CN117695391A - 一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法及应用。具体地，本发明的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒可以在肿瘤细胞内持续扩增，发挥溶瘤病毒的运载携带功能以及溶瘤功能，提供一个具有安全高效便利的光敏剂运载体系以及内源性光源，激活肿瘤组织免疫活性从而大大提高光动力疗法(PDT)在大肠癌中的治疗效率。此体系无需外界光源，为深层组织的PDT提供了可能。同时，溶瘤痘苗病毒发挥其抗肿瘤免疫作用，以有效清除残余的肿瘤细胞并抑制转移，为溶瘤痘苗病毒联合光敏剂介导的免疫治疗提供新的途径，也为后期的PDT在大肠癌治疗中的临床转化提供理论和技术基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物其在治疗大肠癌中的应用；本发明还提供了制备所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的方法。
背景技术
大肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率、死亡率均较高，严重威胁人类的健康。预计到2030年全球将有大肠癌新发病例和死亡比例将超过220万例新发病和110万。近年来随着人民生活水平的提高及饮食习惯的改变，我国CRC的发病率和死亡率不断上升。目前，手术切除联合新辅助放疗或新辅助化疗是治疗CRC的主要治疗手段。虽然辅助治疗显著改善了晚期CRC患者的预后，但仅对15～25％的患者有效。此外，在能接受外科手术切除的患者中，约有20％的患者术后5年内出现局部或远处复发。因此，急需开发一种有效的方法来治疗无法接受手术治疗和术后复发的CRC患者。
溶瘤痘苗病毒是近年来备受关注的一类溶瘤病毒。痘苗病毒具有安全性好(只在胞浆内复制，不会整合进宿主基因组)、表达效率高、基因组容量大、对热稳定以及成本低廉等优点。当溶瘤痘苗病毒(OVV)感染肿瘤细胞时，一方面能够直接裂解肿瘤细胞；另一方面诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放出的钙网蛋白、ATP和HMGB1等细胞危险相关分子信号以及肿瘤相关的或/和特异性的抗原等分子被TME中的抗原呈递细胞识别并触发免疫反应。此外，病毒感染诱导促炎反应，导致细胞因子和趋化因子表达增强，从而激活免疫系统，使“冷”肿瘤变“热”。在科学家们近年来进行的一系列临床研究中，携带GM-CSF基因的JX-594是迄今为止应用于临床研究最完善的溶瘤痘苗病毒，该病毒已进行了两个临床I期和临床II期的研究。因此，OVV作为基因表达载体表达外源性功能基因，发挥双重抗肿瘤效果，具有广泛的应用前景。
肿瘤光动力治疗(PDT)基于光敏剂的使用，这种位于生物组织的内源性或外源性的光敏分子在吸收特定波长的光后在肿瘤部位产生活性氧，导致目标肿瘤细胞的破坏，即将凋亡的肿瘤细胞会释放出肿瘤相关抗原和免疫刺激分子，从引发炎症因子的表达和抗肿瘤免疫，强烈诱导免疫原性细胞死亡。与传统的手术、化疗以及放疗等治疗手段相比，PDT具有较高的靶向性，直接杀伤光照区的病变组织，定位准确，不损伤周围的健康组织；治疗时间短，非侵入性创伤小，不会产生耐药性；能够与其他治疗产生协同作用，早期表层肿瘤。因此，PDT凭借其潜在的巨大优势成为临床治疗肿瘤的新方法。但是光动力治疗的深度受限，且无法应对转移性肿瘤，光敏剂大多为有机分子，其中含有共轭π键，因此其水溶性大多较差且容易团聚，导致最终作用于肿瘤区域的药物数量不足。故开发一种利用溶瘤痘苗病毒作为载体且能够结合PDT有效治疗肿瘤的复合物具有重要的科学意义和临床转化价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物，以及其制备方法和应用，该复合物利用溶瘤痘苗病毒作为载体，携带所需的外源基因和纳米药物进入肿瘤，携带荧光素酶基因的病毒在肿瘤细胞内持续扩增，发挥溶瘤病毒的运载携带功能以及溶瘤功能，同时提供一个无需外源光激发的内源性光源激活的具有安全高效便利的光敏剂运载体系，无需外源光的激发的情况下递送光敏剂进入治疗部位，对于原发结肠癌，转移及深处肿瘤等疾病的治疗具有重要的科学意义和临床转化价值。
具体而言，本发明提供了携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物，携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒是通过同源重组获得的，其呈现砖型外观，尺寸大小为(300～450)nm×(170～260)nm；病毒dsDNA被核衣壳包裹成丝状，丝状核心被核壁包裹成砖状体；砖状体中央有两个中央体，使得病毒中央形成两个突起；光敏剂Ce6通过共价偶联病毒表面蛋白形成酰胺键而黏附在病毒表面。
在本发明的一些具体实施方案中，所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备包括如下步骤：
步骤1：扩增通过同源重组获得的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒，收集扩增后的痘苗病毒液，冻融三次后离心，随后纯化痘苗病毒；
步骤2：将痘苗病毒与Ce6共孵育，同时加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，4℃孵育后超离制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
本发明还提供了一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
步骤1：扩增通过同源重组获得的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒，收集扩增后的痘苗病毒液，冻融三次后离心，随后纯化痘苗病毒；
步骤2：将痘苗病毒与Ce6共孵育，同时加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，孵育后超速离心制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤1中的纯化痘苗病毒的方法为蔗糖密度梯度离心法。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤2的具体操作步骤为：
纯化后的病毒与光敏剂Ce6共孵育，加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合，放入摇床，T1℃孵育t1小时，将孵育后的样品在n1转速下离心t2小时，去除游离的Ce6，最后用PBS重悬制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:10。
在本发明的一些具体实施方案中，12≤t1≤24。
在本发明的一些具体实施方案中，T1＝4；t1＝12；n1＝23900g；t2＝2。
本发明还提供了一种治疗消化道肿瘤的药物，包含上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述消化道肿瘤为结肠癌、直肠癌或结直肠癌的肝肺转移等消化道恶性肿瘤。
本发明还提供了一种治疗消化道肿瘤的药物组合物，其特征在于，上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物及任选的药学上可接受的载体。
本发明还提供了上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或上述任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物在制备癌症治疗的药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明公开的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物，提供一个具有安全高效便利的光敏剂运载体系，溶瘤病毒以多种形式多途径与机体免疫系统相互作用，改善肿瘤免疫微环境，增强免疫细胞浸润，激活肿瘤特异性免疫反应，抑制远端转移灶和肿瘤复发。同时在底物的催化下，产生内源性发光激活光动力治疗，与病毒免疫协同治疗从而提高结肠癌的治疗效率。由于溶瘤痘苗病毒在胞浆中复制，不会整合到宿主的基因组中，具有被免疫系统检测到的特权和极高的安全性，并在人体内有着更高的循环周期和生物利用度，因此，病毒-光敏剂偶联复合物作为一种全新的药物实现解决结肠癌的临床治疗具有极大的优势。
本发明还提供了携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，提取简单、原料易得、产率高、成本低，有利于商业化应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是携带荧光素酶基因溶瘤痘苗病毒的构建示意图；
图2是携带荧光素酶基因溶瘤痘苗病毒的PCR鉴定结果图；
图3是对痘苗病毒形态和尺寸进行表征的透射电子显微镜(TEM)图；
图4是动态光散射表达荧光素酶的痘苗病毒及其复合物的尺寸分布；
图5是酶标仪检测OVV-Luc与OVV在底物的催化下的生物发光的维持时间；
图6是不同处理组给药后的人源结肠细胞杀伤情况图，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图7是结肠肿瘤细胞迁移结果对比图，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图8是q-PCR检测结果，采用q-PCR法检测肿瘤组织中干扰素途径相关的IFN-α的表达，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图9是q-PCR检测结果，采用q-PCR法检测肿瘤组织中干扰素途径相关的IFN-β的表达，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图10是q-PCR检测结果，采用q-PCR法检测肿瘤组织中干扰素途径相关的IFN-γ的表达，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图11是q-PCR检测结果，采用q-PCR法检测肿瘤组织中干扰素途径相关的IFNAR1的表达，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图12是q-PCR检测结果，采用q-PCR法检测肿瘤组织中干扰素途径相关的IFNAR2的表达，空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图13是OV@C+D促进肿瘤组织凋亡的测试数据，利用流式细胞术检测不同处理后CT26细胞的凋亡情况。空白对照组是未经任何处理的样本，Ce6是仅使用Ce6处理过得样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图14是活死染色结果，用PBS,Ce6,OV，OV@C、OV@C+D作用36h后，采用钙黄绿素-AM(绿色)和碘化丙啶(PI)对细胞进行活死染色。，空白对照组是未经任何处理的样本，Ce6是仅使用Ce6处理过得样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图15是Western Blot结果，利用Western检测不同处理组处理36h后CT26细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达水平。空白对照组是未经任何处理的样本，OV是仅使用OV处理过得样本，OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本；
图16是OVV-Luc@Ce6复合物的体内的结肠癌治疗效果的测试数据：HE染色的共聚焦显微成像图；
图17是OVV-Luc@Ce6复合物的体内的结肠癌治疗效果的测试数据：Ki67染色的共聚焦显微成像图；
图18是OVV-Luc@Ce6复合物的体内的结肠癌治疗效果的测试数据：Tunel染色的共聚焦显微成像图；
图19是病毒-光敏剂偶联物增加免疫细胞浸润的测试数据：不同处理组肿瘤CD4+T细胞和CD8+T细胞的流式细胞术图；
图20是病毒-光敏剂偶联物增加免疫细胞浸润的测试数据：肿瘤切片中CD4+和CD8+细胞的丰度；
图21是病毒-光敏剂偶联物增加免疫细胞浸润的测试数据：不同治疗后肿瘤中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。.
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物制备
(1)携带荧光素酶基因溶瘤痘苗病毒的构建步骤如下：构建过表达荧光素酶的质粒，根据病毒的穿梭载体上的多克隆位点选择合适的限制性酶切位点，通过基因合成的方法合成荧光素酶序列，将该序列通过合适的酶切位点与线性化的穿梭质粒连接，进行酶切和PCR鉴定，完成后导入大肠杆菌的感受肽，得到pCB-Luc质粒。培养HEK293细胞并进行溶瘤痘苗病毒感染，病毒吸附于细胞后利用Lipo3000将pCB-Luc质粒转染该细胞，进行穿梭载体的同源重组，筛选获得重组溶瘤痘苗病毒OVV-Luc。利用PCR鉴定外源基因是否成功地插入病毒基因组，且在扩增过程中用抗生素进行筛选，排除野毒的影响。
附图1是携带荧光素酶基因溶瘤痘苗病毒的构建示意图；附图2是PCR鉴定结果图。鉴定结果表明外源基因成功地插入病毒基因组。
(2)携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物制备：
扩增不含野生型的重组溶瘤痘苗病毒痘苗病毒的OVV-Luc，利用Vero细胞扩增，收集扩增后的OVV-Luc病毒液，冻融三次后3000rpm离心30min，随后使用36％蔗糖密度梯度离心法纯化痘苗OVV-Luc，超离后弃上清，用1ml的PBS重悬管底沉淀，得到纯化的OVV-Luc，冻存于-80℃；
纯化后的OVV-Luc与光敏剂Ce6共孵育，加入适量的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC:NHS＝1：10，充分混合，放入4℃摇床，孵育过夜，将孵育后的样品在23900g转速下离心2小时，去除游离的Ce6，最后用1mL PBS重悬制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物(OVV-Luc@Ce6)。
实施例2：OVV-Luc@Ce6复合物的表征
实施例1制备的OVV-Luc@Ce6复合物用2％多聚甲醛固定，用1.9％的甲基纤维素和0.3％的醋酸铀进行阴性对比染色，使用HITACHI HT-7700电子显微镜下观察并收集显微照片，使用Zetasizer Nano ZSE(Malvern Instrument，英国)通过动态光散射(DLS)分析OVV-Luc@Ce6的尺寸分布。
透射电子显微镜(TEM)测试图如附图3所示；动态光散射(DLS)测试尺寸分布图如附图4所示。
电子显微镜对超微结构和形态分析的结果显示，构建得到的溶瘤痘苗病毒为砖型外观，尺寸约为360×270×250nm，病毒dsDNA被核衣壳包裹成丝状，丝状核心被核壁包裹成砖状体。砖状体中央有两个中央体，这使得病毒中央形成两个突起；光敏剂Ce6通过共价偶联病毒表面蛋白形成酰胺键而黏附在病毒表面，动态光散射实验也佐证了复合物的尺寸分布。
实施例3：OVV-Luc与OVV在底物的催化下的生物发光的维持时间效果的测试
为了评估重组得到的OVV-Luc病毒在底物的催化下生物发光的维持时间，分别在孔板中铺CT26细胞，待其长至70-80％，分别给予相同MOI的OVV-Luc和OVV病毒，感染36h后，加入底物D-Luc，在1，2，5，15，18，24h的时候在酶标仪上检测所产生的生物发光强度，绘制得到生物发光维持时间的对比图，如附图5所示。
测试结果表明，重组得到的OVV-Luc病毒的生物发光能力较OVV病毒有显著的提升。
实施例4：OVV-Luc@Ce6复合物的结肠癌治疗效果的测试
为了评估OVV-Luc@Ce6复合物的治疗功效，本发明设计对照实验用来验证OVV-Luc@Ce6复合物的给药后的细胞的存活率。利用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力；将CT26细胞以每孔2×104个细胞的密度接种于96孔板，分别用PBS、OV、OV@C、OV@C+D处理(OV@C是使用OVV-Luc@Ce6复合物处理过得样本，OV@C+D是使用OVV-Luc@Ce6复合物和D-Luc先后处理过得样本)，每种处理均在5个井中重复。病毒感染36h后，加入底物，孵育5h后，丢弃上清液。随后加入100μL含10μL CCK8试剂的无血清培养基，37℃孵育1～2h。不同处理组的细胞毒性评估使用酶标记，在450nm测量吸光度。
测试结果如附图6所示，可以看出OV@C和OV@C+D处理过的细胞存活率最低，可以看出其对结肠癌治疗具有积极效果。
实施例5：OVV-Luc@Ce6复合物的抑制肿瘤细胞迁移效果的测试
将结肠肿瘤细胞以每孔3*10^5cell接种于六孔板，以MOI＝10的OVV-Luc在37℃下感染细胞48h。随后，观察空斑的形成，然后去除培养基，并在孔中加入结晶紫溶液，然后孵育5分钟。在孵育后，去除结晶紫色溶液并且用dd H2O进行5次洗涤，利用倒置荧光显微镜拍摄细胞的的迁移情况。
测试结果如附图7所示。测试结果表明，OVV-Luc@Ce6复合物具有很好的抑制肿瘤细胞迁移的能力。
实施例6：OVV-Luc@Ce6复合物诱导产生IFN激活的测试
本实施例所使用的的肿瘤样本为实施例8所收集的肿瘤样本。
实施方案：q-PCR法检测肿瘤组织RNA中干扰素因子的表达
用TRIzol试剂提取小鼠肿瘤组织的总RNA，使用NanoDrop One/OneC对RNA进行定量和质量评估。使用cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(诺普信科技，中国)对每个提取的样品的总RNA进行逆转录，获得互补DNA(cDNA)。接下来，在Applied Biosystems7500Real-Time PCR系统(Applied Biosystems，美国)中进行实时定量聚合酶链反应；引物是由GenScript生物技术公司合成的。通过监测扩增过程中双链DNA结合染料SYBR Green的荧光积累来检测PCR产物的积累；用2-ΔΔCt进行相对定量，并使用18S对表达数据进行标准化。结果显示OV@C+D处理组中I型干扰素的大量分泌。测试结果如附图8-12所示。
实施例7：OV@C杀伤结肠肿瘤效果的测试
CT26细胞以每孔3×105个的密度接种于6孔板，孵育24h。分别用PBS，Ce6以及溶瘤病毒OVV-Luc(MOI＝1.5)、OVV-Luc@Ce6(Ce6＝15μg/mL)、OVV-Luc@Ce6+D-Luc处理细胞，Annexin-FITC/PI碘化丙啶染色，流式细胞仪分析，测试结果如附图13所示。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒以及Calcein/PI活死染色试剂盒进行染色，并利用倒置荧光显微镜进行拍摄荧光图片。测试结果如附图14所示。
同时在六孔板中接种CT26细胞，并以上述给药剂量给药处理，36h后，吸弃上清，用PBS清洗细胞，同时每孔分别加入80-100ul的RIPA裂解液，在冰上裂解五分钟后，用刮刀将蛋白刮下来收集到EP管中，并在冰上裂解三十分钟。后14000rpm离心15min，收集上清。利用BCA试剂盒进行蛋白定量，在后续进行Westernblot的实验，验证与凋亡相关的BAX，Bcl-2，caspase-3、caspase-9、β-actin因子。
测试结果如附图15所示
实施例8：OVV-Luc@Ce6复合物的体内的结肠癌治疗效果的测试
使用4至5周大的雌性BALB/c小鼠，体重为18-22克，小鼠从GemPharmatech公司获得。所有的小鼠都被安置在SPF条件下，可以自由获得食物和水。饲养环境得到控制：光照(2小时光照：12小时黑暗循环)，温度(24±1℃)和相对湿度(50-60％)。所有的动物在用于实验前都要适应饲养环境至少1-2周。
实验组通过瘤内注射OVV-Luc(10^8pfu/mL)和Ce6(15ug/mL)，在给药后36h，OV@C+D组单独给底物(荧光素钠)；对照组动物接受同等体积的PBS。在治疗周期约15天结束后处死小鼠，收集小鼠各器官及肿瘤用于后续实验，根据主要脏器病理变化检测肿瘤组织坏死或凋亡的发生情况。
将新鲜小鼠肿瘤组织固定在4％多聚甲醛中，然后嵌入石蜡中。5μm厚的石蜡切片用苏木精-伊红(H&E)，KI67和Tunel进行染色。在光学显微镜下观察肿瘤组织的组织病理学变化。
对肿瘤组织的石蜡切片进行脱蜡和再水化处理；用山羊血清阻断非特异性结合后，将切片与一抗、二抗和阿维菌素-生物素过氧化物酶复合物进行孵化。然后，样品用发色底物二氨基联苯胺(DAB)进行发色。用光镜观察染色的切片，并用ImageJ软件进行量化。
对石蜡切片进行补水，用1.5％山羊血清阻断非特异性结合。然后将切片在4℃下与第一抗体孵育过夜。用荧光素结合的二级抗体处理切片后，用共聚焦显微镜检查这些图像。荧光面积和强度由ImageJ软件评估。结果显示，OV@C+D治疗组肿瘤组织分布相对稀疏，凋亡率达到30％，坏死最严重。测试结果如附图16-18所示。
实施例8：病毒-光敏剂偶联物增加免疫细胞浸润的测试
使用4至5周大的雌性BALB/c小鼠，体重为18-22克，小鼠从GemPharmatech公司获得。所有的小鼠都被安置在SPF条件下，可以自由获得食物和水。饲养环境得到控制：光照(2小时光照：12小时黑暗循环)，温度(24±1℃)和相对湿度(50-60％)。所有的动物在用于实验前都要适应饲养环境至少1-2周。
实验组通过瘤内注射OVV-Luc(10^8pfu/mL)和Ce6(15ug/mL)，在给药后36h，OV@C+D组单独给底物(荧光素钠)；对照组动物接受同等体积的PBS。小鼠在注射各组药物后7天后用二氧化碳对小鼠进行安乐死，然后进行颈椎脱位。提取脾脏和肿瘤，用胶原酶A(0.75毫克/毫升)进行体内消化，消化后加工成单细胞悬液。然后通过70μm过滤器过滤这些悬浮液，以消除任何大的组织碎片颗粒。用抗CD45-APC-CY7、抗CD3-FITC、抗CD8-PE、抗CD4-APC抗体对脾脏和肿瘤细胞悬液进行染色，鉴定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在Agilent-NovoCytePenteon仪器上获得数据，用FlowJo v10.5.3软件进行分析。结果显示，与对照组相比，OV、OV@C和OV@C+D组的CD8+免疫细胞数量显著增加，肿瘤和脾脏均表现出CD4+T细胞和CD8+T细胞的存在，它们是CD3+T细胞的主要亚群。测试结果如附图19-21所示。
综上所述，本发明的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒可以在肿瘤细胞内持续扩增，发挥溶瘤病毒的运载携带功能以及溶瘤功能，提供一个具有安全高效便利的光敏剂运载体系以及内源性光源，激活肿瘤组织免疫活性从而大大提高PDT在大肠癌中的治疗效率。此体系无需外界光源，为深层组织的PDT提供了可能。同时，溶瘤痘苗病毒发挥其抗肿瘤免疫作用，以有效清除残余的肿瘤细胞并抑制转移，为溶瘤痘苗病毒联合光敏剂介导的免疫治疗提供新的途径，也为后期的PDT在大肠癌治疗中的临床转化提供理论和技术基础。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物，其特征在于：携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒是通过同源重组获得的，其呈现砖型外观，尺寸大小为(300～450nm×(170～260)nm；病毒dsDNA被核衣壳包裹成丝状，丝状核心被核壁包裹成砖状体；砖状体中央有两个中央体，使得病毒中央形成两个突起；光敏剂Ce6通过共价偶联病毒表面蛋白形成酰胺键而黏附在病毒表面。
2.如权利要求1所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物，其特征在于，所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备包括如下步骤：
步骤1：扩增通过同源重组获得的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒，收集扩增后的痘苗病毒液，冻融三次后离心，随后纯化痘苗病毒；
步骤2：将痘苗病毒与Ce6共孵育，同时加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，4℃孵育后超离制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
3.一种携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
步骤1：扩增通过同源重组获得的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒，收集扩增后的痘苗病毒液，冻融三次后离心，随后纯化痘苗病毒；
步骤2：将痘苗病毒与Ce6共孵育，同时加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，孵育后超速离心制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
4.如权利要求3所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的纯化痘苗病毒的方法为蔗糖密度梯度离心法。
5.如权利要求3所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作步骤为：
纯化后的病毒与光敏剂Ce6共孵育，加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合，放入摇床，T1℃孵育t1小时，将孵育后的样品在n1转速下离心t2小时，去除游离的Ce6，最后用PBS重悬制备得携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
6.如权利要求5所述携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法，其特征在于，T1＝4；12≤t1≤24；n1＝23900g；t2＝2。
7.一种治疗消化道肿瘤的药物，其特征在于，包含权利要求1-2中任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或权利要求3-6任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物。
8.如权利要求7所述消化道肿瘤的药物，其特征在于，所述消化道肿瘤为结肠癌、直肠癌或结直肠癌的肝肺转移等消化道恶性肿瘤。
9.一种治疗消化道肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2中任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或权利要求3-6任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物及任选的药学上可接受的载体。
10.权利要求1-2中任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物或权利要求3-6任一项所述的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物的制备方法制备的携带萤火虫荧光素酶基因的溶瘤痘苗病毒负载光敏剂Ce6的复合物在制备癌症治疗的药物中的应用。
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