KR101176116B1 - 정밀 화학물질의 대사 경로 단백질을 코딩하는 유전자 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정밀 화학물질의 대사 경로 중 돌연변이된 핵산 및 단백질, 유전적으로 변형된 생산자 유기체를 제조하는 방법, 상기 유전적으로 변형된 유기체를 배양하여 정밀 화학물질을 제조하는 방법, 및 상기 유전적으로 변형된 유기체에 관한 것이다.

Description

정밀 화학물질의 대사 경로 단백질을 코딩하는 유전자 변이체 {GENE VARIANTS CODING FOR PROTEINS FROM THE METABOLIC PATHWAY OF FINE CHEMICALS}

본 발명은 정밀 화학물질의 대사 경로의 돌연변이된 핵산 및 단백질, 유전적으로 변형된 생산자 유기체를 제조하는 방법, 상기의 유전적으로 변형된 유기체를 배양하여 정밀 화학물질을 제조하는 방법 및 유전적으로 변형된 유기체 그 자체에 관한 것이다.

세포에서 자연 발생적 대사 과정의 특정 생성물 및 부산물은 식품 산업, 동물 사료 산업, 화장품 산업 및 제약 산업을 비롯한 다양한 산업 분야에 이용된다. 총체적으로 "정밀 화학물질(fine chemical)"로 언급되는 이들 분자에는 유기산, 단백질 생성 및 비-단백질생성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 효소가 포함된다.

이들은 예를 들면, 하나 이상의 원하는 정밀 화학물질을 대량으로 생산하고 분비하도록 개발된 박테리아의 대규모 배양을 통해 생산될 수 있다. 이러한 목적에 특히 유용한 유기체는 그람 양성의 비병원성 박테리아인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다. 균주 선별을 통해, 다양한 바람직한 화합물을 생산하는 다수의 돌연변이 균주가 개발되어 있다. 그러나, 특정 화합물의 생산과 관련하여 개선된 돌연변이체 선별은 시간 소모적이고 어려운 공정이다.

유전자 변형에 의해 생산자 유기체의 생산성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 생산자 유기체에서 특정 유전자의 특이 돌연변이를 통해 원하는 정밀 화학물질의 생산성을 증가시킬 수 있다.

EP 1 108 790 A2에는 코리네박테리움 글루타미쿰호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 야생형 서열로부터 출발하여, 야생형 서열과 비교되는 돌연변이 Val59Ala를 갖는 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이된 핵산 서열이 기술되어 있다. 추가로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 아미노산 서열과 비교하여 돌연변이 Pro458Ser를 갖는 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 돌연변이된 핵산 서열이 기술되어 있다. 상기 돌연변이를 코리네박테리움 글루타미쿰내로 도입함으로써 리신 수득율은 증가된다.

WO 0063388에는 추가로 돌연변이 T3111을 갖는 아스파르토 키나제를 코딩하는 돌연변이된 ask 유전자가 기술되어 있다.

정밀 화학물질의 코리네박테리움 글루타미쿰 생합성 경로의 유전자 및 단백질내 다른 돌연변이는 WO 0340681, WO 0340357, WO 0340181, WO 0340293, WO 0340292, WO 0340291, WO 0340180, WO 0340290, WO 0346123, WO 0340289 및 WO 0342389에 기술되어 있다.

이미 선행 기술에 공지되어 있는 돌연변이를 통해 생산자 유기체는 최적의 생산성을 갖지만, 즉, 원하는 정밀 화학물질을 최적의 수율로 및 최적의 C 수율을 갖지만, 상기 유기체의 생산성을 추가로 개선시켜야 할 필요성은 여전히 남아있다.

본 발명의 목적은 추가로 돌연변이된 유전자 및 단백질을 제공하여 정밀 화학물질의 생산자 유기체에서 생산성을 증가시킴으로써 정밀 화학물질을 제조하는 바이오테크 방법을 개선시키는 것이다.

본 발명자는 본 목적이 표 1의 컬럼 7에 각각 나타낸 기능을 보유하고, 표 1의 컬럼 2에서 각각 언급한 아미노산 서열로부터 출발하여 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 단, 표 2에 따른 단백질은 제외한 것에 의해 달성된다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명은 한편으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 관련 박테리아 종을 확인하거나 분류하기 위해 사용할 수 있고, 다른 한편으로는, 정밀 화학물질의 생산자 유기체의 생산성을 증가시켜 정밀 화학물질을 제조하는 바이오테크 방법을 개선시키는 신규 핵산 분자 및 단백질을 제공한다.

코리네박테리움 글루타미쿰은 수많은 정밀 화학물질의 대규모 생산, 탄화수소의 분해 (예를 들어, 원유 스필의 경우) 및 테르페노이드의 산화를 위해 산업적으로 널리 사용되는 그람 양성 호기성 박테리아이다. 따라서, 상기 핵산 분자는 발효 공정 등에 의한 정밀 화학물질 생산에 이용할 수 있는 미생물 확인에 사용할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 그 자체는 인간에게 병원성이 아니지만, 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae) (디프테리아의 원인균)와 같이, 인간에게 주요한 병원성인 종과 관련되어 있다. 그러므로, 코리네박테리움 종의 존재 확인 능력은 또한 임상적으로, 예를 들어, 진단 적용에 있어 상당히 중요할 수도 있다. 추가로, 상기 핵산 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 또는 관련 유기체의 게놈을 지도화하기 위한 기준점으로 작용할 수 있다.

이하에서 대사 경로 단백질 또는 MP 단백질로서도 언급되는 본 발명의 단백질은 표 1의 컬럼 7에 각각 나타낸 기능을 보유한다. 추가로, 이들은 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

"상응하는" 아미노산 위치는 바람직하게, 당업자는 표 1의 컬럼 2에 각각 언급하고 표 1의 컬럼 4에서 각각 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 위치를 갖는 아미노산 서열과의

a) 아미노산 서열의 상동성 비교에 의해, 또는

b) 상기 아미노산 서열의 2차, 3차 및(또는) 4차 구조의 구조적 비교에 의해 용이하게 찾을 수 있는, 본 발명의 MP 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 위치를 의미한다.

아미노산 서열의 상동성을 비교하는 바람직한 방법은 예를 들면, 하기 파라미터로 세팅하여 클러스탈(Clustal) 방법 [Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1]을 사용하여 미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 DNASTAR 인코포레이티드로부터의 레이저진 소프트웨어(Lasergene software)로 사용된다:

다중 정렬 파라미터:

갭 패널티 10

갭 길이 페널티 10

쌍 정렬 파라미터:

k-tuple 1

갭 패널티 10

윈도우 5

보존 대각선 5

바람직한 실시양태에서, 단백질은 표 1의 컬럼 7에 각각 나타낸 기능을 보유하고, 표 1의 컬럼 2에서 각각 언급한 아미노산 서열로부터 출발하여 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이되, 단, 표 2에 따른 단백질은 제외된다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 단백질은 표 1의 컬럼 2에서 각각 언급한 아미노산 서열로부터 출발하여 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 단백질은 표 1의 컬럼 2에서 각각 언급한 아미노산 서열로부터 출발하여 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

표 1의 컬럼 2에 나타낸 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 서열이다. 표 1의 컬럼 4는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열이 표 1의 컬럼 5의 동일 열에 나타낸 특정 아미노산과는 상이한 단백질성 아미노산을 갖는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 특정의 야생형 아미노산 서열에 대하여 나타낸다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 단백질은 표 1의 컬럼 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 나타낸 아미노산 위치에 상응하는, 하나 이상의 아미노산 위치에서 표 1의 컬럼 6의 동일 열에 나타낸 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 또다른 일면은 단리된 MP 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면, 생물학적으로 활성이 그의 단편에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 MP 단백질 또는 그의 단편은 유기체, 특히 코리네박테리아 및 브레비박테리아에서의 하나 이상의 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독 방법에 의해 조절한다.

MP 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 절편을 MP 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드와 기능적으로 연결하여 융합 단백질을 형성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이 융합 단백질의 활성은 MP 단백질만의 활성과 다르고, 다른 바람직한 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 하나 이상의 대사 경로를 전사, 해독 또는 후 해독적으로 조절한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이 융합 단백질을 숙주 세포로 통합시켜 이 세포에 의해 관심의 대상이 되는 화합물이 생산되는 것을 조정한다.

본 발명은 추가로 상기 기술된 본 발명의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 이들 핵산 분자는 이하에서 대사 경로 핵산 또는 MP 핵산 또는 MP 유전자로서도 언급된다. 이들 신규한 MP 핵산 분자는 본 발명의 MP 단백질을 코딩한다. 이들 MP 단백질은 예를 들어, 세포 의 정상적인 대사 기능에 결정적인 단백질의 전사, 해독 또는 후해독 조절에 관련된 기능을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,649,119호 [Sinskey et al.]에 의해 개시된 클로닝 벡터와 같은 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 클로닝 벡터, 및 관련된 브레비박테리움 종 (예를 들어, 락토페르멘툼(lactofermentum)의 유전자 조작 기술 (문헌 [Yoshihama et al, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985)], 문헌 [Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984)], 및 문헌 [Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)])을 이용하여 본 발명의 핵산 분자를 이용하여 이 유기체를 유전공학적으로 조작함으로써, 이 유기체가 1종 이상의 정밀 화학물질의 보다 우수하거나 보다 효율적인 생산자가 되도록 할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열 제조에 적절한 출발점은 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 ATCC 13032로 입수할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈이다.

본 발명의 핵산 서열은 표 1에 나타낸 변형을 통해 통상의 방법을 이용하여 이들 핵산 서열로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 MP 단백질의 아미노산 서열을 본 발명의 MP 유전자 핵산으로 역-해독(back-translation)하기 위해 본 발명의 MP 핵산 서열이 도입되거나 본 발명의 MP 핵산 서열이 존재하는 유기체의 코돈 사용(codon usage)을 사용하는 것이 유리하다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용을 사용하는 것이 유리하다. 특정 유기체의 코돈 사용은 관심의 대상이 되는 유기체의 적어도 하나의 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 기술하는 특허 출원 또는 데이타베이스로부터 그 자체로서 공지되어 있는 방식으로 결정될 수 있다.

MP 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 표 1의 컬럼 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입하여 생성할 수 있으며, 이에 의해 코딩된 단백질에는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 도입된다. 상기 돌연변이는 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법 등과 같은 표준 기술을 통해 표 1의 컬럼 1에 나타낸 서열중 하나에 도입될 수 있다. 비필수라고 예측되는 하나 이상의 아미노산 잔기에 보존적 아미노산 치환을 도입하는 것이 바람직하다. "보존적 아미노산 치환"은 해당 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 규정되어 있다. 이들 군은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, MP 단백질에서 비필수라고 예측되는 아미노산 잔기는 동일 측쇄군의 또다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이 바람직하다. 다르게는, 또다른 실시양태에서는 상기 돌연변이를 MP-코딩 서열 전체 또는 일부에 예를 들어, 포화 돌연변이유발법 등을 통해 무작위로 도입할 수 있고, 생성되는 돌연변이체를 본 원에 기재한 MP 활성에 대해 시험하여 MP 활성을 유지하는 돌연변이체를 확인할 수 있다. 첨부문서 A에 나타낸 임의의 서열을 돌연변이유발시킨 후에, 코딩되는 단백질을 재조합으로 발현시킬 수 있고, 상기 단백질의 활성을 예를 들어, 본 원에 기재한 분석법을 이용하여 측정할 수 있다 (실시예 단락의 실시예 8 참조).

본 발명은 유기체, 특히, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 하나 이상의 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독 방법에 의해 조절하는, 본 원에서 MP 핵산 및 MP 단백질 분자로 언급되는 새로운 분자의 검출을 기초로 한다. 한 실시양태에서, MP 분자는 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독적으로 조절한다. 바람직한 실시양태에서, 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 하나 이상의 대사 경로를 조절하기 위한 본 발명의 MP 분자의 활성은 이 유기체에 의한 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생산에 영향을 준다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 MP 단백질이 조절하는 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰 대사 경로가 생산성 또는 효율 면에서 조정되도록 본 발명의 MP 분자의 활성을 조정하여, 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 직접적 또는 간접적으로 조절한다.

용어 "MP 단백질" 또는 "MP 폴리펩티드"에는 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독적으로 조절하는 단백질이 포함된다. MP 단백질의 예에는 표 1에 기재된 것들이 포함된다. 용어 "MP 유전자" 또는 "MP 핵산 서열"에는 코딩 영역 및 이에 상응하는 비해독 5' 및 3' 서열 영역으로 구성된, MP 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된다. MP 유전자의 예는 표 1에 기재된다.

용어 "생산량" 및 "생산성"은 당업계에 공지되어 있으며 소정의 기간 및 소정의 발효 부피에서 생산될 발효 산물 (예컨대, 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질)의 농도 (예컨대, 1 L 당 산물 질량 (kg)/시간)를 포함한다.

용어 "생산 효율"은 특정 생산량 (예를 들어, 세포에 의한 정밀 화학물질의 처리량이 특정 속도에 도달하는데 필요한 시간) 달성에 필요한 시간을 포함한다. 용어 "수율" 또는 "산물/탄소 수율"은 당업계에 공지되어 있으며 탄소 공급원을 산물 (즉, 정밀 화학물질)로 전환시키는 효율을 포함한다. 즉, 이는 예를 들어, 통상적으로 탄소 공급원 1 kg 당 산물의 질량 (kg)으로 표현된다. 화합물의 수율 또는 생산 증가는 특정량의 배양물에서 소정의 시간에 걸쳐 수득되는 상기 분자의 양 또는 이 화합물의 적합하게 수득되는 분자의 양을 증가시킨다.

용어 "생합성" 및 "생합성 경로"는 당업계에 공지되어 있으며 세포가 중간체로부터 화합물, 바람직하게는 유기 화합물을 예를 들어, 다단계 과정 또는 고도로 조절되는 과정을 통해 합성하는 것을 포함한다. 용어 "분해" 및 "분해 경로"는 당업계에 공지되어 있으며 세포가 화합물, 바람직하게는 유기 화합물을 예를 들어, 다단계 과정 또는 고도로 조절되는 과정을 통해 분해 산물 (더욱 일반적인 용어로는, 더 작거나 덜 복잡한 분자)로 절단하는 것을 포함한다.

용어 "대사"는 당업계에 공지되어 있으며 유기체에서 일어나는 전반적인 생화학적 반응을 포함한다. 이때, 특정 화합물의 대사 (예컨대, 글리신 등과 같은 아미노산의 대사)는 그 화합물의 세포내 모든 생합성, 변형 및 분해 경로를 포함한다.

용어 "조절"은 당업계에 공지되어 있으며, 또다른 단백질의 활성을 제어하기 위한 단백질의 활성을 포함한다. 용어 "전사 조절"은 당업계에 공지되어 있으며 표적 단백질을 코딩하는 DNA의 mRNA로의 전환을 억제하거나 활성화시키는 단백질의 활성을 포함한다. 용어 "해독 조절"은 당업계에 공지되어 있으며 표적 단백질을 코딩하는 mRNA의 단백질 분자로의 전환을 억제하거나 활성화시키는 단백질의 활성을 포함한다. 용어 "후해독 조절"은 당업계에 공지되어 있으며 표적 단백질을 공유결합적으로 (예컨대, 메틸화, 글리코실화 또는 인산화에 의해) 변형시킴으로써 표적 단백질의 활성을 억제하거나 개선시키는 단백질의 활성을 포함한다.

본 발명의 유전자를 조작함으로써 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 직접적으로 또는 간접적으로 개선시킬 수 있다. 더욱 구체적으로, 보통 정밀 화학물질 대사 경로 중 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 조절하는 MP 단백질의 변형은 상기 유기체로부터의 하나 이상의 상기 원하는 화합물의 총생산 또는 생산 속도에 직접적인 영향을 줄 수 있다.

이들 대사 경로에 관여하는 상기 단백질의 변형은 또한 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율에 간접적인 영향을 줄 수도 있다. 대사 조절은 반드시 복잡하며, 상이한 경로에 영향을 주는 조절 메카니즘은 많은 장소에서 중복될 수 있으므로, 하나 이상의 대사 경로는 특정 세포내 사건에 따라 신속하게 조정될 수 있다. 이로 인해 하나의 대사 경로에 대한 조절 단백질의 변형이 수많은 다른 대사 경로에 영향을 줄 수 있고, 그 중 일부는 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생합성 또는 분해에 관여할 수 있다. 이러한 간접적인 방식으로, MP 단백질의 작용 조정은 상기 MP 단백질에 의해 직접적으로 조절되는 대사 경로와 상이한 대사 경로를 통해 생산된 정밀 화학물질의 생산에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 MP 핵산 및 MP 단백질 분자를 이용하여, 비-인간 유기체로부터 하나 이상의 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 직접 개선시킬 수 있다.

당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여, 본 발명의 하나 이상의 조절 단백질을 조작하여, 그 기능을 조절할 수 있다. 아미노산 생합성에 요구되는 효소를 코딩하는 유전자의 전사를 억제하는 데에 관여하는 MP 단백질의 돌연변이 (여기서, 상기 단백질은 더이상 전사를 억제할 수 없음)로 인해, 예를 들어, 상기 아미노산의 생산이 증가될 수 있다.

따라서, 해독 증가를 유발하거나 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생합성에 관여하는 MP 단백질의 후해독 변형을 활성화시키는 MP 단백질의 활성이 변형되면, 상기 화학물질의 생산이 차례로 증가될 수 있다. 반대의 상황도 또한 유용할 수 있다: 전사 또는 해독의 억제를 증가시키거나, 화합물의 분해 경로 조절에 관여하는 MP 단백질을 후해독적으로 음으로 변형시킴으로써, 상기 화학물질의 생산을 증가시키는 것이 가능하다. 각 경우에서, 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 총 수율 또는 생산 속도가 증가될 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 및 뉴클레오티드 분자에서의 이러한 변형으로 간접적 메카니즘을 통해 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율이 개선될 수 있는 것이 가능하다. 특정 화합물의 대사는 세포내 다른 생합성 및 분해 경로와 반드시 연결되어 있고, 한 대사 경로에 필요한 보조인자, 중간체 또는 기질은 또다른 대사 경로에 의해 공급되거나 제한되는 것으로 보인다. 그러므로, 본 발명의 하나 이상의 조절 단백질을 조정하여, 정밀 화학물질의 다른 생합성 또는 분해 경로의 활성 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이에 더하여, 배양에서, 특히 성장 조건이 최적에 이르지 못할 수 있는 대규모 발효 배양에서, 하나 이상의 조절 단백질을 조작하여 세포가 생장 및 번식하는 전반적인 능력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 최적에 이르지 못하는 영양소의 세포외 공급 (그로 인한 세포 분열 저지)으로의 반응으로서 뉴클레오시드의 생합성을 보통 억제하는 본 발명의 MP 단백질을 돌연변이시킴으로써 (이 때 상기 단백질은 낮은 억제자 활성을 갖음) 뉴클레오시드의 생합성 및 아마도 세포 분열을 증가시키는 것이 가능하다. 배양 중 세포 성장 증가 및 세포 분열 증가를 유발하는 상기 MP 단백질을 변형시키는 것은 적어도 배양 중에 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질을 생산하는 세포의 수를 증가시킴으로써, 배양물로부터의 관심의 대상이 되는, 하나 이상의 상기 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율 증가를 야기할 수 있다.

본 발명은 비-인간 유기체에서 대사 경로의 전사, 해독 또는 후해독 조절에 관여하는 효소 단계를 수행할 수 있는 단백질을 코딩하는 신규 핵산 분자를 제공한다. MP 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본 원에서 MP 핵산 분자로 언급된다. 바람직한 실시양태에서, MP 단백질은 하나 이상의 대사 경로의 전사, 해독 또는 후해독 조절에 관여한다. 이러한 단백질의 예로는 표 1에 기재된 유전자에 의해 코딩되는 것을 들 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 MP 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (예를 들어, cDNA) 뿐만 아니라 MP-코딩 핵산 (예를 들어, DNA 또는 mRNA)의 검출 또는 증폭을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 적절한 핵산 단편에 관한 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 표 1에 기재된 아미노산 서열중 어느 하나를 코딩한다. 본 발명의 바람직한 MP 단백질은 본 원에 기재된 MP 활성 중 적어도 하나를 갖는 것도 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 그 길이가 뉴클레오티드 15개 이상이고 본 발명의 핵산 분자와 엄격 조건하에서 혼성화한다. 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 자연 발생된 핵산 분자에 상응한다. 더욱 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연 발생된 코리네박테리움 글루타미쿰의 MP 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩한다.

모든 살아있는 세포는 많은 대사 경로가 서로 연결되어 있는 복잡한 이화 및 동화 능력을 갖는다. 이러한 극히 복잡한 대사 네트워크의 각종 부분들 사이에 평형을 유지하기 위하여, 세포는 정밀하게 조율된 조절 네트워크를 이용한다. 효소 합성 및 효소 활성을 독립적으로 또는 동시에 조절함으로써, 세포는 완전하게 상이한 대사 경로의 활성을 조절하여 세포의 변화하는 요구들을 충족시킬 수 있다.

효소 합성의 유도 또는 억제는 전사 또는 해독 수준 중 하나에서 또는 전사와 해독 수준 모두에서 발생할 수 있다 (자세한 것은 문헌 [Lewin, B. (1990) Genes IV, Part 3: "Controlling prokaryote genes by transcription" Oxford University Press, Oxford, pp. 213-301]과 그의 참고문헌, 및 문헌 [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons] 참조). 상기 공지된 조절 방법 모두는 각종 외적 효과 (예컨대 온도, 영양소 공급 또는 빛)에 스스로 반응하는 추가의 유전자에 의해 매개된다. 상기 유형의 조절에 관여하는 단백질 인자의 예는 전사 인자를 포함한다. 이들은 DNA와 결합하여 유전자의 발현을 증가시키거나 (대장균 ara 오페론의 경우 양의 조절) 감소시키는 (대장균 lac 오페론의 경우 음의 조절) 단백질이다. 이들 발현-조정 전사 인자는 스스로 조절될 수 있다. 그의 활성은 예를 들어, DNA-결합 단백질에 결합된 저분자량 화합물에 의해 조절될 수 있는데, 상기 단백질과 DNA상의 적절한 결합 부위와의 결합이 자극되거나 (ara 오페론에 대해서는 아라비노스의 경우와 같음) 억제됨으로써 (lac 오페론에 대해서는 락토스의 경우와 같음) 조절된다 (예를 들어, 문헌 [Helmann, J.D. and Chamberlin, M.J. (1988) "Structure and function of bacterial sigma factors" Ann. Rev. Biochem. 57: 839-872]; [Adhya, S. (1995) "The lac and gal operons today" and Boos, W. et al., "The maltose system" both in Regulation of Gene Expression in Escherichia coli (Lin, E.C.C. and Lynch, A.S. editors) Chapman & Hall: New York, pp. 181-200 and 201-229]; 및 [Moran, C.P. (1993) "DNA polymerase and transcription factors" in: Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria, Sonenshein, A.L. editors ASM: Washington D.C. pp. 653-667] 참조).

단백질 합성은 전사 수준에서 뿐 아니라 해독 수준에서도 조절된다. 상기 조절은 리보솜이 하나 이상의 mRNA와 결합하는 능력, 리보솜과 mRNA의 결합, mRNA 2차 구조의 유지 또는 제거, 특정 유전자에 대한 통상적 또는 덜 통상적인 코돈의 이용, 하나 이상의 tRNA의 풍부도를 변형시키는 것을 포함하는 많은 메카니즘 및 약독화와 같은 특이적 조절 메카니즘을 통해 수행될 수 있다 (문헌 [Vellanoweth, R.I. (1993) Translation and its regulation in Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria, Sonenshein, A.L. et al. editors ASM: Washington, D.C., pp. 699-711] 및 그의 참고문헌 참조).

전사 및 해독의 조절은 단일 단백질을 향해 지시되거나 (순차적 조절), 동시에 각종 대사 경로의 복수개의 단백질을 향해 지시될 수 있다 (통합적 조절). 발현이 통합적 방식으로 조절되는 유전자는 종종 게놈상에서 오페론 또는 레귤론에 근접하게 위치한다. 유전자 전사 및 유전자 해독의 이러한 상향 또는 하향 조절은 기질 (하나 이상의 대사 경로에 사용되는 전구체 및 중간체), 이화산물 (당과 같은 복합체 유기 분자의 분해로 인한 에너지 생산과 연결된 생화학적 경로에 의해 생산된 분자) 및 최종 산물 (대사 경로의 마지막에 수득되는 분자) 등과 같은 각종 인자의 세포내 또는 세포외 양에 의해 제어된다. 특정 대사 경로의 활성에 요구되는 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 상기 대사 경로에 대한 다량의 기질 분자에 대해 유도된다. 상응하게, 상기 유전자 발현은 상기 경로의 최종 산물이 세포간에 다량 존재함으로써 억제된다 [Snyder, L. and Champness, W. (1977) The Molecular Biology of Bacteria ASM: Washington]. 유전자 발현은 환경적 조건 (예컨대, 열, 산화적 스트레스 또는 기아)과 같은 내부 및 외부 인자에 의해 조절될 수도 있다. 이들 전체적인 환경적 변화는 DNA에 결합함으로써 유전자 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 (추가의 유전자 또는 단백질을 통해) 유도하는 구체적인 조정 유전자의 발현을 변화시키고, 그로 인해 전사를 유도하거나 억제한다 (예를 들어, 문헌 [Lin, E.C.C. and Lynch, A.S. editors (1995) Regulation of Gene Expression in Escherichia coli, Chapman & Hall: New York] 참조).

세포내 대사를 조절할 수 있는 또다른 메카니즘은 단백질 수준에서 발생한다. 상기 조절은 단백질의 정상 기능을 방해하거나 허용하는 저분자량 성분의 결합 또는 다른 효소의 활성을 통해 수행된다. 저분자량 화합물의 결합에 의한 단백질 조절의 예는 GTP 또는 NAD의 결합을 포함한다. 저분자량 화학물질의 결합은 예를 들어, GTP-결합 단백질의 경우 보통 가역적이다. 이들 단백질은 (GTP 또는 GDP와 결합하여) 2가지 상태로 존재하는데, 한 상태는 단백질의 활성형이고 다른 상태는 비활성형이다.

단백질 활성은 보통 단백질의 공유결합적 변형 (즉, 히스티딘 또는 아스파르테이트와 같은 아미노산 잔기의 인산화 또는 메틸화)을 통한 다른 효소의 작용으로 조절된다. 상기 공유결합적 변형은 보통 가역적이고, 이는 반대 활성을 가진 효소에 의해 수행된다. 이의 예는 단백질 인산화에서의 키나제 및 포스포릴라제의 반대 활성이다: 단백질 키나제는 표적 단백질 (예컨대, 세린 또는 트레오닌)상의 특이적 잔기를 인산화하는 반면, 단백질 포스포릴라제는 상기 단백질로부터 포스페이트 기를 제거한다. 다른 단백질의 활성을 조정하는 효소는 보통 외부 자극에 의해 스스로 조정된다. 이들 자극은 감각기로서 작용하는 단백질에 의해 매개된다. 이들 감각기 단백질이 상기 외적 신호를 매개하는 널리 공지된 메카니즘은 이량체화이나, 다른 메카니즘도 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Msadek, T. et al. (1993) "Two-component Regulatory Systems" in: Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein, A.L. et al., editors, ASM: Washington, pp. 729-745] 및 그의 참고문헌).

미생물에서 세포내 대사를 제어하는 조절 네트워크의 상세한 이해는 발효에 의해 고수율로 화학물질을 생산하기 위해서 중대하다. 대사 경로를 하향조절하기 위한 제어 시스템은 관심의 대상이 되는 화학물질의 합성을 개선시키기 위해 제거되거나 감소될 수 있고, 이와 상응하게 관심의 대상이 되는 산물의 대사 경로를 상향조절하기 위한 제어 시스템은 활성 면에서 구조적으로 활성화되거나 최적화될 수 있다 (문헌 [Hirose, Y. and Okada, H. (1979) "Microbial Production of Amino Acids" in: Peppler, H.J. and Perlman, D. (editors) Microbial Technology 2nd edition, Vol. 1, Chapter 7, Academic Press, New York] 참조).

본 발명의 또 다른 측면은 예를 들면, 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터와 같은 벡터인 핵산 작제물에 관한 것이다.

핵산 작제물은 바람직하게 기능적으로 연결된 방식으로 프로모터 및, 적절하게는, 종결자를 포함한다. 핵산에 대하여 이종이고 비-인간 유기체에서 당해 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터가 특히 바람직하다. 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 바람직한 유기체에서 특히 바람직한 프로모터의 예는 tac 프로모터이다.

본 발명은 추가로

a) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 MP 핵산 또는

b) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 핵산 작제물 또는

c) 상기 기술된 본 발명의 내인성 MP 핵산에 대하여 이종이고 유기체에서 본 발명의 내인성 MP 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터를 비-인간 모체 유기체에 도입시킴으로써 상기 모체 유기체를 형질전환시켜 유전적으로 변형된 비-인간 유기체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 유기체에서 프로모터가 본 발명의 내인성 MP 핵산에 기능적으로 연결될 수 있도록 하기 위하여 실시양태 c)에 따른 프로모터를 유기체내로 도입한다. "기능적 연결"은 기능성인 연결, 즉, 본 발명의 내인성 MP 핵산이 도입된 프로모터에 의해 발현되도록 할 수 있는 연결을 의미한다.

용어 "모체 유기체"는 유전적으로 변형된 유기체로 형질전환되는, 상응하는 비-인간 유기체를 의미한다. 여기에서, 모체 유기체는 야생형 유기체이거나 이미 유전적으로 변형되어 있는 유기체일 수 있다. 추가로, 모체 유기체는 이미 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질을 생산할 수 있거나, 본 발명의 형질전환에 의해 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질을 생산할 수 있다.

용어 "유전적으로 변형된 유기체"는 바람직하게 모체 유기체와 비교하여 유전적으로 변형된 유기체를 의미한다.

상황에 따라, 용어 "유기체"는 비-인간 모체 유기체, 또는 본 발명의 유전적으로 변형된 비-인간 유기체 또는 둘 모두를 의미한다.

본 발명의 MP 핵산 또는 본 발명의 핵산 작제물은 자기-복제 플라스미드로서 염색체에 도입되거나 플라스미드로서 도입될 수 있다. 본 발명의 MP 핵산 또는 본 발명의 핵산 작제물은 바람직하게 염색체에 통합된다.

바람직한 실시양태에서, 사용되는 모체 유기체는 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질을 이미 생산할 수 있는 유기체이다. 특히 바람직한 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 박테리아 유기체 및 특히 바람직한 정밀 화학물질 리신, 메티오닌 및 트레오닌 중에서 이미 리신을 생산할 수 있는 모체 유기체를 제공하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들면, 아스파르토키나제에 대한 유전자 코딩(ask 유전자)이 탈조절되거나 피드백 저해가 제거되거나 감소되어 있는 코리네박테리아가 특히 바람직하다. 예를 들면, 이러한 종류의 박테리아는 피드백 저해를 제거하거나 감소시키는 ask 유전자상의 돌연변이, 예로서, 돌연변이 T311I를 갖는다.

따라서, 특히, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 수득할 수 있는 유전적으로 변형된 유기체이다.

추가로, 본 발명은

a) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 MP 핵산 또는

b) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 핵산 작제물 또는

c) 상기 기술된 본 발명의 내인성 MP 핵산에 대하여 이종이고 유기체에서 본 발명의 내인성 MP 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터로 형질전환된, 유전적으로 변형된 비-인간 유기체에 관한 것이다.

또다른 실시양태에서, 모체 유기체의 게놈에서 내인성 MP 유전자는 변형된 MP 유전자와의 상동성 재조합에 의해 변형되는데, 예를 들면 기능적으로 파괴된다.

바람직하게, 본 발명의 핵산의 발현을 통해 당해 유기체로부터의 정밀 화학물질의 생산은 모체 유기체와 비교하여 조정된다.

바람직한 비-인간 유기체는 식물, 조류(algae) 및 미생물이다. 바람직한 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균이다. 특히 바람직한 미생물은 박테리아, 특히 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 박테리아이고, 코리네박테리움 글루타미쿰이 특히 바람직하다.

모체 유기체 또는 유기체 또는 유전적으로 변형된 유기체로서 특히 바람직한 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 박테리아는 하기 표 3에 기재하는 박테리아이다.

약어는 하기 의미를 갖는다:

ATCC: 미국 메릴랜드주 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)

FERM: 일본 시바에 소재하는 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트(fermentation research institute)

NRRL: 미국 일리노이주 피오리아에 소재하는 ARS 컬쳐 콜렉션 노던 리저널 리서치 라보라토리(Northern Regional Research Laboratory)

CECT: 스페인 발렌시아에 소재하는 꼴레치온 에스파놀라 드 컬티보스 티보(Coleccion Espanola de Cultivos Tipo)

NCIMB: 영국 애버딘에 소재하는 내쇼날 콜렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아 리미티드(National collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.)

CBS: 네덜란드 바아른에 소재하는 센트라알부로 부르 스키멜컬쳐스(centraalbureau voor Schimmelcultures)

NCTC: 영국 런던에 소재하는 내쇼날 콜렉션 오브 타입 컬쳐(National collection of Type Culture)

DSMZ: 독일 브런즈윅에 소재하는 도이치 삼릉 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)

또 다른 바람직한 실시양태는 이하 "숙주 세포"로서 언급되는 되는, 하나 이상의 본 발명의 MP 핵산 분자를 갖는, 본 발명의 유전적으로 변형된 유기체이다. 상기 숙주 세포는 당업자에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 이는 예를 들면, 수개의 본 발명의 핵산 분자를 운반하는 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 그러나, 각각의 경우 하나의 본 발명의 핵산 분자를 숙주 세포내로 도입시키기 위해서도 사용할 수 있고, 따라서, 다양한 벡터를 동시에 또는 순차적으로도 사용할 수 있다. 따라서, 다수의, 단, 수백 개 이하의 본 발명의 핵산 분자를 운반하는 숙주 세포를 작제할 수 있다. 이러한 축적은 자주 정밀 화학물질의 생산성과 관련하여 숙주 세포에 대하여 초부가적인 효과를 가져올 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 유전적으로 변형된 유기체는 염색체에 통합된 방식으로 적어도 2개의 본 발명의 MP 핵산 또는 본 발명의 내인성 MP 핵산에 기능적으로 연결된 이종 프로모터를 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 MP 단백질 및(또는) MP 유전자는 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생산을 조정할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 본 발명의 하나 이상의 본 발명의 조절 단백질을 조작함으로써 이들의 기능을 조정할 수 있다. 예를 들어, 생합성 효소를 효율 면에서 개선시키거나 그의 알로스테릭 제어 영역을 파괴하여 화합물 생산의 피드백 억제를 방해하는 것이 가능하다. 따라서, 분해 효소는 세포 생존력을 손상시키지 않으면서 관심의 대상이 되는 화합물에 대한 그의 분해 활성을 감소시키도록 치환, 결실 또는 부가에 의해 삭제 또는 변형될 수 있다. 어떤 경우에는, 임의의 상기 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 전반적 효율 또는 생산 속도를 증가시키는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 단백질 및 뉴클레오티드 분자에서의 이러한 변형은 정밀 화학물질의 생산을 간접적으로 개선시킬 수도 있다. 세포내 대사 경로의 조절 메카니즘은 반드시 연결되어 있고, 한 대사 경로의 활성화는 그에 수반되는 방식으로 또다른 대사 경로를 억제 또는 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 단백질의 활성을 조정하는 것은 다른 정밀 화학물질 생합성의 생산 또는 활성 효율 또는 분해 경로에 영향을 줄 수 있다. 이들 대사 경로는 서로 연결되어 있으므로 아미노산 생합성에서 특정 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 억제하는 MP 단백질의 능력을 감소시킴으로써 동시에 다른 아미노산 생합성 경로를 억제할 수 있게 된다. 본 발명의 MP 단백질을 변형시킴으로써 그의 세포외 환경으로부터 일정한 수준의 세포 성장 및 세포 분열로 분리하는 것이 가능하고; 성장 및 세포 분열을 위한 세포외 조건이 최적에 이르지 못해 이제 상기 기능이 결핍된 경우, 보통 뉴클레오티드의 생합성을 억제하는 MP 단백질에 영향을 줌으로써 세포외 조건이 불량할지라도 성장할 수 있게 하는 것이 가능하다. 상기 인자에 대한 세포내 조절 시스템이 제거된 후 온도, 영양소 공급 또는 공기공급에 대한 배양물 조건이 종종 최적에 이르지 못하지만 성장 및 세포 분열을 여전히 촉진시킬 수 있는 대규모 발효 배양의 경우 이는 특히 중요하다.

따라서, 본 발명은 추가로, 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 유전적으로 변형된 유기체를 배양하여 정밀 화학물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은

A) 비-인간 모체 유기체를

a) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 MP 핵산 또는

b) 상기 기술된 적어도 하나의 본 발명의 핵산 작제물 또는

c) 상기 기술된 본 발명의 내인성 MP 핵산에 대하여 이종이고 유기체에서 본 발명의 내인성 MP 핵산을 발현시킬 수 있는 프로모터

로 형질전환시키고,

B) 상기 단계 A)에 따라 제조된 유전적으로 변형된 유기체를 배양하여

정밀 화학물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전적으로 변형된 유기체는 그 자체로서 공지된 방식으로 상기 유기체에 따라 배양한다. 예를 들면, 박테리아는 적절한 발효 배지중 배양액에서 배양한다.

바람직한 실시양태에서, 배양 단계 후 유전적으로 변형된 유기체 및(또는) 배양 배지로부터 적어도 하나의 정밀 화학물질을 단리시킨다.

용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 공지되어 있고, 제약, 농업 및 화장품 산업과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 산업에 이용되는 유기체에 의해 생산되는 분자를 포함한다. 이러한 화합물로는 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산, 단백질생성 및 비-단백질생성 아미노산, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p.561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim]과 그의 참고문헌에 기재된 바와 같음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들어, 아라키돈산), 디올 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들어, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", p.443-613 (1996) VCH: Weinheim] 및 그의 참고문헌, 및 문헌 [Ong, A.S., Niki, E. ＆ Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)]에 기재된 바와 같음), 효소 및 문헌 [Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086] 및 상기 문헌에 표시된 참고문헌에 기재된 다른 모든 화학물질이 있다. 특정 정밀 화학물질의 대사 및 용도는 아래에 추가로 예시된다.

I. 아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하므로 정상적인 세포 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 공지되어 있다. 아미노산 중 단백질생성 아미노산은 20종이며 펩티드 결합으로 연결되어 있는 단백질의 구조 단위로 작용하는 반면, 비-단백질생성 아미노산 (수백 종이 공지되어 있음)은 정상적으로는 단백질에서 발견되지 않는다 (문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97 VCH: Weinheim (1985)] 참조). L-아미노산이 통상적으로 자연 발생 단백질에서 발견되는 유일한 형태이지만, 아미노산은 D-광학 또는 L-광학 구조일 수 있다. 20종의 단백질생성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로의 특징은 원핵세포 및 진핵세포 둘 다에서 잘 규명되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pages 578-590 (1988)] 참조). 생합성의 복잡성으로 인해 일반적으로 섭식으로 흡수되어야 하기 때문에 "필수" 아미노산이라고 지칭되는 아미노산 (히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 단순한 생합성 경로에 의해 나머지 1하나의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 쉽게 전환된다. 고등동물은 필수 아미노산 중 일부를 합성하는 능력을 보유하지만, 상기 필수 아미노산은 식사로부터 공급되어야 정상적인 단백질 합성이 일어난다.

아미노산의 단백질 생합성에서의 기능 이외에도, 이들 아미노산은 그 자체가 흥미로운 화학물질이고, 다수의 아미노산이 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약 산업에 다양하게 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 리신은 인간뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위(monogastric) 동물의 영양에 있어서도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미제 첨가물 (모노-소듐 글루타메이트, MSG)로서 가장 흔히 사용되고, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시트테인도 식품 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 사용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에 사용된다. 글루타민, 발린, 루이신, 이소루이신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업 둘다에 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (문헌 [Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids technical production and use, p.466-502 in Rehm et al. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim]). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질, 예를 들어, N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97, VCH: Weinheim, 1985]에 기재된 다른 것의 합성을 위한 전구체로 추가로 적합하다는 것이 밝혀져 있다.

박테리아 등과 같이 이들 천연 아미노산을 생산할 수 있는 유기체에서의 이들 천연 아미노산의 생합성 특징은 잘 규명되어 있다 (박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 자세한 것은 문헌 [Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606] 참조). 글루타메이트는 시트르산 사이클의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원성 아미노화에 의해 합성된다. 글루타민, 프롤린 및 아르기닌은 각각 글루타메이트로부터 생성된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트 (해당 작용의 중간체)로 출발하여, 산화, 트랜스아미노화 및 가수분해의 3 단계 과정 후에 세린이 생성된다. 시스테인 및 글리신은 둘다 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되며, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전달되어 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 프레페네이트의 합성 후 최종 두 단계에서만 다른 9 단계 생합성 경로에서 해당작용 및 펜토스 포스페이트 경로 전구체인 에리쓰로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판도 이들 두 초기 분자로부터 합성되지만, 그의 합성은 11 단계 경로이다. 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 루이신은 해당작용의 최종 산물인 피루베이트의 모든 생합성 산물이다. 아스파르테이트는 시트르산 사이클의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라진, 메티오닌, 트레오닌 및 리신 각각은 아스파르테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소루이신은 트레오닌으로부터 형성된다. 복잡한 9 단계 경로에서 활성화된 당인 5-포스포리보실-1-피로포스페이트로부터 히스티딘이 생성된다.

세포의 단백질 합성 필요량을 초과하는 아미노산은 저장될 수 없고, 그 대신에 분해되어 세포의 주요 대사 경로에 대한 중간체로 제공된다 (자세한 것은 문헌 [Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle" p.495-516 (1988)] 참조). 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생성은 에너지, 전구체 분자, 및 이들 아미노산을 합성하는 데 필요한 효소를 고려할 때 손실이 큰 합성이다. 따라서, 특정한 아미노산의 존재가 그 자신의 생성을 서서히 또는 완전히 중지시키는 피드백 억제에 의해 아미노산의 생합성이 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다 (아미노산 생합성 경로의 피드백 메카니즘에 대한 전체적인 내용은 문헌 [Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 24 "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" p. 575-600 (1988)] 참조). 따라서, 임의의 특정 아미노산의 생산량은 세포에 존재하는 아미노산의 양에 의해 제한된다.

II. 비타민, 보조인자 및 영양제의 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 영양제는 분자의 다른 군을 구성한다. 이들은 박테리아와 같은 다른 유기체에 의해 쉽게 합성된다 하더라도 고등동물이 합성 능력을 상실했기 때문에 섭취해야 한다. 이들 분자는 그 자체가 생활성 물질이거나, 다양한 대사 경로에서 전자 전달자 또는 중간체로 작용할 수 있는 생물학적 활성 물질의 전구체이다. 이들 화합물은 그 영양적 가치뿐 아니라, 색소, 항산화제 및 촉매로서, 또는 다른 과정의 보조제로서도 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적인 용도에 대한 것은 예를 들어, 문헌 [Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996] 참조). 용어 "비타민"은 당업계에 공지되어 있고, 유기체의 정상적인 기능을 위해서는 필요하지만 유기체가 스스로 합성할 수 없는 영양분을 포함한다. 비타민 군은 보조인자 및 영양제 화합물도 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성이 일어나는 데 필요한 비-단백질생성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기성 또는 무기성일 수 있고, 본 발명의 보조인자 분자는 유기성인 것이 바람직하다. 용어 "영양제(nutraceutical)" 는 식물 및 동물, 특히 인간에게 건강상 유익한 식이성 보충물을 포함한다. 이러한 분자의 예로는 비타민, 항산화제 및 일부 지질 (예를 들어, 다불포화 지방산)이 있다.

이들을 생산할 수 있는 유기체, 예를 들어, 박테리아에서 일어나는 이들 분자의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (문헌 [Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996], 문헌 [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons], 문헌 [Ong, A.S., Niki, E. ＆ Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease "Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S]).

티아민 (비타민 B₁)은 피리미딘과 티아졸 잔기의 화학적 커플링에 의해 생성된다. 리보플라빈 (비타민 B₂)는 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스-5'-포스페이트로부터 합성된다. 그 다음, 상기 리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)의 합성에 사용된다. 총칭하여 "비타민 B6"로 지칭되는 화합물 족 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독사-5'-포스페이트 및 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)은 모두 통상적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, (R)-(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적인 합성 또는 발효에 의해 생성될 수 있다. 판토테네이트의 생합성의 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합으로 구성된다. 판토산으로 전환하는 생합성 단계, β-알라닌으로 전환하는 생합성 단계 및 판토텐산으로의 축합에 관여하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사 활성 형태는 보조효소 A인데, 이 보조 효소 A를 위한 생합성은 5 단계 효소 반응으로 진행된다. 판토테네이트, 피리독살-5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 보조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할 뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B₅), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 보조효소 A의 생성도 촉매한다.

미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터의 비오틴 생합성 과정은 자세히 연구되어 있고 이에 관련된 수개의 유전자가 확인되어 있다. 상응하는 다수의 단백질이 Fe-클러스터 합성에도 관여하는 것으로 밝혀져 있고 이들 단백질은 nifS 클래스 단백질의 구성원이다. 리포산은 옥타노산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 보조효소로 작용하는데, 상기 리포산은 에너지 대사에서 피루베이트 데히드로게나제 결합체 및 α-케토글루타레이트 데히드로게나제 결합체의 일부가 된다. 폴레이트는 모두 엽산의 유도체 물질의 군이고, 엽산은 L-글루탐산, p-아미노벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 대사 중간체인 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산으로부터 출발하는, 엽산 및 그의 유도체의 생합성은 일부 미생물에서 상세히 연구되어 있다.

코리노이드 (예를 들어, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포피린은 테트라피롤 고리계에 의해 특징지워지는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 그 특징이 완전히 규명되어 있지는 않지만 다수의 효소 및 기질이 현재 공지되어 있다는 점에서 충분히 복잡하다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신"으로도 지칭되는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 보조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드), NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 그들의 환원된 형태의 전구체이다.

이들 화합물의 대량 생산은 비록 이들 화학물질 중 일부, 예를 들어, 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 비오틴이 미생물의 대량 배양에 의해서도 생산된다 하더라도 세포-유리 화학 합성에 주로 의존한다. 비타민 B₁₂만이 발효에 의해 전적으로 생성되는데, 이는 비타민 B₁₂의 합성의 복잡성 때문이다. 시험관내 방법론은 재료 및 시간, 종종 많은 비용의 상당한 투입을 요구한다.

III. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 이들의 상응하는 단백질은 종양 질환 및 바이러스 감염의 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 보조효소 및 뉴클레오티드의 구성 성분인 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 오탄당 (RNA의 경우, 상기 당은 리보스이고, DNA의 경우, 상기 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산으로 구성된, 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로 작용하지만 뉴클레오티드가 갖는 인산 잔기가 없는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성을 억제하거나 핵산 분자를 형성하기 위한 이들 분자의 동원을 억제함으로써, RNA 및 DNA 합성 억제가 가능하고, 암세포에 표적화시키는 방식으로 상기 활성을 억제하여 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제할 수 있다.

또한, 핵산 분자를 형성하기 보다는 에너지 저장물 (즉, AMP) 또는 보조효소 (즉, FAD 및 NAD)로 작용하는 뉴클레오티드도 있다.

이들 화학물질이 퓨린 및(또는) 피리미딘 대사에 영향을 줌으로써 상기 의학적 증상에 사용될 수 있다는 것은 여러 가지 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents." Med. Res. Reviews 10: 505-548]). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소의 연구는 예를 들어, 면역억제제 또는 항증식제로 사용할 수 있는 신약의 개발에 초점을 두고 있다 (문헌 [Smith, J.L., "Enzymes in nucleotide synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem Soc. Transact. 23: 877-902]). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 여러 가지 정밀 화학물질 (예를 들어, 티아민, S-아데노실-메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에 있어서 중간체로서의 용도, 세포를 위한 에너지 전달자 (예를 들어, ATP 또는 GTP)로서의 용도, 및 통상적으로 향 상승제 (예를 들어, IMP 또는 GMP)로 사용되는 화학물질 자체를 위한 용도 또는 여러 가지 의학 용도를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology" Vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, p.561-612] 참조). 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소를 표적으로 사용하여 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯한, 농작물 보호용 화학물질을 개발하는 연구가 증가하고 있다.

박테리아에서 이들 화합물 대사의 특징은 규명되어 있다 (자세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) "De novo purine nucleotide biosynthesis", in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press:, p.259-287], 및 문헌 [Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides"; Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York] 참조). 퓨린의 대사는 집중적인 연구의 대상이고, 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등 동물의 손상된 퓨린 대사는 통풍과 같은 심각한 질환을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP)를 생성시키는 중간체 화합물인 이노신-5'-포스페이트 (IMP)를 통해 일련의 단계에서 리보스-5-포스페이트로부터 합성되고, 이들 GMP 또는 AMP로부터 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트가 용이하게 형성된다. 이들 화합물은 에너지 저장물로도 사용되므로, 이들의 분해는 세포에서 다수의 다양한 생합성 과정을 위한 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스-5-포스페이트로부터의 유리딘-5'-모노포스페이트 (UMP)의 형성에 의해 진행된다. 그 다음, UMP가 시티딘-5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 이들 모든 뉴클레오티드의 디옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 전환되는 1 단계 환원 반응에서 생성된다. 인산화 후에 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.

IV. 트레할로스의 대사 및 용도

트레할로스는 α,α-1,1 결합에 의해 결합된 두 가지 당 분자로 구성된다. 트레할로스는 감미료, 건조 또는 동결 식품용 첨가제로서 식품 산업, 및 음료 산업에 통상적으로 사용된다. 그러나, 제약, 화장품 및 생물공학 산업에도 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제5,759,610호], 문헌 [Singer, M.A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467], 문헌 [Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech. Ann. Rev. 2 (1996) 293-314], 문헌 [Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102] 참조). 트레할로스는 다수의 미생물로부터 효소에 의해 생성되고 주변 배지내로 자연적으로 방출되는데, 트레할로스는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상기 배지로부터 수득할 수 있다.

특히 바람직하게, 정밀 화학물질은 아미노산, 특히, L-리신, L-트레오닌 및 L-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 또다른 측면은 비-인간 유기체로부터 정밀 화학물질이 생산되는 것을 조정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 MP 단백질 활성 또는 MP 핵산 발현을 조정하는 물질과 세포를 접촉시켰을 때의 세포 관련 활성이 상기 물질의 부재 하에서의 동일한 활성에 비해 변형되도록 하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 유기체, 특히, 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종 박테리아, 특히 바람직하게, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 대사 경로에 대한 하나 이상의 조절 시스템에 대해 세포를 조정하여, 이 미생물에 의한 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생산 속도 또는 수율을 개선시킨다. MP 단백질 활성을 조절하는 물질은, 예를 들어, MP 단백질 활성 또는 MP 핵산 발현을 자극한다. MP 단백질 활성 또는 MP 핵산 발현을 자극하는 물질의 예로는 소분자, 활성 MP 단백질, 및 세포로 도입되어 MP 단백질을 코딩하는 핵산이 있다. MP 활성 또는 발현을 억제하는 물질의 예로는 소분자 및 안티센스 MP 핵산 분자 등이 있다.

본 발명의 또다른 측면은 MP 유전자가 별개의 플라스미드 상에 유지되거나 숙주 세포의 게놈 내로 통합되도록 이 유전자를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 세포로부터의 관심의 대상이 되는 화합물의 수율을 조정하는 방법에 관한 것이다. 게놈 내로의 통합은 무작위적일 수도 있고 통합된 카피가 천연 유전자를 대체하도록 하는 상동성 재조합에 의해 일어날 수도 있는데, 이러한 통합에 의해 세포로부터의 관심의 대상이 되는 화합물의 생산이 조정된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 수율은 증가한다.

또다른 바람직한 실시양태에서, 정밀 화학물질은 아미노산이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 아미노산은 L-리신, L-트레오닌 및 L-메티오닌이다.

하기 단락에서는 본 발명의 다양한 측면 및 바람직한 실시양태를 더욱 상세하게 기재한다:

A. 단리된 핵산 분자

본 원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예컨대, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예컨대, mRNA)를 포함하며, 또한 뉴클레오티드 유사체에 의해 생성된 DNA 또는 RNA 유사체를 포함한다. 추가로, 상기 용어는 코딩 유전자 영역의 3' 및 5' 말단에 위치한 비해독 서열 (코딩 영역의 5' 말단 상류 서열의 뉴클레오티드 약 100개 이상 및 코딩 유전자 영역의 3' 말단 하류 서열의 뉴클레오티드 약 20개 이상)을 포함한다.

핵산 분자는 단일 가닥일 수도 있고 이중 가닥일 수도 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 해당 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자가 제거된 것이다. "단리된" 핵산은 해당 핵산이 기원된 유기체의 게놈 DNA에서 천연적으로 핵산 측면에 위치하는(flanking)하는 임의의 서열 (예를 들어, 해당 핵산의 5' 또는 3' 말단에 위치한 서열)을 보유하지 않는 것이 바람직하다.

다양한 실시양태에서, 단리된 MP 핵산 분자는 해당 핵산이 기원된 세포 (예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포)의 게놈 DNA에서 천연적으로 핵산 분자 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 예를 들어, 약 5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2 kb 미만, 약 1 kb 미만, 약 0.5 kb 미만 또는 약 0.1 kb 미만으로 보유할 수 있다. 게다가, cDNA 분자 등과 같은 "단리된" 핵산 분자에는, 재조합 기술로 제조된 경우에는 다른 세포내 물질 또는 배양 배지가 본질적으로 존재하지 않으며 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 본질적으로 존재하지 않을 수 있다.

추가로, 핵산 분자는 상기 서열을 기초로 생성한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응으로 단리할 수 있다 (예를 들어, 첨부문서 A로부터의 완전 서열 또는 그의 절편을 포함하는 핵산 분자는 첨부문서 A로부터의 동일 서열을 기초로 생성한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응으로 단리할 수 있음). 예를 들면, mRNA는 정상적인 내피 세포에서 단리할 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299]의 구아니디늄-티오시아네이트 추출 방법에 의한 단리), cDNA는 역전사효소 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 베테스다에 소재하는 Gibco/BRL이 시판하는 몰로니 (Moloney)-MLV 역전사효소 또는 미국 플로리다주 세인트 페터스부르크에 소재하는 세이카가꾸 아메리카, 인크. (Seikagaku America, Inc.)에서 구입한 AMV 역전사효소)로 제조할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응을 통한 증폭에 사용하기 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 첨부문서 A에 나타낸 임의의 뉴클레오티드 서열을 기초로 생성할 수 있다. 본 발명의 핵산은 cDNA로 증폭시킬 수도 있고, 다르게는 주형으로서의 게놈 DNA 및 PCR 표준 증폭 기술에 따른 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수도 있다. 이러한 방법으로 증폭된 핵산을 적절한 벡터에 클로닝하고 DNA 서열 분석함으로써 특성화할 수 있다. 또한, MP 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 자동 DNA 합성기 등과 같은 표준 합성법을 통해 제조할 수도 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 표 1의 컬럼 4에 따른 아미노산 위치에 상응하는, 역-해독된 돌연변이를 포함하는, 표 1의 컬럼 1에 기재된 임의의 뉴클레오티드를 포함한다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 상기 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 절편과 상보적인 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 상기 기술된 서열과 혼성화하여 안정한 이중나선을 형성할 정도로 상기 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열과 충분히 상보적이다.

본 발명의 MP 핵산 분자가 코딩하는 단백질의 절편은 임의의 MP 단백질의 생물학적 활성 절편인 것이 바람직하다. 본 원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MP 단백질의 생물학적 활성 절편"은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독적으로 조절할 수 있는 MP 단백질의 절편, 예를 들어, 도메인 또는 모티프를 포함하는 것으로 의도되며, 표 1에 나타낸 활성을 갖는다. MP 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편이 코리네박테리움 글루타미쿰에서 대사 경로를 전사, 해독 또는 후해독적으로 조절할 수 있는 지의 여부는 효소 활성 분석을 수행하여 결정할 수 있다. 이러한 분석 방법은 실시예 단락의 실시예 8에 상세하게 기재한 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 당업자는 집단 내에 존재할 수 있는 천연 MP 서열 변이체 뿐 아니라 표 1의 뉴클레오티드 서열에 돌연변이에 의한 변화를 도입시켜, 야생형과 비교하여 코딩된 MP 단백질의 아미노산 서열을 변화시키면서도 MP 단백질의 기능을 손상시키지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 표 1의 서열에서 "비필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환을 생성할 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 임의의 MP 단백질의 야생형 서열 (표 1)을 변경시키면서도 상기 MP 단백질의 활성을 변화시키지 않을 수 있는 잔기이며, "필수" 아미노산 잔기는 MP 단백질 활성에 필요한 잔기이다. 그러나, 다른 아미노산 잔기 (예컨대, MP 활성을 갖는 도메인에서 비-보존 또는 단지 반-보존된 아미노산 잔기)가 활성에 비필수일 수도 있기 때문에 이를 변형시키면서 MP 활성은 변형시키지 않을 수도 있을 것이다.

B. 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명의 또다른 측면은 MP 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그와 결합된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자와 관련된 것이다.

벡터의 유형 중 하나는 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 용어인 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서는 추가의 DNA 세그먼트를 바이러스 게놈에 결찰시킬 수 있다. 몇몇 벡터들은 그들이 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터).

다른 벡터들 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)은 숙주 세포에 도입될 때 상기 숙주 세포의 게놈에 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.

추가로, 특정 벡터들은 기능적으로 연결된 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 본 원에서는 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 지칭한다. 통상, DNA 재조합 기술에 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 유형의 벡터이므로, 본 명세서에서는 "플라스미드" 및 "벡터"를 혼용하여 사용한다. 본 발명은 유사한 기능을 발휘하는 상기 다른 유형의 발현 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터 (예컨대 복제-결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노바이러스-관련 바이러스)를 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산을 숙주 세포에서의 발현에 적절한 형태로 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용될 숙주 세포를 기초로 하여 선택되고 발현될 핵산 서열에 기능적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, 용어 "기능적으로 연결된"은 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열이 그의 발현 (예를 들어, 시험관내 전사/해독 시스템에서 발현되거나 또는 상기 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우에는 그 숙주 세포에서 발현됨)이 가능하도록 조절 서열(들)에 결합된 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)] 등에 기재되어 있다. 조절 서열은 여러 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적(constitutive) 발현을 제어하는 서열 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 서열을 포함한다. 당업자라면, 발현 벡터의 고안이 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 관심의 대상이 되는 단백질 발현 정도 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써, 본 원에 기재한 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 융합 펩티드 (예컨대, MP 단백질, MP 단백질의 돌연변이된 형태, 융합 단백질 등)를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 제조할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 MP 단백질을 발현하도록 고안될 수 있다. 예를 들면, MP 유전자는 박테리아 세포, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰, 곤충 세포 (이 경우에는 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 세포 및 다른 진균 세포 (문헌 [Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" Yeast 8: 423-488], [van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet ＆ L.L. Lasure, Editors, pp. 396-428: Academic Press: San Diego] 및 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 및 다세포 식물 세포 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants", Plant Cell Rep.: 583-586] 참조) 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 추가로 논의되어 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사 및 해독시킬 수 있다.

단백질은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 제어하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터를 함유하는 벡터를 주로 사용하여 원핵생물에서 발현시킨다. 융합 벡터는 그에 의해 코딩되는 단백질에, 통상적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단에 수많은 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 통상적으로 다음의 3가지 기능을 수행한다: 1) 재조합 단백질의 발현을 증진시킴; 2) 재조합 단백질의 가용성을 증가시킴; 3) 친화성 정제시에 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제를 보조함. 종종, 융합 발현 벡터에서 융합 단위와 재조합 단백질의 접합부에 단백질분해성 절단 부위를 도입함으로써, 재조합 단백질이 융합 단백질의 정제 후에 상기 융합 단위로부터 분리될 수 있도록 한다. 이러한 효소 및 이들의 상응하는 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.

통상의 융합 발현 벡터는 재조합 표적 단백질에 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)가 융합된 pGEX (파마시아 바이오테크 인크. (Pharmacia Biotech Inc.), [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40]), 재조합 표적 단백질에 말토스 E-결합 단백질이 융합된 pMAL (미국 매사추세츠주 배벌리에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)) 및 재조합 표적 단백질에 단백질 A가 융합된 pRIT 5 (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아)를 포함한다. 한 실시양태에서, MP 단백질-코딩 서열을 pGEX 발현 벡터에 클로닝하여, 상기 벡터가 N-말단에서 C-말단 방향으로 GST-트롬빈 절단 부위-단백질 X를 포함하는 융합 단백질을 코딩하도록 한다. 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다. GST에 융합되지 않은 재조합 MP 단백질은 융합 단백질을 트롬빈으로 절단하여 수득할 수 있다.

적절한 유도가능한 비-융합 대장균 발현 벡터의 예로는 pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] 및 pET 11d [Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89] 등이 있다. pTrc 벡터로부터의 표적-유전자 발현은 숙주 RNA 폴리머라제에 의한 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 전사를 기초로 한다. pET 11d 벡터로부터의 표적-유전자 발현은 동시발현되는 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7 gn1)에 의해 매개되는 T7-gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사를 기초로 한다. BL21 (DE3) 또는 HMS174 (DE3) 숙주 균주에서, 상기 바이러스 폴리머라제는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어를 받는 T7 gn1 유전자를 보유하는 상재(resident) λ 프로파지에 의해 제공된다.

재조합 단백질의 발현을 최대화하기 위한 전략 중 하나는 상기 재조합 단백질을 그에 대한 단백질분해성 절단력이 파괴된 숙주 박테리아에서 발현시키는 것이다 [Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]. 또다른 전략은 발현 벡터로 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변형시켜 각 아미노산에 대한 개개의 코돈이 발현을 위해 선택한 박테리아, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 바람직하게 이용되는 코돈이 되도록 하는 것이다 [Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]. 본 발명의 핵산 서열에 대한 이러한 변형은 DNA 합성의 표준 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

추가의 실시양태에서, MP 단백질 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현시키기 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 [Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234], pMFa [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943], pJRY88 [Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123] 및 pYES2 (미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corporation)) 등이 있다. 다른 진균, 예를 들어 섬유상 진균에 사용하기에 적절한 벡터 및 그의 제작 방법은 문헌 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene Transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]에 상세하게 기재된 것들을 포함한다.

대체 방법으로, 본 발명의 MP 단백질은 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용한 곤충 세포에서 발현될 수도 있다. 배양된 곤충 세포 (예컨대, Sf9 세포)에서의 단백질 발현에 이용가능한 바큘로바이러스 벡터로는 pAc 계열 [Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 및 pVL 계열 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39] 등이 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 MP 단백질은 단세포 식물 세포 (예컨대, 조류) 또는 고등 식물 (예컨대, 작물 등의 종자식물) 세포에서 발현될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 ([Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197] 및 [Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721])에 상세하게 기재된 것들을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 발현을 포유동물 발현 벡터를 사용한 포유동물 세포에서 수행한다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8 [Seed, B. (1987) Nature 329:840] 및 pMT2PC [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195] 등이 있다. 포유동물 세포에서 사용할 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 통상 사용되는 프로모터는 예를 들어, 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40에서 유래된 것이다. 원핵 세포 및 진핵 세포에 적절한 다른 발현 시스템에 대해서는 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]의 제16장 및 제17장에서 찾을 수 있다.

추가의 실시양태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서 핵산을 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소를 사용하여 핵산을 발현시킴). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 예로는 알부민 프로모터 (간-특이적; [Pinkert et al. (1987) Genes De. 1:268-277]), 림프양-특이적 프로모터 [Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275], 특히 T-세포 수용체의 프로모터 [Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 이뮤노글로불린의 프로모터 ([Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740], [Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748]), 뉴런-특이적 프로모터 (예컨대, 신경필라멘트 프로모터; [Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터 [Edlund et al., (1985) Science 230:912-916] 및 유선-특이적 프로모터 (예컨대, 유청(milk serum) 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 특허 출원 번호 제 264,166호) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 발생-조절되는 프로모터의 예로는 뮤린(murine) hox 프로모터 [Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379] 및 α-태아단백질 프로모터 [Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546] 등이 있다.

추가로, 본 발명은 발현 벡터에 안티센스 방향으로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 이는 DNA 분자가 조절 서열에 기능적으로 연결되어 MP mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자가 발현 (DNA 분자의 전사를 통해 발현됨)될 수 있음을 의미한다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 기능적으로 결합되고 다수의 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자가 지속적으로 발현되도록 제어하는 조절 서열을 선택할 수 있으며, 예를 들어, 안티센스 RNA가 구성적으로 조직-특이적 발현되거나 세포 유형-특이적 발현되도록 제어하는 바이러스 프로모터 및(또는) 인핸서 또는 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화 바이러스의 형태일 수 있으며, 이는 벡터가 도입된 세포 유형에 따라 활성이 결정되는 고도로 효과적인 조절 영역의 제어하에서 안티센스 핵산을 생산한다. 안티센스 유전자를 이용한 유전자 발현의 조절에 관해서는 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]에 논의되어 있다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 원에서는 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"를 혼용하여 사용한다. 사실상, 이러한 용어는 특정 표적 세포와만 관련된 것이 아니라 그 세포의 자손 또는 잠재적인 자손과도 관련된 것이다. 돌연변이 또는 환경적 요인으로 인해서 특정 변형이 세대에 걸쳐 연속적으로 나타날 수 있기 때문에, 이 자손이 모(母) 세포와 반드시 동일한 것은 아니지만, 본 원에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범위에 포함되는 것은 마찬가지이다.

숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, MP 단백질은 박테리아 세포, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포 (예컨대, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 COS 세포)에서 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰과 관련되어 있고 적절한 방식으로 본 발명의 핵산 분자 및 단백질 분자를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있는 미생물은 표 3에 기재되어 있다.

통상의 형질전환 또는 형질감염 방법을 이용하여 벡터 DNA를 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입할 수 있다. 본 원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산 (예컨대, DNA)을 숙주 세포에 도입하기 위한 인산칼슘 또는 염화 칼슘 동시침전법, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염법, 리포펙션법 (lipofection) 또는 전기천공법 등과 같은 당업계에 공지된 다수의 방법을 포함한다. 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적절한 방법은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 및 다른 실험 안내서에서 찾을 수 있다.

포유동물 세포의 안정한 형질감염의 경우, 사용된 발현 벡터 및 이용된 형질감염 기술에 따라 오직 적은 비율의 세포만이 외래 DNA를 그의 게놈에 통합시킬 수 있음이 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 통합체는 선별가능한 마커 (예컨대, 항생제에 대한 내성)를 코딩하는 유전자를 관심의 대상이 되는 유전자와 함께 숙주 세포에 도입함으로써 확인 및 선별된다. 바람직한 선별가능한 마커로는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 등과 같은 약물에 내성을 부여하는 유전자 등이 있다. 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산을 MP 단백질을 코딩하는 벡터에 함께 함유시켜서 숙주 세포에 도입하거나, 상기 벡터와는 별개인 벡터를 통해 숙주 세포에 도입할 수 있다. 안정하게 형질감염되어 핵산이 도입된 세포는 예를 들어, 약물 선별을 통해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선별가능한 마커가 통합된 세포는 생존하지만 다른 세포는 사멸함).

상동성 재조합된 미생물을 생성하기 위해서는, MP 유전자에 결실, 부가 또는 치환을 도입하여 그를 변형시킨, 예를 들어, 기능적으로 파괴시킨 하나 이상의 MP-유전자 절편을 함유하는 벡터를 제조한다. 상기 MP 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 MP 유전자인 것이 바람직하지만, 그와 관련된 박테리아 또는 심지어는 포유동물, 효모 또는 곤충 공급원으로부터의 상동체를 사용할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 상동성 재조합이 내인성 MP 유전자를 기능적으로 파괴 (즉, 유전자가 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 않게됨; "녹아웃(knockout) 벡터"라고 지칭하기도 함)하도록 고안될 수 있다. 다르게는, 벡터는 상동성 재조합 돌연변이체 등이 내인성 MP 유전자를 변형시키지만 여전히 기능적 단백질을 코딩하도록 고안될 수 있다 (예를 들어, 상류에 위치한 조절 영역을 변형시킴으로써 내인성 MP 단백질의 발현이 변형되도록 할 수 있음). 상동성 재조합 벡터 내에 존재하는 변형된 MP-유전자 절편의 5' 및 3' 말단에는 MP 유전자의 추가 핵산이 측면에 위치하는데, 이는 벡터가 운반하는 외인성 MP 유전자와 미생물의 내인성 MP 유전자 사이의 상동성 재조합을 가능케 한다. 추가의 측면에 위치하는 MP 핵산은 내인성 유전자와의 성공적인 상동성 재조합에 충분한 길이이다. 통상적으로, 벡터는 측면에 위치하는 DNA를 수 kb 미만으로 함유한다 (5' 말단 및 3' 말단 모두에서) (상동성 재조합 벡터에 관해서는 예를 들어, 문헌 [Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503]의 기재 참조). 벡터를 미생물에 도입 (예를 들어, 전기천공법에 의해 도입)하고, 도입된 MP 유전자가 내인성 MP 유전자와 상동성 재조합된 세포를 당업계에 공지된 방법으로 선별한다.

또다른 실시양태에서, 도입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것으로 선택한 시스템을 함유하는 재조합 미생물을 생산할 수 있다. 벡터로의 MP 유전자 삽입은 상기 유전자가 lac 오페론의 제어를 받게 하기 때문에, 예를 들어, MP-유전자 발현이 IPTG의 존재하에서만 가능해 진다. 이러한 조절 시스템은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 숙주 세포, 예를 들어, 배양된 원핵 세포 또는 진핵 숙주 세포를 사용하여 MP 단백질을 생산할 수 있다 (즉, 발현시킬 수 있음). 추가로, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용한 MP 단백질의 생산 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포 (MP 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있거나 그의 게놈에 야생형 또는 변형된 MP 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있음)를 적절한 배지 중에서 MP 단백질이 생산될 때까지 배양하는 단계를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은 상기 배지 또는 숙주 세포로부터 MP 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.

C. 본 발명의 용도 및 방법

본 원에 기재한 핵산 분자, 단백질, 융합 단백질, 프라이머, 벡터 및 숙주 세포는 하기한 방법 중 하나 이상에서 사용할 수 있다: 코리네박테리움 글루타미쿰 및 그와 관련된 유기체의 확인, 코리네박테리움 글루타미쿰과 관련이 있는 유기체의 게놈 지도화, 코리네박테리움 글루타미쿰 관심의 대상이 되는 서열의 확인 및 위치분석, 진화 연구, 기능수행에 필요한 MP 단백질 영역의 결정, MP 단백질의 활성 조정; MP 경로의 활성 조정; 및 관심의 대상이 되는 화합물, 예컨대, 정밀 화학물질의 세포내 생산 조정. 본 발명의 MP 핵산 분자에는 여러가지 용도가 있다. 첫째로, 이들은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그와 밀접한 관련이 있는 유기체의 확인에 이용될 수 있다. 또한, 이들은 미생물들이 혼합된 집단 내에서 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그와 관련된 유기체를 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 매우 다양한 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 핵산 서열을 제공한다. 하나 미생물의 집단 또는 미생물들이 혼합된 집단의 배양물에서 추출한 게놈 DNA를 엄격 조건하에서 코리네박테리움 글루타미쿰에 고유한 유전자 영역을 포함하는 프로브로 프로빙(probing)함으로써 상기 유기체의 존재 여부를 결정할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 자체는 병원성이 아니지만, 코리네박테리움 디프테리애 등과 같은 병원성 종과 관련이 있다. 이러한 유기체의 검출은 실질적인 임상적 중요성을 갖는다.

본 발명의 핵산 및 단백질 분자는 게놈의 특정 영역에 대한 마커로 작용할 수 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질 분자는 게놈 지도화 뿐 아니라 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질의 기능 연구에도 유용하다. 특정 코리네박테리움 글루타미쿰 DNA-결합 단백질이 결합하는 게놈 영역은 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈을 절단하고 그 단편들을 DNA-결합 단백질과 함께 인큐베이션 시켜서 확인할 수 있다. 상기 단백질과 결합하는 단편은 본 발명의 핵산 분자로 바람직하게는 쉽게 검출가능한 표지를 이용하여 추가로 프로빙될 수 있다; 이러한 핵산 분자와 게놈 단편의 결합을 통해, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 지도에서 상기 단편의 위치를 결정할 수 있으며 여러가지 효소를 사용하여 이 방법을 여러 회 수행함으로써, 단백질이 결합하는 핵산 서열의 신속한 결정을 용이하게 할 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산 분자는 관련 종의 서열에 충분한 상동성이 있을 수 있으며, 이 경우에도 이러한 핵산 분자를 마커로서 사용하여 해당 박테리아 (예컨대, 브레비박테리움 락토페르멘툼)의 게놈 지도를 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 MP 핵산 분자는 진화 연구 및 단백질 구조 연구에도 적합하다. 여러 원핵 세포 및 진핵 세포는 본 발명의 분자가 관여하는 대사 과정을 이용한다. 본 발명의 핵산 분자 서열을 다른 유기체에서의 유사 효소를 코딩하는 핵산 분자 서열과 비교함으로써 상기 유기체의 진화 관계 정도를 조사할 수 있다. 따라서, 이러한 비교를 통해 서열 영역이 보존되었는지의 여부를 결정할 수 있고, 이는 효소 기능에 필수적인 단백질의 보존 영역을 조사하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 방식의 조사는 단백질 조작 연구에 중요하며, 단백질에서 그의 기능 손실 없이 돌연변이유발을 허용할 수 있는 수준에 관한 지침을 제공할 수 있다.

본 발명의 MP 핵산 분자의 유전자 조작을 통해, 야생형 MP 단백질과는 기능적으로 상이한 MP 단백질이 생산되도록 할 수 있다. 이러한 단백질은 효율 또는 활성과 관련하여 개선될 수 있어서, 이들이 세포 내에 통상적인 수보다 더 많은 수로 존재하게 하거나 이들의 효율 또는 활성을 약화시킬 수도 있다.

이러한 활성 변화를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰에서 하나 이상의 정밀 화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 직접 조정할 수 있다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 생합성의 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 또는 해독을 활성화시키는 MP 단백질의 활성을 최적화시키거나, 이러한 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 MP 단백질의 활성에 영향을 주거나 이 활성을 삭제함으로써, 예를 들어, 속도제한 효소가 증가된 양으로 존재하므로 상기 생합성 경로의 활성 또는 활성 속도가 증가될 수 있다. 상응하게, 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 분해 경로에 관여하는 단백질을 구조적으로 후해독적으로 비활성화 시키도록 MP 단백질의 활성을 변형시킴으로써 또는 이러한 유전자의 전사 또는 해독을 구조적으로 억제하도록 MP 단백질의 활성을 변형시킴으로써, 화합물의 분해가 감소하므로 세포로부터 상기 정밀 화학물질의 수율 및(또는) 생산 속도가 증가될 수 있다.

각종 대사 경로가 연결되어 있기 때문에, 하나 이상의 MP 단백질의 활성을 조정함으로써 세포로부터의 하나 이상의 정밀 화학물질 생산을 간접적으로 촉진시키거나 생산 속도를 개선시키는 것이 가능해진다. 예를 들어, 리신 생합성에서의 하나 이상의 효소의 발현을 활성화하여 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 증가시킴으로써, 더 많은 양의 리신이 요구되는 경우 세포가 보통 더 많은 양을 필요로 하는 다른 아미노산과 같은 다른 화합물의 발현을 동시에 증가시키는 것이 가능하다. 발효 배양의 환경 조건 (영양소 및 산소의 공급이 불량할 수 있고, 독성 폐기물이 환경에 다량 존재할 수 있다고 추정됨)하의 세포가 성장 또는 복제를 개선시키도록 전체적인 세포에서의 대사 조절을 변형시키는 것이 또한 가능하다. 따라서, 성장 조건이 최적에 이르지 못할 지라도, 반응 중 세포막 생산에 요구되는 분자의 합성을 억제하는 MP 단백질을 세포외 매질 중의 고수준의 폐기물로 돌연변이시킴으로써 (최적에 이르지 못하는 성장 조건에서 세포 성장 및 세포 분열을 차단하기 위함) 상기 단백질이 더이상 상기 합성을 억제할 수 없게 하도록 배양중 세포의 성장 및 전파를 개선시키는 것 등이 가능하다. 배양물 중에는 상기 화합물을 생산하는 세포가 비교적 다수 존재하기 때문에, 이러한 증가된 성장 또는 증가된 생존력은 또한 발효 배양으로부터의 관심의 대상이 되는 정밀 화학물질의 수율 및(또는) 생산 속도를 증가시켜야 한다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 정밀 화학물질 수율을 증가시키기 위해서 MP 단백질을 돌연변이유발시키는 상기 전략들은 그에 제한되는 것이 아니며, 당업자에게는 이러한 돌연변이유발 전략들에 대한 변형법이 매우 명백하다. 이러한 전략을 사용하고 본 원에 개시한 메카니즘을 포함시킴으로써, 돌연변이된 MP 핵산 및 단백질 분자를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그와 관련된 박테리아 균주를 생성하여 관심의 대상이 되는 화합물의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 개선시키는데 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 이용할 수 있다. 상기 관심의 대상이 되는 화합물은, 생합성 경로의 최종 산물 및 천연 대사 경로의 중간체 뿐 아니라 코리네박테리움 글루타미쿰 대사시에 천연적으로 생성되는 것은 아니지만 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 의해 생산되는 분자 등을 비롯하여 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산된 임의의 산물일 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다. 본 특허 출원 명세서에서 인용한 모든 참고문헌, 특허 출원 명세서, 특허 문헌 및 공개된 특허 출원 명세서의 내용은 본 원에 참고로 도입된다.

<실시예>

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 전체 게놈 DNA의 제조

BHI 배지 (디프코(Difco))중의 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 배양물을 30℃에서 격렬히 진탕시키면서 밤새도록 배양하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 상등액은 버리고, 세포를 5 mL의 완충액 I (배양물 처음 부피의 5％에 해당함-언급한 모든 부피는 배양 부피 100 mL에 대해 계산한 값임)중에 재현탁하였다. 완충액 I의 조성은 다음과 같았다: 140.34 g/L 수크로스, 2.46 g/L MgS0₄ ×7 H₂O, 10 mL/L KH₂PO₄ 용액 (100 g/L, KOH를 사용하여 pH 6.7로 조정함), 50 mL/L M12 농축물 (10 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L NaCl, 2 g/L MgSO₄?7 H₂O, 0.2 g/L CaCl₂, 0.5 g/L 효모 추출물 (디프코), 10 mL/L 미량 원소 혼합물 (200 mg/L FeSO₄ ×H₂O, 10 mg/L ZnSO₄?7 H₂O, 3 mg/L MnCl₂?4 H₂O, 30 mg/L H₃BO₃, 20 mg/L CoCl₂?6 H₂O, 1 mg/L NiCl₂?6 H₂O, 3 mg/L Na₂MoO₄?2 H₂O), 500 mg/L 착화제 (EDTA 또는 시트르산), 100 mL/L 비타민 혼합물 (0.2 mg/L 바이오틴, 0.2 mg/L 엽산, 20 mg/L p-아미노 벤조산, 20 mg/L 리보플라빈, 40 mg/L Ca 판토테네이트, 140 mg/L 니코틴산, 40 mg/L 피리독솔 히드로클로라이드, 200 mg/L 미오이노시톨). 상기 현탁액에 리소짐을 최종 농도 2.5 mg/mL로 첨가하였다. 37℃에서 대략 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포벽을 파괴하고 원심분리하여 원형질체를 수거하였다. 펠릿을 5 mL의 완충액으로 1회 세척하고, 5 mL의 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)으로 1회 세척하였다. 펠릿을 4 mL의 TE 완충액중에 재현탁하고, 0.5 mL의 SDS 용액(10％) 및 0.5 mL의 NaCl 용액 (5 M)을 첨가하였다. 프로테이나제 K를 최종 농도 200 ㎍/mL로 첨가한 후, 상기 현탁액을 37℃에서 대략 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 표준 방법에 따라 DNA를 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜로 추출하여 정제하였다. 이어서, 1/50 부피의 3 M 아세트산나트륨 및 2 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, -20℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, SS34 회전자 (소르발 (Sorvall))를 사용한 고속 원심분리기에서 12,000 rpm로 30분 동안 원심분리하였다. DNA를 20 ㎍/mL RNaseA를 함유하는 1 mL의 TE 완충액중에 용해시키고, 4℃에서 적어도 3시간 동안 1000 mL의 TE 완충액중에 투석하였다. 투석하는 동안, 상기 완충액을 3회 교환하였다. 투석된 DNA 용액을 0.4 mL씩 분취하여, 0.4 mL의 2 M LiCl 및 0.8 mL의 에탄올을 첨가하였다. -20℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 원심분리 (13,000 rpm, 독일 하나우 헤래우스에 소재하는 바이오퓨지 프레스코 (Biofuge Fresco))하여 DNA를 수집하였다. DNA 펠릿을 TE 완충액중에 용해하였다. 이 방법으로 제조된 DNA를 서던 블럿팅 및 게놈 라이브러리 작제 등의 모든 목적에 이용하였다.

실시예 2: 대장균에서 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC13032)의 게놈 뱅크 작제

실시예 1에 기재한 바와 같이 제조된 DNA로부터 출발하여, 공지되고 확립되어 있는 방법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons] 참조)에 따라 코스미드 및 플라스미드 뱅크를 제조하였다.

임의의 플라스미드 또는 코스미드를 사용할 수 있었다. 특히, 플라스미드 pBR322 [Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741]; pACYC177 [Change ＆ Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156], pBS 계열의 플라스미드 (pBSSK+, pBSSK- 등; 미국 라졸라에 소재하는 스트라타진 (Stratagene)) 또는 SuperCos I (미국 라졸라에 소재하는 스트라타진) 또는 Lorist6 [Gibson, T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286] 등의 코스미드를 사용하는 것이 바람직하였다.

실시예 3: DNA 서열분석 및 컴퓨터를 이용한 기능 분석

실시예 2에 기재한 바와 같은 게놈 뱅크를 사용하여, 표준 방법, 특히 ABI377 서열 분석기를 사용한 쇄 종결 방법 (예를 들어, 문헌 [Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.", Science, 269:496-512])에 따른 DNA 서열분석을 수행하였다. 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열분석 프라이머를 사용했다: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' 또는 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.

실시예 4: 생체내 돌연변이유발

코리네박테리움 글루타미쿰의 생체내 돌연변이유발은 유전 정보의 통합성을 유지할 수 없는 대장균 또는 다른 미생물 (예를 들면, 바실러스 종(Bacilus spp .) 또는 사카로마이세스 세레비지애 등의 효모)에 플라스미드 (또는 다른 벡터) DNA를 계대배양하여 수행할 수 있다. 전형적인 돌연변이유발 균주는 DNA 수복 시스템에 관한 유전자 (예를 들면, mutHLS, mutD, mutT 등; 비교하기 위해서는 문헌 [Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in Escherichia coli and Salmonella, p.2277-2294, ASM: Washington] 참조)에 돌연변이가 있다. 이러한 균주들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 균주의 사용법은 예를 들어, 문헌 [Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34]에 예시되어 있다.

실시예 5: 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰 사이의 DNA 전달

여러 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종은 자율적으로 복제되는 내인성 플라스미드 (예를 들면, pHM1519 또는 pBL1 등)를 함유하고 있다 (이에 관해 검토하기 위해서는 예를 들어, 문헌 [Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 참조). 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 셔틀 벡터는 대장균의 경우에 사용하는 표준 벡터 (문헌 [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons])에 코리네박테리움 글루타미쿰의 복제 기점 및 적당한 마커를 부가하여 사용함으로써 쉽게 작제될 수 있다. 이러한 복제 기점은 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종에서 단리한 내인성 플라스미드로부터 얻는 것이 바람직하다. 이들 종에 특히 유용한 형질전환 마커는 카나마이신 내성 유전자 (예를 들면, Tn5 또는 Tn903 트란스포손에서 유래함) 또는 클로람페니콜 내성 유전자 [Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology", VCH, Weinheim]이다. 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되고 유전자 과다발현 등을 비롯한 각종 목적에 사용할 수 있는 매우 다양한 셔틀 벡터의 제조법에 관한 문헌들이 많이 있다 (예를 들어, [Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597], [Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 및 [Eikmanns, B.J. et al. (1991) Gene, 102:93-98] 참조).

표준 방법을 이용하여, 관심의 대상이 되는 유전자를 상기 기재한 셔틀 벡터들중 하나에 클로닝하고 이러한 하이브리드 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 원형질체 형질전환법 [Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159:306-311], 전기천공법 [Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303]을 이용하고 특정 벡터가 사용되는 경우에는 접합법 (예를 들어, 문헌 [Schaefer, A et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666]에 기재된 바와 같음)도 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 플라스미드 DNA를 제조 (당업계에 공지된 표준 방법을 사용함)하고, 이것으로 대장균을 형질전환시켜 코리네박테리움 글루타미쿰의 셔틀 벡터를 대장균에 전달할 수도 있다. 이러한 형질전환 단계는 표준 방법으로 수행할 수 있지만, NM522 [Gough ＆ Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19] 등과 같은 Mcr-결핍 대장균 균주를 사용하는 것이 유리하고 바람직하다.

실시예 6: 돌연변이된 단백질의 발현 평가

형질전환된 숙주 세포에서 돌연변이된 단백질의 활성 관찰은 상기 돌연변이 단백질이 야생형 단백질과 유사한 방식 및 유사한 양으로 발현된다는 사실을 바탕으로 한다. 돌연변이된 유전자의 전사량 (유전자 산물의 해독에 이용가능한 mRNA 양에 관한 지표) 측정에 적절한 방법은 관심의 대상이 되는 유전자에 결합하도록 고안되어 검출가능한 표지 (통상적으로 방사성 표지 또는 화학발광 표지)가 부착된 프라이머를 사용하여 노던 블럿팅 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York] 참조)을 수행하는 것인데, 이는 유기체 배양물의 전체 RNA를 추출하고 겔상에서 분리하여 안정한 매트릭스에 옮긴 후에 상기 프로브와 인큐베이션시켜, 프로브의 결합 및 그 결합 활성이 상기 유전자에 대한 mRNA의 존재 여부 및 또한 그 존재량을 지시하는 방법이다. 이러한 정보는 돌연변이된 유전자의 전사 정도에 관한 지표가 된다. 예를 들어, 문헌 [Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 각종 방법들을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포내 전체 RNA를 단리할 수 있다.

상기 mRNA로부터 해독된 단백질의 존재 여부 또는 그 상대량은 웨스턴 블럿팅과 같은 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York] 참조). 이 방법에서는, 세포내 전체 단백질을 추출하여 겔 전기영동법으로 분리한 후에 이를 니트로셀룰로스 등과 같은 매트릭스에 옮겨서 관심의 대상이 되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 등과 같은 프로브와 함께 인큐베이션시킨다. 통상적으로, 이 프로브에는 쉽게 검출될 수 있는 화학발광 표지 또는 비색 표지가 부착되어 있다. 표지의 존재 여부 및 그의 관찰된 양은 그 세포 내에서 원하는 돌연변이 단백질의 존재 여부 및 그 존재량을 지시한다.

실시예 7: 유전자 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 - 배지 및 배양 조건

유전자 변형된 코리네박테리움을 합성 또는 천연 성장 배지에서 배양한다. 코리네박테리움을 위한 여러 다양한 성장 배지는 당업계에 공지되어 있으며 쉽게 입수가능하다 (문헌 [Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210], [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16], 독일 특허 제4,120,867호, [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag]). 이들 배지는 1종 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 구성된다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등의 당이다. 매우 훌륭한 탄소 공급원의 예로는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 녹말 및 셀룰로스 등이 있다. 또한, 당 정제시 생성되는 당밀 또는 다른 부산물 등과 같은 복합 화합물 등으로서 배지에 당을 공급할 수도 있다. 또한, 각종 탄소 공급원들의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산 등의 알콜 및 유기산이다. 질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물이거나 이러한 화합물을 함유하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 및 NH₄Cl 또는 (NH₄)₂SO₄, NH₄0H 등의 암모늄염, 질산염, 우레아, 아미노산 또는 옥수수 침유(cornsteep liquor), 대두 가루, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등과 같은 복합 질소 공급원 등이 있다.

배지에 함유시킬 수 있는 무기 염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염산염, 인산염 또는 황산염 등이 있다. 킬레이팅제를 배지에 첨가하여 금속 이온을 용액 중에 유지할 수 있다. 특히 적절한 킬레이팅제로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트 등과 같은 디히드록시페놀 또는 시트르산 등의 유기산 등이 있다. 또한, 배지에는 통상적으로 비타민 또는 성장 촉진제 등의 다른 성장 인자가 함유되어 있고, 이들의 예로는 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신 등이 있다. 성장 인자 및 염은 흔히 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침유 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 생성된다. 배지의 정확한 조성은 특정 실험마다 크게 달라지고, 각 경우마다 따로 결정된다. 배지의 최적화에 관한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 찾을 수 있다. 또한, 스탠다드 1(Standard 1) (머크(Merck)) 또는 BHI(Brain Heart Infusion, 디프코) 등과 같이 제조 회사가 시판하는 것을 구입할 수도 있다.

모든 배지 성분들을 열처리 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과로 멸균시킨다. 이 성분들은 한꺼번에 멸균시킬 수도 있고 필요에 따라서는 따로 멸균시킬 수도 있다. 모든 배지 성분들은 배양 초기부터 함유시킬 수도 있고, 원한다면 연속적으로 또는 배치식으로(batchwise) 첨가할 수도 있다.

배양 조건은 각 실험마다 따로 정의된다. 온도는 15℃와 45℃ 사이의 범위이어야 하고, 실험하는 동안 일정하게 유지시키거나 변경시킬 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0 정도이어야 하며, 배지에 완충액을 첨가하여 유지시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용할 수 있는 완충액의 예로는 인산칼륨 완충액 등이 있다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 완충액을 대안적으로 사용하거나 동시에 사용할 수 있다. 또한, 배양하는 동안 NaOH 또는 NH₄OH를 첨가하여 pH를 일정하게 유지시킬 수도 있다. 효모 추출물 등의 복합 배지 성분이 사용되는 경우, 많은 복합 화합물들은 완충 성능이 높기 때문에 추가 완충액에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 미생물 배양에 발효기를 사용하는 경우, pH는 암모니아 기체를 사용하여 조절할 수도 있다.

인큐베이션 기간은 통상적으로 수 시간 내지 수 일이다. 이 시간은 브로쓰(broth)에 축적되는 산물의 양이 최대가 되도록 선택한다. 개시한 성장 실험을 다양한 크기의 미량역가 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 유리 또는 금속 발효기 등의 각종 용기에서 수행할 수 있다. 다수의 클론을 스크리닝하기 위해서는, 미생물을 배플(baffle)이 있거나 없는 미량역가 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양해야 한다. 요구되는 성장 배지를 100 mL 진탕 플라스크에 10％ (부피 기준) 채워 사용하는 것이 바람직하다. 이 플라스크들은 100 내지 300 rpm 속력 범위의 회전 진탕기 상에서 진탕 (진폭 25 mm)되어야 한다. 대기를 습하게 유지함으로써 증발로 인한 손실량을 감소시키거나, 다르게는, 증발로 인한 손실량을 정확하게 보정해야 한다.

유전자 변형된 클론을 연구하는 경우, 변형되지 않은 대조군 클론 또는 인서트가 없는 원래의 플라스미드를 함유하는 대조군 클론도 분석해야 한다. CM 플레이트 (10 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L 육류 추출물, 22 g/L 아가, 2 M NaOH을 사용하여 pH 6.8로 조정) 등과 같은 아가 플레이트 상에서 30℃에서 인큐베이션하여 성장시킨 세포를 OD₆₀₀이 0.5 내지 1.5가 되도록 배지에 접종한다. 배지 접종은 CM 플레이트로부터의 코리네박테리움 글루타미쿰 세포의 염수 용액을 도입하거나, 상기 세균의 예비배양액을 첨가하여 수행한다.

실시예 8: 돌연변이된 단백질의 기능에 관한 시험관내 분석

효소의 활성 및 반응 속도(kinetics) 측정법은 당업계에 공지되어 있다. 특정하게 변형된 효소의 활성 측정 실험은 야생형 효소의 특정 활성에 적합화시켜야 하며, 당업자라면 이를 잘 수행할 수 있다. 효소에 관한 일반적인 개요뿐만 아니라 효소의 구조, 반응 속도, 원리, 방법, 적용에 관한 구체적인 세부사항 및 많은 효소들의 활성 측정 방법의 예는 예를 들어, 하기의 참고문헌에서 찾을 수 있다: ([Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York], [Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: SanFrancisco], [Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford], [Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd edition. Academic Press: New York], [Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd edition. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325)], [Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition, Vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim] 및 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol.A9, "Enzymes". VCH: Weinheim, p.352-363]).

DNA에 결합하는 단백질의 활성은 DNA 밴드시프트(bandshift) 분석법 (겔 지연 분석법 (gel retardation assays)이라고 지칭하기도 함) 등과 같이 잘 확립되어 있는 여러 방법들을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 단백질들이 다른 분자들의 발현에 미치는 영향은 리포터 유전자 분석법 (예를 들어, 문헌 [Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14:3895-3904]과 그의 참고문헌에 기재된 바와 같음)을 사용하여 측정할 수 있다. 베타-갈락토시다제 등의 효소, 녹색 형광 단백질 및 수개의 다른 효소가 사용되는 리포터 유전자 시험 시스템은 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에의 적용에 대해 공지되어 있으며 잘 확립되어 있다.

막 수송 단백질의 활성은 문헌 [Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, p.85-137, 199-234 및 270-322]에 기재된 기술에 따라 측정할 수 있다.

실시예 9: 돌연변이된 단백질이 관심의 대상이 되는 산물의 생산에 미치는 영향 분석

코리네박테리움 글루타미쿰에서의 유전자 변형이 관심의 대상이 되는 화합물 (예컨대, 아미노산)의 생산에 미치는 영향은 변형된 미생물을 적절한 조건 (예를 들어, 상기 기재한 조건)하에서 성장시키고, 관심의 대상이 되는 산물 (즉, 아미노산)의 생산 증가에 관여한 배지 성분 및(또는) 세포내 성분을 시험하여 결정할 수 있다. 이러한 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 분광분석법, 박층 크로마토그래피법, 각종 유형의 착색법, 효소적 및 미생물학적 방법 및 고성능 액체 크로마토그래피법 등과 같은 분석용 크로마토그래피법 등이 있다 (예를 들어, 문헌 ([Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A2, p.89-90 및 p.443-613, VCH: Weinheim (1985)], [Fallon, A. et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17], [Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol.3, Chapter III: "Product recovery and purification", page 469-714, VCH: Weinheim], [Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons], [Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons], [Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim] 및 [Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications]) 참조).

최종 발효 산물의 측정 뿐만 아니라, 중간체 및 부산물 등과 같이 관심의 대상이 되는 화합물의 생산에 이용된 대사 경로 중의 다른 성분들을 분석함으로써 전반적인 유기체의 생산량, 화합물의 수율 및(또는) 생산 효율을 측정할 수도 있다. 분석 방법으로는 배지 내의 영양분 (예컨대, 당, 탄화수소, 질소 공급원, 인산염 및 다른 이온) 함량 측정, 생물집단(biomass)의 조성 및 성장 측정, 생합성 경로의 공통 대사물질의 생산 분석 및 발효 동안에 생성된 기체의 측정 등이 있다. 이러한 측정을 위한 표준 방법은 문헌 [Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M.Rhodes and P.F.Stanbury, eds., IRL Press, p.103-129, 131-163 및 165-192 (ISBN:0199635773)과 그의 참고문헌]에 기재되어 있다.

실시예 10: 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터의 관심의 대상이 되는 산물 정제

당업계에 공지된 여러가지 방법을 사용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 또는 상기 기재한 배양물의 상등액으로부터 관심의 대상이 되는 산물을 수득할 수 있다. 세포가 관심의 대상이 되는 산물을 분비하지 않는 경우에는 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 수거하고 기계적인 힘이나 초음파 등과 같은 표준 기술로 세포를 용균시킬 수 있다. 원심분리로 세포 잔해를 제거하여 가용성 단백질을 함유하는 상등액 분획물을 수득하고, 이를 사용하여 관심의 대상이 되는 화합물을 추가로 정제한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 세포가 산물을 분비하는 경우에는 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 제거하고, 수득한 상등액 분획물을 추가로 정제 한다.

상기 두 가지 정제 방법 모두의 경우에서 수득한 상등액 분획물을 적절한 수지를 사용한 크로마토그래피에 적용하여 관심의 대상이 되는 분자는 크로마토그래피 수지상에 남지만 샘플 중의 많은 오염물질들은 남지 않게 하거나, 오염물질들은 수지에 남지만 원하는 분자는 남지 않게 한다. 필요에 따라서는, 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 이러한 크로마토그래피 단계를 반복할 수 있다. 당업자라면, 적절한 크로마토그래피 수지를 선택하고 정제할 특정 분자에 대해 가장 효과적으로 이를 적용하는 것에 숙달되어 있을 것이다. 정제된 산물을 여과 또는 한외여과사켜 농축시키고, 산물의 안정성이 최대가 되는 온도에 저장할 수 있다.

당업계에는 상기 기재한 정제법 및 예를 들어, 문헌 [Bailey, J.E. ＆ Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)]에 기재된 정제법 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 정제법들이 공지되어 있다.

단리된 화합물의 확인 및 순도는 당업계의 기술로 측정할 수 있다. 이러한 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피법 (HPLC), 분광분석법, 착색법, 박층 크로마토그래피법, NIRS법, 효소 분석법 또는 미생물학적 분석법 등이 있다. 이러한 분석 방법은 하기 문헌에서 고찰된다: ([Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140], [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32], [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70], [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, p.89-90, p.521-540, p.540-547, p.559-566, p.575-581 및 p.581-587], [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons] 및 [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17]).

등가물

당업자라면, 단순한 통상의 방법을 이용하여 본 발명의 특정 실시양태의 수많은 등가물을 알아내거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기의 청구의 범위에 포함된다.

표 1 및 표 2의 정보는 다음과 같이 이해되어야 한다:

컬럼 1에서, "DNA 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "DNA 서열 번호"의 "5"는 서열 5를 지칭한다.

컬럼 2에서, "아미노산 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "아미노산 서열 번호"의 "6"은 서열 6을 지칭한다.

컬럼 3에서, "확인"은 각 서열에 대한 명확한 식별기호를 기재한 것이다.

컬럼 4에서, "아미노산 위치"의 해당 번호는 각 경우에서 동일 열에 있는 "아미노산 서열 번호"에 기재된 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 위치를 지칭한다. 따라서, 컬럼 "아미노산 위치"의 "26"은 해당 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26이다. 위치 번호는 N 말단을 +1로 하여 출발한다.

컬럼 5에서, "아미노산 야생형"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 야생형 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 6에서, "아미노산 돌연변이체"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 돌연변이체 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 7에서, "기능"은 해당 폴리펩티드 서열의 생리적 기능을 기재한 것이다.

컬럼 4, 5 및 6은 특정 기능 (컬럼 7) 및 특정 출발 아미노산 서열 (컬럼 2)을 갖는 MP 단백질에 대한 적어도 하나의 돌연변이, 몇몇 서열의 경우에는 또한, 수개의 돌연변이를 기술한다. 상기 수개의 돌연변이는 항상 상단에 기재된 것인 경우에는 가장 가까운 출발 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 특정 아미노산 서열의 "하나 이상의 아미노산 위치"는 바람직하게 컬럼 4, 5 및 6에서 기술된 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 돌연변이를 의미한다.

단백질성 아미노산의 1문자 코드는 다음과 같다:

A 알라닌

C 시스테인

D 아스파르트산

E 글루탐산

F 페닐알라닌

G 글리신

H 히스티딘

I 이소루이신

*K 리신

L 루이신

M 메티오닌

N 아스파라긴

P 프롤린

Q 글루타민

R 아르기닌

S 세린

T 트레오닌

V 발린

W 트립토판

Y 티로신

서열목록 전자파일 첨부

Claims (23)

1. 5-메틸테트라히드로폴레이트 호모시스테인 메틸트랜스퍼라제의 생리적 기능을 보유하고, 서열번호 90의 아미노산 서열을 가지며,
   상기 아미노산 서열의 348번째 아미노산 위치에서 글루탐산, 474번째 아미노산 위치에서 아스파르트산, 731번째 아미노산 위치에서 리신 및 747번째 아미노산 위치에서 리신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 갖는 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
3. 제2항의 핵산 하나 이상을 포함하는 단리된 핵산 작제물.
4. 제3항에 있어서, 프로모터 및 종결자를 기능적으로 연결된 형태로 포함하는 핵산 작제물.
5. (a) 제2항의 핵산 하나 이상, 또는
   (b) 제3항의 핵산 작제물 하나 이상, 또는
   (c) 제2항의 핵산에 대하여 이종이고, 코리네박테리움 속의 박테리아에서 제2항의 핵산이 발현되도록 할 수 있는 프로모터
   를 코리네박테리움 속의 박테리아에 도입시켜서 상기 코리네박테리움 속의 박테리아를 형질전환시킴으로써 유전적으로 변형된 코리네박테리움 속의 박테리아를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 제5항의 실시양태 (a)의 핵산 또는 제5항의 실시양태 (b)의 핵산 작제물을 복제 플라스미드로서 도입하거나 염색체에 통합시키는 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 제5항의 실시양태 (c)의 프로모터가, 코리네박테리움 속의 박테리아에서, 5-메틸테트라히드로폴레이트 호모시스테인 메틸트랜스퍼라제의 생리적 기능을 보유하고, 서열번호 90의 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열의 348번째 아미노산 위치에서 글루탐산, 474번째 아미노산 위치에서 아스파르트산, 731번째 아미노산 위치에서 리신 및 747번째 아미노산 위치에서 리신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산에 기능적으로 연결된 것인 방법.
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9. (a) 제2항의 핵산 하나 이상, 또는
   (b) 제3항의 핵산 작제물 하나 이상, 또는
   (c) 제2항의 핵산에 대하여 이종이고, 코리네박테리움 속의 박테리아에서 제2항의 핵산이 발현되도록 할 수 있는 프로모터
   로 형질전환된, 유전적으로 변형된 코리네박테리움 속의 박테리아.
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