CN117323421A - 一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用，疫苗由流感病毒诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡而发挥抗肿瘤效应；流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1、肿瘤细胞为B16‑F10肿瘤细胞，流感病毒的添加量为MOI=1，疫苗施用方式为皮下注射。本发明通过使用流感病毒感染肿瘤细胞并诱导其免疫原性死亡，释放到肿瘤微环境中的细胞碎片和病毒抗原会刺激免疫反应，并且随后产生的具有传染性的病毒后代，扩散到周围的肿瘤细胞，并产生病原相关分子模式、损伤相关分子模式、肿瘤细胞碎片和肿瘤相关抗原等子产物，所有这些活动都有助于对先天性和适应性抗肿瘤免疫反应的局部和全身刺激打破免疫抑制的肿瘤微环境，为肿瘤免疫疗法提供新的治疗思路和平台。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤以其治愈率低、病死率高而成为目前危害人类健康的最主要疾病。目前，国内针对肿瘤的治疗方式主要包括手术、化疗和放疗，但手术方式创面过大预后不好，放、化疗对机体损伤过大，传统的肿瘤治疗手段难以应对恶性肿瘤。
近年来，针对肿瘤治疗的研究如火如荼地进行，免疫疗法成为肿瘤治疗中的研究热点，肿瘤免疫疗法的机制与其他癌症治疗方法的机制有很大不同。与化学疗法或癌基因靶向疗法不同，癌症免疫疗法依赖于促进一种动态的抗癌反应，而不仅限于针对单个致癌基因紊乱或癌细胞的其他自主特征。因此，癌症免疫疗法可以产生抗肿瘤活性，同时靶向许多将肿瘤细胞与正常细胞和组织区分开来的异常。尽管针对免疫检查点CTLA4和PD-L1/PD-1的抗体在临床上取得了成功，但只有一部分人表现出持久的反应，并且对实体瘤治疗效果不尽如人意，所以肿瘤治疗的研究仍旧任重而道远。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用，一方面利用流感病毒诱导肿瘤细胞免疫原性死亡而引发良好的抗肿瘤反应，另一方面通过流感病毒调节机体的固有免疫，固有免疫与适应性免疫相结合达到强有力的抗肿瘤效应。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗，所述疫苗由流感病毒诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡而获得；
所述流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；
所述肿瘤细胞为B16-F10肿瘤细胞。
进一步的，所述流感病毒的添加量为MOI=1。
进一步的，所述疫苗的施用方式为皮下注射。
本发明的另一方面：
所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗的制备方法，以下步骤：
步骤1，流感病毒感染肿瘤细胞：
向肿瘤细胞中加入配置好的含感染复数MOI为1的流感病毒的无血清培养基，使流感病毒吸附并内吞进入肿瘤细胞，保证肿瘤细胞受到流感病毒感染；
步骤2，抗肿瘤疫苗的制备：
取步骤1获得的被流感病毒感染的肿瘤细胞，通过消化、清洗、计数、稀释的处理后，获得所述抗肿瘤疫苗。
本发明的另一方面：
所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明相比现有技术的有益效果为：
本发明通过Cell Counting Kit-8（CCK8）和乳酸脱氢酶（LactateDehydrogenase, LDH）的检测发现了流感病毒对B16-F10和A549肿瘤细胞均具有良好的亲嗜性；利用流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，制备得到的流感病毒介导的抗肿瘤疫苗具有抗肿瘤作用，一是病毒增强固有免疫，二是病毒杀伤肿瘤细胞，引起肿瘤细胞免疫原性死亡释放DAMP、PAMP、TAA和肿瘤碎片等，增强免疫细胞的浸润，并释放病原体继续感染相邻的肿瘤细胞，引发持续的免疫刺激发挥良好的抗肿瘤效应，三是流感病毒感染肿瘤细胞后细胞膜上表达流感病毒血凝素HA，HA会介导溶酶体逃逸，有助于肿瘤抗原的交叉递呈。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1为本发明所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗制备流程及其杀伤肿瘤原理示意图；
图2为实施例1胶体金法试纸条检测结果图；其中，试纸条检测尿囊液中病毒，红色箭头处有条带则为阳性；
图3为实施例1血凝实验检测血凝价结果示意图；
图4为实施例1纯化后流感病毒的电镜图片；
图5为实施例1纯化浓缩后流感病毒噬斑实验对病毒进行定量结果图；
图6为实施例2所述CCK8法检测不同感染复数的流感病毒在不同时间段的细胞活力；
图7为实施例2不同肿瘤细胞经不同感染复数流感病毒感染后72h的照片；
图8为实施例2所述LDH法检测不同感染复数的流感病毒感染不同肿瘤细胞72h后LDH的释放率；
图9为对比例Cur和DOX联合诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡显微镜下观察细胞形态；
图10为对比例Cur+DOX诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞所制备的疫苗具有良好的抗肿瘤潜力；其中，A.免疫程序（n=4每组）；B.肿瘤大小；C.肿瘤图像；
图11为测试例1流感病毒以不同感染复数诱导B16-F10肿瘤细胞后24H的图像；
图12为测试例1流感病毒以MOI=1条件感染B16-F10肿瘤细胞后24H免疫荧光图像；
图13为测试例1药物和流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞释放ATP和HMGB1；其中，A.诱导上清中ATP含量的检测；B.诱导上清中HMGB1的检测，1：Cur+DOX诱导B16-F10免疫原性死亡培养上清；2：MOI=0.1流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡培养上清；3：MOI=1流感病毒诱导B16-F10免疫原性死亡培养上清；4：B16-F10细胞培养上清；
图14为测试例1流感病毒诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞所制备的疫苗具有良好的抗肿瘤潜力结果图（n=4每组）；
图15为测试例1肿瘤细胞免疫原性死亡肿瘤模型治疗性实验结果图；其中，A.免疫程序（n=5每组）；B.免疫原性死亡的细胞皮下注射组肿瘤大小；C.免疫原性死亡的细胞皮下注射组肿瘤照片；D.免疫原性死亡的细胞瘤周注射组肿瘤大小；
图16为测试例1流感病毒诱导肿瘤细胞免疫原性死亡在小鼠体内诱发良好的抗肿瘤效应结果图；其中，A. 流感病毒感染肿瘤细胞后诱导死亡的时机在荷瘤小鼠中的摸索，肿瘤大小（n=5每组）；B. 肿瘤大小（n=8每组）；C. 肿瘤重量；D. 最后一天测量的肿瘤大小；E. 肿瘤照片；
图17为测试例1流感病毒和免疫原性死亡的细胞及流感病毒诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡诱导高水平CTL；其中，A. 牺牲图16.B实验小鼠分离的脾淋巴细胞的CTL流式代表图；B. 脾淋巴细胞中的CD8α的水平；C. 脾淋巴细胞中的CTL的水平；
图18为测试例1流感病毒和流感病毒诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡诱导高水平IFN-γ；其中，A. ELISPOT的斑点代表图；B. ELISPOT斑点数统计图。
具体实施方式
本发明实施例中所述流感病毒A/WSN/1933毒株的DNA片段载体质粒PHW2000-PB2，PHW2000-PB1，PHW2000-PA，PHW2000-HA，PHW2000-NP，PHW2000-NA，PHW2000-M，PHW2000-NS由Robert G. Webster教授实验室赠予。
大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株购自宝生物工程（大连）有限公司。
MDCK细胞由云南省疾病与控制中心赠予，293T、B16-F10、A549、TC-1、CT26、4T1和Vero细胞由中国医学科学院医学生物学研究所分子免疫科室保存。
实验所用的雌性C57BL/6小鼠（6-8周；16-18g）由中国医学科学院医学生物学研究所（IMBCAMS）小动物实验中心提供，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养（许可证编号：SYXK滇 2019-0003）。所有动物实验均经中国医学科学院医学生物学研究所实验动物使用和管理委员会批准。
如图1所示，本发明所述抗肿瘤疫苗由流感病毒诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的原理出发，使用流感病毒在体内持续诱导肿瘤细胞免疫原性死亡；病毒优先攻击和破坏肿瘤细胞，肿瘤细胞裂解释放肿瘤相关抗原和病原相关分子模式，它们触发模式识别受体，然后产生炎性细胞因子和抗病毒I型干扰素。随后流感病毒激活细胞死亡途径导致免疫原性细胞死亡，诸如 ATP、HMGB1和I型IFN等损伤相关分子模式被垂死的肿瘤细胞释放出来，抗原提呈细胞如树突状细胞（Dendritic cells，DC）被募集到肿瘤部位。P2Y2和P2X7是嘌呤受体，当细胞外ATP与它们结合时，它们分别增加DC募集和成熟。钙网蛋白（Calreticulin，CRT）翻转到濒死细胞膜表面，CRT通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白1重组蛋白（Recombinant Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein 1，LRP1）结合增强吞噬作用和促炎细胞因子的产生。此外，HMGB1与Toll样受体4（Toll like receptor4，TLR-4）结合，促进细胞因子的产生和抗原的交叉呈递。干扰素与干扰素受体结合并促进大量干扰素刺激基因的产生，这些基因有助于诱导适应性免疫反应。成熟的DCs可以将肿瘤相关的抗原呈递给肿瘤特异性T细胞，从而产生由穿孔素和颗粒酶B介导的抗肿瘤免疫和细胞溶解作用。
实施例1——流感病毒的拯救、扩增、纯化与定量
本实施例将由Robert G. Webster教授实验室赠予的PHW2000-PB2, PHW2000-PB1, PHW2000-PA, PHW2000-HA, PHW2000-NP, PHW2000-NA, PHW2000-M, PHW2000-NS质粒进行转化、提取，对提取得到的质粒进行测序，并将测序结果与NCBI比对，确定获得的质粒为甲型流感病毒（A/WSN/33 H1N1）。
而后使用流感病毒反向遗传操作体系，用八质粒共转染293T细胞拯救流感病毒，收集培养上清液用鸡胚扩增病毒后，使用流感病毒鸡胚尿囊液胶体金法试纸条检测尿囊液中是否存在流感病毒，试纸检测物质为流感病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）。试纸条在红箭头处显示条带为阳性结果，说明尿囊液中存在流感病毒（图2）。收集病毒液进行红细胞凝集实验检测病毒的血凝价，观察血凝现象，当红细胞在底部形成一个环状四周有血块，而下一孔红细胞在孔底形成边缘不光滑的圆形团状时，病毒液的稀释度即为病毒的血凝价。结果显示流感病毒的血凝价为28（图3）。
将收集的鸡胚尿囊液经过8000 rpm，4 ℃离心20 min，去除红细胞和大的杂蛋白后，使用0.45 μm滤器过滤上清，再将过滤液20000 rpm，4 ℃离心2 h，用少量PBS悬起完成流感病毒的纯化。取样使用电子显微镜观察流感病毒（图4）。纯化后的流感病毒放入-80℃超低温冰箱保存，使用MDCK细胞进行噬斑实验对纯化的病毒定量，实验结果如图5所示。选取空斑数为3～30的孔使用公式进行计算，流感病毒为1.8×107 PFU/ml，后续实验以该单位对病毒定量。
实施例2——流感病毒对不同肿瘤细胞的亲嗜性
使用CCK8法检测流感病毒在不同感染复数下对不同肿瘤细胞的亲嗜性，辨明流感病毒易感染的肿瘤细胞。如图6所示的实验结果表明在感染流感病毒后B16-F10和A549细胞活力急剧下降，说明流感病毒对B16-F10和A549具有较好亲嗜性。流感病毒感染不同肿瘤细胞后的照片（图7）显示出相同的结果。
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）是细胞内存在的较为稳定的酶，在细胞凋亡或坏死过程中细胞膜结构会被破坏，导致细胞浆内的乳酸脱氢酶释放到培养液里。通过检测从流感病毒感染后质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，从而反映出流感病毒对细胞的杀伤力（图8）。实验结果显示，在B16-F10和A549细胞感染病毒后，在上清中检测到较多的LDH，再次验证了流感病毒对该细胞的亲嗜性。
对比例
本对比例拟采用药物诱导的B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡作为对照，考察流感病毒诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡的抗肿瘤潜力。
药物诱导B16-F10细胞免疫原性死亡的具体方法为：
（1）12孔板：每孔接种2.5×105个B16-F10细胞，37 ℃，5% CO2培养箱中过夜，待细胞汇合度约为90%及以上时开始诱导。计算所需培养基的量，使用RMPI-1640完全培养基（含10%胎牛血清及1%双抗），加入对应量的化疗药物，最终使用药物的浓度为姜黄素（Cur）7.5μM，阿霉素（DOX）5 μg/ml。吸除培养板内原有培养基，加入1 ml配置好的含化疗药物的培养基，随后放入培养箱24 h，即可获得化疗药物诱导的免疫原性死亡的B16-F10细胞。
（2）T75培养瓶：头一天将一个长满的T75细胞培养瓶中的细胞一传二传代，过夜培养后即可开始诱导，将培养瓶中的培养基小心倒出并收集到50 ml离心管中，按照设定药物浓度向其中加入药物，混匀后再将培养基倒回培养瓶中进行诱导，培养24 h后即可收获。
（3）T225培养瓶：头一天将一个长满的T225细胞培养瓶中的细胞一传二传代，过夜培养后即可开始诱导，将培养瓶中的培养基小心倒出并收集到50 ml离心管中，按照设定药物浓度向其中加入药物，混匀后再将培养基倒回培养瓶中进行诱导，培养24 h后即可收获。
查阅文献获知姜黄素（Curcumin，Cur）、双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）、阿霉素（Doxorubicin，DOX）、米托蒽醌（Methotrexate，MTX）和奥沙利铂（oxaliplatin ，OXA）诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的浓度，并依据该浓度设置药物浓度梯度观察B16-F10肿瘤细胞对何种化疗药物较为敏感。
为提高诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的质量，本对比例将两种化疗药物组合使用。将两种化疗药物以不同浓度梯度组合诱导肿瘤细胞（图9），诱导后24 h显微镜下观察细胞形态，在以较低浓度组合，即5 μM Cur和7.5 μg DOX组合诱导时细胞呈现出典型的免疫原性细胞死亡形态。实验表明，该两种药物的联合能够在极低药物浓度下诱导B16-F10肿瘤细胞发生免疫原性死亡，所以后续实验拟采用该浓度药物组合进行后续实验。
Cur+DOX诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡肿瘤模型预防性实验：
实验拟考察化疗药物Cur + DOX诱导免疫原性死亡细胞制备疫苗的安全性及疫苗潜力，按照图10中A免疫程序进行实验。在小鼠左侧腹皮下接种一针疫苗后观察两周，在左侧腹未见成型肿瘤，表明该种方法制备的疫苗并无致瘤性。在小鼠右侧腹接种肿瘤，观察一个月后发现与PBS组相比，注射疫苗组肿瘤远小于PBS组（图10中B和C），实验显示Cur + DOX诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞所制备的疫苗具有良好的抗肿瘤潜力。
实施例3——流感病毒介导的抗肿瘤疫苗
通过实验发现，流感病毒在肿瘤组织诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡而引发较好的抗肿瘤反应。但这种干预的方式肿瘤组织内的肿瘤细胞并未能完全地被诱导死亡，且只能在肿瘤局部产生溶瘤效果，不能渗透到整个肿瘤。所以本实施例在体外利用流感病毒诱导肿瘤免疫原性死亡后，再将处于濒死状态的细胞注射荷瘤小鼠，以进行治疗。
本实施例提供了一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗，由流感病毒诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡而获得；所述流感病毒为实施例1所述甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；所述肿瘤细胞为B16-F10肿瘤细胞。
流感病毒诱导B16-F10细胞免疫原性死亡的具体方法为：
细胞处理方式与上述对比例所述的药物诱导相同，在诱导时需将瓶内培养基去除，并使用无菌PBS洗一遍，随后使用无血清RMPI-1640培养基，加入适量病毒（其中含流感病毒的感染复数MOI为1，T75细胞培养瓶加入2×107 PFU病毒，T225细胞培养瓶加入约1×108 PFU病毒），混匀后加入培养瓶中诱导，使流感病毒吸附并内吞进入肿瘤细胞，保证肿瘤细胞受到流感病毒感染；获得的被流感病毒感染的肿瘤细胞，通过消化、清洗、计数、稀释的处理后，获得所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗。
测试例1
在前期对流感病毒的研究当中发现，流感病毒感染B16-F10肿瘤细胞后，肿瘤细胞也发生了类似免疫原性细胞死亡的形态改变（见图11）。经过对流感病毒感染宿主细胞的生活史相关文献查阅，使用免疫荧光验证了，流感病毒感染B16-F10肿瘤细胞后，流感病毒血凝素（Hemagglutinin，HA）表达在肿瘤细胞的细胞膜上（见图12）。根据文献查阅得知流感病毒HA可以介导溶酶体逃逸，此时表达于肿瘤细胞表面的HA介导溶酶体逃逸可以增强肿瘤抗原的交叉递呈，达到良好的抗肿瘤效应。
当细胞免疫原性死亡时，细胞会释放ATP，发出“找到我”信号，使DC细胞找到濒死细胞。与此同时，细胞内质网上的钙网蛋白翻转到细胞膜表面，发出“吃了我”信号，使DC细胞将濒死细胞内吞将其清除。除此之外濒死细胞还释放HMGB1，促进炎症的发生，促使免疫细胞聚集清除濒死细胞。所以设计实验检测了对比例使用药物和实施例3流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞后24H，培养上清中的ATP和HMGB1。如图13所示结果显示感染复数为1的流感病毒感染B16-F10肿瘤细胞后24H检测到了较多的ATP和HMGB1，验证了流感病毒能诱导较好水平的免疫原性细胞死亡。
本测试例进一步，利用实施例3制备得到的流感病毒介导的抗肿瘤疫苗进行预防性实验，即流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡肿瘤模型预防性实验：
按照如图10中A所示的免疫程序进行实验，考察流感病毒诱导免疫原性死亡细胞制备疫苗的安全性和抗肿瘤潜力。在小鼠左侧腹接种一针感染复数为1的流感病毒诱导的免疫原性死亡细胞制备的疫苗后观察两周，在左侧腹未见肿瘤成型，表明该种方法制备的疫苗并无致瘤性。在小鼠右侧腹接种肿瘤，观察一个月后发现与PBS组相比，注射疫苗组肿瘤明显小于PBS组（图14），实验显示流感病毒诱导的免疫原性死亡的肿瘤细胞所制备的疫苗具有良好的抗肿瘤潜力。
进而，本测试例利用实施例3制备得到的流感病毒介导的抗肿瘤疫苗进行治疗性实验，即流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡肿瘤模型治疗性实验：
实验拟考察免疫原性死亡的肿瘤细胞制备的疫苗，在小鼠肿瘤模型中诱导抗肿瘤反应的潜力。注射免疫原性死亡的细胞量均为5×105个/只小鼠，免疫程序如图15中A所示，小鼠成瘤后在肿瘤对侧皮下接种疫苗，肿瘤起始大小约为2~3 mm。实验结果显示与PBS组相比，药物及流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞均显示出其能诱发良好的抗肿瘤免疫反应，肿瘤均远小于PBS组。
流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡诱发良好的抗肿瘤效应：
在体内实验中，流感病毒诱导的免疫原性死亡的细胞并未比药物诱导的显示出更好的抗肿瘤效果，这与申请人设想不相符。在流感病毒的协助下，一方面流感病毒增强小鼠的固有免疫，一方面协助免疫原性死亡的细胞进行溶酶体逃逸，增强交叉递呈，将两者结合起来，流感病毒诱导的免疫原性细胞死亡所制备的疫苗应更具抗肿瘤能力。分析原因疑似流感病毒诱导时机未准确把握，流感病毒诱导24h时肿瘤细胞未能处于最佳免疫原性死亡状态。且此时流感病毒已经被释放到细胞培养上清中，注射时流感病毒的量并不准确。所以设计实验调整流感病毒诱导的时间，将流感病毒以感染复数为1吸附B16-F10肿瘤细胞2h后，将细胞消化制备疫苗，免疫荷瘤小鼠，每周免疫两次共免疫四次。实验结果显示流感病毒吸附肿瘤细胞2h后组小鼠的肿瘤大小与PBS组有统计学差异，而药物诱导组与PBS组的肿瘤大小并无统计学差异（图16中A），实验结果说明了流感病毒在小鼠体内诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡诱发了更好的抗肿瘤效应。且在实验中观察到流感病毒吸附肿瘤细胞2h的细胞疫苗并未致瘤，具有安全性。由于本次实验中，肿瘤模型建立时加入了基质胶由于基质胶对接种的肿瘤细胞的固定和保护作用，肿瘤模型生长速度过快，没有足够的时间进行干预。所以本测试例未加入基质胶再次进行荷瘤小鼠的肿瘤治疗，在未加入基质胶的情况下接种肿瘤，接种后14天，肿瘤长至2~3毫米时，将小鼠随机分组，分为PBS、IAV、Drug inducedICD、Drug induced ICD + IAV和IAV induced ICD五个组，其中IAV induced ICD组诱导时长为流感病毒感染后2h，实验免疫程序为在肿瘤接种后14和18天注射疫苗，共注射两次。如图16中 B-E实验结果显示，流感病毒诱导的免疫原性肿瘤细胞死亡诱导了极好的抗肿瘤免疫反应，与其他组相比IAV induced ICD组肿瘤远远小于其余组。分析结果，流感病毒在小鼠体内持续诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，从肿瘤细胞中产生的有感染性的子代病毒扩散到周围的肿瘤细胞继续诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，并产生PAMP、DAMP、肿瘤细胞碎片和TAA等子产物，激活先天性和适应性抗肿瘤免疫反应的局部和全身刺激。
流感病毒诱导B16-F10肿瘤细胞免疫原性死亡疫苗对小鼠脾内CTL水平的影响：
待小鼠肿瘤观测完成后，牺牲小鼠并分离小鼠脾淋巴细胞，对小鼠脾淋巴细胞中的CTL进行染色，并进行流式细胞术分析实验结果显示（图17），Drug induced ICD + IAV和IAV induced ICD组都诱导了较高水平的CD8α和CTL。使用脾淋巴细胞对细胞的IFN-γ进行ELISPOT分析，在IAV组和IAV induced ICD组都检测到了较好水平的IFN-γ（图18）。在细胞水平的检测证明了流感病毒在小鼠体内诱导肿瘤细胞免疫原性死亡激发了较好水平的抗肿瘤反应。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种流感病毒介导的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗由流感病毒诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡而获得；
所述流感病毒为甲型流感病毒A/WSN/33 H1N1；
所述肿瘤细胞为B16-F10肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的流感病毒介导的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述流感病毒的添加量为MOI=1。
3.根据权利要求1或2所述的流感病毒介导的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗的施用方式为皮下注射。
4.一种如权利要求1~3任一项所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，流感病毒感染肿瘤细胞：
向肿瘤细胞中加入配置好的含感染复数MOI为1的流感病毒的无血清培养基，使流感病毒吸附并内吞进入肿瘤细胞，保证肿瘤细胞受到流感病毒感染；
步骤2，抗肿瘤疫苗的制备：
取步骤1获得的被流感病毒感染的肿瘤细胞，通过消化、清洗、计数、稀释的处理后，获得所述抗肿瘤疫苗。
5.一种如权利要求1~3任一项所述流感病毒介导的抗肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
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