KR101174702B1

KR101174702B1 - 허수테논을 포함하는 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학조성물 및 비만 치료용 동물 의약품

Info

Publication number: KR101174702B1
Application number: KR1020110146239A
Authority: KR
Inventors: 석수진; 이기원
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-08-17

Abstract

본 발명은 허수테논을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학 조성물 및 비만 치료용 동물 의약품에 관한 것으로, 지방 축적 억제 효과, 지방 세포로의 분화 시 발현되는 중요한 전사인자인 C/EBPα, PPARγ의 발현 저해 효과 및 FAS 발현 저해 효과를 발휘하는 허수테논을 유효성분으로 함유하기 때문에 우수한 비만 예방 또는 치료효과를 발휘한다.

Description

허수테논을 포함하는 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학조성물 및 비만 치료용 동물 의약품{Food composition, pharmaceutical composition and animal medicine against obesity containing hirsutenone}

본 발명은 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학 조성물 및 비만 치료용 동물 의약품에 관한 것이다.

영국, 미국, 오스트리아 국민의 2/3가 과체중이고, 1/4이 비만으로 보고될 정도로 세계의 비만이 위험 수준에 이르고 있다. 우리나라도 2009년 보건복지가족 통계연보에서 분석한 결과를 보면, 1998년에 비해 약 10년 후인 2007년에 성인 비만율이 10% 이상 증가했음을 알 수 있고, 소아 비만율도 빠르게 증가하는 것으로 나타났다.

비만의 원인으로는 필요 이상의 과량의 음식 섭취와 운동량의 부족 그리고 유전적인 민감성 등을 꼽을 수 있다. 그 중에서도 가장 큰 요인은 고열량의 서구식 음식 섭취라 할 수 있다. 비만이 우리의 건강과 삶의 질에 있어서 많은 부정적인 결과를 초래하고 있는데 그 예로, 제2형 당뇨, 고혈압, 고 콜레스테롤 혈증, 심혈관 질환 등이 있다. 비만으로 인한 이러한 대사성 질환들이 점차 증가하고 있고, 그에 따른 사회적 비용이 점차 증가하는 추세이다.

당뇨병은 인슐린 작용의 부족에 의한 만성 고혈당증을 특징으로 하면서 여러 가지 대사 이상을 수반하는 질환군이다. 이는 인슐린 의존형인 제1형 당뇨병과 인슐린 비의존형인 제2형 당뇨병으로 나뉠 수 있으며, 비만으로 인한 당뇨병은 제2형 당뇨병을 의미한다.

고혈압이란 성인에서 수축기 혈압이 140 mmHg 이상이거나 이완기 혈압이 90 mmHg 이상일 때를 말한다. 고혈압은 우리나라 성인의 약 30% 이상에서 발견되는 아주 흔한 질환이며, 외국의 27% 정도보다 오히려 높은 유병률을 보이고 있다. 고혈압은 관상동맥질환과 뇌졸중, 신부전 등 전신에 걸쳐 다양한 합병증을 일으키며, 이 중 상당수는 환자의 생명과 건강을 직접적으로 위협할 정도로 심각한 문제를 발생시킨다.

고 콜레스테롤 혈증은 콜레스테롤의 과잉섭취나 콜레스테롤 대사장애로 인해 혈액 속의 콜레스테롤이 정상치를 넘은 상태를 말하며, 합병증으로는 협심증, 심장마비, 뇌졸중 등이 있다.

이와 같이 비만으로 인한 대사성 질환이 다양하고, 그 심각성도 심화되면서 이를 막기 위한 예방이나 치료가 절실한 상황이다.

현재까지 사용된 비만 치료제는 작용 기작에 따라 크게 포만감 항진제, 지방 흡수 억제제, 향정신성 식욕 억제제로 나뉜다.

포만감 항진제는 뇌에서 식욕을 조절하는 신경 호르몬 세로토닌(serotonin)과 노르아드레날린(noradrenalin)의 재흡수를 억제해 식욕을 저해하며, 기초대사량을 증가시켜 에너지 소모도 늘린다. 리덕틸(Reductil)이 대표적이며, 이 제품의 성분인 시부트라민(Sibutramine)은 심혈관계 부작용으로 현재 퇴출된 상태이다.

지방 흡수 억제제는 지방을 체내로 흡수하는 소화효소인 리파아제(lipase)의 기능을 억제해 섭취한 지방을 몸 밖으로 배출하는 기능을 한다. 이러한 지방 흡수억제제로는 올리스타트(Orlistat) 성분으로 제니칼(Xenical)이 대표적이다.

향정신성 식욕 억제제는 뇌에서 식욕을 조절하는 신경 호르몬인 노르에피네프린(norepinephrine)과 도파민(dopamine)의 생성을 촉진해 식욕 자체를 감소시킴으로써 비만을 치료하는데, 그 성분으로는 펜디메트라진(phendimetrazine), 펜터민(phentermine)이 있다.

이러한 비만 치료제들은 많은 부작용을 수반하는데 대표적 치료제인 시부트라민(Sibutramin)은 지난해 10월 식약청에서 심근경색과 뇌졸중 등의 이유로 최종 판매 중지 및 자발적 회수 권고 조치를 결정해 시장에서 빠르게 자취를 감췄다.

부작용이 가장 적은 것으로 알려진 제니칼 또한 지방변, 장내가스발생, 복부팽만감 등의 부작용을 나타내고 있고, 최근에는 신장장애를 호소하는 환자들도 생겨나는 추세이다.

위와 같이 합성 항비만 치료제들이 여러 부작용을 나타내며 한계를 보임에 따라 상대적으로 안정성이 확보되는 천연 비만 치료제의 개발이 활기를 띄고 있다. 특허청 조사에 따르면 천연물 비만 치료제의 특허 출원은 2000년 5건에서 2008년 42건으로 큰 폭으로 증가했음을 밝혔다.

지난 10년간(1998～2008년) 천연물 비만 치료제 출원 현황을 보면 전통의학을 바탕으로 한 전통적 복합한방 재료부터 녹차, 인삼, 솔잎, 갈조류 등을 포함한 식물, 광물, 미생물 등으로 매우 다양해지고 있다. 이 중 대표적인 것으로 대두류에 많이 포함된 제니스틴(genistein)을 이용한 비만 치료제가 있다(M. Zhang et al ., Phytother Res . 23(5):713-8, 2009; H. J. Park et al ., J. Nutr . Biochem . 20(2):140-8, 2009).

하지만, 제니스틴보다 효과가 좋은 비만 예방 및 치료용 천연물의 발굴 및 그에 대한 연구가 여전히 필요한 실정이다.

대한민국 등록 특허 제10-0552425호(허수테논을 포함하는 간암 억제용 조성물)에는, 활성성분으로 허수테논을 함유하고, 매트리스 메탈로프로티나아제의 활성을 저해함으로써 간암의 진행 및 전이를 억제하는 약학 조성물에 대해 개시되어 있으나, 여기에에는 허수테논이 비만 예방 및 치료에 효과가 있다는 점에 대해서는 기재된 바 없다. 대한민국 등록 특허 제10-0668172호(물오리나무 추출물 또는 베툴리닉에시드를 포함하는 비만 및 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물)에는, 활성성분으로 물오리나무 추출물 또는 베툴리닉에시드를 함유하고, 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 비만 및 제2형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에 대해 개시되어 있으나, 여기에는 허수테논이 비만 예방 및 치료에 효과가 있다는 점에 대해서는 기재된 바 없다.

이에 본 발명은 항비만 효과가 있는 천연활성물질을 새롭게 발굴하여 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학 조성물 또는 비만 치료용 동물 의약품으로 개발하여 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 다음의 화학식 1으로 표기되는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 다음의 화학식 1로 표기되는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약학 조성물 또는 비만 치료용 동물 의약품을 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 비만을 억제하는 생리활성물질을 탐색하는 과정에서 물오리나무 수피(Bark of Alnus hirsuta)에 함유되어 있는 생리 활성 물질인 허수테논(hirsutenone)에 주목하게 되었다.

학명이 알누스 히르수타(Alnus hirsuta)인 물오리나무는 한국에서 자라는 토착의 알누스(Alnus) 종 중 하나이다. 이러한 종의 수피는 동양의 전통 의약으로 열, 출혈, 설사, 알코올 중독 등을 치료하는데 사용되어 왔다. 물오리나무의 성분은 강력한 인듀서블 니트릭 옥사이드 신타아제(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 억제제로 알려져 있고(Lee et al., Planta Med 66(6):551-3, 2000), 항염증(Hu et al ., J Wood Sci 57(4):323-330, 2011; Kim et al., FEBS Letters 580(2):385-392), 항암(Lee et al., Invest New Drugs Epub. 2010) 효과를 가진다고 보고되었다. 허수테논(hirsutenone)은 물오리나무 수피에서 새롭게 발견된 물질로 현재까지는 이 물질에 대한 생리활성은 보고된 것이 거의 없다. 허수테논(hirsutenone)은 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 구조로 이루어져 있으며, 구조식은 C₁₉H₂₀O₅이다.

본 발명에 사용되는 허수테논(hirsutenone)은 도 1에서 나타낸 바와 같은 공정에 따라 강황 또는 울금이라 불리는 식물의 뿌리에서 나오는 천연 색상의 소재인 커큐민(curcumin)을 수소화(hydrogenation) 처리 및 탈수소화(dehydration) 처리를 수행하여 진저레논 에이(gingerenone A)로 합성한 후, 피리딘(pyridine)과 에틸렌디클로라이드(ethylenedichloride)를 처리하여 합성한 것이다.

한편, 우리 몸의 줄기 세포에서 지방 세포로 분화되는 과정은 크게 코미트먼트(Commitment), 미토틱 클로날 익스팬션(Mitotic Clonal Expansion), 터미널 디퍼런시에이션(Terminal Differentiation)의 세부분으로 나뉜다. 줄기세포에서 코미트먼트(commitment)를 거치면 지방 전구 세포(preadipocyte)가 되고, 이것이 미토틱 클로날 익스팬션(Mitotic Clonal Expansion)을 거쳐 세포 숫자를 늘린 후 터미널 디퍼런시에이션(Terminal Differentiation)을 통해 세포 내 지방의 축적이 증가하게 된다.

미토틱 클로날 익스팬션(Mitotic Clonal Expansion)은 지방 전구 세포가 2～4배로 증식하는 것을 말하며, 지방 분화 시 거쳐야하는 필수적인 과정이다(Q.Q. Tang et al ., Proc Natl Acad Sci U S A, 100(1):44-9, 2003). 그리고 이 과정에서 중요한 전사인자로 작용하는 것이 C/EBPβ(CCAAT/enhancer-binding protein β)이다. 이 전사인자에 결함이 있는 쥐의 경우 지방 분화가 일어나지 않는다고 보고되어 있다(Q. Tang et al . Proc Natl Acad Sci U S A, 100(3):850-5, 2003).

터미널 디퍼런시에이션(Terminal Differentiation)은 분화된 지방세포(adipocyte)가 세포 내에 지방의 양을 늘려나가는 과정이며, 이 과정을 촉진하는 중요한 전사인자로는 C/EBPα(CCAAT/enhancer-binding protein α)와 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)가 있다(E.D. Rosen et al ., Mol Cell , 4(4):611-7, 1999). C/EBPα와 PPARγ는 상호 조절(Cross-regulation)을 통해 지방 전구 세포가 지방 세포로 분화하는 것을 조절한다(Z. Wu et al ., Mol Cell , 3(2):151-8, 1999).

FAS(Fatty acid synthase)는 세포 내 중성 지방을 합성하는 효소로서 PPARγ 전사인자에 의해 발현이 조절되며, 이를 억제하면 식품 섭취를 감소시키고 체중을 감소시킨다(Loftus et al ., Science, 288((5475):2379-2381, 2000).

본 발명에서는 허수테논(hirsutenone)의 지방 축적에 대한 효과, 지방 세포로의 분화 시 발현되는 중요한 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 발현 조절 효과, FAS 단백질 발현 조절 효과를 측정하였다. 그 결과, 허수테논(hirsutenone)은 세포 내 지방 축적량을 감소시키고, C/EBPα와 PPARγ, FAS의 단백질 발현을 모두 저해함을 확인할 수 있었다.

본 발명에 유효성분으로 함유되는 허수테논(hirsutenone)은 합성 화합물 또는 물오리나무 수피 추출물로부터 유래된 것을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물을 제공하는데, 허수테논(hirsutenone)은 바람직하게 비만 예방용 식품 조성물 중 0.000001중량%～50중량% 포함되는 것이 좋다. 0.000001중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.

한편, 본 발명의 비만 예방용 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약학 조성물 및 비만 치료용 동물 의약품을 제공한다.

본 발명의 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품에 포함되는 허수테논(hirsutenone)의 함량은, 예방 및 치료제의 사용방법, 복용자(동물)의 상태, 질환의 종류 및 질환의 중증 정도에 따라 바람직하게 조절하는 것이 좋다. 본 발명의 조성물에서 허수테논(hirsutenone)의 함량은 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품 중 0.000001중량%～50중량% 일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 그 함량이 0.1중량% 미만인 경우 비만 치료 효과가 미비할 수 있으며, 50중량% 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 상승률이 낮아 비경제적일 수 있다.

한편, 본 발명의 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품 조성물에 함유되는 허수테논(hirsutenone)의 농도는 바람직하게 10 μM～1 mM인 것이 좋은데, 반드시 이에 한정되지는 아니한다.

한편, 본 발명의 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 비만 치료용 약학 조성물 또는 동물 의약품의 투여량은 투여방법, 복용자(동물)의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 비만 예방 및 비만 치료제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자(동물)의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비만 예방용 식품 조성물, 비만 치료용 약학 조성물 및 비만 치료용 동물 의약품은 지방 축적 억제 효과, 지방 세포로의 분화 시 발현되는 중요한 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 단백질 발현 저해 효과, 중성지방의 합성을 조절하는 FAS 단백질의 발현 저해 효과를 발휘하는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하기 때문에, 비만 예방 또는 치료 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명에 사용되는 허수테논(hirsutenone)을 합성하는 공정으로 강황 또는 울금이라 불리는 식물의 뿌리에서 나오는 천연 색상의 소재인 커큐민(curcumin)을 수소화(hydrogenation)처리 및 탈수소화(dehydration)처리를 수행하여 진저레논 에이(gingerenone A)로 합성한 후, 피리딘(pyridine)과 에틸렌디클로라이드(ethylenedichloride) 처리하여 합성한 것이다.
도 2는 허수테논 처리에 대한 3T3-L1 세포의 생존도를 나타낸 것으로, 24시간, 48시간 모두에서 허수테논은 40 μM 농도까지 독성 효과를 나타내지 않았다.
도 3은 허수테논의 지방 축적 억제 효과를 나타낸 것으로, 레인 1은 분화시키지 않은 음성 대조군, 레인 2는 MDI 처리로 분화된 대조군, 레인 3은 MDI와 허수테논 10 μM 처리군, 레인 4는 MDI와 허수테논 20 μM 처리군, 레인 5는 MDI와 허수테논 40 μM 처리군이다.
도 4는 허수테논의 C/EBPα와 PPARγ, FAS 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 것으로, 레인 1은 분화시키지 않은 음성 대조군, 레인 2는 MDI 처리로 분화된 대조군, 레인 3은 MDI와 허수테논 10 μM 처리군, 레인 4는 MDI와 허수테논 20 μM 처리군, 레인 5는 MDI와 허수테논 40 μM 처리군이다.

이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실험예 1: 커큐민(curcumin)에서 허수테논(hirsutenone)의 합성

본 발명에 사용되는 허수테논(hirsutenone)은 도 1에서 나타낸 바와 같은 공정에 따라 강황 또는 울금이라 불리는 식물의 뿌리에서 나오는 천연 색상의 소재인 커큐민(curcumin)에 대해 수소화(hydrogenation)처리 및 탈수소화(dehydration)처리를 수행하여 진저레논 에이(gingerenone A)로 합성한 후, 피리딘(pyridine)과 에틸렌디클로라이드(ethylenedichloride) 처리하여 합성한 것이다.

실험예 2: 허수테논이 3T3-L1 세포주의 생존도에 미치는 효과 측정

허수테논 처리 농도의 3T3-L1 세포주에 대한 독성 정도를 측정하기 위하여, MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide) 분석법을 실시하였다. 먼저 3T3-L1 세포를 96 웰 플레이트에 접종한 뒤 웰(well)에 세포가 꽉 차도록 배양하고 허수테논을 10, 20, 40 μM 농도로 처리하였다. 각각 24, 48시간 동안 배양한 뒤에 MTT를 0.5 mg/㎖의 농도가 되도록 처리하고 4시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 안에서 배양하였다. 그 후에, 배양액을 제거하고 DMSO (dimethylsulfoxide)를 200 ㎕ 처리한 뒤 면역 흡광도 분석기(Versa Max, Moleular device, Califonia, USA)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존도는 MDI{0.5 mM 아이소부틸-메틸잔틴(isobutyl-methylxanthine), 1 μM 덱사메타손(dexamethason) 및 10 ㎍/㎖ 인슐린}만을 처리한 대조군에 대해 백분율로 계산하였다.

MTT 분석 결과, 허수테논의 처리 농도(10, 20, 40 μM)가 3T3-L1 지방 전구 세포에 독성이 없음을 확인하였다.

실험예 3: 허수테논의 지방 축적 억제 효과 측정

실험예 3에서는 허수테논의 지방 축적 억제 효과를 분석하기 위하여 지방 전구세포를 분화시킨 후, 오일 레드 오 스테이닝(Oil Red O staining) (K. Tobe et al., FEBS lett, 215(2):345-9, 1987)을 수행하였다.

지방 전구 세포인 3T3-L1 세포주(ATCC, Gaithersburg, MD)를 24-well plate에 접종하고 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic) 10 ㎖/L이 첨가된 DMEM(Dulbecco-modified Eagle medium, 웰진) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(MCO-15AC, SANYO E&E, Europe)에서 100% 컨플루언트(confluent)한 상태로 자랄 때까지 배양시켰다.

100% 컨플루언트한 상태로 자란 3T3-L1 세포를 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic) 10 ㎖/L, 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지에 MDI가 첨가된 배양액에서 이틀간 배양한 후, 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic) 10 ㎖/L, 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지에 10 ㎍/㎖ 인슐린을 포함하는 DMEM 배양액에서 이틀간 더 배양시켰다. 그 후에는 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic) 10 ㎖/L, 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum)만 포함한 DMEM 배양액으로 교체하면서 이틀간 더 배양하여 완전히 분화된 지방세포(mature adipocyte)를 형성시켰다.

3T3-L1 세포를 MDI 첨가로 분화시키는 첫날부터 이틀간격으로 허수테논을 10, 20, 40 μM 농도로 각각의 배양액과 함께 처리하였다. 허수테논은 DMSO에 녹여서 사용하였으며, 총 6일간 배양하여 분화가 완성된 시점에 배양액을 제거하고 분화된 지방세포에 함유된 지방구를 염색하였다. 이를 위해 3～4% 포름알데히드(formaldehyde)를 400 ㎕ 넣고 1시간 동안 고정시킨 다음 용액을 제거하였다. 여기에 60% 이소프로판올(isoporpanol)을 넣어 세척하고 석션(suction)하여 용액을 제거하였다. 그 후에, 오일 레드 오 용액(Oil Red O solution) 400 ㎕를 넣고 호일로 싸서 최소 1시간 동안 상온에서 염색시켰다. 오일 레드 오 용액을 제거하고, PBS로 4번 세척한 후 100% 이소프로판올 500 ㎕로 녹여내었다. 이를 면역 흡광도 분석기를 이용하여 515 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

허수테논을 3T3-L1 세포에 처리한 결과(도 3), 허수테논의 처리로 인해 세포 내 지방 축적량이 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 허수테논의 C/ EBP α, PPAR γ, FAS 발현 저해 효과 측정

본 실험예 4에서는 지방 세포로의 분화 시 발현되는 가장 중요한 전사인자들 중 하나인 C/EBPα, PPARγ 및 이들 전사인자에 의해 조절되는 단백질인 FAS의 발현에 대해 허수테논이 미치는 영향을 살펴보기 위하여 웨스턴 블랏팅(Western Blotting) [B.L. Upham et al ., Carcinogenesis . 18:37-42, 1997]을 수행하였다.

MDI가 포함되고 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)과 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibiotic-antimycotic) 10 ㎖/L를 함유한 DMEM배지에 허수테논이 10, 20, 40 μM가 되도록 넣어 100% 꽉 차게 자란 3T3-L1 세포주에 처리하고 0~2일 동안 배양하였다. 2~4일 동안은 인슐린이 포함되고 10% FBS, 1% 안티바이오틱-안티마이코틱을 함유한 DMEM배지에 허수테논이 10, 20, 40 μM가 되도록 넣어 세포에 처리하였다. 4~6일 동안은 10% FBS, 1% 안티바이오틱-안티마이코틱을 함유한 DMEM 배지에 허수테논을 10, 20, 40 μM 농도별로 처리하였다. 배양된 세포로부터 단백질을 추출하기 위하여 차가운 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 두 번 세척하고 RIPA 완충액(50 mM, Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 5 mM EDTA, 그리고 1 mM PMSF)에 단백질 분해효소 저해제(시그마알드리치) 0.5%와 인산 분해효소 저해제(250 mM Sodium Fluoride, 5 mM Sodium Orthovanadate, 50 mM Sodium Pyrophosphate and 50 mM Glycerophosphate) 0.5%를 함유하는 단백질 추출 용액으로 세포를 용해하였다. 세포 용해물을 4℃에서 12000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 새 1.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮겼다. 단백질 함량은 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 표준용액으로 한 ‘DC assay kit [Bio-Rad Corp., Richmond, CA, USA]'를 이용하여 결정하였다. 20～50 ㎍의 단백질을 브로모페놀 블루를 함유하는 시료 완충액에 섞은 뒤 100℃에서 5분간 반응하여 변성을 가한 뒤 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 분리하였다. 분리된 단백질을 젤에서 폴리비닐리덴 플루로라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 옮긴 뒤 차단 완충액(탈지유 5%, 세척완충액 94.8%, 그리고 sodium azide 0.2%)으로 실온에서 1시간 반응시킨 뒤 세척 완충액으로 10분간 세 차례 세척하였다. Santacruz에서 구입한 PPARγ 항체와 Cell signal에서 구입한 C/EBPα, FAS 그리고 Sigma에서 구입한 β-actin 항체를 상온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새도록 반응시킨 뒤 세척 완충액으로 10분간 세 차례 세척하였다. 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 공유결합한 2차 항체(anti-rabbit IgG-HRP 또는 anti-mouse IgG, Santa cruz)를 1시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤 세척 완충액으로 10분간 세 차례 세척하였다. 화학 발광액 (EZ-Western Detection Kit, Daeillab Service Co, Ltd)으로 5분간 반응시킨 뒤 엑스레이 필름에 노출시킨 뒤에 엑스레이 필름을 인화하였다.

측정결과(도 4), 허수테논에 의해서 C/EBPα, PPARγ, FAS의 밴드가 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.

실시예 1: 비만 치료용 약제 조성물 제조

실시예 1에서는 하기와 같이 비만 치료용 약제 조성물을 제조하였다.

(1) 산제 제조

허수테논 2 g에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

(2) 정제 제조

허수테논 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(3) 캡슐제 제조

허수테논 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

(4) 주사제 제조

허수테논 100 ㎎에 주사용 증류수 적량을 가하여 용해시키고, pH를 약 7.5로 조절한 다음 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진 및 멸균시하여 주사제를 제조하였다.

실시예 2: 비만 예방용 식품 조성물 제조

실시예 2에서는 하기와 같이 비만 예방용 식품 조성물을 제조하였다.

(1) 선식 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%, 찹쌀 9중량%, 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%, 허수테논 3중량%, 영지 0.5중량% 및 지황 0.5중량%을 혼합하여 선식을 제조하였다.

(2) 츄잉껌 제조

껌 베이스 20중량%, 설탕 76.9중량%, 향료 1중량%, 물 2중량% 및 허수테논 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

(3) 캔디 제조

설탕 60중량%, 물엿 39.8중량%, 향료 0.1중량% 및 허수테논 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

(4) 비스킷 제조

박력 1급 25.59중량%, 중력 1급 22.22중량%, 정백당 4.80중량%, 식염 0.73중량%, 포도당 0.78중량%, 팜쇼트닝 11.78중량%, 암모니움 1.54중량%, 중조 0.17중량%, 중아황산나트륨 0.16중량%, 쌀가루 1.45중량%, 비타민 B₁0.0001중량%, 비타민 B₂0.0001중량%, 밀크향 0.04중량%, 물 20.6998중량%, 전지분유 1.16중량%, 대용분유 0.29중량%, 제일인산칼슘 0.03중량%, 살포염 0.29중량% 및 분무유 7.27중량%와 허수테논 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스킷을 제조하였다.

(5) 건강음료 제조

꿀 0.26중량%, 치옥토산아미드 0.0002중량%, 니코틴산아미드 0.0004중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001중량%, 염산피리독신 0.0001중량%, 이노시톨 0.001중량%, 오르트산 0.002중량%, 물 98.7362중량% 및 허수테논 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

(6) 소시지 제조

돈육 65.18중량%, 계육 25중량%, 전분 3.5중량%, 대두단백 1.7중량%, 식염 1.62중량%, 포도당 0.5중량% 및 글리세린 1.5중량%와 허수테논 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소시지를 제조하였다.

(7) 건강보조식품 제조

스피루리나 55중량%, 구아검효소 분해물 10중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01중량%, DL-메티오닌 0.23중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7중량%, 유당 22.2중량% 및 옥수수전분 1.85중량%와 허수테논 10중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

(8) 주류 제조

허수테논 0.5중량%를 소주, 맥주, 양주 또는 과실주와 혼합하여 에멀전 상태로 만든 후, 진공상태에서 7,000 rpm으로 15분간 원심분리하거나 고속믹서기로 9,000 rpm에서 혼합하여 허수테논이 함유된 주류를 제조하였다.

실시예 3: 비만 치료용 동물 의약품 제조

실시예 3에서는 하기와 같이 비만 치료용 동물 의약품을 제조하였다.

(1)정제 제조

허수테논 100 ㎎에 단백질 혼합물 100 ㎎, 말분 100 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(2)주사제 제조

Claims

다음의 화학식 1로 표기되는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물
[화학식 1]
제1항에 있어서,
허수테논은,
조성물 중 0.000001중량%～50중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물
제1항에 있어서,
비만 예방용 식품 조성물은,
육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만 예방용 식품 조성물.
다음의 화학식 1로 표기되는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제4항에 있어서,
허수테논(hirsutenone)은,
조성물 중 0.000001중량% 내지 50중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
비만 치료용 약학 조성물은,
경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만 치료용 약학 조성물.
다음의 화학식 1로 표기되는 허수테논(hirsutenone)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 동물 의약품 조성물
[화학식 1]
제7항에 있어서,
상기 허수테논(hirsutenone)은,
조성물 중 0.000001~50중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 동물 의약품