KR102007465B1 - 퀘르시트린과 스피레오시드 그리고 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 조성물이 제공된다. 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물은 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside)의 단일 물질보다 지방세포분화와 관련된 전사인자의 발현을 조절함으로써 지방 생성 억제, 체중 및 체지방 감소와 지질대사 개선 효과가 우수하여 비만 또는 비만과 관련된 심혈관계 질환, 제2형 당뇨병, 고혈압, 동맥경화 등과 같은 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물 또는 기능성 식품, 약학적 조성물 및 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 그리고 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 인해 체내 지방이 과잉 축적되어 있어 여러 건강상의 문제들을 야기할 수 있는 상태를 말한다. 그 원인으로는 지나친 열량 섭취, 운동 부족, 내분비 장애, 유전적 요인 등이 있다.
최근 현대인들의 생활수준이 향상되면서 전 세계적으로 비만 및 비만 관련 질환 환자가 급격히 증가하여 사회적인 문제가 되고 있다. 2014년 세계보건기구(WHO) 통계에 따르면, 18세 이상의 성인 중 19억이 과체중이며, 그 중 비만인구가 무려 6억에 달하고, 과체중이나 비만으로 인해 매년 280만 명이 사망한다. 비만 자체만으로도 건강에 문제가 되지만, 심혈관계 질환, 제 2형 당뇨병, 고혈압, 동맥경화 등과 같은 대사증후군을 일으키는 요인으로도 문제가 되고 있다.
2015년 국민건강영양조사에 따르면, 지난 10년간 우리나라 사람들의 지방 섭취량은 5.9 g 증가하여 비만 유병률은 2005년 대비 1.9% 증가한 것으로 조사되었다. 특히, 남자 비만 유병률은 39.7%까지 크게 증가하였으며, 고콜레스테롤혈증 유병률이 17.9%로, 9.9%가 증가하였다.
비만을 개선하기 위한 약물로는 작용기전에 따라 식욕억제제와 지방흡수 억제제로 나누어진다. 식욕을 억제하는 펜터민(phentermine)과 디에틸프로피온(diethylpropion)은 혈압 상승, 어지럼증, 두통, 진전, 구갈 등의 부작용을 가지고 있으며 시부트라민(sibutramine)은 심혈관계 부작용이 있다. 지방흡수 억제제인 올리스타트(orlistat)의 경우에는 지방에 용해되는 비타민의 흡수가 억제되고 지방변, 지방배출, 빈번한 배변, 대변 실금의 부작용이 있다.
이에 따라 최근 비만의 예방과 치료를 위해 안전하면서도 항비만 효능이 우수한 약물에 대한 연구의 필요성이 제기되고 있으며, 특히 부작용이 적은 천연 기능성 소재를 이용하여 치료제를 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 따라서 천연 기능성 소재 개발은 항비만 효능과 연계하여 의약품 혹은 다이어트 식품류 등으로 보다 안전하고 우수한 효능의 제품 개발이 가능할 것이다.
본 발명은 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 그리고 이들의 혼합물을 이용하여 비만 또는 비만과 관련된 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 그리고 이들의 혼합물을 이용하여, 지방세포분화와 관련된 전사인자의 발현을 조절함으로써 지방 생성 억제, 체중 및 체지방 감소와 지질대사 개선 효과가 우수한 비만 또는 비만과 관련된 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 자연계에서 넓게 분포하는 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside)의 천연 기능성 소재를 이용하여 인체에 무해하고 부작용이 없는 비만 또는 비만과 관련된 대사증후군의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1에 기재된 구조식을 갖는 퀘르시트린(Quercitrin), 하기 화학식 2에 기재된 구조식을 갖는 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 비만 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 본 발명은 상기 혼합물이 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside)가 1~3 : 1~3 의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 조성물이 페록시솜증식체활성화수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor γ) 또는 지방산결합단백질-4(FABP4. Fatty acid-binding protein-4)의 발현을 억제하는 반면, 아디포넥틴(Adiponectin)의 발현을 증가시켜 지방 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 조성물이 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 0.0001~90중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1에 기재된 구조식을 갖는 퀘르시트린(Quercitrin), 하기 화학식 2에 기재된 구조식을 갖는 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 본 발명은 상기 혼합물이 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside)가 1~3 : 1~3 의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물이 페록시솜증식체활성화수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor γ) 또는 지방산결합단백질-4(FABP4. Fatty acid-binding protein-4)의 발현을 억제하는 반면, 아디포넥틴(Adiponectin)의 발현을 증가시켜 지방 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물이 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 0.0001~90중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 그리고 이들의 혼합물을 포함하는 조성물은 독성과 부작용이 없으면서 지방세포분화와 관련된 전사인자의 발현을 조절함으로써 지방 생성 억제, 체중 및 체지방을 감소하며 우수한 지질대사 개선 효과를 갖는 기능성 식품 및 약학적 조성물로 다양하게 적용될 수 있다.
도 1은 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)의 세포생존능력 시험에 관한 것이다.
도 2는 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)의 TG 축적량을 나타낸 것이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리했을 때 축적된 TG를 Oil red O 염색하여 광학현미경으로 관찰한 것이다.
도 4는 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리했을 때 지방세포분화와 관련된 전사인자의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 C57BL/6J 마우스에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 투여했을 때 8주 동안의 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)의 TG 축적량을 나타낸 것이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리했을 때 축적된 TG를 Oil red O 염색하여 광학현미경으로 관찰한 것이다.
도 4는 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리했을 때 지방세포분화와 관련된 전사인자의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 C57BL/6J 마우스에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 투여했을 때 8주 동안의 체중 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 비만 개선용 식품 조성물과 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 '퀘르시트린(Quercitrin)'은 Quercetin 3-O-a-L-rhamnoside라고도 하며, 분자식은 C21H20O11이며 분자량이 448g/mol인 화합물로, 하기 화학식 1에 기재된 구조식을 갖는다. 여기서, 퀘르시트린(Quercitrin)은 화학적으로 합성된 것을 사용할 수 있으며, 어성초, 약모밀, 삼백초, 오이풀 등의 천연물질에서 유래된 것을 사용할 수도 있다.
[화학식 1]
한편, 스피레오시드(spiraeoside)는 Quercetin 4'-O-glucoside라고도 하며, 분자식은 C21H20O11이며 분자량이 464.38g/mol인 화합물로, 하기 화학식 2에 기재된 구조식을 갖는다. 여기서, 스피레오시드(spiraeoside)는 화학적으로 합성된 것을 사용할 수 있으며, 마가목, 양파, 삼백초, 오이풀 등의 천연물질에서 유래된 것을 사용할 수도 있다.
[화학식 2]
본 발명의 비만 개선, 예방 또는 치료 효과는 in vitro 시험으로 3T3-L1 지방전구세포에서 지방 생성 및 축적 억제를 통해 항비만 효과를 확인한 후, in vivo 시험으로 C57BL/6J 마우스에서 체중 및 체지방 감소를 통해 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물이 항비만 효과가 있으며, 특히 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물이 단일 물질보다 항비만 효과가 훨씬 우수하다는 것을 입증하였다.
아래의 실험예에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)은 3T3-L1 세포에서 우수한 지방 축적 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다. 지방전구세포인 3T3-L1은 다양한 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포 내에 지방을 축적한다. 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)을 3T3-L1세포에 처리하였을 때 단일 물질에 비하여 지방전구세포의 분화가 가장 우수하게 억제되었음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)이 지방세포분화에 관여하는 전사인자들의 발현 조절에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blot 분석을 실시하였는데, 그 결과, 지방세포분화와 관련된 전사인자인 PPARγ의 발현과 FABP4의 발현은 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)을 처리한 군에서 가장 많이 감소되었으며, 지방합성을 억제하고 지방분해를 촉진하는 Adiponectin의 발현 또한 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)을 처리한 군에서 가장 많이 증가되었다. 이를 통해 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)은 단일 물질로 처리했을 때보다 지방세포 분화를 효과적으로 억제하여 우수한 항비만 효능을 발휘함을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)은 C57BL/6J 마우스에서 체중과 체지방의 감소 효과를 갖는 것으로 나타났다. 실험군은 총 칼로리의 10%가 지방인 식이를 공급한 ND(Normal Diet)군, 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 식이를 공급한 HFD(High Fat Diet)군, HFD에 Quercitrin을 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+Q25군, HFD에 Spiraeoside를 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+S25군, HFD에 Quercitrin과 Spiraeoside의 혼합물(중량비=2 : 1)을 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+QS25군으로 나누었다. 체지방 감소에 미치는 영향을 조사하기 위해 2주 동안 비만을 유도하였고, 8주 동안 경구투여한 후 실험동물의 식이섭취량, 체중 변화를 측정하였고 식이효율을 계산하였다. 그 결과, HFD군과 비교하였을 때 HFD+QS25군의 체중이 가장 많이 감소되었고, 다음으로 HFD+S25군, HFD+Q25군의 순서로 감소되었다. 식이효율을 계산한 결과에서도 HFD+QS25군, HFD+S25군, HFD+Q25군의 순서로 감소되어 같은 경향을 보였다. 따라서 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(중량비=2 : 1)은 단일 물질에 비하여 체중과 체지방 감소 효과가 더욱 우수하여 비만 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물에 있어서, 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)로 조성된 혼합물은, 바람직하게 중량비가 퀘르시트린(Quercitrin) : 스피레오시드(Spiraeoside)= 1~3 : 1~3 인 것이 좋고, 더욱 바람직하게 중량비가 퀘르시트린(Quercitrin) : 스피레오시드(Spiraeoside)= 2 : 1 인 것이 좋다. 하기 실험예에서 알 수 있듯이, 퀘르시트린(Quercitrin) : 스피레오시드(Spiraeoside)이 1~3 : 1~3 중량비, 바람직하게는 2 : 1의 중량비로 혼합된 경우, 퀘르시트린(Quercitrin) 또는 스피레오시드(Spiraeoside) 단독에 비하여 지방축적억제효과가 매우 우수함을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물에 있어서, 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물은, 바람직하게 식품 조성물 대비 0.0001~90 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.0001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 90 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물은, 바람직하게 약학 조성물 대비 0.0001~90 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.0001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 90 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside) 또는 이들의 혼합물 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 약학 조성물이 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예, 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 시료의 준비 :
제조예
]
분말 상태의 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 시료를 준비하였다. 혼합물은 퀘르시트린(Quercitrin)과 스피레오시드(Spiraeoside) 시료를 분말 상태에서 혼합하였으며, 아래와 같이 다양한 중량비로 혼합한 퀘르시트린 및 스피레오시드 혼합물을 준비하였다.
| 중량비- 퀘르시트린(Quercitrin) : 스피레오시드(Spiraeoside) | ||
| 제조예 1 | 혼합물 1 | 1 : 1 |
| 제조예 2 | 혼합물 2 | 1 : 2 |
| 제조예 3 | 혼합물 3 | 2 : 1 |
| 제조예 4 | 혼합물 4 | 2 : 3 |
| 제조예 5 | 혼합물 5 | 3 : 2 |
[
지방전구세포의
준비 : 3T3-L1
지방전구세포
배양 및 분화 ]
3T3-L1 지방전구세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Lonza, Walkersville, MD, USA)에 10% bovine serum(BS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin/streptomycin(P/S, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 혼합하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
지방세포 분화는 12-well plate에 2×105 cells/well로 분주한 후 100% 융합(confluent) 상태가 되면 2일간 더 유지하였다. 2일 후 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)(IBMX, Sigma Aldrich, saint Louis, MO, USA), 1 μM 덱타메타손(dexamethasone)(Dexa, Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA), 10 μg/mL 인슐린(insulin)(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) DMEM 배지로 2일 동안 분화를 유도하였다. 2일 후 10 μg/mL 인슐린(insulin)을 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 2일간 더 유지하고, 그 후 4일 동안 2일 마다 10% FBS DMEM 배지로 교환하며 분화하였다. 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)은 분화유도물질을 처리할 때부터 첨가하였다.
[
실험예
1 : MTT
assay를 이용한 세포생존능력 측정]
본 실험예 1에서는 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)의 혼합물(제조예 3)이 지방세포의 생존에 독성을 나타내는지 확인하였다.
탈수소 효소 작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸륨(tetrazolium)을 청자색의 비수용성 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용한 시험법이다. 24-well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 5×104 cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 각각 0, 25, 50 μM/mL로 첨가하고 24시간을 더 배양하였다. 그 후, 2 mg/mL의 MTT 용액을 처리하고 4시간 동안 반응시킨 뒤 배지를 제거하고, DMSO로 용해한 다음 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 3T3-L1 지방전구세포에 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)의 혼합물(제조예 3)을 각각 0, 25, 50 μM/mL 농도로 처리한 후 세포생존능력을 측정한 결과, 대조군과 비교하였을 때 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)의 혼합물(제조예 3) 모두 세포 생존률이 통계학적으로 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
[
실험예
2 : Oil red O 염색을 통한 TG 함량 측정]
본 실험예 2에서는 3T3-L1 지방세포에서 형성되는 중성지방을 특이적으로 염색시키는 Oil red O 용액을 통해 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)의 지방세포 분화 및 지방생성 억제능을 확인하였다.
분화 종료 후 배지를 제거하고 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척한 후, 4% 파라포말디하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 30분 동안 고정시켰다. 고정 후 60% 아이소프로판올(isopropanol)로 세척하고, 0.6% Oil red O(dissolved in 60% isopropanol)으로 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색 후 증류수로 세척한 후 광학현미경으로 관찰한 다음, 아이소프로판올(isopropanol)로 용해하여 'ELISA reader'를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2는 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)의 TG 축적량을 나타낸 것이다. 이에 의하면, 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 1 내지 5)은 25 μM/mL 농도에서 MDI와 비교하였을 때, 축적된 중성 지방이 감소하였으며, 특히 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)에서 가장 우수한 지방 생성 억제능을 보였다.
도 3은 3T3-L1 세포에서 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리했을 때 축적된 TG를 Oil red O 염색하여 광학현미경으로 관찰한 것이다. 이에 의하면, 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)은 퀘르시트린(Quercitrin) 또는 스피레오시드(Spiraeoside) 단독에 비하여 우수한 지방 생성 억제능을 보임을 알 수 있었다.
이에 아래의 실험예에서는 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물로 제조예 3의 혼합물을 사용하였다.
[
실험예
3 : Western blot 분석]
본 실험예 3에서는 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)이 3T3-L1세포에서 지방세포분화에 관여하는 전사인자들의 발현 조절을 확인하기 위해 웨스턴블롯(western blot) 분석을 실시하였다.
3T3-L1 세포에 PRO-PREP protein extraction solution을 첨가하여 -20℃에 30분간 반응 시킨 후 12,000 g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 상등액을 얻어 Lowry 측정법으로 단백질을 정량화하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리하여 지방세포 분화에 관여하는 인자들의 항체와 반응시켜 단백질의 발현을 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 지방세포분화와 관련된 전사인자인 PPARγ의 발현과 FABP4의 발현은 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)로 조성된 혼합물(제조예 3)을 처리한 군에서 가장 많이 감소되었으며, 지방합성을 억제하고 지방분해를 촉진하는 아디포넥틴(Adiponectin)의 발현 또한 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 처리한 군에서 가장 많이 증가되었다. 이를 통해 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside)로 조성된 혼합물(제조예 3)은 퀘르시트린(Quercitrin) 또는 스피레오시드(Spiraeoside) 단독에 비하여 지방세포 분화를 효과적으로 억제하여 항비만 효능이 우수함을 알 수 있었다.
[
실험예
4 :
고지방식이로
유도된 비만 마우스 모델을 통한 체중변화,
식이
섭취량 및
식이효율의
측정]
본 실험예 4는 고지방 식이로 비만 유도된 C57BL/6J 마우스를 이용하여 퀘르시트린(Quercitrin), 스피레오시드(Spiraeoside), 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)이 체중변화, 식이섭취량 및 식이효율에 미치는 영향을 측정하였다.
특정 병원체가 없는(specific pathogen free) 5주령의 C57BL/6J 마우스를 ㈜중앙실험동물(Central Lab-Animal Inc., Seoul, Korea) 에서 구입하여 1주일간 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 온도 및 습도는 24±5℃, 55±5%로 설정하였으며 lighting cycle은 12시간 주기로 하였다. 식이는 일반식이(10% kcal fat; Research Diet, Inc., No. D12450B)와 고지방식이(60% kcal; Research Diet, Inc., No. D12492)를 공급하였으며, 조성은 하기 표 2에 나타내었다.
2주간의 비만 유도 후, 실험동물을 난괴법으로 총 칼로리의 10%가 지방인 식이를 공급한 ND(Normal Diet)군, 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 식이를 공급한 HFD(High Fat Diet)군, HFD에 Quercitrin을 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+Q25군, HFD에 Spiraeoside를 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+S25군, HFD에 Quercitrin 및 Spiraeoside 혼합물(제조예 3)을 25 mg/kg의 농도로 투여한 HFD+QS25군으로 총 5군으로 나누었으며, 하기 표 3에 나타내었다. 체지방 감소에 미치는 영향을 조사하기 위해 각 투여물질을 증류수에 용해하여 8주 동안 경구투여 하였으며 이 기간 동안 실험동물의 식이섭취량, 체중 변화를 측정하였고 식이효율을 계산하였다.
| 성분 | 일반식이(Kcal) | 고지방식이(Kcal) |
| Casein, 80 Mesh | 800 | 800 |
| L-Cystine | 12 | 12 |
| Corn starch | 1260 | 0 |
| Maltodextrin 10 | 140 | 500 |
| Sucrose | 1400 | 275.2 |
| Cellulose, BW200 | 0 | 0 |
| Soybean oil | 225 | 225 |
| Lard | 180 | 2205 |
| Mineral mix S10026 | 0 | 0 |
| Dicalcium phosphate | 0 | 0 |
| Calcium carbonate | 0 | 0 |
| Potassium citrate, 1H2O | 0 | 0 |
| Vitamin mix V10001 | 40 | 40 |
| Choline bitartrate | 0 | 0 |
| Total | 4057 | 4057 |
| Group | Treatment |
| Normal Diet (ND) | Normal diet (10% Kcal fat) |
| High Fat Diet (HFD) | High fat diet (60% Kcal fat) |
| High Fat Diet + Quercitrin 25 mg/kg (HFD+Q25) |
HFD + Quercitrin 25 mg/kg |
| High Fat Diet + Spiraeoside 25 mg/kg (HFD+S25) |
HFD + Spiraeoside 25 mg/kg |
| High Fat Diet + Quercitrin 및 Spiraeoside 혼합물 25 mg/kg (HFD+QS25) | HFD + Quercitrin과 Spiraeoside 혼합물(제조예 3) 25 mg/kg |
실험동물이 자유롭게 물과 식이를 섭취하도록 하였고, 주 1회 체중을 측정하였으며 매주 동일한 시간에 식이를 공급하여 전주에 남은 식이량과 그날 공급한 식이량의 차이로 섭취 식이량을 계산하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
실험동물 각 군의 체중 변화에서 Initial body weight에는 각 군별로 유의한 차이가 없었으나, Final body weight에는 현저한 체중 변화를 나타내었다. 고지방식이군(HFD)은 일반 식이군(ND)에 비해 체중이 1.53배 증가하였으며 이로부터 고지방식이에 의해 비만이 유도되었음을 알 수 있었다. 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)을 투여한 군(HFD+QS25)의 체중이 가장 많이 감소되었고, 다음으로 스피레오시드(Spiraeoside)를 투여한 군(HFD+S25), 퀘르시트린(Quercitrin)을 투여한 군(HFD+Q25)의 순서로 감소하였다. 식이효율을 계산한 결과에서도 HFD+QS25군(제조예 3), HFD+S25군, HFD+Q25군의 순서로 감소되어 같은 경향을 보였다. 이에 따라 퀘르시트린(Quercitrin) 및 스피레오시드(Spiraeoside) 혼합물(제조예 3)은 퀘르시트린(Quercitrin) 또는 스피레오시드(Spiraeoside) 단독에 비하여 체중과 체지방 감소 효과가 더욱 우수한 것을 알 수 있었다.
| ND | HFD | HFD+Q25 | HFD+S25 | HFD+QS25 | |
| Initial body weight (g) | 20.43±0.85a | 20.36±0.76a | 20.37±0.57a | 20.41±0.66a | 20.21±0.70a |
| Final body weight (g) | 29.53±1.42e | 45.12±3.52a | 41.94±3.48b | 38.43±3.70c | 35.13±1.94d |
| Body weight gain (g) | 9.11±1.53e | 24.76±3.64a | 21.58±3.64b | 18.02±3.98c | 14.92±2.24d |
| Food intake (g/day) | 3.50±0.25a | 3.90±0.81a | 3.76±0.21a | 3.75±0.60a | 3.70±0.46a |
| Calorie intake (kcal/day) | 13.45±0.97b | 20.45±4.22a | 19.70±1.12a | 19.65±3.16a | 19.38±2.43a |
| Water intake (g/day) | 3.98±0.48a | 3.51±0.17a | 3.53±0.03a | 3.70±0.46a | 3.67±0.67a |
| Food efficiency (%) | 2.70±0.75e | 8.83±0.95a | 7.94±0.44b | 6.04±0.77c | 4.68±0.79d |
[통계처리]
본 실험에서 얻은 결과는 실험군당 평균 ± 표준편차(Mean ± S.D)로 나타내었으며 처리군 간의 유의성은 SPSS(17.0, Statistical Package for Social Science Inc., USA)를 이용하여 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
[
실시예
1 : 비만 개선용 식품 조성물의 제조]
본 실시예 1에서는 하기와 같이 비만 개선용 식품 조성물을 제조하였다.
(1) 선식 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60메쉬의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%, 찹쌀 9중량%, 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%, 제조예 3의 혼합물 3중량%, 영지 0.5중량% 및 지황 0.5중량%을 혼합하여 선식을 제조하였다.
(2) 츄잉껌 제조
껌 베이스 20중량%, 설탕 76.9중량%, 향료 1중량%, 물 2중량% 및 제조예 3의 혼합물 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.
(3) 캔디 제조
설탕 60중량%, 물엿 39.8중량%, 향료 0.1중량% 및 제조예 3의 혼합물 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.
(4) 비스킷 제조
박력 1급 25.59중량%, 중력 1급 22.22중량%, 정백당 4.80중량%, 식염 0.73중량%, 포도당 0.78중량%, 팜쇼트닝 11.78중량%, 암모니움 1.54중량%, 중조 0.17중량%, 중아황산나트륨 0.16중량%, 쌀가루 1.45중량%, 비타민 B₁0.0001중량%, 비타민 B₂0.0001중량%, 밀크향 0.04중량%, 물 20.6998중량%, 전지분유 1.16중량%, 대용분유 0.29중량%, 제일인산칼슘 0.03중량%, 살포염 0.29중량% 및 분무유 7.27중량%와 제조예 3의 혼합물 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스킷을 제조하였다.
(5) 건강음료 제조
꿀 0.26중량%, 치옥토산아미드 0.0002중량%, 니코틴산아미드 0.0004중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001중량%, 염산피리독신 0.0001중량%, 이노시톨 0.001중량%, 오르트산 0.002중량%, 물 98.7362중량% 및 제조예 3의 혼합물 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.
(6) 소시지 제조
돈육 65.18중량%, 계육 25중량%, 전분 3.5중량%, 대두단백 1.7중량%, 식염 1.62중량%, 포도당 0.5중량% 및 글리세린 1.5중량%와 제조예 3의 혼합물 1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 소시지를 제조하였다.
(7) 건강보조식품 제조
스피루리나 55중량%, 구아검효소 분해물 10중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01중량%, DL-메티오닌 0.23중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7중량%, 유당 22.2중량% 및 옥수수전분 1.85중량%와 제조예 3의 혼합물 10중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.
(8) 주류 제조
제조예 3의 혼합물 0.5중량%를 소주, 맥주, 양주 또는 과실주와 혼합하여 에멀전 상태로 만든 후, 진공상태에서 7,000 rpm으로 15분간 원심분리하거나 고속믹서기로 9,000 rpm에서 혼합하여 제조예 3의 혼합물이 함유된 주류를 제조하였다.
[
실시예
2: 비만 예방 또는 치료용 약제 조성물의 제조]
본 실시예 2에서는 하기와 같이 비만 예방 또는 치료용 약제 조성물을 제조하였다.
(1) 산제 제조
제조예 3의 혼합물 2 g에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
(2) 정제 제조
제조예 3의 혼합물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
(3) 캡슐제 제조
제조예 3의 혼합물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
(4) 주사제 제조
제조예 3의 혼합물 100 ㎎에 주사용 증류수 적량을 가하여 용해시키고, pH를 약 7.5로 조절한 다음 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진 및 멸균시하여 주사제를 제조하였다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1에 기재된 구조식을 갖는 퀘르시트린(Quercitrin)과 하기 화학식 2에 기재된 구조식을 갖는 스피레오시드(Spiraeoside)가 2:1의 중량비로 혼합된 혼합물을 포함하는 비만 개선용 식품 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 식품 조성물은,
페록시솜증식체활성화수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor γ) 또는 지방산결합단백질-4(FABP4. Fatty acid-binding protein-4)의 발현을 억제하는 반면, 아디포넥틴(Adiponectin)의 발현을 증가시켜 지방 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 식품 조성물은 상기 혼합물을 0.0001~90중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물.
- 하기 화학식 1에 기재된 구조식을 갖는 퀘르시트린(Quercitrin)과 하기 화학식 2에 기재된 구조식을 갖는 스피레오시드(Spiraeoside)가 2:1의 중량비로 혼합된 혼합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
페록시솜증식체활성화수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor γ) 또는 지방산결합단백질-4(FABP4. Fatty acid-binding protein-4)의 발현을 억제하는 반면, 아디포넥틴(Adiponectin)의 발현을 증가시켜 지방 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 상기 혼합물을 0.0001~90중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000344673A (ja) * | 1999-05-31 | 2000-12-12 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 脂肪蓄積抑制剤、抗肥満剤、食品添加物、食品及びペットフード |
| KR100466580B1 (ko) | 2004-05-20 | 2005-01-15 | 알앤엘생명과학주식회사 | 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 방지 또는 치료용 조성물 |
| US20060188590A1 (en) * | 2005-01-05 | 2006-08-24 | Mitsunori Ono | Compositions for treating diabetes or obesity |
| KR101490786B1 (ko) | 2011-12-09 | 2015-02-09 | 포항공과대학교 산학협력단 | 아까시재목버섯의 물 추출물을 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물 |
| KR20150066729A (ko) * | 2013-12-09 | 2015-06-17 | 건국대학교 산학협력단 | 어성초 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2018
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