KR20050111657A - 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병치료제제조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당귀추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 5' AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 높이는데 우수한 활성을 나타내는 당귀추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.

Description

당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료제제조성물 {anti-diabets treatment with Angelica species extracts}

본 발명은 당귀추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 5' AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 높이는데 우수한 활성을 나타내는 당귀추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.

최근, 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 운동 부족 현상이 초래되고 또한 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하여 심각한 비만이 발생하며 이에 따라 야기 되는 제 2형 당뇨병이 증가하고 있다. 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 동맥 경화, 관상 심장 질환 등의 심혈관 질환, 당뇨병성 신장 및 망막 질환 등의 합병증을 유발하므로 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

현재, 인슐린 저항성(insulin resistance)이 제 2형 당뇨병의 가장 중요한 병리 기전으로 인식되고 있으며 이는 체내 인슐린이 충분하다 해도 당을 제대로 활용하지 못하는 현상을 의미하고 있으며 이를 치료하기 위해 다양한 혈당 강하제가 사용되고 있다. 혈당 강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 다음의 경우로 분류된다.

1) 설포닐우레아 계통은 주로 췌장의 베타 세포 안에 있는 인슐린을 함유한 과립포의 이동을 촉진하여 간접적으로 인슐린을 분비 시키는 약물이며 저혈당 유발 등의 심각한 부작용이 보고 되고 있으나 최근에는 부작용을 최소화한 약물이 개발되어지고 있다.

2) 비구아나이드 계통 약물은 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당의 합성 (gluco-neogenesis)을 억제하는 약물로 저혈당을 일으키지 않는 장점을 갖고 있으나 고령자와 심 혈관 질환 환자에게는 사용 시는 주의가 요구되고 있다.

3) 알파-글루코시다아제 저해제는 소장에서 포도당을 만드는 효소 활동을 억제 시켜 식후에 일시적으로 혈당이 급상승하는 것을 막아주고, 부작용이 심하지 않은 편이어서 경증 당뇨병 치료에 이용된다.

4) 최근에는 지방세포 분화에 관계되는 피피에이알 감마를 활성화하는 피페리디온계 약물도 개발되고 있다.

이러한 경구용 혈당 강하제 만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로 보다 안전한 당뇨병 치료제 개발이 시급한 실정이다. 또한 제 2형 당뇨병은 인슐린 신호 전달 체계 및 탄수화물과 지질대사 과정에서의 다양한 문제점으로 인해 발생하기 때문에 새로운 치료제 개발을 위해서는 이러한 신호 전달 및 대사 과정을 전반적으로 조절하는 새로운 목표 단백질의 발굴이 절실한 실정이다.

최근 5'AMP 활성화 단백질 인산화 효소 (5' AMP-activated protein kinase ; AMPK)가 탄수화물 및 지질대사 그리고 포도당 흡수를 조절하는 역할이 밝혀지면서 이의 활성물질이 제 2형 당뇨병 치료제로서의 개발 가능성이 제시되고 있으며 이러한 근거는 다음과 같다.

1) 운동을 시킨 쥐의 근육세포에서 ATP 소모의 결과로 AMP의 양이 증가하고 이로 인해 AMPK 의 활성도가 증가하고 그 결과 포도당 흡수가 증가하는 사실이 관찰되었다.

2) AMPK에 의해 포도당 흡수가 증가되는 기전은 인슐린 신호 전달 체계와 독립적이며 이 사실은 인슐린 신호 전달 체계에 이상이 발견되는 대부분의 제 2형 당뇨병 환자에서 새로운 치료 목표 물질이 될 수 있다는 사실을 의미한다.

3) 실제로 제2형 당뇨 환자들의 대부분이 운동을 함으로써 혈당량을 감소할 수 있으며 당뇨 모델 동물에서 운동에 의해 AMPK가 활성화되며 동시에 혈당량이 감소되는 사실도 보고되고 있다.

4) 이 뿐 아니라 AMPK는 생체 내에서 다양할 역할을 수행하는데 췌장세포에서 인슐린의 분비를 조절할 뿐만 아니라 지방세포에서 acetyl-CoA carboxylase (ACC)와 HMG-CoA reductase의 활성을 저해하여 lipogenesis 및 콜레스테롤 합성을 억제하여 비만의 조절에도 중요한 역할을 한다.

5) 최근 제 2형 당뇨병 치료제로 널리 쓰이고 있는 혈당 강하제 메포민 (Metformin)이 AMPK 효소의 활성을 높여 혈당을 강하시킨다는 보고가 있다.

그러나 AMPK의 활성제로서 제 2형 당뇨병과 비만증에 선택적으로 효과가 있으며 또한 당뇨병 실험동물에 대하여 현저히 혈당을 감소시키는 저해물질에 대한 보고는 미비하다.

일반적으로, 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적어지는 장점이 존재한다.

이에, 본 발명에서는 당귀에서 추출한 당귀 추출물이 세포에서 5' AMP-activated protein kinase (AMPK)을 효과적으로 활성화시키는 것으로 확인하였으며 당귀 추출물이 세포에서 인슐린과 상관없이 포도당의 흡수를 촉진시키는 효과를 관찰하였다. 따라서, 당귀추출물이 당뇨 예방 및 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 근육세포인 C2C12 myotube에서 AMPK의 활성화 및 포도당흡수 촉진을 통해 당뇨 예방 및 치료효과가 있는 당귀추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 당귀 추출물과 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 당뇨 예방 및 치료 조성물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

당귀((Angelica gigas Nakai , 連翹)는 미나리과에 속하는 다년생 초본으로 한의학에서는 승검초의 뿌리를 가리키는 말이다. 당귀의 용도를 보면 자궁기능조절작용, 진정작용, 진통작용, 항균작용, 설사작용, 및 비타민E 결핍치료작용을 하므로 빈혈증, 진통, 강장, 통경, 및 부인병약으로 쓰인다. 당귀는 크게 참당귀(angelica gigas Nakai), 당귀(angelica sinensis Diels), 일당귀(angelica acutiloba Kitagawa)로 나뉘는데 참당귀인 angelica gigas Nakai는 바디나물속(angelica linne)에 속하는 것으로 여기에는 개구릿대(angelica anomala), 처녀바디(좀바디나물(angelica cartilaginomarginata Nakai)), 흰바디나물(angelica cartilaginomarginata nakai var. distans Kitagawa), 잔잎바디 (선바디나물) (angelica czernaevia Kitawa), 구릿대(angelica dehurica Bentham et Hooker), 바디나물(사약채, 토당귀 )(angelica decursiva Franch. Et Savat.), 제주사약채(개강활)(angelica fallax Boissieu), 왜천궁(angelica genuflexa Nuttall), 삼수구릿대(angelica jaluana Nakai), 갯강활(angelica japonica A. Gray), 궁궁이(천궁, 백봉천궁, 심산천궁)(angelica polymorpha Maximowicz), 지리강활(angelica purpuraefolia Chung)섬바디 (돼지풀)(angelica takeshimana Nakai) 등이 여기에 속한다. 일당귀, 좀당귀로 불리는 왜당귀(ligusticum acutilobum Sieb. Et. Zucc.)(angelica acutiloba Kitagawa)는 왜당귀속(ligusticum Linne)에 속하는 것으로 여기에는 기름당귀(갯당귀)(ligusticum hultenii Fernald), 고본(ligusticum tenuissima Kitagawa, angelica tenuissima Nakai) 등이 속한다. (한국식물도감, 이영로)

또한, 당귀의 성분으로는 데쿠신(decursin), 데쿠시놀(decursinol), 노다케인(nodakenin) 등의 쿠마린(coumarin) 유도체와 알파-피네네(pinene), 리모네네(limonene),베타-오데스몰(eudesmol), 에레몰(elemol) 등을 주로 한 정유성분을 함유하고 있다.

본 발명은 당뇨 예방 및 치료에 유효한 조성물로 특히 세포 내에서 AMPK 활성 증가 및 포도당 흡수촉진 효과를 나타내는 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명이 유효성분으로 사용하는 당귀 추출물은 생약제인 당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리, 잎, 줄기, 그리고 열매를 단독 혹은 혼합하여 주원료로 추출할 수 있다. 이러한 추출방법은 통상적인 것으로, 먼저 메탄올로 추출하여 분리 여과한 후 감압 농축하여 건조하였다.

당귀 추출물은 세포내에서 AMPK를 활성화시킴과 동시에 포도당의 흡수를 촉진시켜 혈당을 조절함을 통하여 당뇨를 치료하게 된다.

이에, 본 발명에서는 생리활성이 부여된 당귀 추출물에 대하여 근육세포인 C2C12 세포에서 AMPK 활성을 측정하였으며, 그 결과 이들 화합물이 우수한 활성을 보임을 확인할 수 있다. 또한, 당귀 추출물의 당뇨 예방 및 치료효과를 위해 근육세포인 C2C12에서 포도당의 흡수를 촉진시킴을 확인하여 매우 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있다.

따라서, 당귀 추출물이 유효성분으로 함유되어 있는 당뇨 예방 및 치료제 조성물은 AMPK의 활성화를 통하여 당뇨를 예방 및 치료할 수 있음으로 인하여 당뇨와 관련된 각종 질병에 대한 다양한 약제로의 개발이 가능하리라 사료된다. 본 발명에 따른 당뇨 예방 및 치료제 조성물은 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 당뇨 예방 및 치료제로 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 당뇨 예방 및 치료제의 약학적 조성물은 상기 당귀추출물을 유효 성분으로 함유한다. 상기 당귀추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 당귀추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 당귀추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 당귀추출물의 유효용량은 농도 의존적이나 바람직하게는 0.1mg 내지 10g/㎏이고, 더욱 바람직하기로는 0.4 내지 5g/kg이며, 하루 1-6 회 투여 될 수 있다.

또한, 본 발명은 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨 예방 및 치료용 건강식품 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 건강식품이란 일반 식품에 당귀 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능을 향상시킨 식품이며, 당귀 추출물을 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오고, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하였기 때문에 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 당귀 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 당귀 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 당귀 추출물을 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강식품은 상기 약학적 조성물로 이용하는 경우는 측정된 독성 범위내의 당귀 추출물을 함유되도록 하는 것이 바람직하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 당귀 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 구체적으로, 당귀 추출물을 함유하는 건강 식품으로는 당귀 추출물을 주성분으로 만든 즙, 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만 본 발명의 범위가 다음 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 . 당귀뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매 추출물의 분리

당귀 (Angelica gigas Nakai) 뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매는 안동의 한약재상에서 각 5 kg씩을 구입하여 재료로 사용하였으며, 그 이외의 재료들은 약재상에서 구입하거나 채집하였다. 당귀 뿌리, 잎/줄기, 및 열매는 메탄올 50 ℓ로 24 시간 용출시킨 후 잔사를 분리 여과한 후 감압 농축 건조하여 실험에 사용하였다.

실시예 2 . 포도당 흡수도 분석

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 1% bovine calf serum 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. 완전히 분화된 세포를 5mM 의 glucose 가 포함된 Krebs-Ringer Buffer (KRB) 로 2시간 더 배양한다. 당귀뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매 추출물을 일정 시간 처리한 후 0.2 μCi 2-deoxyglucose 를 첨가하고 2분동안 방치한다. KRB buffer를 제거한 후 ice-cold PBS로 세번 세포를 세척한 후 0.5N NaOH를 사용하여 세포를 용해시키고 방사선 계측기를 이용하여 cpm을 측정한다. 이 경우 non-specific glucose uptake는 10μM 의 cytochalsin B를 포함한 KRB buffer로 측정하여 전체 값에서 제거한다.

도 1에서 보듯이 C2C12 세포에 당귀뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매 추출물을 50 ug/ml 의 농도로 처리하였을 경우 대조군에 비하여 근육세포주에서 포도당의 흡수가 300% 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시예 3 . AMPK 효소의 활성 측정

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 1% bovine calf serum 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. AMPK 의 효소 활성 측정은 C2C12 세포를 lysis 시켜 단백질 추출물을 얻은 후 final concentration 이 30% 되게 암모니움 설페이트를 넣고 단백질을 침전시킨다. 단백질 침전물을 버퍼 (62.5 mM Hepes, pH 7.2, 62.5 mM NaCl, 62.5 mM NaF, 1.25 mM Na pyrophosphate, 1.25 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 200 μM AMP)에 녹인 후 200 μM SAMS peptide (HMRSAM S GLHLVKRR : acetyl-CoA carboxylase 의 AMPK phophorylation 부위로써 밑줄 친 serine 잔기가 인산화 자리) 와 [γ-³²P]ATP 를 첨가하여 10분간 30℃에서 반응시킨 후 p81 phosphocellulose paper에 반응용액을 spotting 한다. p81 용지를 3% 인산용액으로 세척한 후 radioactivity 를 측정한다. 매 조건마다 SAMS peptide 가 들어있지 않은 반응을 수행하여 background를 빼준다.

도 2에서 보듯이 당귀뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매 추출물을 근육 세포주에 처리하면 AMPK 효소의 활성이 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시예 4 . 세포독성 측정

근육 세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 세포독성을 측정하는 용액을 넣어 세포 활성 정도를 측정한다.

도 3에서 보듯이 당귀뿌리 추출물을 근육 세포주에 처리하면 세포독성이 없음을 관찰할 수 있었다.

실시예 5 . AMPK 효소의 발현 측정

근육 세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 1% bovine calf serum 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. AMPK 의 효소 활성 측정은 C2C12 세포를 lysis 시켜 단백질 추출물을 얻은 후 Western Blot으로 측정하였다.

도 4에서 보듯이 당귀뿌리 추출물을 근육 세포주에 처리하면 AMPK 효소의 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시예 6 . 당뇨 모델 동물인 Leprdb/Leprdb 마우스에서 당뇨 예방 및 치료효과 검정

Leprdb/Leprdb 웅성 마우스는 렙틴 수용체의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 혈당이 상승하게 되는데 출생 후 약 10-11주 정도가 되면 혈당이 대략 350-400mg/dl 내외가 된다. 따라서 비만예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 혈당이 350-400mg/dl 정도 되는 성숙한 Leprdb/Leprdb 웅성 마우스를 각 군 당 10 마리씩을 을 대상으로 하였다. 한 개의 실험군 당 10 마리씩으로 하여 당귀추출물로부터 추출된 활성 분획을 150mg/일/마우스가 되도록 30일 동안 투여하였다. 대조군 10마리의 경우에는 당귀추출물 대신에 증류수를 투여하였다. 투여기간에 따른 혈당의 변화를 도 5에 나타내진 것과 같이 당귀추출물에 의한 혈당강하 효과가 있음을 확인 하였다.

실시예 7 . 구릿대 (angelica dehurica Bentham et Hooker), 고본 (ligusticum tenuissimum Kitagawa, angelica tenuissima Nakai), 강활(angelica japonica A. Gray)의 AMPK 효소의 활성 측정

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 1% bovine calf serum 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. AMPK 의 효소 활성 측정은 C2C12 세포를 lysis 시켜 단백질 추출물을 얻은 후 final concentration 이 30% 되게 암모니움 설페이트를 넣고 단백질을 침전시킨다. 단백질 침전물을 버퍼 (62.5 mM Hepes, pH 7.2, 62.5 mM NaCl, 62.5 mM NaF, 1.25 mM Na pyrophosphate, 1.25 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 200 μM AMP)에 녹인 후 200 μM SAMS peptide (HMRSAM S GLHLVKRR : acetyl-CoA carboxylase 의 AMPK phophorylation 부위로써 밑줄 친 serine 잔기가 인산화 자리) 와 [γ-³²P]ATP 를 첨가하여 10분간 30℃에서 반응시킨 후 p81 phosphocellulose paper에 반응용액을 spotting 한다. p81 용지를 3% 인산용액으로 세척한 후 radioactivity 를 측정한다. 매 조건마다 SAMS peptide 가 들어있지 않은 반응을 수행하여 background를 빼준다.

도 6 에서 보듯이 구릿대, 고본, 강활 추출물을 근육 세포주에 처리하면 AMPK 효소의 활성이 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시예 8 . 구릿대(angelica dehurica Bentham et Hooker), 고본(ligusticum tenuissima Kitagawa, angelica tenuissima Nakai), 강활(angelica japonica A. Gray)의 포도당 흡수도 분석

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 1% bovine calf serum 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. 완전히 분화된 세포를 5mM 의 glucose 가 포함된 Krebs-Ringer Buffer (KRB) 로 2시간 더 배양한다. 당귀뿌리, 잎/줄기, 그리고 열매 추출물을 일정 시간 처리한 후 0.2 μCi 2-deoxyglucose 를 첨가하고 2분동안 방치한다. KRB buffer를 제거한 후 ice-cold PBS로 세번 세포를 세척한 후 0.5N NaOH를 사용하여 세포를 용해시키고 방사선 계측기를 이용하여 cpm을 측정한다. 이 경우 non-specific glucose uptake는 10μM 의 cytochalsin B를 포함한 KRB buffer로 측정하여 전체 값에서 제거한다.

도 7 에서 보듯이 C2C12 세포에 구릿대, 고본, 강활 추출물을 50 ug/ml 의 농도로 처리하였을 경우 대조군에 비하여 근육세포주에서 포도당의 흡수가 증가함을 관찰할 수 있었다

실시예 9. 정제의 제조

당귀 추출물 600 g

아르기닌 240 g

결정셀룰로오스 140 g

스테아르산 마그네슘 10 g

하이드록시프로필메칠셀룰로오스 10 g

실시예 10 : 분말제의 제조

당귀 추출물 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 젤라틴으로 이루어진 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

실시예 11 . 당귀추출물의 우유에의 적용

우유 99g

당귀 추출물 1g

실시예 12. 당귀 추출물의 오렌지쥬스에의 적용

액상과당--------------------5%

폴리덱스트로스---------------1%

구연산---------------------5%

비타민C--------------------0.02%

당귀 추출물 --------------------2%

오렌지과즙농축액-------------25%

물------------------------67%

실시예 13.. 음료의 제조

젖산칼슘 50 ㎎

구연산 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

아르기닌 30 ㎎

당귀 추출물 100 ㎎

물 200 ㎖

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 당귀추출물은 AMPK를 활성화시키는 물질로 유효하므로, 당귀추출물은 당뇨 예방 및 치료제 조성물의 유효성분으로 유용하다. 또한, 당귀추출물은 포도당의 흡수를 촉진시켜 혈당을 조절함으로 당뇨로 인하여 발생되는 각종 질병들을 예방하거나 치료할 수 있는 식품, 화장품, 의약품 조성물로 개발될 수 있다.

도 1 은 당귀 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리하여 포도당의 흡수정도를 대조군과 비교한 막대그래프이다.

도 2 는 당귀 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리한 후 AMPK 효소의 활성정도를 대조군과 비교한 막대그래프이다.

도 3 은 당귀 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리한 후 세포독성을 대조군과 비교한 막대그래프이다.

도 4 는 당귀 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리한 후 AMPK 효소의 활성정도를 대조군과 비교한 Western Blot 사진이다.

도 5는 당뇨 모델 동물인 Leprdb/Leprdb 마우스에서 당귀추출물의 혈당강하효과를 대조군과 비교한 그래프이다.

도 6 은 구릿대, 고본, 강활 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리한 후 AMPK 효소의 활성정도를 대조군과 비교한 막대그래프이다.

도 7 은 구릿대, 고본, 강활 추출물을 근육세포주인 C2C12 세포주에 처리하여 포도당의 흡수정도를 대조군과 비교한 막대그래프이다.

Claims (17)

1. 당귀 추출물을 유효성분으로 하여 치료 및/또는 예방적 유효량 이상을 함유하는 당뇨 예방 및/또는 치료용 조성물
2. 제 1 항에 있어서, 상기 당귀는 안젤리카 (angelica) 속 또는 리구스티쿰 (ligusticum) 속의 당귀임을 특징으로 하는 조성물
3. 제 1 항 내지 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 5' AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시키는 것임을 특징으로 하는 조성물
4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 5' AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시켜 혈액 내 당의 세포 흡수를 촉진하여 혈당을 강하하는 것임을 특징으로 하는 조성물
5. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것임을 특징으로 하는 당뇨 예방 및/또는 치료용 조성물
6. 제 5 항에 있어서, 유효성분의 함량이 성인 체중 1Kg 당 0.1mg ~ 60g/일 범위로 투여 됨을 특징으로 하는 조성물
7. 제 5 항의 조성물을 포함하는 당뇨 예방 및/또는 치료용 제제
8. 제 7 항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것임을 특징으로 하는 제제
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 경질 또는 연질의 캅셀제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 동결건조제제, 좌제, 주사용 제제, 유화액, 비경구 투여용의 단위 투여형 또는 수회 투여형 인 것임을 특징으로 제제
10. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 식용음료 또는 식품의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것임을 특징으로 하는 당뇨 예방 및/또는 치료용 조성물
11. 제 10 항에 있어서, 유효성분의 함량이 0.0001 내지 10 중량% 범위로 포함됨을 특징으로 하는 조성물
12. 당귀로부터 a) 물 또는 유기용매 추출하여 조 추출액을 얻는 단계 b) 상기 조 추출물을 여과한 후 (감압)농축하는 단계 및 c) 선택적으로, 용매를 제거하는 단계를 포함하는 당귀 추출물 제조방법
13. 제 12 항에 있어서, 상기 당귀는 안젤리카 (angelica) 속 또는 리구스티쿰 (ligusticum) 속의 당귀임을 특징으로 제조방법
14. 제 12 항에 있어서, 상기 당귀(Angelica gigas Nakai)는 뿌리, 잎, 줄기 또는 열매이거나, 둘 이상의 혼합물이고, 건조약재 또는 생약재인 것임을 특징으로 하는 제조방법
15. 제 12 항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 등의 알코올류인 것임을 특징으로 하는 제조방법
16. 제 12 항 또는 제 15 항에 의해 제조된 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 것임을 특징으로 하는 당뇨 예방 및/또는 치료용 조성물
17. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 당뇨 예방 및/또는 치료 활성 분획물