해 바이러스 활성은 크게 감소하게 된다.

본 발명에서는 보체 조절 단백질 중 CD55를 재조합을 통해 세포내성숙 바이러스(IMV) 표면에 발현되도록 함으로써 보체 시스템으로부터 항암 바이러스를 보호할 수 있도록 설계하였다.

또한, 막관통 도메인(transmembrane domain)을 CD55 유전자와 연결하여 CD55 단백질이 세포내성숙 바이러스(IMV) 표면에 안정적으로 발현되도록 하였다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트는 CD55 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 제1뉴클레오티드 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 제1뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질이 연결되어 발현되도록 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트는 다양한 항암 바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 기반으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항암 바이러스 게놈, 예를 들어 백시니아 바이러스의 게놈 내에 또는 게놈의 말단에, 다른 유전자의 기능에 영향을 미치지 않도록, 상기 제1뉴클레오티드 서열 및 상기 제2뉴클레오티드 서열이 연결된 형태로 이루어질 수 있다.

본 발명의 제1뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 CD55 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 CD55는 다양한 동물 유래의 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항암 바이러스를 투여할 대상 유래의 것이다. 예를 들어, 인간에 투여하기 위한 항암 바이러스를 제조하는 경우, 인간 유래의 CD55, 즉 hCD55를 적용한다.

본 발명에서 막관통 도메인은 바람직하게는 기반이 되는 항암 바이러스 유래의 것이다. 예를 들어, 본 발명의 게놈 컨스트럭트가 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 경우, 막관통 도메인은 H3L 단백질의 막관통 도메인인 것이 바람직하다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트에는 상기와 같은 서열 이외에 다른 서열이 더 포함될 수 있다. 더 포함될 수 있는 서열은 예를 들어 게놈 컨스트럭트의 발현을 모니터링하기 위한 마커 서열, 항암 바이러스 작용 효과를 높이거나 제한하기 위한 서열, 클로닝을 위한 서열 등일 수 있다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있으며, 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트는 통상의 뉴클레오티드 합성 방법 또는 재조합 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 게놈 컨스트럭트를 유지하거나 본 발명의 항암 바이러스를 제조하기 위한 것으로, 상기와 같은 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 숙주 세포는 이 분야에서 바이러스를 도입하는데 사용하는 통상의 동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 단리된 인간 유래의 세포이다.

본 발명의 항암 바이러스 생산 방법은 상기와 같은 게놈 컨스트럭트를 사용하여 항암 바이러스를 생산하는 방법으로, 숙주 세포에서 상기 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및 숙주 세포에 의해 생성된 항암 바이러스를 포집하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 항암 바이러스 생산 방법은 상기 단계에 추가로 숙주 세포에 상기 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 도입하는 단계;를 포함할 수 있다. 이때의 도입을 위해 이 분야에서 바이러스 벡터를 숙주 세포에 도입하는데 사용하는 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 게놈에 도 3과 같이 막관통 도메인을 암호화하는 서열(TM), 인간 CD55를 암호화하는 서열(hCD55+SPhCD55) 및 녹색형광단백질을 암호화하는 서열(GFP)이 연결된 형태의 재조합 항암 바이러스 벡터를 제작하였다.

이때 막관통 도메인으로는 H3L 단백질의 막관통 도메인을 적용하였으며, 인간 CD55와 막관통 도메인이 연결된 형태로 발현되도록 하였다.

상기 제작된 재조합 항암 바이러스 벡터를 숙주 세포에 도입하고 발현을 유도한 다음 GFP를 통해 발현 여부를 확인하고 숙주 세포로부터 생산된 재조합 항암 바이러스를 포집하였다.

혈청이 없는 상태에서 혹은 혈청이 25%로 함유된 상태에서 본래의 백시니아 바이러스와 상기 재조합 항암 바이러스의 안정성을 비교실험하였으며, 이의 결과는 표 1과 같다.

	본래의 백시니아 바이러스	본 발명의 재조합 항암 바이러스
무-혈청 조건	100	100
25% 혈청 함유 조건	18.2	82.3

표 1과 같이, 본 발명의 재조합 항암 바이러스가 본래의 백시니아 바이러스에 비해 혈청 함유 조건에서의 안정성이 훨씬 우수한 것으로 나타났다.

Claims (6)

1. CD55 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 제1뉴클레오티드 서열 및 막관통 도메인을 암호화하는 제2뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 제1뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열이 암호화하는 단백질이 연결되어 발현되도록 이루어진 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1뉴클레오티드 서열은 CD55 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는, 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트.
3. 제1항에 있어서,
   상기 막관통 도메인은 H3L 단백질의 막관통 도메인인, 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트.
4. 제1항의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포.
5. 숙주 세포에서 제1항의 항암 바이러스 게놈 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및
   숙주 세포에 의해 생성된 항암 바이러스를 포집하는 단계;를 포함하는 항암 바이러스 생산 방법.
6. 제5항의 방법으로 생산된 항암 바이러스.

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