KR101165600B1 - 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 ａ（ｈ１ｎ１）동시 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 구체적으로 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 정상 및 변이 유전자에 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하고, MP/swInfA/swH1 프라이머 세트에 nor 프라이머 세트/res 프라이머 세트를 포함한 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 농도, 바이러스 농도에 따른 민감성 및 RTase의 농도에 따른 민감성을 확인하여 키트 구성에서 최적의 프라이머 농도 및 키트의 우수한 민감성을 확인하고, 본 발명의 키트를 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)의 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 밝혔다.
Description
본 발명은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 진단할 수 있는 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 대부분의 경우 수 일간 앓고 회복되나 노약자나 만성 질환자들에게는 폐렴 등의 치명적인 합병증을 초래할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 A, B, C형으로 분류되며, 매년 유행하는 A형 인플루엔자 바이러스는 표면항원인 헤마글루티닌(Hemaglutinine)(H1-H16)과 뉴라미니다아제(Neuraminidase)(N1-N9)에 의해서 아형이 결정된다.
인플루엔자 바이러스는 항원변이를 통해 유행을 초래하는데, 일반적인 계절 인플루엔자는 항원 소변이로 매년 겨울 우리를 괴롭히고 있다. 2009년 4월 이후 전 세계적으로 유행하고 있는 신종 인플루엔자 바이러스(pandemic influenza H1N1 2009)는 유전자 재조합으로 항원 대변이가 일어나 새로운 인플루엔자 바이러스가 만들어진 것이다.
인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 1918년 조류로부터 사람과 돼지에게 전파되어 대유행을 일으켰고, 1957년 사람 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스가 사라지고, 사람 인플루엔자 A(H2N2)가 출현하였다. 사람 인플루엔자 A(H1N1)가 1977년에 다시 출현하였고, 1968년에 출현한 사람 인플루엔자 A(H3N2)와 함께 계절 인플루엔자의 주요 원인 바이러스가 되었다. 또한 돼지 인플루엔자 바이러스의 사람 감염에 대한 혈청학적 진단에 대한 보고가 1958년도에 있었고, 1974년에는 사람으로부터 돼지 인플루엔자 바이러스를 분리한 이후, 1970년대부터 개인 또는 집단적으로 돼지 인플루엔자 바이러스 감염이 산발적으로 보고되어왔다. 1998년도부터 사람 인플루엔자 A(H3N2) 바이러스, 북미 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 그리고 조류 인플루엔자 바이러스[triple reassortant swneinfluenza A(H1N1)]의 인체 감염이 보고되었으며, 사람간 전파가 가능함을 시사하였다. 2009년 유라시아 돼지 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스와 기존의 3종 유전자 재편성 돼지 인플루엔자 바이러스 간에 유전자 재편성이 일어난 새로운 형태의 바이러스가 나타나 전세계적으로 인플루엔자 대유행을 일으켰다. 현재 이러한 바이러스의 확산을 통제하기 위한 노력이 이루어지고 있으며, 신종 인플루엔자를 진단하기 위한 연구개발도 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있는 실정이다.
현재 사용중인 신종플루 확진을 위한 진단법으로는 미국 CDC에서 이미 보고된 실시간 RT-PCR(real time RT-PCR)이 있다. 인플루엔자가 의심이 되어 확진 검사를 해야 하는 대상이 되면 임상의들은 면봉법(swab)을 통해서 환자의 비인두 도찰물, 비강 흡인물 또는 비인두와 구강인두로부터 혼합된 도찰물을 검체로 채취할 수 있고, 상기 검체물들을 채취하기가 어려우면 비강 면봉법이나 구강인두 면봉법도 가능할 수 있으며, 채취된 검체물을 이용하여 검사를 시행하게 된다. 실시간 RT-PCR로 검사할 경우, 신종 인플루엔자는 인플루엔자 A에 대해서는 양성 결과를, H1, H3에 대해서는 음성 결과로 나타내면서 써브타입을 확인할 수 없는 인플루엔자 A로 나오면, CDC S-OIV real time RT-PCR Detection Panel로 신종 인플루엔자 A(H1N1)로 확진된다. 이러한 실시간 RT-PCR은 전세계적으로 사용중이며, 한국에서는 (주)바이오니아에서 해당 키트를 제작 판매중에 있다.
그외 전통적인(conventional) RT-PCR을 이용하여 전기영동상에서 확인할 수 있는 키트를 (주)씨젠, (주)인트론바이오테크놀로지, LG생명과학 등에서 판매중에 있으나, 각각 약 11만원(real time RT-PCR)에서 5만원(conventional RT-PCR)까지 고비용으로 판매되고 있어, 감염 여부를 확인하고자 하는 환자들에게 경제적으로 많은 부담이 되고 있다.
인플루엔자 치료제는 M2 억제제인 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)이 있으며, 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 억제제인 자나미비르(zanamivir, 리렌자, Relenza)와 오셀타미비르(oseltamivir, 타미플루, Tamiflu)가 있는데, 이 가운데 자나미비르(zanamivir)는 흡입용, 아만타틴(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 그리고 오셀타미비르(oseltamivir)는 경구용으로 사용되고 있다. M2 억제제는 인플루엔자 A형 바이러스에만 존재하는 M2 단백질에 작용하므로 아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)은 A형 인플루엔자 바이러스에만 특이적으로 작용한다. 반면 NA 억제제는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 모두에 대해 억제 효과가 있다.
최근 이러한 인플루엔자 치료제에 대한 내성이 보고되고 있으며, 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 치료에 가장 널리 효과적으로 쓰이고 있는 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 바이러스가 발견되면서, 이 같은 내성바이러스 출현에 대한 공포감이 높아지고 있으며, 국내에서도 2009년 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 바이러스가 처음으로 확인되었다. 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자는 다른 치료제인 리렌자에는 내성을 나타내지 않았다. 따라서, 이러한 타미플루 내성 신종인플루엔자 바이러스의 감염 여부를 손쉽게 진단하여, 다른 치료제를 투여함으로써, 이러한 바이러스에 감염된 환자에 대한 치료율을 높일 수 있다. 하지만, 아직까지 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 방법은 전혀 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 변이 바이러스중, 99% 이상이 NA 유전자의 H275Y 변종(NA 유전자의 823-825번째 뉴클레오티드에 해당하는 CAC가 TAC로 바뀌어, 275번째 아미노산인 히스티틴이 티로신으로 변이)이라는 점에 착안하여, NA 정상 및 변이 유전자에 각각 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였다. 또한, MP/swInfA/swH1 프라이머 세트에 NA 유전자에 선택적으로 결합할 수 있는 nor(normal, 타미플루 민감성) 프라이머 또는 res(resistant, 타미플루 내성) 프라이머를 포함하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제작할 수 있고, 상기 제작된 키트가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 농도, 바이러스 농도에 따른 민감성 및 RTase의 농도에 따른 민감성을 확인하여 키트 구성에서 최적의 프라이머 농도 및 키트의 우수한 민감성을 확인하고, 본 발명의 키트를 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)의 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 타미플루 민감성 또는 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타미플루 민감성 또는 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 개별 또는 동시에 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트 또는 이를 포함한 키트를 이용한 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자를 개별 또는 동시에 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 8 및 18로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 20으로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법을 제공하는 것이다;
1) 서열번호 23으로 기재되는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제(neuraminidase) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, N-말단으로부터 274 또는 275번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열이 변형된 프라이머를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법을 제공하는 것이다;
1) 서열번호 23으로 기재되는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제(neuraminidase) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, N-말단으로부터 274 또는 275번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열이 변형된 프라이머를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 제공하는 것이다:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 제공하는 것이다:
a) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트, 및 하기 d) 내지 f)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제공하는 것이다:
d) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
e) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
f) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루에 민감성을 갖는 신종인플루엔자 A(H1N1)를 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 검체에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 상기 타미플루 민감 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루에 내성을 갖는 신종인플루엔자 A(H1N1)를 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 검체에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 상기 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)를 동시에 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 시료에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
본 발명의 진단 키트는 일반적인 신종인플루엔자 A(H1N1)의 감염 여부를 저렴하게 검출할 수 있을 뿐 아니라, 비용의 추가 없이 기존의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 확진 검사와 동시에 타미플루 내성 변이 바이러스주(H275Y)를 한번에 검출할 수 있으므로, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자의 동시 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 타미플루 민감 신종인플루엔자 A(H1N1)의 검출을 위해 복합 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 각 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swH1 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: MP 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 5: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 2는 신종인플루엔자 A(H1N1) 뉴라미니다아제(neuraminidase) 유전자에서 유래된 타미플루 민감성 및 내성 프라이머의 확인을 위해 PCR 주형을 증폭한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 질병관리본부로부터 분양받은 정상의 신종인플루엔자 A(H1N1) RNA를 주형으로 사용하였으며, 민감성 및 내성 뉴라미니다아제를 증폭시키기 위해 각각 NAnor-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍 및 NAres-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하였다. 이 때 각 프라이머는 각각 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: NAnor-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물인 NA 정상 주형(634 bp) 및
레인 2: NAres-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물인 NA 내성(변이) 주형(634 bp).
도 3은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 뉴라미니다아제 유전자에 대한 신규 제작 프라이머의 선택적 결합 여부를 확인하기 위해, RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 주형은 각각 1 ng을, 각 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주) 바이오니아 구입)),
레인 1: NA 유전자 정상 주형 / NAnor2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: NA 유전자 정상 주형 / NAnor4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 5: NA 유전자 정상 주형 / NAnor5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 6: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 7: NA 유전자 정상 주형 / NAres2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 8: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 9: NA 유전자 정상 주형 / NAres4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 10: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 11: NA 유전자 정상 주형 / NAres5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 12: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물.
도 4는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단을 위한 키트를 구성하는 다양한 종류의 프라이머 조합으로 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 질병관리본부로부터 분양받은 influenza A(H1N1) 바이러스 RNA를 주형으로 사용하였다. 사진에서 별표는 서열분석을 의뢰하여(주문처 : 대한민국 (주) 제노텍) 서열이 확인되었음을 의미한다. 또한 이 때 프라이머는 MP/swInfA/swH1 프라이머 세트의 경우 4 pmol, NA 계열의 경우 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres2F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor4F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres4F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 5: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 6: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres5F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 5는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 최적 농도를 확인하기 위해, 프라이머의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: MP 프라이머 쌍(2 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 2 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: MP 프라이머 쌍(3 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 3 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: MP 프라이머 쌍(4 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 4 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 4: MP 프라이머 쌍(6 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 6 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 6은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 바이러스 농도에 따른 민감성을 확인하기 위하여, 바이러스의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 swInfA/swH1/MP 프라이머는 각각 4 pmol, NA 계열의 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였으며, 바이러스는 질병관리본부로부터 분양받은 바이러스 RNA를 적절히 희석하여 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/17(바이러스 10000 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/170(바이러스 1000 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/1700(바이러스 100 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/17000(바이러스 10 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 5: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/170000(바이러스 1 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 7은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 RTase 농도에 따른 민감성을 확인하기 위해, RTase의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 swInfA/swH1/MP 프라이머는 각각 4 pmol, NA 계열의 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였으며 RTase는 Quiagen 제품을 사용하였다. 바이러스는 질병관리본부로부터 분양받은 바이러스 RNA를 X 1/17(바이러스 10000 게놈 카피에 상응) 희석하여 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 1 ul를 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.75 ul를 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.5 ul를 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 4: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.25 ul를 사용한 RT-PCR 결과물.
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swH1 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: MP 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 5: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 2는 신종인플루엔자 A(H1N1) 뉴라미니다아제(neuraminidase) 유전자에서 유래된 타미플루 민감성 및 내성 프라이머의 확인을 위해 PCR 주형을 증폭한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 질병관리본부로부터 분양받은 정상의 신종인플루엔자 A(H1N1) RNA를 주형으로 사용하였으며, 민감성 및 내성 뉴라미니다아제를 증폭시키기 위해 각각 NAnor-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍 및 NAres-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하였다. 이 때 각 프라이머는 각각 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: NAnor-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물인 NA 정상 주형(634 bp) 및
레인 2: NAres-F(temp)/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물인 NA 내성(변이) 주형(634 bp).
도 3은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 뉴라미니다아제 유전자에 대한 신규 제작 프라이머의 선택적 결합 여부를 확인하기 위해, RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 주형은 각각 1 ng을, 각 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주) 바이오니아 구입)),
레인 1: NA 유전자 정상 주형 / NAnor2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: NA 유전자 정상 주형 / NAnor4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 5: NA 유전자 정상 주형 / NAnor5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 6: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAnor5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 7: NA 유전자 정상 주형 / NAres2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 8: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres2F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 9: NA 유전자 정상 주형 / NAres4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 10: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres4F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물,
레인 11: NA 유전자 정상 주형 / NAres5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 12: NA 유전자 내성(변이) 주형 / NAres5F-NAR 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과물.
도 4는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단을 위한 키트를 구성하는 다양한 종류의 프라이머 조합으로 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 질병관리본부로부터 분양받은 influenza A(H1N1) 바이러스 RNA를 주형으로 사용하였다. 사진에서 별표는 서열분석을 의뢰하여(주문처 : 대한민국 (주) 제노텍) 서열이 확인되었음을 의미한다. 또한 이 때 프라이머는 MP/swInfA/swH1 프라이머 세트의 경우 4 pmol, NA 계열의 경우 10 pmol의 농도로 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres2F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor4F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres4F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 5: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 6: swInfA 프라이머 쌍 + swH1 프라이머 쌍 + MP 프라이머 쌍 + NAres5F/NA-R 프라이머 쌍을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 5는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 최적 농도를 확인하기 위해, 프라이머의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: MP 프라이머 쌍(2 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 2 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: MP 프라이머 쌍(3 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 3 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: MP 프라이머 쌍(4 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 4 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 4: MP 프라이머 쌍(6 pmol) + swInfA/Sw H1 프라이머 쌍(각 6 pmol) + NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍(10 pmol)을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 6은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 바이러스 농도에 따른 민감성을 확인하기 위하여, 바이러스의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 swInfA/swH1/MP 프라이머는 각각 4 pmol, NA 계열의 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였으며, 바이러스는 질병관리본부로부터 분양받은 바이러스 RNA를 적절히 희석하여 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/17(바이러스 10000 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/170(바이러스 1000 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/1700(바이러스 100 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 4: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/17000(바이러스 10 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 5: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 RNA X1/170000(바이러스 1 게놈 카피)을 사용한 RT-PCR 결과물.
도 7은 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 RTase 농도에 따른 민감성을 확인하기 위해, RTase의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 결과를 확인한 아가로즈 겔 사진이다. 이 때 swInfA/swH1/MP 프라이머는 각각 4 pmol, NA 계열의 프라이머는 10 pmol의 농도로 사용하였으며 RTase는 Quiagen 제품을 사용하였다. 바이러스는 질병관리본부로부터 분양받은 바이러스 RNA를 X 1/17(바이러스 10000 게놈 카피에 상응) 희석하여 사용하였다;
M: DNA 싸이즈 마커(100bp DNA ladder((주)인트론바이오테크놀로지 구입)),
레인 1: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 1 ul를 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 2: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.75 ul를 사용한 RT-PCR 결과물,
레인 3: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.5 ul를 사용한 RT-PCR 결과물, 및
레인 4: swInfA/swH1/MP 프라이머 쌍 + NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍 + 바이러스 X1/17 + RTase 0.25 ul를 사용한 RT-PCR 결과물.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 8 및 18로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 8 및 20으로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 변이 바이러스 중, 99% 이상이 NA 유전자의 H275Y 변종(NA 유전자의 823-825번째 뉴클레오티드에 해당하는 CAC가 TAC로 바뀌어, 275번째 아미노산인 히스티틴이 티로신으로 변이)이라는 점에 착안하여, NA 정상 및 변이 유전자에 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고(표 2 참조), 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였다(도 3 참조). 또한, MP/swInfA/swH1 프라이머 세트에 nor 프라이머/res 프라이머를 포함하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제작할 수 있고, 상기 제작된 키트가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다(도 4 참조). 아울러, 본 발명의 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 농도, 바이러스 농도에 따른 민감성 및 RTase의 농도에 따른 민감성을 확인하여 키트 구성에서 최적의 프라이머 농도 및 키트의 우수한 민감성을 확인하였으므로(도 5 내지 7 참조), 본 발명에서 제작된 신규 프라이머는 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트, 및 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머 세트로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법을 제공하는 것이다;
1) 서열번호 23으로 기재되는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제(neuraminidase) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, N-말단으로부터 274 또는 275번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열이 변형된 프라이머를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계.
상기 단계 1)에서 변형된 프라이머는 C-말단 부위가 변형된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 타미플루에 내성을 보이는 신종인플루엔자 변이 바이러스 중, 99% 이상이 NA 유전자의 H275Y 변종(NA 유전자의 823-825번째 뉴클레오티드에 해당하는 CAC가 TAC로 바뀌어, 275번째 아미노산인 히스티틴이 티로신으로 변이)이라는 점에 착안하여, NA 정상 및 변이 유전자에 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였으므로, 본 발명은 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법, 및 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단용 프라이머의 제조 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 제공하는 것이다:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 제공하는 것이다:
a) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트, 및 하기 d) 내지 f)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제공하는 것이다:
d) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
e) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
f) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
본 발명의 구체적인 실시예에서, NA 정상 및 변이 유전자에 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였다. 또한, MP/swInfA/swH1 프라이머 세트에 nor 프라이머/res 프라이머를 포함하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제작할 수 있고, 상기 제작된 키트가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 농도, 바이러스 농도에 따른 민감성 및 RTase의 농도에 따른 민감성을 확인하여 키트 구성에서 최적의 프라이머 농도 및 키트의 우수한 민감성을 확인하였으므로, 본 발명에서 제작된 신규 프라이머를 포함한 키트는 타미플루 민감성 또는 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)의 개별 또는 동시 진단을 위한 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루에 민감성을 갖는 신종인플루엔자 A(H1N1)를 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 검체에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 상기 타미플루 민감 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루에 내성을 갖는 신종인플루엔자 A(H1N1)를 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 검체에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 상기 타미플루 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)를 동시에 진단하는 방법을 제공하는 것이다;
1) 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 시료에서 바이러스 유래 RNA 또는 DNA를 분리하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 분리된 RNA 또는 DNA를 주형으로, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계.
상기 단계 1)의 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 시료는 면봉법을 통한 피검자의 비인두 도찰물, 비강 흡인물 및 비인두와 구강인두로부터 혼합된 도찰물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, NA 정상 및 변이 유전자에 특이적으로 결합하는 신규 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였다. 또한, MP/swInfA/swH1 프라이머 세트에 nor 프라이머/res 프라이머를 포함하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제작할 수 있고, 상기 제작된 키트가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트의 프라이머 농도, 바이러스 농도에 따른 민감성 및 RTase의 농도에 따른 민감성을 확인하여 키트 구성에서 최적의 프라이머 농도 및 키트의 우수한 민감성을 확인하였으므로, 본 발명에서 제작된 신규 프라이머를 포함한 키트는 타미플루 민감성 또는 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)의 개별 또는 동시에 진단하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
타미플루
민감 신종인플루엔자 A(
H1N1
)의 검출을 위한 복합(
multiplex
)
RT
-
PCR
swInfA, swH1 및 MP 프라이머 세트를 이용하여 타미플루 민감 신종인플루엔자 H1N1 바이러스를 검출하기 위하여, 복합 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 복합 RT-PCR은 Qiagen one step RT-PCR 키트(cat.no. 210212)를 이용하여 하기 [표 1]에서 나타낸 바와 같이 수행하였다.
| 성분 | 부피/반응 | 최종 농도 |
| 주형 RNA 또는 DNA | 1 ul | - 바이러스 RNA의 경우 1 X 104 게놈 카피 - DNA의 경우 1ng |
| 마스터 혼합물 | ||
| Qiagen 효소 혼합물 | 1 ul | - |
| Qiagen 버퍼 | 5 ul | 1X |
| dNTP 혼합물 | 1 ul | 각 dNTP 400 uM |
| 프라이머 세트 | ||
| 정방향 프라이머 | 변동 | 2- 10 pmol |
| 역방향 프라이머 | 변동 | 2- 10 pmol |
| DW로 총 부피 25 ul이 되도록 맞춤. | ||
RT-PCR은 55℃에서 30분간 역전사를 수행하고, 95℃에서 15분간 초기 역전사 단계를 거친 후 94℃, 0.5분 변성, 60℃ 1.5분 어닐링, 72℃ 1분 신장의 싸이클을 45 싸이클 수행한 다음, 72℃에서 10분 동안 최종 신장하는 단계를 거쳐 수행되었다. 주형으로는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스(질병관리본부 병원체 관리번호 NCCP7005)를 7배 희석 후 RNA 1 ul(1X104 게놈 카피)를 이용하였다. 프라이머는 각각 정방향/역방향 프라이머로 구성된 SwinfA 프라이머 세트(서열번호 1 및 2), SwH1 프라이머 세트(서열번호 3 및 4) 및 MP 프라이머 세트(서열번호 5 및 6)를 이용하였고, 각 프라이머는 100 pmol/ul 농도로 (주)제노텍에서 합성주문한 것을 10배 희석하여 10 pmol/ul의 농도를 스탁 용액(stock solution)으로 사용하였으며, 1종 또는 다수의 서로 다른 프라이머 세트를 한 튜브(tube)에 섞어 사용하였다. PCR 산물은 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
그 결과, swInfA, swH1 및 MP 프라이머 세트를 이용하여 각각의 유전자가 검출됨을 확인하였으며, 또한 세 가지 프라이머를 동시에 섞은 경우, 한 번에 세 가지 유전자를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 1).
이 방법은 기존의 일반적인 전통적 RT-PCR 방법과 유사한 방법이지만, 단가적인 측면에서 상당히 저렴한 방법으로, 또한 코딩 서열을 완전히 포함하고 있는 MP 유전자를 증폭시킬 수 있어, MP 프라이머 세트를 사용하여 MP 유전자를 전체 시퀀싱(sequencing)할 수 있다.
<
실시예
2>
타미플루
민감성 및 내성 유전자 검출을 위한 신종인플루엔자 A(H1N1) 뉴라미니다아제(
neuraminidase
) 유전자 서열을 이용한
프라이머
제작
신종인플루엔자 A(H1N1) 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA, 서열번호 22) 유전자의 총 길이는 1410bp이며, 이 중에서 823-825번째 뉴클레오티드 CAC가 H275에 해당한다. 잘 알려진 타미플루 내성 변이는 H275Y로서, 275번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 티로신(tyrosine)으로 돌연변이된 것이며, 정확히는 823번째 뉴클레오티드 C가 T로 바뀌어 생긴 것이다.
타미플루 내성 돌연변이 바이러스를 전기영동 겔상에서 확인하기 위하여, 뉴라미니다아제 단백질(서열번호 23)의 274-275 아미노산 부위에 해당하는 염기서열이 변형된 프라이머를 제작하였다.
프라이머 서열의 C-말단 부위의 염기서열은 주형에의 부착성을 결정짓는 중요한 부위로, 이 C-말단 염기서열을 조작함으로써 정상의 타미플루 민감 바이러스 및 타미플루 내성 돌연변이 바이러스주에 대해 특정 프라이머만이 붙거나 붙지 않도록 제작하였으며, 프라이머 서열의 변형은 상기 그림에서와 같은 방법으로 수행되었다.
상기 그림에서 temp라고 명기된 것은, 타미플루 민감성 및 내성 돌연변이 NA 유전자 주형(template)을 제작하기 위해 사용된 프라이머를 의미하고, Nor이라고 명기된 것은 타미플루 민감성을 갖는 정상(Normal)의 신종인플루엔자를 의미하며, res는 타미플루 내성(resistant)을 갖는 내성 돌연변이 신종인플루엔자를 의미한다.
그 결과, 정상의 타미플루 민감 바이러스 특이적 정방향 프라이머 5개 및, 돌연변이의 타미플루 내성 바이러스 특이적 정방향 프라이머 5개를 제작하였으며, 이를 하기 [표 2]에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| swInfA-F | 5'-GCACGGTCAGCACTTATYCT | 1 |
| swInfA-R | 5'-GTGRGCTGGGTTTTCATTTG | 2 |
| swH1-F | 5'-GTGCTATAAACACCAGCCTY | 3 |
| swH1-R | 5'-CGGGATATTCCTTAATCCTG | 4 |
| MP-F | 5'-ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC | 5 |
| MP-R | 5'-ACCATCGTCAACATCCACAG | 6 |
| NA-F | 5'-GCAAAAGCAGGAGTTTAAAATG | 7 |
| NA-R | 5'-TGACCAGTAGAAACAAGGAGTTT | 8 |
| HA-F | 5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATA | 9 |
| HA-R | 5'-CAAGGGTGTTTTTCTCATGC | 10 |
| NAnor-F (temp) | 5'-CGAAATGAATGCCCCTAATTATCAC | 11 |
| NAres-F (temp) | 5'-CGAAATGAATGCCCCTAATTATTAC | 12 |
| NAnor2-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGCC | 13 |
| NAres2-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGCT | 14 |
| NAnor3-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGAC | 15 |
| NAres3-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGAT | 16 |
| NAnor4-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTAGC | 17 |
| NAres4-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTAGT | 18 |
| NAnor5-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGTC | 19 |
| NAres5-F | 5'-AATGAATGCCCCTAATTGTT | 20 |
| Na-M | 5'-TGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTC | 21 |
R은 A+G의 혼합된 염기(mixed bases)를 의미
Y = C+T의 혼합된 염기(mixed bases)를 의미
<
실시예
3> 신종인플루엔자 A(
H1N1
) 뉴라미니다아제(
neuraminidase
) 유전자에서
유래된
타미플루
민감성 및 내성
프라이머의
확인을 위한
PCR
주형의 증폭
상기 <실시예 2>에서 제작된 신종인플루엔자 A(H1N1)의 NA 유전자에서 유래된 타미플루 민감성 및 내성 프라이머의 선택적 결합 여부를 확인하기 위하여 PCR 주형을 증폭하였다.
구체적으로, NAnor-F(temp)(서열번호 11), NAres-F(temp)(서열번호 12)를 정방향 프라이머로, NA-R(서열번호 8) 프라이머를 역방향 프라이머로 하여, 각 프라이머를 10 pmol의 농도로 처리하여, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, NA 정상 주형 및 NA 내성 주형이 각 프라이머를 통해 증폭되었음을 확인하였다(도 2).
<
실험예
1>
타미플루
민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(
H1N1
)
바이러스주에
대한 신규 제작
프라이머의
선택적 결합 여부 확인
타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스주에 대해 상기 <실시예 2>에서 제작된 신규 프라이머가 선택적으로 결합하는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 3>에서 증폭된 NA 정상 주형 및 NA 내성 주형을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 증폭된 NA 정상 유전자 및 NA 내성 유전자를 주형으로 1 ng 처리하고, 상기 <실시예 2>에서 제작된 NAnor2F/NA-R, NAnor4F/NA-R, NAnor5F/NA-R, NAres2F/NA-R, NAres4F/NA-R 및 NAres5F/NA-R 프라이머 쌍을, 각 프라이머의 농도를 10 pmol로 처리하여, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법에서 PCR 싸이클을 20 싸이클로 변형한 조건으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, nor 프라이머는 타미플루 민감성을 보이는 주형에만 결합하고, Res 프라이머는 타미플루 내성을 보이는 H275Y 변이 주형에만 결합하였다(도 3). 특히, NAnor5F 및 NAres5F 정방향 프라이머를 이용한 경우, 가장 진하게 밴드가 검출되어, NAnor5F 및 NAres5F 정방향 프라이머가 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스의 진단에 가장 유용함을 알 수 있었다(도 3).
이를 통해, 본 발명에서 제작된 신규 프라이머는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스주에 대해 선택적으로 결합함을 확인하였다.
<
실험예
2>
타미플루
민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(
H1N1
) 동시 진단을 위한
키트
제작 및 이의 확인
타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)를 동시에 진단할 수 있는 키트를 제작하기 위하여 다양한 조합의 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 타미플루에 민감한 NA 유전자 정상 신종인플루엔자를 진단할 수 있는 MP/swInfA/swH1 프라이머 세트를 4 pmol로 처리함을 기본으로 하고, NAnor2F/NA-R, NAres2F/NA-R, NAnor4F/NA-R, NAres4F/NA-R, NAnor5F/NA-R 및 NAres5F/NA-R 프라이머 세트를 10 pmol 농도로 각각 처리하고, NA 유전자 정상 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 RNA를 주형으로 하여, 상기 <실시예 1>의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, Nor 프라이머 계열은 NA 유전자가 정상인 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A(H1N1)만을 증폭시키고, res 프라이머는 NA 유전자 정상인 신종인플루엔자 A(H1N1)은 검출하지 못하였다(도 4).
따라서, MP/Sw infA/Sw H1 프라이머 세트에 nor 프라이머/res 프라이머를 포함하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트를 제작할 수 있고, 상기 제작된 키트는 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)를 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다.
<
실험예
3>
타미플루
민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(
H1N1
) 동시 진단
키트의
프라이머
최적 농도 확인
타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트에서 프라이머의 최적 농도를 확인하기 위하여, 프라이머의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, MP 프라이머 쌍을 2, 3, 4, 6 pmol 처리하고, swInfA 및 swH1 프라이머 쌍은 각각 2, 3, 4, 6 pmol 처리하고, NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍을 10 pmol 처리하여, 상기 <실시예 1>의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 4 pmol의 MP 프라이머 쌍, 4 pmol의 swInfA 및 swH1 프라이머 쌍, 10 pmol NAnor2F/NA-R 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행한 경우, MP/swInfA/swH1/NA 유전자의 4가지 밴드가 선명하게 검출되었음을 확인하였다(도 5).
<
실험예
4>
타미플루
민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(
H1N1
) 동시 진단
키트의
바이러스 농도에 따른 민감성 확인
타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트에서 바이러스 농도에 따른 민감성을 확인하기 위하여, 바이러스의 농도를 변형하여 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 4 pmol MP/swInfA/swH1 프라이머 쌍, 10 pmol NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍을 주고, 바이러스의 양을 X1/17(바이러스 10000 게놈 카피), X1/170(바이러스 1000 게놈 카피), X1/1700(바이러스 100 게놈 카피), X1/17000(바이러스 10 게놈 카피) 및 X1/170000(바이러스 1 게놈 카피) 처리하여, 상기 <실시예 1>의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다(이 때 바이러스는 질병관리본부로부터 분양받은 바이러스 RNA를 의미하며, 분양받은 바이러스 RNA는 7×104 게놈 카피/ul로서, 7배 희석후 1 ul를 실험에 사용하게 되면 바이러스 10000 게놈 카피(genome copy)에 상응하게 된다).
그 결과, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트는 바이러스가 최소 100마리만 되어도 MP/swInfA/swH1/NA 유전자를 모두 검출할 수 있었다(도 6).
이를 통해 본 발명의 키트는 적은 농도의 바이러스를 이용하여 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1)을 동시에 진단할 수 있음을 확인하였다.
<
실험예
5>
타미플루
민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(
H1N1
) 동시 진단
키트의
RTase
농도에 따른 민감성 확인
본 발명의 키트에서 제조 원가 비용의 대부분은 RTase(Reverse transcriptase, 역전사 효소)가 차지하고 있다. 따라서, 이러한 RTase의 양을 최소화함으로써 경제적으로 효과적인 키트를 제작할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트에서 RTase 농도에 따른 민감성을 확인하였다.
구체적으로, 4 pmol MP/swInfA/swH1 프라이머 쌍, 10 pmol NAnor5F/NA-R 프라이머 쌍을 처리하고, 바이러스의 양을 X1/7(바이러스 10000 게놈 카피) 처리하고, Qiagen one step RT-PCR 키트 내 RTase 양을 1, 0.75, 0.5 및 0.25 ul 씩 달리 처리하여, 상기 <실시예 1>의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A(H1N1) 동시 진단 키트는 RTase를 0.5 ul만 이용하여도 MP/swInfA/swH1/NA 유전자를 모두 검출할 수 있었다(도 7).
이는 Qiagen에서 공급되는 one step RT-PCR의 제조사 메뉴얼에는 50 ul 반응액을 기준으로 1회 검사당 2 ul의 RTase를 사용하도록 설계되어 있으나, 본 실험예의 결과 메뉴얼에 제시된 기준의 1/4의 RTase를 사용하더라도 진단이 가능하다는 것을 의미하므로, 본 발명의 키트는 경제적으로 효과적이다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 신규 제작된 프라이머를 포함한 진단 키트는 타미플루에 민감한 신종인플루엔자 바이러스뿐 아니라, 타미플루에 내성을 갖는 신종인플루엔자 바이러스를 동시에 검출할 수 있으므로, 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자의 동시적 진단에 유용하게 이용할 수 있으며, 기존의 진단에 필요한 대부분의 단가를 결정하는 RTase의 사용량을 1/4 수준으로 낮출 수 있어 경제적이어서, 기존의 시장에 진입할 수 있도록 성능이 향상된 경제적인 방법이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (10)
1) 서열번호 23으로 기재되는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제(neuraminidase) 단백질의 아미노산 서열로부터, 상기 단백질의 N-말단으로부터 274번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열이 변형되고, 275번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열의 첫 번째 염기에서 프라이머의 3'-말단이 형성되도록 변형된 상기 프라이머를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 타미플루 내성 신종인플루엔자 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계를 포함하는, 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 판별용 프라이머의 제조 방법.
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 타미플루 내성 신종인플루엔자 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계를 포함하는, 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 판별용 프라이머의 제조 방법.
1) 서열번호 23으로 기재되는 신종인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질의 아미노산 서열로부터, 상기 단백질의 N-말단으로부터 274번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열이 변형되고, 275번째 아미노산 부위를 암호화하는 염기 서열의 첫 번째 염기에서 프라이머의 3'-말단이 형성되도록 변형된 상기 프라이머를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계를 포함하는, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A 판별용 프라이머의 제조 방법.
2) 상기 단계 1)에서 제작된 프라이머 중에서 정상의 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에는 결합하지 않고, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A 바이러스 유래 뉴라미니다아제 단백질을 암호화하는 염기 서열에만 특이적으로 결합하는 프라이머를 선별하는 단계를 포함하는, 타미플루 내성 신종인플루엔자 A 판별용 프라이머의 제조 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 프라이머의 3'-말단의 염기는 티민(thymine) 또는 시토신(cytosine)인 것을 특징으로 하는 프라이머의 제조 방법.
swInfA 프라이머 쌍인 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, swH1 프라이머 쌍인 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, MP 프라이머 쌍인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 단일 단계의 복합 RT-PCR이 가능한 타미플루 민감성 신종인플루엔자 A 진단 키트:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트.
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트.
swInfA 프라이머 쌍인 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, swH1 프라이머 쌍인 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, MP 프라이머 쌍인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 및, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 단일 단계의 복합 RT-PCR이 가능한 타미플루 내성 신종인플루엔자 A 진단 키트:
a) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
a) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
swInfA 프라이머 쌍인 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, swH1 프라이머 쌍인 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, MP 프라이머 쌍인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 하기 a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트:
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트, 및
하기 d) 내지 f)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 단일 단계의 복합 RT-PCR이 가능한 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A 동시 진단 키트:
d) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
e) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
f) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
a) 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 프라이머 세트;
b) 서열번호 8 및 서열번호 17로 구성된 프라이머 세트; 및
c) 서열번호 8 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 세트, 및
하기 d) 내지 f)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 단일 단계의 복합 RT-PCR이 가능한 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 A 동시 진단 키트:
d) 서열번호 8 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트;
e) 서열번호 8 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트; 및
f) 서열번호 8 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트.
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|---|---|---|---|
| PCT/KR2012/000974 WO2012108706A2 (ko) | 2011-02-09 | 2012-02-09 | 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 ａ（ｈ１ｎ１）동시 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110011651 | 2011-02-09 | ||
| KR20110011651 | 2011-02-09 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101165600B1 true KR101165600B1 (ko) | 2012-07-23 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110094661A KR101165600B1 (ko) | 2011-02-09 | 2011-09-20 | 타미플루 민감성 및 내성 신종인플루엔자 ａ（ｈ１ｎ１）동시 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101165600B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102218980B1 (ko) * | 2019-09-18 | 2021-02-23 | 한국생명공학연구원 | 오셀타미비르 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000342268A (ja) | 1999-06-02 | 2000-12-12 | Meiji Seika Kaisha Ltd | アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法及びそのキット |
-
2011
- 2011-09-20 KR KR1020110094661A patent/KR101165600B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000342268A (ja) | 1999-06-02 | 2000-12-12 | Meiji Seika Kaisha Ltd | アンピシリン耐性インフルエンザ菌の検査法及びそのキット |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Antiviral Research. 2009, Volume 82, No. 1, pp. 29-33.* |
| Journal of Virological Methods. 2010, Volume 170, Issues 1-2, pp. 165-168.* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102218980B1 (ko) * | 2019-09-18 | 2021-02-23 | 한국생명공학연구원 | 오셀타미비르 내성 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 |
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