KR101119879B1

KR101119879B1 - 캐놀라 단백질 분리조성물

Info

Publication number: KR101119879B1
Application number: KR1020047016637A
Authority: KR
Inventors: 로지제임스; 밀라노바래드카
Original assignee: 버콘 뉴트라사이언스 (엠비) 코포레이션
Priority date: 2002-04-15
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2012-04-12
Also published as: US7662922B2; CN1658763A; CA2481936C; HK1081814A1; JP2005522522A; US20100063255A1; KR20050011748A; RU2004133342A; CN1658763B; BR0309207A; WO2003088760A1; NZ536228A; AU2003218931A1; RU2343711C2; JP4663989B2; AU2003218931B2; ZA200408656B; US20040034200A1; US20050249828A1; CA2481936A1

Abstract

새로운 캐놀라 단백질 분리물이 새로운 캐놀라 단백질과 함께 제공된다. 새로운 캐놀라 단백질 분리물은 캐놀라 단백질 교질 입자(micellar) 덩어리의 생성으로부터의 상층액에서 수득되며, 주로 2S 단백질을 함유한다. PMM으로부터 유래된 캐놀라 단백질 분리물은 주로 7S 단백질을 함유한다. 캐놀라 단백질 분리물의 조성물들이 제공된다.

캐놀라 단백질 분리물, 캐놀라 단백질, 2S, 7S 및 12S 단백질

Description

캐놀라 단백질 분리조성물{Canola protein isolate compositions}

본 발명은 캐놀라 단백질 분리조성물 및 이러한 조성물들의 개별 단백질성분에 관한 것이다.

캐놀라 단백질 분리물은 캐놀라 기름 씨의 거친 가루(meal)로부터 형성될 수 있다. 함께 계류 중이며 이 출원의 출원인에게 모두 양도되고 그들의 개시내용이 참조로써 여기에 포함되어 있는 2001년 5월 4일자 미국 특허출원 제60/288,415호, 2001년 10월 5일자 특허출원 제60/326,987호, 2001년 11월 7일자 특허출원 제60/331,066호, 2001년 11월 26일자 특허출원 제60/333,494호, 2002년 4월 24일자 출원의 출원번호 제60/374,801호, 및 2002년 5월 3일자 출원의 출원번호 제10/137,391호에는, 캐놀라 기름 씨의 거친 가루로부터 적어도 100wt%의 단백질 함량(N x 6.25)을 가지는 캐놀라 단백질 분리물을 만드는 방법이 개시되어 있다. 그 과정은 염 용액을 이용하여 캐놀라 기름 씨의 거친 가루를 추출하는 단계, 수득된 단백질 수용액을 잔류하는 기름 씨 거친 가루로부터 분리하는 단계, 선택적 박막기법을 이용하여 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 수용액의 단백질 농도를 적어도 약 200g/L까지 증가시키는 단계, 수득된 농축 단백질 용액을 냉수로 희석하여 단백질 교질 입자 (micelles)이 형성되게 하는 단계, 단백질 교질 입자를 침전시켜 무정형인 점착성 젤라틴질 글루텐형 단백질 교질 입자 덩어리(protein micellar mass; PMM)를 형성하는 단계, 및 상층액(supernatant)으로부터 켈달 질소 (N)×6.25에 의해 결정된 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지는 단백질 교질 입자 덩어리를 상층액으로부터 회수하는 단계를 포함하는 다단계의 공정을 포함한다. 여기서 사용되는 단백질 함량은 건조 중량에 기초하여 결정된다. 회수된 PMM은 건조될 수도 있다.

상술하고, 특히 미국 특허출원 제60/326,987호, 제60/331,066호, 제60/333,494호, 제60/374,801호 및 제10/137,391호에서 기술된 바와 같은 공정의 하나의 구체예에서는, PMM 침전단계로부터의 상층액은 젖은 PMM과 상층액으로부터 건조된 단백질을 포함하는 단백질 분리물을 회수하기 위해 처리된다. 이 과정은 우선 한외여과 막을 사용하여 상층액을 농축하고, 농축된 상층액을 젖은 PMM과 혼합하고 그 혼합물을 건조시킴으로써 수행될 수 있다. 수득된 캐놀라 단백질 분리물은 적어도 약 90wt%의 단백질(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질(N x 6.25)의 높은 순도를 가진다.

상술하고, 특히 미국 특허출원 제60/333,494호, 제60/374,801호 및 제10/137,391호에서 기술된 바와 같은 공정의 다른 구체예에서는, PMM 침전단계로부터의 상층액은 상층액으로부터 단백질을 회수하도록 처리된다. 이 과정은 우선 상층액을 한외여과 막을 사용하여 농축시키고, 농축물을 건조시킴으로써 수행될 수 있다. 수득된 캐놀라 단백질 분리물은 적어도 약 90wt%의 단백질(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질(N x 6.25)의 높은 순도를 가진다.

전술한 미국 특허출원에 기재된 과정들은 본질적으로 배취식 과정이다. 함께 계류 중이며 이 출원의 출원인에게 모두 양도되고 그것들의 개시내용이 참조로써 여기에 포함된 2001년 11월 20일자 미국 특허출원 제60/331,646호, 2002년 5월 30일자 특허출원 제60/383,809호 및 2002년 11월 19일자 특허출원 제10/298,678호에는, 캐놀라 단백질 분리물을 만들기 위한 연속공정이 기재되어 있다. 그에 따르면, 캐놀라 기름 씨의 거친 가루는 염 용액과 연속적으로 혼합되며, 그 혼합물은 파이프를 통해 운반되면서 캐놀라 기름 씨의 거친 가루로부터 단백질이 추출되어 단백질 수용액이 형성되며, 단백질 수용액은 잔류하는 캐놀라 기름 씨 거친 가루로부터 연속적으로 분리되며, 그 단백질 수용액은 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 단백질 수용액의 단백질 함량을 적어도 약 200g/L까지 증가시키기 위해 선택적인 박막작업을 통해 연속적으로 운반되고, 수득된 농축 단백질 용액은 냉수와 연속적으로 혼합되어 단백질 교질 입자가 형성되게 하고, 원하는 양의 PMM이 침전용기에 축적될 때까지 상층액이 계속 넘쳐흐르게 하면서 단백질 교질 입자들은 계속 침전되도록 한다. PMM은 침전용기로부터 분리하여 건조시킬 수 있다. PMM은 켈달 질소(N) x 6.25에 의해 결정된 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 100wt%(N x 6.25)의 단백질 함량을 가진다.

전술한 미국 특허출원 제60/326,987호, 제60/331,066호, 제60/333,494호, 제60/374,801호, 및 제10/137,391호에서 기재된 바와 같이, 넘쳐흐르는 상층액은 그것으로부터 캐놀라 단백질 분리물을 회수하도록 처리되 수 있다.

캐놀라 씨는 약 10 내지 약 30wt%의 단백질들을 함유한다고 알려져 있고, 몇몇 다른 단백질 성분들이 확인되고 있다. 이러한 단백질은 다른 침강계수(sedimentation coefficients; S)에 의해 구분된다. 이러한 알려지고 확인된 단백질에는 크루시페린(cruciferin)으로 알려진 12S 글로블린과, 네핀(napin)으로 알려진 2S 저장 단백질이 포함된다.

캐놀라는 평지씨(rapeseed) 또는 기름 씨 평지(oil seed rape)라고도 알려져 있다.

12S 및 2S 단백질 이외에, 본 발명자들은 캐놀라 단백질 분리물의 분리를 위한 상술한 과정들이 새로운 단백질이라고 여겨지는 7S 단백질의 상당한 량을 생산함을 밝혀내었다. 따라서 본 발명의 한가지 관점에서는, 캐놀라의 분리 정제된 7S 단백질이 제공된다.

본 발명자들은 또한, 단백질 교질 입자 덩어리-유래 캐놀라 단백질 분리물과 전술한 과정들을 이용하여 제조된 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물 간에는 12S, 7S 및 2S 단백질들의 상대비율들이 서로 다르다는 것을 밝혀내었다. 특히, 적어도 약 90wt%(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지는 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물이 약 60 내지 약 98wt%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 15wt%의 12S 단백질 및 0 내지 약 25wt%의 2S 단백질의 단백질 성분 함량을 가짐을 밝혀내었다. 반면에, 적어도 약 90wt%(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지는 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 0 내지 약 5wt%의 12S 단백질, 약 5 내지 약 40wt%의 7S 단백질 및 약 60 내지 약 95wt%의 2S 단백질을 가진다.

PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는 약 88 내지 약 98wt%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 10wt%의 12S 단백질 및 0 내지 약 6wt%의 2S 단백질의 단백질 성분 함량을 가지는 반면, 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는 약 70 내지 약 95wt%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 30wt%의 7S 단백질 및 0 내지 약 2wt%의 12S 단백질의 단백질 성분 함량을 가진다.

따라서, 단백질 성분 프로파일은 두 가지 캐놀라 단백질 분리물에 대해 매우 다르다. PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물의 경우에 우세한 단백질 종은 7S 단백질인 반면, 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물의 경우에 우세한 단백질 종은 2S 단백질이다. 이러한 차이는 캐놀라 단백질 분리물들이 적용되는 환경에서 다른 작용(behaviour)을 하게 한다.

다른 단백질 함량 프로파일은, 2개의 다른 캐놀라 단백질 분리물의 혼합물들이 특정 응용을 위해서 원하는 어떤 비율로나 조합되어 PMM-유래 분리물의 프로파일과 상층액-유래 분리물의 프로파일 사이의 원하는 어떤 2S/7S/12S 단백질 프로파일을 제공하도록 하는 캐놀라 단백질 분리 조성물이 제공될 수 있게 한다.

상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 신규한 캐놀라 단백질 분리물이다. 따라서, 본 발명의 다른 관점에서는, 건조 중량 기준으로 N x 6.25의 켈달 질소 변환 시에 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지며, 약 60 내지 약 95wt%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 40wt%의 7S 단백질 및 0 내지 약 5wt%의 12S 단백질로 되는 단백질 프로파일을 나타내는 캐놀라 단백질 분리물이 제공된다. 바람직하게는, 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는 약 70 내지 약 95wt%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 30wt%의 7S 단백질 및 0 내지 약 2wt%의 12S 단백질로 되는 단백질 프로파일을 나타낸다.

어떤 원하는 비율의 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리 생성물과 어떤 원하는 비율의 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리 생성물의 조합은 신규한 캐놀라 단백질 분리 조성물인 원하는 비율의 2S, 7S 및 12S 캐놀라 단백질을 함유하는 조성물을 제공한다. 따라서 다른 관점에서, 본 발명은 (1) 건조 중량 기준으로 N x 6.25의 켈달 질소 변환 시에 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지며, 약 60 내지 약 98wt%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 15wt%의 12S 단백질 및 0 내지 약 25wt%의 2S 단백질로 되는 단백질 프로파일을 나타내는 제1 캐놀라 단백질 분리물, 및 (2) 건조 중량 기준으로 N x 6.25의 켈달 질소 변환 시에 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질 함량을 가지며, 약 60 내지 약 95wt%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 40wt%의 7S 단백질 및 0 내지 약 5wt%의 12S 단백질로 되는 단백질 프로파일을 나타내는 제2 캐놀라 단백질 분리물을 포함하는 캐놀라 단백질 분리 조성물을 제공한다.

제1 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는 약 88 내지 약 98wt%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 10wt%의 12S 단백질 및 0 내지 약 6wt%의 2S 단백질로 되는 단백질 프로파일을 나타낸다. 제2 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는 여기에 기술된 신규한 캐놀라 단백질 분리물의 바람직한 단백질 프로파일을 나타낸다.

특정 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물 및/또는 특정 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물에서의 12S/7S/2S의 비율에서의 변화는 캐놀라 기름 씨의 거친 가루로부터 각각의 캐놀라 단백질 분리물을 유도하는데 사용되는 공정 조건을 변화시킴으로써 달성될 수 있다.

캐놀라 단백질 분리물의 개별 성분들은 분리, 정제 및 특성화되었다. 개별 단백질들은 위에서 설명된 과정들에 따라 생산된 각각의 PMM- 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터 어떤 통상적인 과정에 의해서라도 분리될 수 있으며, 따라서 단백질 혼합물은 크기 차이에 기초하여, 바람직하게는 조제용(preparative) 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography; HPLC) 및 그에 이어서 용리액(용리제; eluant)의 부피를 감소시키기 위한 한외여과 및 잔류하는 가용화 염의 함량을 감소시키기 위한 투석(dialysis)에 의해서 분리될 수 있다. 투석된 물질은 건조시켜 순수 단백질을 분리시킬 수 있다.

본 발명에 기술된 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물을 포함하는, 2S, 7S 및 12S 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 다른 캐놀라 단백질의 혼합물을 함유하는 캐놀라 단백질 분리물로부터 개별 캐놀라단백질을 분리 및 정제하는 과정은 본 발명의 추가 관점을 구성한다.

통상 2S 단백질은 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터 분리 및 정제되는 반면, 7S 및 12S 단백질은 통상 단백질 교질 입자 덩어리로부터 분리 및 정제된다. 2S 단백질은 MALDI-MS에 의해 결정된 것으로서 약 14kDa의 분자량을 가지며, 7S 단백질은 MALDI-MS에 의해 결정된 것으로 약 145kDa의 분자량을 가지고, 12S 단백질은 MALDI-MS에 의해 결정된 것으로 약 290kDa의 분자량을 가진다.

7S 및 12S 단백질은 매우 유사한 아미노산 프로파일을 가지며, 각각 대략 413개의 아미노산을 함유하는 다수의 동일 소단위체(subunits)로 이루어진다. 7S 단백질은 대략 1240개의 아미노산을 함유하는 반면 12S 단백질은 대략 2480개의 아미노산을 함유한다. 2S 단백질은 7S 및 12S 단백질들과는 매우 다른 아미노산 프로파일을 가지고, 대략 120개의 아미노산을 함유한다. 수득된 아미노산 프로파일은 이하의 실시예에 기술된다.

분리 및 정제된 개별적인 2S, 7S 및 12S 캐놀라 단백질의 제공은 정제된 단백질들의 활용 시에 독특한 기능성을 가질 수 있는 조성물을 제공하기 위해서 7S 단백질과 다양한 비율의 12S 및/또는 2S 단백질과의 조성물이 생성될 수 있도록 한다. 이러한 조성물들은 본 발명의 다른 관점을 구성한다.

본 발명의 공정에 따라 생산된 캐놀라 단백질 분리물은 가공 식품의 단백질 보강, 기름의 유화, 구운 물건의 바디 (body) 형성제 및 기체를 포획하는 제품의 발포제와 같은 단백질 분리물의 통상적인 적용분야에서 사용될 수 있다. 그에 더하여, 캐놀라 단백질 분리물은 고기 유사물에 유용한 단백질 섬유로 형성될 수 있고, 달걀 흰자가 결합제로서 사용되는 식품에서 달걀 흰자 대체물 또는 증량제(extender)로서 사용될 수 있다. 캐놀라 단백질 분리물은 영양 보충물로 사용될 수도 있다. 캐놀라 단백질 분리물의 다른 용도는 애완동물 사료, 동물 사료, 및 산업적 및 화장품 적용분야, 및 개인용 위생 제품에서의 용도이다. 분리 및 정제된 개별적인 단백질은 유사한 용도에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 한가지 구체예에 따르는, 상이한 단백질 프로파일을 갖는 캐놀라 단백질 분리물을 생산하기 위한 과정의 개략적인 공정도이다.

도 2는 본 발명의 또 다른 구체예에 따르는, 상이한 단백질 프로파일을 갖는 캐놀라 단백질 분리물을 생산하기 위한 연속 공정의 개략적인 공정도이다.

도 3 내지 도 5는 낮은 온도의 거친 가루로부터의 추출물의 분석용 HPLC 크로마토그램이다.

도 6 및 도 7은 개별적인 2S, 7S 및 12S 캐놀라 단백질의 수집을 위한 7개의 연속적인 조제용 HPLC 실행결과들을 겹쳐서 보여준다.

발명의 개괄적 설명

개별적인 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물과 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 전술한 미국 특허출원에 개괄적으로 기재된 바와 같은 배취식 공정 또는 연속 공정 또는 반-연속 공정에 의해 캐놀라 기름 씨의 거친 가루로부터 분리될 수 있다.

캐놀라 단백질 분리물을 제공하는 공정의 초기 단계는 캐놀라 기름 씨 거친 가루로부터 단백질성 물질을 가용화시키는 것을 포함한다. 캐놀라 씨 거친 가루로부터 회수된 단백질성 물질은 캐놀라 씨 또는 다른 기름 씨에 천연적으로 존재하는 단백질일 수 있거나, 단백질성 물질은 유전자 조작에 의해 변형되었지만 천연 단백질의 특징적인 소수성 및 극성 특성 보유하는 단백질일 수 있다. 캐놀라 거친 가루는 예를 들어, 열 헥산 추출법 또는 냉 기름 압출법에 의해서 제공되는, 다양한 레벨의 비변성 단백질을 갖는 캐놀라 기름 씨로부터 캐놀라 기름을 제거함으로써 제공되는 어떤 캐놀라 거친 가루라도 될 수 있다. 캐놀라 기름 씨로부터의 캐놀라 기름의 제거는 통상적으로, 본 발명에 기술된 단백질 분리물 회수 공정과는 별개의 작업으로 수행된다.

단백질 가용화는, 염의 존재가 기름 씨 거친 가루로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키므로 식품 등급의 염 용액을 사용하여 가장 효율적으로 수행된다. 캐놀라 단백질 분리물이 비-식품적 용도를 위한 것인 경우에는, 비-식품 등급의 화학물질이 사용될 수 있다. 염은 통상적으로 염화나트륨이지만, 염화칼륨과 같은 다른 염이 사용될 수도 있다. 염 용액은 적어도 약 0.10, 바람직하게는 적어도 약 0.15의 이온 강도를 가져서 상당한 양의 단백질의 가용화가 이루어질 수 있도록 한다. 염 용액의 이온 강도가 증가함에 따라, 기름 씨 거친 가루 내의 단백질의 가용화 정도는 우선 최대값이 얻어질 때까지 증가한다. 이온 강도의 어떤 후속적인 증가라도 가용화된 전체 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 가용화를 야기하는 식품 등급의 염 용액의 이온 강도는 관련된 염과, 선택된 기름 씨 거친 가루에 따라 달라진다.

이온 강도를 증가시킴에 따라 단백질 침전에 더 큰 정도의 희석이 필요하다는 점을 고려하여, 통상적으로 약 0.8 미만의 이온 강도 값, 더욱 바람직하게는 약 0.15 내지 약 0.6의 값을 사용하는 것이 바람직이다.

배취식 공정에서, 단백질의 염 가용화는 적어도 약 5℃, 바람직하게는 약 35℃까지의 온도에서, 바람직하게는 통상적으로 약 10 내지 약 60 분인 가용화 시간을 감소시키기 위한 교반을 동반하여 수행된다. 가용화는 전반적으로 높은 생산 수율을 제공하기 위해 실질적으로 실행가능한 만큼 다량의 단백질이 기름 씨 거친 가루로부터 추출하도록 수행되는 것이 바람직하다.

약 5℃ 이하의 온도에서는 가용화가 실행 불가능하게 느리기 때문에, 약 5℃의 하한 온도가 선택되는 반면에, 배취식 모드에서 더 높은 온도 레벨에서는 공정이 비경제적이 되기 때문에 약 35℃의 바람직한 상한 온도가 선택된다.

연속 공정에서, 캐놀라 기름 씨 거친 가루로부터의 단백질의 추출은 캐놀라 기름 씨 거친 가루로부터 단백질의 연속 추출과 일치하는 어떤 방식으로나 수행된다. 한가지 구체예에서, 캐놀라 기름 씨 거친 가루는 식품 등급의 염 용액과 연속적으로 혼합되고, 그 혼합물은 여기에 기재된 매개변수에 따라 원하는 추출을 수행하기에 충분한 체류 시간 동안 충분한 길이 및 유속을 갖는 파이프 또는 도관을 통해서 운반된다. 이러한 연속 과정에서, 염 용해 단계는바람직하게는 실질적으로 실행가능한 만큼 다량의 단백질을 기름 씨 거친 가루로부터 추출하는 가용화를 수행하도록 약 10분까지의 시간 내에 신속하게 수행된다. 연속 과정에서의 가용화는 바람직하게는 상승된 온도에서, 바람직하게는 약 35℃ 이상, 일반적으로는 약 65℃까지의 온도에서 수행된다.

식품 등급 염 수용액과 캐놀라 기름 씨 거친 가루는 약 5 내지 약 6.8의 천연 pH를 가져서 이하에 더 상세히 기술되는 바와 같이 단백질 분리물이 교질 입자 루트에 의해 형성될 수 있도록 한다.

pH 범위의 한계 및 그 그 부근에서, 단백질 분리물의 형성은 pH 범위 내의 다른 경우에서 수득될 수 있는 것보다 더 낮은 수율로 교질 입자 루트를 통해서 단지 부분적으로 일어난다. 이러한 이유로, 약 5.3 내지 약 6.2의 약산성 pH 값이 바람직하다.

염 용액의 pH는 필요에 따라, 어떤 편리한 산, 통상적으로는 염산, 또는 알칼리, 통상적으로는 수산화나트륨을 사용함으로써 추출 단계에서의 사용을 위해 약 5 내지 약 6.8의 범위 내의 어떤 바람직한 값으로나 조정될 수 있다.

가용화 단계 중에 식품 등급 염 용액 중의 기름 씨 거친 가루의 농도는 광범위하게 변화할 수 있다. 전형적인 농도 값은 약 5 내지 약 15%w/v이다.

염 수용액에 의한 단백질 추출 단계는 캐놀라 거친 가루에 존재할 수 있는 지방을 가용화시키는 부가적인 효과를 가지고, 이는 지방이 수성상 내에 존재하도록 한다.

추출 단계로부터 얻어지는 단백질 용액은 일반적으로 약 5 내지 약 40g/L, 바람직하게는 약 10 내지 약 30g/L의 단백질 농도를 갖는다.

그 후 추출 단계로부터 제공되는 수성상은 진공 여과를 사용한 다음에 원심분리 및/또는 여과하여 잔류하는 거친 가루를 제거하는 것과 같은 어떤 편리한 방식에 의해서 잔류하는 캐놀라 거친 가루로부터 분리될 수 있다.

최종 캐놀라 단백질 분리물의 색깔은 분말형 활성 탄소 또는 다른 색소흡착제를 분리된 단백질 수용액을 혼합시키고, 이어서 흡착제를 편리하게는 여과에 의해 제거하여 단백질 용액을 제공함으로써 밝은 색상의 덜 강렬한 황색의 관점에서 개선될 수 있다. 투석여과(diafiltration)가 또한 색소 제거에 사용될 수 있다.

이러한 색소 제거 단계는 어떤 편리한 조건 하에, 일반적으로는 분리된 단백질 수용액의 주변 온도에서, 어떤 적절한 색소 흡착제를 사용하여 수행될 수 있다. 분말형 활성 탄소의 경우에는, 약 0.025 내지 약 5%w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 25%w/v의 양이 사용된다.

본 발명의 출원인에게 양도되고, 참고로 본 발명에 포함된 미국 특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호에 기술된 바와 같이, 캐놀라 씨 거친 가루가 상당한 양의 지방을 함유하는 경우에, 본 발명에 기술된 지방 제거 단계는 분리된 단백질 수용액에 대해서, 및 이하에 거론되는 농축 단백질 수용액에 대해서 수행될 수 있다. 색깔 개선 단계가 수행되는 경우에, 이러한 단계는 제1 지방 제거 단계 후에 수행될 수 있다.

염 수용액으로 기름 씨 거친 가루를 추출하는데 대한 대체예로서, 이러한 추출은 물만을 사용하여 이루어질 수 있지만, 물만을 이용하는 것은 염 수용액보다 기름 씨 거친 가루로부터 더 적은 단백질을 추출하는 경향이 있다. 이러한 대체예가 사용되는 경우에는, 이하에 기술되는 농축 단계 중에 용액 내의 단백질을 유지시키기 위해서, 잔류하는 기름 씨 거친 가루로부터 분리시킨 후의 단백질 용액에 염을 상기 거론된 농도로 첨가할 수 있다. 색깔 제거 단계 및/또는 제1 지방 제거 단계가 수행되는 경우에, 염은 일반적으로 이러한 조작의 완료 후에 첨가된다.

또 다른 대체 과정은 기름 씨 거친 가루를 약 6.8 이상의, 일반적으로는 약 9.9까지의 비교적 높은 pH 값에서 식품 등급의 염 용액으로 추출하는 것이다. 식품 등급의 염 용액의 pH는 수산화나트륨 수용액과 같은 어떤 편리한 식품-등급 알칼리를 사용함으로써 원하는 알칼리 값의 pH로 조정될 수 있다. 대신으로, 기름 씨 거친 가루는 약 pH 5 이하, 일반적으로는 약 pH 3까지 저하된 비교적 낮은 pH에서 염 용액으로 추출될 수 있다. 이러한 대체예가 사용되는 경우에, 기름 씨 거친 가루 추출 단계로부터 수득되는 수성상은 진공 여과를 사용한 다음에 원심분리 및/또는 여과하여 잔류하는 거친 가루를 제거하는 것과 같은 어떤 편리한 방식에 의해서 잔류하는 캐놀라 거친 가루로부터 분리된다. 분리된 잔류하는 거친 가루는 폐기를 위해 건조될 수 있다.

그 후 높거나 낮은 pH 추출 단계로부터 제공된 단백질 수용액은 이하에 거론된 바와 같은 추가의 처리 전에, 전술한 바와 같이 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 범위로 pH 조정된다. 이러한 pH 조정은 적절한 경우에, 염산과 같은 어떤 편리한 산, 또는 수산화나트륨과 같은 알칼리를 사용함으로써 수행될 수 있다.

그 후 단백질 수용액은 그의 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 그의 단백질 농도를 증가시키기 위해서 농축된다. 이러한 농축은 일반적으로 적어도 약 200g/L, 바람직하게는 적어도 약 250g/L의 단백질 농도를 갖는 농축 단백질 용액을 제공하도록 수행된다.

농축 단계는 배취식 또는 연속 조작에 부합되는 어떤 편리한 방식으로나 수행될 수 있는데, 이를테면 다양한 박막 재료 및 배열을 고려하여 약 3,000 내지 약 50,000 돌턴과 같은 적합한 분자량 컷-오프(cut-off)를 가지며, 연속 조작을 위해서는 단백질 수용액이 박막들을 통과함에 따라서 원하는 정도의 농도이 이루어지도록 하는 크기로 되는 중공-섬유 박막 또는 나선형-권취된(spiral-wound) 박막과 같은 박막을 사용하여 한외여과 또는 투석여과와 같은 어떤 편리한 선택적 박막기법을 사용함으로써 수행될 수 있다.

농축 단계는 어떤 편리한 온도, 일반적으로는 약 20℃ 내지 약 60℃에서, 원하는 정도의 농축이 이루어지는 기간 동안 수행될 수 있다. 사용된 온도 및 다른 조건들은 어느 정도는 농축을 수행하는데 사용된 박막 설비 및 용액의 원하는 단백질 농도에 따라 좌우된다.

이 단계에서 약 200g/L 이상의 농도로 단백질 용액을 농축시키는 것은 건조된 단백질 분리물로서 회수되는 추출된 단백질의 비율로 환산하여 약 40% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상의 수준까지 공정 수율을 증가시킬 뿐만 아니라, 건조 후의 최종 단백질 분리물의 염 농도를 감소시키기도 한다. 분리물의 염 농도를 조절하는 능력은 염 농도의 변화가 특정 식품 적용분야에서의 기능성 및 지각성에 영향을 미치는 분리물의 적용분야에서 중요하다.

잘 알려진 바와 같이, 한외여과 및 유사한 선택적 박막기법은 낮은 분자량의 종(species)은 그들을 통해서 통과하게 하면서 높은 분자량의 종은 통과하는 것을 방지한다. 낮은 분자량의 종은 염의 이온성 종뿐만 아니라 탄수화물, 색소 및 반-영양인자(anti-nutritional factor)와 같은 원료로부터 추출된 저분자량 물질 및 단백질의 모든 저분자량 형태도 포함한다. 박막의 분자량 컷-오프는 통상적으로, 다양한 박막 재료 및 배열을 고려하여 불순물은 통과하도록 허용하면서도 단백질의 상당한 비율은 용액 중에 보존되는 것이 보장되도록 선택된다.

농축 단계에서 사용되는 온도에 따라, 농축된 단백질 용액은 적어도 약 20℃, 약 60℃까지, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도로 가온하여 후속하는 희석 단계 및 교질 입자 형성의 수행이 용이하도록 농축 단백질 용액의 점도를 감소시킬 수 있다. 농축 단백질 용액은 농축 단백질 용액의 온도가 냉수에 의한 희석 시에 교질 입자 형성을 허용하지 않는 온도를 넘기까지 가열되지 않아야 한다. 농축 단백질 용액은 필요하다면, 미국 특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호에 기술된 바와 같이 추가의 지방 제거 조작을 받을 수 있다.

농축 단계 및 임의의 지방 제거 단계로부터 제공된 농축 단백질 용액은, 농축 단백직 용액을 원하는 희석 정도를 달성하는데 필요한 체적을 갖는 냉수와 혼합시킴으로써 교질 입자 형성이 이루어지도록 희석된다.

교질 입자 루트에 의해 얻어지도록 요망된 캐놀라 단백질의 비율 및 상층액으로부터의 비율에 따라, 농축 단백질 용액의 희석 정도는 변화될 수 있다. 일반적으로, 희석 수준이 높을수록 더 큰 비율의 캐놀라 단백질이 수성상에 잔류한다.

교질 입자 루트에 의해 단백질의 최고 비율을 제공하는 것이 바람직한 경우에, 농축 단백질 용액은 약 15배 또는 그 미만까지, 바람직하게는 약 10배 또는 그 미만까지 희석된다.

농축 단백질 용액과 혼합되는 냉수는 약 15℃ 미만, 일반적으로는 약 3℃ 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 10℃ 미만의 온도를 가지는데, 이것은 단백질 교질 입자 덩어리 형태의 단백질 분리물의 개선된 수율이 사용된 희석 인자에서 이들 더 낮은 온도에 의해서 달성되기 때문이다.

배취식 작업에서, 농축 단백질 용액의 배취는 상기 거론한 바와 같이 원하는 체적을 가지는 냉수의 정적 바디 (static body)에 첨가된다. 농축 단백질 용액의 희석 및 결과적인 이온 강도의 감소는 교질 입자 형태인 불연속적인 단백질 소적 형태의 고도로 결합된 단백질 분자의 구름-양 덩어리의 형성을 야기한다. 배치식 과정에서, 단백질 교질 입자들은 냉수의 바디 내에서 침전되어 집합되고, 합체되고, 조밀하고 무정형인 점착성 글루텐-양 단백질 교질 입자 덩어리(PMM)를 형성한다. 침전은 원심분리 등에 의해 도움을 받을 수 있다. 이렇게 유도된 침전은 단백질 교질 입자 덩어리의 액체 함량을 감소시켜, 전체 교질 입자 덩어리의 수분 함량을 일반적으로 약 70중량% 내지 약 95중량%로부터 일반적으로 약 50중량% 내지 약 80중량%로 감소시킨다. 이런 방식으로 교질 입자 덩어리의 수분 함량을 감소시키는 것은 또한, 교질 입자 덩어리의 내포된 염 함량을 감소시키고, 따라서 건조된 분리물의 염 함량을 감소시킨다.

대신으로, 희석 작업은 T-자형 파이프의 하나의 입구에 농축 단백질 용액을 계속 통과시키면서 희석수를 T-자형 파이프의 다른 입구에 공급하여 파이프 내에서 혼합이 이루어지도록 함으로써 연속적으로 수행될 수 있다. 희석수는 원하는 정도의 희석을 달성하기에 충분한 속도로 T-자형 파이프 내로 공급된다.

파이프 내에서의 농축 단백질 용액 및 희석수의 혼합은 단백질 교질 입자의 형성을 개시시키며, 그 혼합물은 T-자형 파이프의 출구로부터 침전용기에 계속 공급되어, 침전용기가 가득 차면 상층액은 넘쳐흐르게 된다. 혼합물은 바람직하게는 액체의 바디 내에서의 난류를 최소화하는 방식으로 침전용기 내의 액체 바디 내로 공급된다.

연속과정에서, 단백질 교질 입자는 침전용기 내에 침전되어 집합되고, 합체되고, 조밀하고 무정형인 점착성 글루텐-양 단백질 교질 입자 덩어리(PMM)를 형성하며, 그 과정은 원하는 양의 PMM이 침전용기의 바닥에 축적될 때까지 계속되고, 그리고 나서 축적된 PMM은 침전용기로부터 제거된다.

단백질 용액을 적어도 약 200g/L의 단백질 함량까지 농축하는 공정 매개변수와 약 15 미만의 희석계수(dilution factor)의 사용의 조합은 원래의 거친 가루 추출물로부터 단백질 교질 입자 덩어리의 형태로 단백질을 회수하는 관점에서 더 높은 수율, 종종 상당히 더 높은 수율을 제공하고, 단백질 함량의 관점에서는 전술한 미국 특허에서 논의된 공지된 선행기술의 단백질 분리물 형성 과정 중의 어느 것을 사용하여 얻어지는 것에 비해 훨씬 더 순수한 분리물을 제공한다.

배취식 공정에 비해서 캐놀라 단백질 분리물의 회수를 위해 연속공정을 사용함으로써 초기 단백질 추출 단계는 동일 수준의 단백질 추출을 위해서 시간이 상당히 줄어들 수 있고, 상당히 더 높은 온도가 추출 단계에서 사용될 수 있다. 그에 더하여, 연속 작업에서는, 배취식 작업에서보다 오염의 기회가 더 적어서 더 높은 생산 품질을 제공하고, 공정은 더욱 컴팩트한 설비에서 수행될 수 있다.

침전된 분리물은 침전된 덩어리로부터 잔류하는 수성상을 경사시키거나, 원심분리시키는 것과 같은 방법에 의해서 잔류하는 수성상 또는 상층액으로부터 분리된다. PMM은 젖은 형태로 사용될 수 있거나, 분무 건조, 동결 건조 또는 진공 드럼 건조와 같은 어떤 편리한 기술에 의해서나 건조 형태로 건조될 수 있다. 건조 PMM은 약 90wt%의 단백질을 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질(켈달 N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질 함량을 가지고, 실질적으로는 비변성된다(시차주사열계량법(differential scanning calorimetry)에 의해 결정됨). 지방질의 기름 씨 거친 가루로부터 분리된 건조 PMM은 또한, 미국 특허 제5,844,086호 및 제6,005,076호의 과정을 사용하는 경우에 약 1wt%이하일 수 있는 낮은 잔류 지방 함량을 갖는다.

PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물은 주로 7S 캐놀라 단백질과 미량의 12S 캐놀라 단백질, 및 임의로 소량의 2S 캐놀라 단백질로 구성된다. 일반적으로, PMM은

약 60 내지 약 98wt%의 7S 단백질,

약 1 내지 약 15wt%의 12S 단백질,

0 내지 약 25wt%의 2S 단백질을 함유한다.

바람직하게는, PMM은

약 88wt% 내지 약 98wt%의 7S 단백질,

약 1 내지 약 10wt%의 12S 단백질,

0 내지 약 6wt%의 2S 단백질을 함유한다.

PMM 형성 및 침전 단계로부터의 상층액은 희석 단계에서 침전되지 않은 상당한 양의 캐놀라 단백질을 함유하고, 그것으로부터 캐놀라 단백질 분리물을 회수하도록 처리된다.

PMM의 제거 후에 희석 단계로부터의 상층액은 그의 단백질 농도를 증가시키기 위해 농축된다. 이러한 농축은 용액 중의 캐놀라 단백질을 유지시키면서, 단백질 원료 물질로부터 추출된 염 및 다른 비-단백질성 저분자량 물질을 포함한 저분자량의 종이 박막을 통해서 통과하도록 허용하는 적합한 분자량 컷-오프를 갖는 박막을 사용하여 한외여과와 같은 어떤 편리한 선택적 박막기법이라도 사용하여 수행된다. 상이한 박막 재료 및 배열을 고려하여 약 3,000 내지 약 10,000돌턴의 분자량 컷-오프를 갖는 한외여과 박막이 사용될 수 있다. 이런 식의 상층액의 농축은 또한, 단백질을 회수하기 위해 건조되는 것이 필요한 액체의 체적을 감소시킨다. 일반적으로, 상층액은 건조 전에 약 100 내지 약 400g/L, 바람직하게는 약 200 내지 약 300g/L의 단백질 농도로 농축된다. 이러한 농축 작업은 단백질 용액 농축 단계에 관해 위에서 기재된 바와 같이, 배취식 모드로, 또는 연속 작업으로 수행될 수 있다.

농축된 상층액은 분무 건조, 동결 건조 또는 진공 드럼 건조와 같은 어떤 편리한 기법에 의해서나 건조 형태로 건조시켜 추가의 캐놀라 단백질 분리물을 제공할 수 있다. 이러한 추가의 캐놀라 단백질 분리물은 약 90wt%를 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질(켈달 N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질 함량을 가지고, 실질적으로 비변성된다(시차주사열계량법에 의해 결정됨).

건조된 상층액은 주로 2S 캐놀라 단백질과 미량의 7S 캐놀라 단백질, 및 임의로 소량의 12S 캐놀라 단백질로 구성된다. 일반적으로, 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은

약 60 내지 약 95wt%의 2S 단백질,

약 5 내지 약 40wt%의 7S 단백질,

0 내지 약 5wt%의 12S 단백질을 함유한다.

상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물은 바람직하게는,

약 70 내지 약 95wt%의 2S 단백질,

약 5 내지 약 30wt%의 7S 단백질,

0 내지 약 2wt%의 12S 단백질을 함유한다.

바람직하다면, 젖은 PMM의 적어도 일부분을 어떤 편리한 기법에 의해서 조합된 단백질 흐름을 건조시키기 전에 농축된 상층액의 적어도 일부분과 혼합시켜 하나의 발명에 따른 조합된 캐놀라 단백질 분리 조성물을 제공할 수 있다. 함께 혼합된 단백질성 물질의 상대적 비율은 2S/7S/12S 단백질들의 바람직한 프로파일을 갖는, 생성된 캐놀라 단백질 분리 조성물을 제공하도록 선택될 수 있다. 대신으로, 건조된 단백질 분리물은 혼합물에서 어떤 바람직한 특정의 2S/7S/12S 단백질 프로파일을 제공하도록 어떤 바람직한 비율로나 조합될 수 있으며, 이에 의해서 본 발명에 따르는 조성물을 제공한다. 조합된 캐놀라 단백질 분리 조성물은 약 90wt%를 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100wt%(켈달 N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질 함량을 가지고, 실질적으로 비변성된다(시차주사열계량법에 의해 결정됨).

또 다른 대체 과정에서, 단지 농축된 상층액의 일부만을 PMM의 단지 일부와 혼합시키고, 생성된 혼합물을 건조시키는 경우에, 농축된 상층액의 나머지는 PMM의 나머지의 일부가 그런 것처럼 건조될 수 있다. 게다가, 건조된 PMM 및 건조된 상층액은 또한 위에서 논의된 것처럼 어떤 바람직한 상대적 비율로나 건조 혼합될 수 있다.

이런 방식으로 작업함으로써, 다수의 캐놀라 단백질 분리물이 건조된 PMM, 건조된 상층액, 및 조성물 내의 2S/7S/12S 단백질의 상이한 비율을 기초로 하여 상이한 기능성 및 영양적 특성을 수득하는데 바람직할 수 있는 다양한 중량비, 일반적으로 약 5:95 내지 약 95:5인 중량비로 된 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물의 건조된 혼합물들의 형태로 회수될 수 있다.

상술한 바와 같이 농축된 단백질 용액을 냉수로 희석하고, 생성된 침전물과 상층액을 처리하는 것에 대한 대체예로서, 단백질은 농축된 단백질 용액을 투석하여 그의 염 함량을 감소시킴으로써 농축된 단백질 용액으로부터 회수될 수 있다. 농축 단백질 용액의 염 함량의 감소는 투석 튜빙(tubing)에서 단백질 교질 입자의 형성을 야기한다. 투석 후에, 단백질 교질 입자는 상기 언급한 바와 같이 침전되며, 수집되고 건조될 수 있다. 단백질 교질 입자 침전 단계로부터의 상층액은 상기 언급한 바와 같이 처리되어 이들로부터 추가의 단백질을 회수할 수 있다. 대신으로, 투석 튜빙의 내용물은 직접 건조될 수 있다. 후자의 대체적인 과정은 작은 실험실 규모의 단백질의 량이 요구될 때 유용하다.

어떤 소정의 단백질 분리물에서 각각의 단백질의 상대적인 양은 분석용 분리기법과 같은 어떤 편리한 분석기법에 의해서라도 결정될 수 있다. 이러한 기법 중의 가장 통상적인 것은 크기에 기초한 분리를 가능케 하는 칼럼(column) 내의 선택적 매질을 사용한다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 용용의 경우, 구형의 겔-유사 재료들이 사용된다. 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에서와 같이 압력이 사용되는 경우에는, 강성 매질이 사용된다. 후자의 기법은 또한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)라고 알려져 있다. 본 발명에 기술된 바와 같이 제조된 캐놀라 단백질 분리물의 샘플에 대해 이러한 기법들을 이용하여 얻어진 결과물들은 이하의 실시예에 포함된다.

질량분석법(mass spectroscopy; MS)의 과정은 여기에 기재된 캐놀라의 2S, 7S 및 12S 단백질을 포함한 단백질 샘플을 식별 및 분석하는데 사용될 수 있다. 전자 분무 이온화(electron spray ionization; ESI) 질량분석법에서, 단백질은 저에너지 전자들로 충격을 주고, 충돌로 형성된 하전된 단편 또는 종들이 검출된다. 특히, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화(matrix assisted laser desorption ionization; MALDI) 질량분석계가 사용될 수 있으며, 여기에서는 특정 분자 매트릭스를 함유하는 분석용 재료의 건조 샘플을 레이저 증발이 있다. 이 매트릭스는 분석 하의 이원고분자(bipolymer)를 충분히 보호하여 레이저 충격 에너지로부터 생성되는 이온화된 종들의 수를 감소시키는 호환성의 소분자량 유기 분자를 함유한다.

여기에 기재된 바와 같이 단백질 분리물 샘플로부터 도출된 데이터는 2S 단백질이 ESI-MS에 의한 전자 충격에 안정하지 않고, 4kDa, 10kDa 및 21kDa 종을 포함한 수많은 폴리펩티드 단편들로 쉽게 조각난다. 그러나 MALDI-MS를 사용하면 14,000돌턴에 가까운 분자 질량을 갖는 온전한 2S 분획(fraction)이 생성된다.

PMM-유래 단백질 분리물의 7S 단백질 또한 ESI-MS의 전자 충격에 대한 분자 불안정성을 시사하는 많은 수의 서브-10kDa 단편을 생산하였다. 그에 더하여, 21kDa 종이 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터의 7S 단백질의 분석에서 확인되었지만, 이 종은 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터의 7S 단백질에는 없었다.

또한 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터의 7S 단백질의 ESI-MS분석은 126 내지 166kDa 범위의 6개의 단백질 분자 질량을 나타내었던 반면 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터의 7S 단백질은 167kDa의 하나의 큰 종을 나타내었다.

여기에 기재된 MALDI-MS 분석 결과는 2S 단백질이 13,960과 14,250Da 사이의 분자 질량을 나타내고, 약산 처리에 대해 상당한 내성이 있다는 것을 보여준다. 7S 및 12S 단백질은 48,200 내지 48,400Da의 기본적인 소단위체를 갖는 동일한 빌딩 블럭(building blocks)으로 구성된다. 7S 단백질은 3개의 소단위체의 분자 질량 또는 145,000Da 분자 질량을 가지는 반면 12S 단백질은 약 290,000Da의 조합된 분자 질량을 갖는 6개의 소단위체를 함유한다. 7S 및 12S 단백질의 산 가수분해는 2S 단백질을 생산하지 않고, 거의 동일한 결과를 제공하며, 이것은 이러한 2 개의 구형 단백질이 동일한 소단위체로부터 얻어진다는 것을 확인해 주었다.

개별적인 2S, 7S 및 12S 단백질은 소량의 단백질에 대한 분석적 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 대량에 대한 조제용 HPLC를 포함한 어떤 통상적인 방식에 의해서라도 각각의 단백질 분리물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 분자 질량에 기초하여 조성물을 획득하는 다른 과정들이 사용될 수도 있다. 2S 단백질은 일반적으로 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터 분리되고 정제되는 반면 7S 및 12S 단백질들은 일반적으로 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물로부터 분리되고 정제된다. 캐놀라 단백질 분리물은 식염수의 사용 등에 의해 가용화된 다음에, HPLC 칼럼을 통해서 통과한다. 단백질 중의 하나를 함유하는 용리액의 분획 내에 함유된 HPLC 분리 단백질은 통상적으로, 용리액의 체적을 감소시키기 위해서 한외여과시킨 다음 단백질 내의 잔류하는 염 함량을 감소시키기 위해서 단백질 분리물 투석을 수행한다. 투석된 재료들을 건조시켜 건조되고, 분리 및 정제된 개별적인 캐놀라 단백질을 제공할 수 있다.

바람직한 구체예의 설명

도 1을 참조하여, 여기에는 캐놀라 단백질 분리물들의 제조를 위한 배취식 공정의 공정도가 개략적으로 도시되어 있다. 캐놀라 기름 씨 거친 가루와 수성 추출 매질은 라인(10)에 의해 추출용기(12)에 공급되고, 여기에서 기름 씨 거친 가루는 추출되고 단백질 수용액이 형성된다. 단백질 수용액 및 잔류하는 기름 씨 거친 가루로 된 슬러리는 라인(14)에 의해서 잔류하는 기름 씨 거친 가루의 분리를 위해서 진공 필터 벨트(16)로 보내지며, 이 잔류 기름 씨 거친 가루는 라인(18)에 의해서 제거된다. 그 후 단백질 수용액은 라인(20)을 통해 청정화 작업부(22)로 가고 이 청정화 작업부에서 단백질 수용액은 원심분리 및 여과하여 미세물들(fines)을 제거하며, 미세물들은 라인(24)로 회수된다.

청정화된 단백질 수용액은 라인(26)에 의해 한외여과 박막(28)을 통과하도록 펌프질되어 라인(30)에서 투과잔류물(retentate)로서 농축 단백질 용액을 생성시키며, 투과물(permeate)은 라인(32)에 의해서 회수된다. 농축 단백질 용액은 라인(36)에 의해 공급된 냉수를 함유하는 침전용기(34)로 간다. 침전용기(34)에서 형성된 단백질 교질 입자 덩어리는 라인(38)에 의해 분리되어 분무 건조기(40)를 통과하여 건조 캐놀라 단백질 분리물(42)을 제공한다.

침전용기(34)로부터의 상층액은 라인(44)에 의해 분리되고, 한외여과 박막들(46)을 통과하도록 펌프질되어 라인(48)에서의 투과잔류물로서 농축 단백질 용액을 생성시키며, 투과물은 라인(50)에 의해서 분리된다. 농축 단백질 용액은 분무 건조기(52)를 통과하여 추가의 건조 캐놀라 단백질 분리물(54)을 제공한다.

대체예로서, 라인(48) 내의 농축 단백질 용액은 라인(56)으로 지나가서 단백질 교질 입자 덩어리와 혼합된 후 그 혼합물이 분무 건조기(40)에서 건조될 수도 있다.

도 2를 참조하여, 여기에는 캐놀라 단백질 분리물의 제조를 위한 연속 공정의 공정도가 개략적으로 도시되어 있다. 캐놀라 기름 씨 거친 가루와 수성의 추출 매질은 각각 라인(110) 및 (112)에 의해서 혼합기(114)에 공급되고, 이 혼합기에서 캐놀라 기름 씨 거친 가루와 수성 추출 매질은 혼합되고, 그 혼합물은 라인(116)에 의해 혼합 파이프(118)로 보내진다. 혼합 파이프(188)에서, 캐놀라 기름 씨 거친 가루는 추출되고 단백질 수용액이 형성된다. 단백질 수용액 및 잔류하는 기름 씨 거친 가루로 된 슬러리는 라인(120)에 의해 잔류하는 기름 씨 거친 가루를 분리하기 위한 진공 필터 벨트(122)로 가고, 잔류하는 기름 씨 거친 가루는 라인(124)에 의해 제거된다. 그 후 단백질 수용액은 라인(126)에 의해 청정화 작업부(128)로 가고, 여기에서 단백질 수용액은 원심분리 및 여과하여 미세물들을 제거하고, 미세물들은 라인(130)에 의해 회수된다.

청정화된 단백질 수용액은 원하는 정도의 단백질 수용액의 농축을 제공하는 크기로 된 한외여과 박막(134)을 통과하도록 라인(132)에 의해 펌프질되어 라인(136) 내의 투과 잔류물로서 농축 단백질 용액을 생성시키고, 투과물은 라인(138)에 의해 회수된다. 농축 단백질 용액은 라인(142)에 의해 원하는 희석 정도를 달성하기에 충분한 체적으로 냉수가 공급되는 혼합대(mixing tee; 140)의 입구를 통과한다. 생성된 용액은 라인(144)에 의해 침전 탱크(146)에 공급되어 단백질 교질 입자 덩어리가 침전하도록 한다. 침전용기(146)에서 침전된 단백질 교질 입자 덩어리는 라인(148)에 의해 때때로 분리되어, 분무 건조기(150)를 통과하여 건조 캐놀라 단백질 분리물(152)을 제공한다.

침전탱크로부터의 상층액은 라인(154)에 의해 분리되어 한외여과 박막(152)을 통해 펌프질되어 라인(158) 내의 투과 잔류물로서 농축 단백질 용액을 생성시키고, 투과물은 라인(160)에 의해 제거된다. 농축 단백질 용액은 분무 건조기(162)를 통과하여 추가의 건조 캐놀라 단백질 분리물(164)을 제공한다.

대체예로서, 라인(158) 내의 농축 단백질 용액은 라인(166)에 의해 통과되어 단백질 교질 입자 덩어리와 혼합된 후 분무 건조기(150)에서 건조될 수도 좋다.

실시예들

실시예 1:

이 실시예는 본 발명의 캐놀라 단백질 분리물을 제공하기 위해 채택된 과정을 설명한다.

'a'㎏의 상업적 캐놀라 거친 가루가 상온에서 'b'L의 0.15M NaCl 용액에 첨가되었고, 30분 동안 교반되어 'c'g/L의 단백질 함량을 갖는 단백질 수용액이 제공되었다. 잔류하는 캐놀라 거친 가루는 제거되었고, 진공 필터 벨트에서 세척하였다. 생성된 단백질 용액은 원심분리에 의해 청정화되어 'e'g/L의 단백질 함량을 갖는 'd'L의 청정화된 단백질 용액이 생성되었다.

'f'L의 분취량(aliqout)의 단백질 추출 용액은 'h'돌턴 분자량 컷-오프의 박막을 사용한 한외여과 시스템 상에서의 농축에 의해 'g'로 체적이 감소되었다. 수득된 농축 단백질 용액은 'i'g/L의 단백질 함량을 가졌다.

'j'℃의 농축 용액은 4℃의 물에 'k'배로 희석되었다. 흰색의 구름이 즉시 형성되었고, 침전될 수 있었다. 상부의 희석수는 제거되었고, 침전된 점성의 점착성 덩어리(PMM)는 용기의 바닥으로부터 추출된 단백질의 'l'wt%의 수득율로 회수되었다. 건조된 PMM-유래 단백질은 'm'%(N x 6.25)d.b.(질소 백분율 값은 Leco FP528 Nitrigen Determinator를 사용하여 결정되었다)의 단백질 함량을 가짐이 확인되었다. 생성물에는 표시 'n'이 주어졌다.

5개의 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물에 관한 매개변수들 'a' 내지 'n'은 다음의 표 1에 주어져 있다.

n	BW-AL017-B14-02A-C300	BW-AL017-B20-02A-C300	BW-AL017-D29-C300	BW-AL021-I24-02A-C300	BW-AL021-I30-02A-C300
a	150	150	150	150	150
b	1000	1000	1000	1000	1000
c	22.0	22.6	20.2	29.3	30.0
d	1000	1040	1040	1080	1080
e	15.4	15.3	14.6	20.8	19.2
f	600	500	1040	1080	1080
g	18	17	44	47.5	48.0
h	3000	3000	5000	5000	5000
i	289	236	225	311	218
j	31	32	30	24	19
k	1:15	1:15	1:15	1:15	1:15
l	19	22	29	35	20
m	105.8	102.9	103.2	105.4	103.0

제거된 희석수는 'o'돌턴 분자량 컷-오프 박막을 사용하는 한외여과에 의해서 'p'g/L의 단백질 농도로 체적이 감소되었다. 농축물은 건조되었다. 부가적인 단백질이 상층액으로부터 회수됨에 따라, 전체 단백질 회수율은 'q'wt%였다. 형성된 건조된 단백질은 'r'wt%(N x 6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다.

생성물에는 표시 's'가 주어졌다. 5개의 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물들에 관한 매개변수 'o' 내지 's'는 다음의 표 2에 주어져 있다.

s	BW-AL017-B14-02A-C200	BW-AL017-B20-02A-C200	BW-AL017-D29-C200	BW-AL021-I24-02A-C200	BW-AL021-I30-02A-C200
o	3000	3000	5000	5000	5000
p	60.8	57.8	121.8	78.0	68.1
q	31.0	33.0	45	49	33
r	97.8	103.6	100.8	103.7	97.8

실시예 2:

이 실시예는 실시예 1의 PMM-유래 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물의 분석을 설명한다.

100㎝의 칼럼과 Sephacryl 300 HR 매질(Sephacryl 300 HR은 10,000 내지 1,500,000돌턴크기를 갖는 구형 단백질의 분획화(fractionation)를 가능케 하는 메틸렌 비스-아크릴아미드와 교차결합된 덱스트란 폴리머이다)을 갖는 Gradi-Frac(Pharmacia Amersham)단백질 분리기가 1.0mL/분의 용출 유속에서, A280㎚에서 측정된 각 성분의 체류시간(RT)을 결정하기 위해 단백질원(protein origin)의 일련의 표준물을 사용하여 가동되었다. pH 조정되고, 나트륨아지드를 항균제로서 함유하는 식염수 용액이 칼럼의 용매로 사용되었다. 용리제는 자동샘플 래크(autosample rack)상의 시험관들에 모아졌으며, 여기에서 각각의 시험관은 5mL의 액체를 보유한다. 상대적인 단백질 비율은 최대에서의 피크 높이에 기부-절반(half-base)을 곱함으로써 얻어진 피크 면적에 의해 계산된다.

5미크론의 직경, 290-옹스트롬의 세공(pore)크기를 가지며 5,000 내지 700,000돌턴 크기의 구형 단백질을 분리할 수 있는 친수결합된(hydrophilic-bonded) 실리카 고체 지지 매체를 함유하는 300x7.8㎜ BioSep S3000 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 칼럼을 사용하는 분석용 배리안(Varian) 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 칼럼이, 그래디-프랙(Gradi-Frac) 시스템에서와 동일한 바이오래드(BioRad) 단백질 표준물을 사용하여 가동되었다. 바이오래드 단백질은 1,3500돌턴에서의 저분자 질량 표시자로서 비타민 B12가 첨가되어 17,000돌턴(미오글로불린) 내지 670,000돌턴(티로글로불첨)의 범위를 망라한다. 각 성분은 1.0mL/분의 용출 유속 및 280㎚에서 측정되었다. pH 조절되고 나트륨아지드을 항균제로서 함유하는 식염수 용액이 칼럼의 용매로서, 및 건조 샘플을 용해시키 위해서 사용되었다. 용리액은 가동마다 50마이크로리터 이하의 샘플이 요구되므로 UV 검출 후에 버려졌다. HPLC Prostar 시스템은 체류시간 및 피크 면적을 자동으로 계산하였고, 요약보고서를 인쇄로 출력하였다.

BW-AL-017-B14-02A-C300 및 BW-AL017-B20-02A-C300 로트를 위해서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 PMM-유래 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물의 샘플이 각 칼럼 상에서 가동되었다. 피크 면적 계수값들은 각 피크에 관한 백분율로 변환되었다. 다른 가동들에 대한 모든 피크들이 계산되었고, 그 후 3개의 주된 단백질 단편(fraction)들인 12S, 7S 및 2S가 별도로 계산되었다.

그에 더하여, 바이오래드 표준물로부터 도출된 표준 곡선을 사용하여 GPC 및 HPLC 양자를 사용하여 이루어진 가동들에 대해 3개의 단백질 분획들 12S, 7S 및 2S의 근사 분자량을 계산하였다. 그래디-프랙 시스템은 HPLC 시스템보다 더 많은 가변성(variability)을 가지며 이는 더 큰 샘플 크기(1밀리리터 대 25마이크로리터) 및 칼럼 직경, 그래디-프랙 결과들의 수작업 계산, 및 가동시간의 차이(HPLC는 25분이고 그래디-프랙은 5시간)로 인한 것이다. 더구나, 그래디-프랙 시스템은 단백질 체류의 측정에 체적을 사용하는 반면 HPLC 시스템은 시간을 사용한다.

아래의 표 3 및 표 4에 나타낸 데이터의 변동은 위에서 지적된 차이들을 반영한다. 통계적으로는 HPLC 시스템이 그래디-프랙 시스템보다 더 우수하다(가변성이 더 낮다). HPLC 시스템과는 달리, 그래디-프랙 시스템은 추가로 검사(예컨대, 질량분석법을 사용함)될 수 있는 개별적인 샘플 단편을 제공할 수 있다.

얻어진 결과들은 다음의 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물(CPI)에 관한 표 3 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물(CPI)에 관한 표 4에서 표시되어 있다.

			PMM-유래 PCI			HPLC GPC 단백질 비율들
HPLC-SEC
단백질			단백질 분율들:			총피크 중의 %			2,7,12S	기타	계산된 분자량
단백질			%	%	%	%	%	%	중의 %	중의 %	킬로달톤
유형:	거친 가루:	가동#:	12S	7S	2S	12S	7S	2S	피크들	피크들	12S	7S	2S

PMM	AL017	B14	6%	94%	0.1%	6%	92%	0%	98%	2%	341	147	12.1
PMM	AL017	B20	6%	94%	0.1%	6%	92%	0%	98%	2%	342	146	11.5

		평균	6%	94%	0%	6%	92%	0%	98%	2%	342	146	11.8
		s.d.	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	1	1	0.4
그래디-프랙 GPC
단백질			단백질 분율들:			총피크 중의 %			2,7,12S	기타	계산된 분자량
유형:	거친 가루:	가동#:	%	%	%	%	%	%	중의 %	중의 %	킬로달톤
유형:	거친 가루:	가동#:	12S	7S	2S	12S	7S	2S	피크들	피크들	12S	7S	2S

PMM	AL017	B14	8%	82%	9%	8%	82%	9%	99%	1%	354	152	8.7
PMM	AL017	B20	9%	89%	2%	9%	88%	2%	99%	1%	403	163	8.6

		평균	9%	86%	6%	8%	85%	6%	99%	1%	378	158	8.6
		s.d.	0%	5%	5%	0%	5%	5%	0%	0%	35	8	0.0

표 3은 동물 단백질을 함유하는 바이오래드 GPC 표준물에 기초한 분자량계산이다.

			상층액-유래 PCI			HPLC GPC 단백질 비율들
HPLC-SEC
단백질			단백질 분율들:			총피크 중의 %			2,7,12S	기타	계산된 분자량
단백질			%	%	%	%	%	%	중의 %	중의 %	킬로달톤
유형:	거친 가루:	가동#:	12S	7S	2S	12S	7S	2S	피크들	피크들	12S	7S	2S

PMM	AL017	B14	0%	25%	75%	0%	25%	75%	99%	1%	없음	126	13.9
PMM	AL017	B20	6%	94%	0.1%	6%	92%	0%	98%	2%	없음	135	15.2

		평균	0%	24%	76%	0%	24%	75%	99%	1%		130	14.5
		s.d.	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%		6	1.0

그래디-프랙GPC
단백질			단백질 분율들:			총피크 중의 %			2,7,12S	기타	계산된 분자량
유형:	거친 가루:	가동#:	%	%	%	%	%	%	중의 %	중의 %	킬로달톤
유형:	거친 가루:	가동#:	12S	7S	2S	12S	7S	2S	피크들	피크들	12S	7S	2S

PMM	AL017	B14	0%	37%	63%	0%	29%	50%	79%	21%	없음	147	10.6
PMM	AL017	B20	0%	37%	63%	0%	27%	46%	73%	27%	없음	152	11.0

		평균	0%	37%	63%	0%	28%	48%	76%	24%		150	10.8
		s.d.	0%	0%	0%	0%	1%	3%	4%	4%		4	0.3

표 4는 동물 단백질을 함유하는 바이오래드 GPC 표준물에 기초한 분자량계산이다.

표 3에 나타낸 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, PMM-유래 샘플은 대량의 7S 단백질과 적은 백분율의 2S 및 12S 단백질을 함유하였다.

표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 12S 단백질은 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물에는 거의 존재하지 않는 반면에 우세한 단백질은 2S 단백질이었고, 일정량의 7S 단백질도 존재하였다.

HPLC 가동에 관해 계산된 분자량들은 12S 및 7S 단백질들의 경우 낮았지만 2S 단백질의 경우 높았다. 이 명백한 모순은 부분적으로는, 모두 수작업으로 행해졌던 GPC 가동에 관한 피크 최대를 정확히 나타내는 것이 어렵다는 점에 기인할 수 있다.

12S에 대해서 385,000돌턴의 GPC 계산된 분자량들은 캐놀라 크루시페린에 관해 문헌에서 보고된 300,000 내지 310,000Da 범위보다 높았다. 7S에 대해 GPC 및 HPLC 계산된 분자량은 약 150,000Da의 보고된 값과 거의 유사하다. 2S에 대한 HPLC 추정치는 GPC 평균보다 컸고, 이들 둘 다는 14,000Da의 내핀에 대해서 보고된 값보다 작았다.

위의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험한 샘플에서 PMM-유래 캐놀라 단백질 분리물은 82 내지 89%의 범위(GPC의 경우)와 94%(HPLC의 경우)의 양으로 7S 분획을 함유한다. 전술한 바와 같이, HPLC 과정은 GPC보다 더 빠르고, 더 정확한 것으로 생각된다. 3개의 단백질 분획 면적을 기초로 하여, PMM-유래 샘플은

약 88 내지 약 98wt%의 7S 단백질,

약 1 내지 약 10wt%의 12S 단백질,

0 내지 약 6wt%의 2S 단백질을 함유한다고 생각된다.

마찬가지로, 상층액-유래 샘플의 경우, 3개의 단백질 분획 면적을 기초로 하여, 이들 샘플은

약 70 내지 약 95wt%의 2S 단백질,

약 5 내지 약 30wt%의 7S 단백질,

0 내지 약 2wt%의 12S 단백질을 함유한다고 생각된다.

위에서 사용된 "단백질 분율(protein fraction)"이란 용어는 바이오래드로부터 입수가능한 것과 같은 허용되는 GPC/HPLC 단백질 표준에 따라, 상기 언급된 범위 내의 계산된 분자량을 생성하는 HPLC(또는 GPC) 체류시간에서의 피크의 면적으로서 정의된다. 이러한 피크는 다른 성분을 함유할 수 있지만, 그것들이 용인되는 범위의 목표 분자량 내에 있는 한 그것들의 존재는 무관할 것이다.

이 실시예에 포함된 정보를 기초로 하여 분자량의 허용되는 목표는

12S : 300,000 내지 360,000Da

7S : 125,000 내지 160,000Da

2S : 9,000 내지 15,000Da라고 여겨진다.

실시예 3:

이 실시예는 단백질 추출에 대한 특정 매개변수들의 영향을 보여준다.

제1 세트의 실험에서, 100℃의 낮은 온도에서 토스트식으로 구워서 잔류 용매를 제거한 캐놀라 기름 씨 거친 가루(LT 거친 가루)의 50g의 샘플이 실온에서 0.05M 또는 0.10M NaCl 용액의 500mL 샘플에 첨가되었고, 15분 동안 저어졌다. 슬러리는 5000 x g에서 10분 동안 추출물과 폐 거친 가루로 원심분리되었다.

제2 세트의 실험에서는, 염이 첨가되지 않은 500mL의 물이 열판 교반기(hot plate stirrer) 상에서 먼저 60℃로 가열되고, 그 후 잔류 용매를 제거하기 위해 100℃의 저온에서 토스트 식으로 구워진 50g의 캐놀라 기름 씨 거친 가루가 첨가되고 그 온도를 유지하면서 15분 동안 교반되었다. 추출물은 5000 x g에서 10분 동안 원심분리함으로써 폐 거친 가루로부터 분리되었다.

이러한 실험에서 얻어진 다양한 단백질 수용액의 단백질 농도가 결정되었고 다음의 표 5에서 보여진다.

추출물들에서의 단백질 농도(wt%)

	0.05M 식염수	0.10M 식염수	60℃의 물
LT거친 가루	1.11	1.44	0.98

거친 가루들로부터의 단백질 추출능력은 표 5의 단백질 농도 데이터로부터 결정되었고 이 데이터는 표 6에 표시되어 있다.

단백질 추출능력(wt%)^*

	0.05M 식염수	0.10M 식염수	60℃의 물
LT거친 가루	28.6	37.4	25.5

주: ^*거친 가루 내의 단백질의 총량 중 추출된 단백질의 양의 백분율로서 정의됨.

이 실시예에서 기재된 바와 같이 제조된 추출물의 샘플은 실시예 2에 기재된 HPLC 및 SEC 칼럼의 각각에서 가동되었다. 피크 면적 계수값은 각각의 피크에 대한 백분율로 변환되었다. 다른 가동들에 대한 모든 피크가 계산되었고, 그 후 3개의 주된 단백질 분획인 12S, 7S 및 2S가 개별적으로 다시 계산되었다. 얻어진 결과들은 도 2 내지 도 4의 그래프 데이터로 나타내었다.

각 크로마트그램은 7S 캐놀라 단백질 분획을 나타내는 뚜렷한 피크와 12S 캐놀라 단백질 분획의 작은 융기를 보여주고 있다. 2S 캐놀라 단백질 분획에 관한 피크는 추출물의 다른 성분들에 관한 피크들 중에 존재하였다. 크로마토그램의 저분자량 말단에서의 피크들은 적절히 확인되지 않았지만, 짧은 펩티드 및 유리 아미노산과 같은 비-단백질의 질소 함유 화합물들 뿐만 아니라 페놀 화합물, 글루코시놀레이트 및 파이테이트(phytates)와 같은 다른 거친 가루 성분들에 해당할 것 같다.

실시예 4:

이 실시예는 캐놀라 단백질 분리물 샘플의 분석을 예시한다.

실시예 2에서 기재된 바와 같은 겔 투과 크로마토그래피는 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조된 BW-AL017-D29-C200 및 BW-AL017-D29-C300 로트로부터의 분무 건조된 캐놀라 단백질 분리물의 샘플에 대해 수행되었으며, 이것은 2S, >2S, 7S 및 12S로 불리는 네 가지 단백질 분획을 생성하였고, 여기에서 2S 및 아마도 >2S 분획은 작은 수용성 알부민을 나타내고, 7S 및 12S 단백질은 더 소수성이며 덜 수용성인 글로불린을 나타낸다.

이들 분획 및 약산-처리된 샘플은 MALDI 질량분석법에 의해 분석되었고 다음의 결과들을 제공하였다.

2S 분획:

MALDI-MS를 이용한 분석은 14,000돌턴에 가까운 분자 질량을 나타내었다. 분열된 피크 꼭대기를 갖는 좁은 밴드 피크가 관찰되었으며, 여기에서 주된 스파이크는 2 내지 3개의 아미노산 차이인 13,960Da과 14,250Da 사이에 있고, 이는 다른 단백질 이소자임(isozymes)이라는 표시일 수 있다.

24시간 동안 5% 아세트산 중에서의 2S 분획의 산 처리는 8,000Da의 컷-오프 하한까지 어떤 더 작은 폴리펩티드 종도 나타내지 않았으며, 이는 온화한 산성화에 대한 2S 단백질의 저항성을 나타내는 것이다.

>2S 분획:

이 재료의 MS 스캔(scans)은 2S 단백질에 기인하는 약 13,950 내지 13,990Da에서의 작은 피크, 및 알려지지 않은 원인의 13,380 내지 13,410Da에서의 주된 피크를 나타내었다. 이 분획은 또한 알려지지 않은 원인의 17,160과 17,260da 사이의 상당하지만 덜 강한 피크를 함유하였다.

24시간 동안 5% 아세트산을 이용한 후자의 분획의 약산 처리는 13,400Da에서의 주된 피크만을 감소시켰고, 아마도 가수분해 생성물들일 지도 모를 약간의 작은 성분들이 약 7,000 내지 8,000Da에서 나타났다. 2S 피크는 감소되지 않은 듯하다.

7S 분획:

이 재료의 MS 스캔은 약 48,400 +/- 100Da에서 주된 스파이크를 가지면서 48,150과 49,950Da 사이에서 가장 현저한 피크가 발생함을 보여주었다. 훨씬 덜 강하고 폭이 넓은 피크가 대략 각각 95,940Da 및 97,510Da에서의 2개의 스파이크에 의해서 나타났고, 이는 2개의 소단위체를 함유하는 소량의 단백질이 존재함을 시사한다. 실시예 2에서 수행된 분석은 7S 단백질에 대해 약 159,000Da의 분자 질량을 제시하는 반면 여기서의 MALDI 분석은 약 145,000Da의 약간 낮은 분자 질량을 나타낸다.

작은 성분은 주된 >2S 분획 피크의 영역에서의 13,420Da에서 나타났지만 14,000Da에서는 나타나지 않았다. 주된 3중(triplet) 피크가 16,975 및 17,905Da 사이에서 나타났다. 이러한 피크들은 아마도 단백질 소단위체에서의 주된 폴리펩티드에 기인한 것일 거라 여겨지며 또한 >2S 분획에서는 나타났지만 2S 분획에서는 나타나지 않았다.

24시간 동안 1% 아세트산에 의한 7S 분획의 산 처리는 48,310Da에서 주된 종들을 손상되지 않은 채로 남겨 두었고 덜 강한 피크를 45,750Da(작은 폴리펩티드의 손실이 일어날 수 있음)에 가졌다. 새로운 피크들이 16,310Da, 22,710Da 및 24,070Da에서 나타났고, 아마도 가수분해 생성물인 것 같다.

7S 분획의 추가의 산 처리는 20%의 포름산을 사용하여 수행되었다. 스캔은 처리의 한 시간 후에 행해졌고, 포름산에 대한 3일간의 노출 후에 다시 행해졌다. 새로운 종이 한 시간의 노출 후 26,300Da에서 나타났고 다른 피크들은 대략 5%의 아세트산 처리의 경우에 주목된 곳에서 있었다. 3일간의 노출은 16,315Da 및 17,850Da에서의 주된 피크의 상승과 함께 주된 소단위체(48,260Da)에 대한 피크 강도의 저하를 유도하였다.

9,000Da 이하의 스캔은 4,490Da, 5,720Da, 6,530Da, 7,030Da 및 7,330Da에서 6개 피크의 특징적 패턴을 나타내었지만, 4,490Da에서의 피크는 3일째에 상당히 증가하였다.

12S 분획:

12S 분획의 MALDI-MS 분석은 주된 단백질 소단위체를 나타내는 48,150 및 48,200Da 사이에 집중되는 주된 피크를 생성하였다. 큰 다운필드(downfield) 피크가 94,960Da에서 발생하였고 다른 더 작은 피크들이 64,620Da, 77,540Da, 126,990Da 및 143,280Da에서 발생하였다. 큰 분자 질량 피크는 잘 정의되지 않았고, 단지 실제 분자 질량에 근접할 수 있다. 큰 다운필드 피크는 소단위체 분자 질량의 2배에 가까운 반면 143,280Da에서의 넓은 피크는 소단위체 질량의 3배에 가까웠다.

다른 현저한 피크들이 약 13,400Da, 16,400Da, 17,900Da, 및 29,000Da 내지 29,700Da에서 나타났고, 이것들은 아마도 단백질 소단위체를 구성하는 폴리펩티드들의 일부일 것이다.

5% 아세트산을 이용한 24시간 동안의 12S 분획의 산 처리는 7S 분획에 대해 위에서 설명된 것과 거의 동일한 프로파일을 제공하였다. 3일 후의 20% 포름산에 의한 처리는 48,100Da에서의 큰 소단위체의 손실과 17,900Da 종의 증가를 보여주었다.

9,000Da 이하의 스캔은 20% 포름산 중에서 1시간 후의 7S 가수분해와 거의 동일하였고, 4,480Da, 5,730Da, 6,510Da, 6,650Da, 7,020Da 및 7,310Da에서 6개의 큰 피크들이 있었다. 4,480Da에서의 피크는 7S 분획의 결과와는 달리 포름산 처리 3일째에 현저히 증가하지 않았다.

이 실시예에서 보고된 MALDI-MS 분석의 결과를 고려하여, 다음과 같이 결론지을 수 있다:

(a) 2S 단백질은 14,000Da에 가까운 공개된 결과와 일치하는 13,960 및 14,250Da 사이의 분자 질량을 가지며, 약산 처리에 대해 꽤 저항성이 있다.

(b) 7S 및 12S 단백질은 48,200 내지 48,400Da 범위에 기본 소단위체들이 있는 동일한 빌딩 블럭으로 구성된다. 7S 단백질은 3개의 소단위체 또는 약 145,000Da의 분자 질량을 가지며, 12S 단백질은 약 290,000Da의 조합된 분자 질량을 가지는 6개의 소단위체를 함유한다. 이러한 값들은 실시예 2의 GPL 및 HPLC SEC 분자 질량 계산에 의해 얻어진 것들보다는 낮지만, 그러한 결과들은 동물 표준들에 기초된다.

(c) 7S 및 12S 단백질의 산 가수분해는 2S 단백질을 생성하지 않는다.

(d) 2개의 구형 단백질의 산 가수분해는 거의 동일한 결과들을 제공하여, 2 개의 단백질이 동일한 소단위체로부터 얻어졌음을 확인해 주었다.

실시예 5:

이 실시예는 조제용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 설명한다.

5미크론의 직경 및 290옹스트롬의 세공크기를 갖는 친수결합된 실리카 강성 지지매체를 함유하는 300 x 21.20㎜ Phenomenex BioSep S3000 크기 배제크로마토그래피(SEC) 주 칼럼을 사용하는 배리안 조제용 고압 액체 크로마토그래피 시스템(prep-HPLC)이 캐놀라 단백질의 분획화를 위해 사용되었다. 동일한 패킹을 함유하는 60 x 21.20㎜ 크기의 일회용 프리-칼럼(pre-column)이 주 칼럼의 앞쪽에 부착되었다.

각 분석물은 280㎚에서 6mL/분 내지 8mL/분 사이의 용출 속도로 모니터되었다. 이러한 유속에서 칼럼에 대한 1,000psi의 압력 상한은 초과되지 않았다. 나트륨아지드를 항균제로서 함유하는 식염수 용액이 칼럼 이동상(mobile phase)으로 사용되었고 또한 건조 캐놀라 단백질 샘플을 용해하기 위해 사용되었다. 용리제는 배리안 모델 701 분획 수집기에 모아졌다. 가동 시간은 샘플에 따라 12분 내지 15분의 범위로 하였다.

단백질 분리물의 건조 중량으로 2.0% 내지 3.0% 사이, 또는 주입 당 20mg 내지 45mg 고체의 샘플 농도를 위해 샘플 주입 체적은 1.0 내지 1.5mL 사이였다. 칼럼의 용량은 샘플 유형 및 농도에 따라 1.5mL를 초과할 수 있다. 샘플 제제는 30분 동안 교반된 후 20분 동안 10,000rpm에서 원심분리되었다. 그 후 상층액은 최소 0.45미크론의 박막 디스크를 통해 진공 여과되었다.

시스템은 24시간의 기간에 걸쳐서 연속적으로 가동될 수 있지만, 이것은 통상적으로 물 중의 아세토니트릴을 수반하는 세정과정이 칼럼으로부터 불순물을 매일 제거하기 위해서 필요하였기 때문에 사용되지 않았다. 그래서 통상은 80 내지 100회의 가동이 0.5 내지 1.2그램의 수집된 분석물로 날마다 행해졌다.

샘플은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 제조된 BW-AL-017-D29-02A-C200, BW-AL021-I24-02A-C200, BW-AL021-I30-02A-C200, BW-AL-017-D29-02A-C300, BW-AL021-I24-02A-C300 및 BW-AL021-I30-02A-C300을 포함하는 PMM-유래 및 상층액-유래 캐놀라 단백질 분리물들로부터 준비되었다.

PMM(C300) 샘플은 7S 및 12S 단백질의 수집을 위해서 사용되는 반면, 상층액-유래(C200) 샘플은 주로 2S의 수집을 위해서 사용되었다. 분획 분취량은 순도에 관해서 배리안 분석용 SEC-HPLC 상에서 시험하였다. 용리제 단백질 레벨은 전형적으로 280㎚에서 2.0의 흡광도 단위(Absorbance Unit) 미만이거나 0.3wt%(N x 6.25) 미만이었고, 염 함량은 일반적으로 전도성으로 결정했을 때 0.5wt% 내지 0.7wt% NaCl 사이였다.

실시예 6:

이 실시예는 실시예 5에서 수집된 분획들의 한외여과 및 투석을 예시한다.

한외여과와 그 후의 투석은 둘 다 큰 용리제 체적 및 높은 염-대-단백질 비율을 감소시키기 위해 수행되었다. 실시예 5에 기재된 배리안 조제용 HPLC 시스템으로부터의 희석된 용리제는 각각 400mL 체적의 정격 최대 용량을 가지는 2개의 Amicon Series 8000 한외여과 교반형 셀유닛 내에서 농축되었다.

각 유닛은 선택적 분자 크기 컷-오프를 갖는 76㎜ 직경 박막에 고정되었다. 2S 단백질의 경우에는, 1,000 NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)의 재생된 셀룰로즈를 갖는 Ultracel Amicon YM1 UF 디스크, #13342, 및 10,000 NMWL의 재생된 셀룰로즈를 갖는 Ultracel Amicon YM10 UF 디스크, #13462를 포함하는 박막이 사용되었다.

더 큰 7S 및 12S 구형 단백질의 경우에는, 50,000 NMWL의 폴리에틸렌술폰(PES)의 PBQK UF 디스크, #PBQK 07610, 또는 100,000 NMWL의 PES의 Biomax PBHK UF 디스크, #PBHK 07610을 포함하는 더 큰 NMWL 박막이 사용되었다.

더 큰 NMWL 박막은 투과 잔류물이라 불리는 단백질의 체류에 약간의 손실을 제공하였지만, 단백질에 약하게 결합된 저분자량 불순물을 제거하였다. 더 큰 NMWL 컷-오프는 또한 UF 조작 시간을 감소시켰다. 2개의 UF 단위 상에서의 1,200mL의 HPLC 샘플에 대한 전형적인 가동 시간은 4 내지 5시간이었다.

전형적인 가동 시에, 샘플은 각 유닛에 325mL 라인에 첨가되었다. 교반에 의해서 레벨은 약 375mL로 올라갔다. 유닛들은 밀봉되었고 샘플을 교반하면서 압력이 60psi로 가해졌다. 유닛 내부의 투과 잔류물이 약 100mL로 떨어졌을 때, 압력은 해제되었고 추가의 샘플이 각 유닛에 첨가되었다. 이 공정은 전체 샘플이 첨가될 때까지 계속되었다. 최종 투과 잔류물은 각 셀 내에서 75mL와 100mL 사이로 농축되었다.

투과물이라 불리는 용리액은 각 유닛으로부터 분리하여 전도성에 의해 염도에 대해서 측정되었고, UV-가시 UltraSpec 1000E 분광광도계 상에서 1㎝ 셀을 사용하여 280㎚에서의 흡광도에 의해 상대적 단백질 함량에 대해서 측정되었다. 질량 평형을 계산하여 UF 박막의 효율에 관한 정보를 제공하였다. UF투과물과 최종 투과 잔류물의 샘플은 순도를 관해서 실시예 2에서 기재된 바와 같이 분석용 SEC-HPLC에 의해 검사되었다.

한외여과 투과 잔류물은 1,000 MWCO(Molecular weight Cut-Off), 24.2㎜ 직경의 Spectra/Por 7 투석 박막, #132104에 부어졌다. 튜빙(tubing)의 각 조각은 약 300㎜로 잘라졌다. 그 후 채워진 박막은 RO수(water)를 함유하는 밀봉된 4리터 병에 놓여졌다. RO수는 2회 교체되었고 그 후 투석된 샘플은 튜브들로부터 제거되었고 -65℃로 냉각하기 위해 팬(pan)들에 놓여졌다. 최종 염도는 전형적으로 전도성에 기초하여 0.1wt% 이하였다.

그 후 동결된 샘플은 Virtis SRCX-15 동결 건조기 내에 놓여졌다. 건조 시간은 적재되는 물에 따라 가변적이었다. 건조된 샘플은 팬들로부터 제거되었고, 분석을 위해 배분하기 전에 중량을 평량하였다.

실시예 7:

이 실시예는 아미노산 분석을 설명한다.

실시예 5 및 6에 기술된 바와 같이 제조된 한외여과, 투석 및 동결-건조된 개별적인 캐놀라 단백질 2S, 7S 및 12S는 아미노산 함량에 관해 분석되었다. 2S 샘플은 캐놀라 단백질 분리물 AL021-I30-02A C200으로부터 유도되었고, 7S 및 12S 단백질은 AL017-D29-02A C300으로부터 유도되었다.

아미노산 분석은 다음의 표 7에 제시된다.

g/100g 건조물
아미노산 MW(1)	아미노산	AL021-130-02A 2S	AL017-D29-02A 7S	AL017-D29-02A 12S
133.1	아스파르트산	3.18	11.60	3.02
119.1	트레오닌	2.70	3.34	1.00
105.1	세린	3.84	4.52	1.23
204.2	트립토판	1.16	1.42	0.40
146.1	글루탐산	25.10	21.50	5.91
75.1	글리신	3.91	5.44	1.45
89.1	알라닌	3.67	4.47	1.18
121.1	시스틴	4.13	1.19	0.34
117.1	발린	4.02	5.92	1.55
149.2	메티오닌	2.55	1.74	0.41
131.2	이소류신	2.89	5.12	1.31
131.2	류신	6.13	8.70	2.31
181.2	티로신	1.14	2.67	0.70
165.2	페닐알라닌	2.43	5.01	1.28
155.2	히스티딘	2.58	1.60	0.46
146.2	리신	5.92	3.17	0.88
174.2	아르기닌	5.99	8.02	2.13
115.1	프롤린	9.02	5.83	1.68
	합:	90.36	101.26	27.24
	평균 aa MW(1)	134.61	134.86	134.77
	무수 MW(2)	116.59	116.85	116.75

주: 표 7에서 (1)은 "유리(free)" 아미노산의 분자량이고, (2)는 고분자아미노산의 중량평균분자량이다.

표 7에 제시된 값은 100그램 건조 중량 당의 그램에 기초하여 아미노산을 나타낸다. 12S 샘플은 한외여과 후에도 잔류하는 염을 함유하고 있어, 7S 및 2S 샘플에 비해 샘플에서의 총 아미노산 중량이 낮았다. 이 데이터는 아미노산 100그램 기준으로 조정되었고, 수정된 데이터는 다음의 표 8에 제시된다.

아미노산 요약: g/100g 아미노산
소수성: 깁스:kJ/100g:	아미노산	AL021-130-02A 2S	AL017-D29-02A 7S	AL017-D29-02A 12S
-	아스파르트산^*	3.5	11.5	11.1
1.40	트레오닌^e	3.0	3.3	3.7
-	세린	4.2	4.5	4.5
6.96	트립토판^e	1.3	1.4	1.5
-	글루탐산^*	27.8	21.2	21.7
-	글리신	4.3	5.4	5.3
2.35	알라닌	4.1	4.4	4.3
3.45	시스틴^e	4.6	1.2	1.2
5.35	발린^e	4.4	5.8	5.7
3.64	메티오닌^e	2.8	1.7	1.5
9.56	이소류신^c	3.2	5.1	4.8
7.32	류신^e	6.8	8.6	8.5
5.30	티로신	1.3	2.6	2.6
6.33	페닐알라닌^c	2.7	4.9	4.7
1.35	히스티딘^e	2.9	1.6	1.7
-	리신^c	6.6	3.1	3.2
-	아르기닌^c	6.6	7.9	7.8
9.44	프롤린	10.0	5.8	6.2
	합:	100.0	100.0	100.0
	필수aa 합:	44.8	44.7	44.3
	% 소수성 aa:	46.9	46.4	46.3
	소수성 kJ/100g:	274.5	279.3	277.7

주: 표 8에서 e는 11개의 필수 아미노산, aa는 아미노산이고, ^*글루탐산과 아스파르트산은 글루타민과 아스파라긴으로 대부분 아미드화된다.

표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 알부민 2S 단백질은 다른 아미노산들의 상대적인 수준에 있어서 구형 2S 및 12S 단백질과는 다르다. 중요한 차이는 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 리신 및 프롤린에서 나타나지만, 열거된 아미노산의 대부분에 대해서도 차이는 명확하다. 비교해 보면, 7S 및 12S 프로파일은 거의 동일하고, 확실히 이 검사에 대한 표준편차 내에 들게 된다. 글루탐산의 양은 또한 글루타민을 포함하고, 아스파르트산은 아스파라긴을 포함한다. 글루타민과 아스파라긴 둘 다는 산 가수분해 중에 탈아미노화되어 아미노산 분석의 검출을 유도한다.

표 7은 개별 아미노산들의 분자량을 포함한다. 개별 양과 조합하여 2S, 7S 및 12S에 관한 "유리" 아미노산의 평균분자량을 나타내며, 이들은 모두 135Da 바로 아래에 있다. 단백질은 무수 아미노산들의 생체고분자들이기 때문에, 무수 중량평균분자량이 또한 제시된다(폴리펩티드 당 하나의 말단 아미노산을 제외하고 각각 하나의 물 분자를 뺀다). 두 개의 단백질 유형 사이의 차이에도 불구하고, 고분자 아미노산 평균분자량은 약 117Da로 거의 동일하다. 이것은 MALDI-MS로 결정된 14kDa의 분자량을 가지는 2S가 대략 120개의 아미노산으로 구성되며, MALDI-MS로 145kDa의 분쟈량을 가지는 7S는 대략 1,240개의 아미노산을 함유하고, 12S는 이 수의 2배, 또는 2,480개의 아미노산을 가지는 것을 의미한다. 각 7S/12S 소단위체는 약 413개의 아미노산을 함유할 것이다.

또한 표 8은 사람에 의해서는 합성될 수 없는 필수 아미노산을 나타낸다. 11개의 필수 아미노산의 전체 함량은 단백질의 두 가지 유형에 대해 매우 유사하다. 하나의 아미노산의 약화는 다른 필수 아미노산의 강화에 의해 균형이 유지된다. 리신은 2S에서 7S 및 12S의 레벨의 약 2배로 확인된다. 그러나 구형 단백질은 방향족 필수 아미노산인 티로신 및 페닐알라닌에서 더 높은 전체 레벨을 가지고, 일반적으로 메티오닌 및 시스테인을 제외하고는 지방족 소수성 필수 아미노산에서 더 높다.

표 8에서 아미노산의 소수성은 100그램의 아미노산 당 KJ로 표현되는 깁스(Gibb's) 자유 에너지값에 따라 결정된다. 깁스 자유 에너지값은 문헌(Food Chemistry, 3rd ed., edited by Owen Fennema, Marcel Dekker, New York, 1996, p330)에 열거되어 있다. 단백질의 두 가지 유형은 소수성에 관한 중량 합계 또는 에너지 합계에서 실질적으로 다르지는 않고, 소수성은 폴리펩티드들의 구조적 배향에 따라 좌우되지만, 개별적인 아미노산의 화학적 성질에는 직접 의존하지 않는다. 전반적으로, 구형 단백질들은 중성 pH(7.2)에 가까운 등전점(isoelectric point)을 가지는 반면에 2S는 Mieth 등에 의한 평지씨 단백질의 개관에 따르면 pH 9.0 이상의 등전점을 가진다(아래의 표 9). 2S는 분자량이 매우 작은 반면에, 7S 및 12S는 상당히 커서 물의 수화작용에 저항하는 잠재적으로 더 소수성인 내부 구역을 가진다.

아미노산 조성은 생체고분자 내의 아미노산 잔기의 수의 추정치를 사용하여 아미노산 잔기로 변환될 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, MALDI-MS 분석을 기초로 하여, 2S는 대략 120개의 아미노산 잔기를 함유하는 반면, 7S는 약 1,240개, 그리고 12S는 약 2,480개의 잔기를 함유한다.

다음의 표 9는 위에서 제시된 아미노산 분석 결과를 2S에 관한 아미노산들로 변환하고, 그 결과를 공개된 아미노산 잔기 범위와 비교한 것이다.

아미노산 잔기값을 기초로 하는 2S 아미노산 잔기와 문헌 값의 비교
아미노산	AL021-130-02A 2S	2S@ 120 aa:	2S 리터. 범위¹:	2S 리터. 범위²:
아스파르트산^*	3.4	4	2-5	2
트레오닌^e	3.2	4	3-4	4
세린	5.2	6	4-7	6-7
트립토판^e	0.8	1	1-2	1
글루탐산^*	24.6	29	27-32	29-34
글리신	7.4	9	6-10	7-9
알라닌	5.9	7	6-7	6-8
시스틴^e	4.9	6	8	7-8
발린^e	4.9	6	5-7	6-7
메티오닌^e	2.4	3	1-3	2-3
이소류신^c	3.2	4	4-7	4
류신^e	6.7	8	7-9	8-9
티로신	0.9	1	1-2	1
페닐알라닌^c	2.1	3	3-5	2-3
히스티딘^e	2.4	3	3-4	3-4
리신^c	5.8	7	5-9	6-9
아르기닌^c	4.9	6	5-8	4-6
프롤린	11.2	13	13-14	12-15
합:	100.0	120	114-126	110-133

주)
표 9에서 e는 11개의 필수아미노산, aa는 아미노산이며, MALDI-MS 데이터는 2S가 약 14,000Da의 분자량(MW) 또는 120개의 고분자 아미노산을 가짐을 나타낸다.
^*글루탐산과 아스파르트산은 대부분 아미드화된다.
¹Monsalve et al., J. Experimental Botany, Vol. 41, No. 222, pp.89-94, January 1990.
²Mieth et al., Die Nahrung, 27, 7, 1983, pp.675-697.

변환들은 공개된 결과들과 매우 잘 일치한다. Monsalve 등의 더 최근의 연구(1990, 표 9 대로)와 그에 더하여 Gehrig 등의 연구(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Vol. 93, pp.3647-3652, April, 1996) 및 Ericson 등의 연구(J. Biological Chem., Vol. 261, No. 31, pp. 14576-14581, Nov. 1986)는 실제 아미노산 서열분석을 포함한, 2S 및 전구체 분자 프로-네핀에 관한 상세한 정보를 제공한다.

개별적인 아미노산은 표 9에서 표시된 공개된 논문들로부터의 범위들 내에 놓여 있다. 열거된 범위들은 평지씨 품종들간의 변이에 기인하며, 또한 보고된 실험 작업에서의 미소한 가수분해성 손실들 때문일 수도 있다.

크루시페린(12S)에 대해서는 덜 공개되었지만, 구형 캐놀라 단백질이 우리의 현재의 결론과 잘 부합하는지에 관해서는 알 수 있다. 아미노산 분석 데이터는 표 10에서 아미노산 잔기로 변환되었고, 12S 단백질에 대해서 공개된 범위와 비교되었다.

7S/12S 아미노산 잔기와 문헌 값의 비교
아미노산	Burcon AL017-D29-02A 7S	Burcon AL017-D29-02A 12S	7S@ 1240 aa:	12@ 2480 aa:	잔기의 문헌 개관 범위 12S¹
아스파르트산^*	11.09	10.73	137	266	235-270
트레오닌	3.57	3.97	44	98
세린	5.47	5.53	68	137
트립토판	0.88	0.93	11	23
글루탐산^*	18.72	19.12	232	474	434-531
글리신	9.22	9.13	114	226
알라닌	6.38	6.26	79	155
시스틴	1.25	1.33	16	33	14-37
발린	6.43	6.26	80	155
메티오닌	1.48	1.30	18	32	13-44
이소류신	4.49	4.72	62	117
류신	8.44	8.32	105	206
티로신	1.87	1.83	23	45
페닐알라닌	3.86	3.66	48	91
히스티딘	1.31	1.40	16	35	45-47
리신	2.76	2.85	34	71	78-96
아르기닌	5.86	5.78	73	143	83-143
프롤린	6.44	6.90	80	171
합:	100.0	100.0	1240	2480

주: 표 10에서 7S 및 12S에 대한 평균(무수) 분자량(MW)은 116.8돌턴으로 계산된다.
MALDI-MS 결과는 7S가 145kDa 그리고 12S 단백질이 290kDa의 분쟈량임을 나타낸다(실시예 4). 따라서, 7S는 대략 1,240개의 아미노산으로 구성되고, 12S는 두 배, 또는 대략 2,480개의 잔기를 함유할 것이다.
¹Mieth et al., Die Nahrung, 27, 7, 1983, pp.678-697.

공개된 정보는 1983년에 Mieth 등에 의한 평지씨 단백질의 개관으로부터 도출된다. 이 참고문헌은 특정 아미노산 잔기의 범위를 열거한다. 여기에 나타낸 데이터는 일반적으로 보여준 바와 같은 범위와 일치한다.

저자들(Mieth 등)은, 12S 분자가 각각 약 18,000Da와 31,000Da의 분자 질량을 갖는 2개의 폴리펩티드로 구성된 6개의 큰 소단위체를 함유한다고 언급하였다. 이 정보는 또한 실시예 4에서 제시된 MALDI-MS 데이터와 일치한다.

개시의 요약

본원의 개시내용을 요약하면, 본 발명은 2S, 7S 및 12S 단백질의 독특한 프로파일을 갖는 신규의 캐놀라 단백질 분리물뿐 아니라 개별적인 분리 및 정제된 단백질을 제공한다. 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다.

Claims

캐놀라 단백질 교질 입자덩어리로부터 분리 및 정제된 것으로, 캐놀라의 분리 및 정제된 7S 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 7S 단백질은 MALDI-MS에 의해서 측정된 것으로 145 kDa의 분자량을 갖는 7S 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 7S 단백질은 각각이 413개의 아미노산의 크기를 갖는 3 개의 소단위체로 구성된 7S 단백질.

청구항 3에 있어서, 상기 7S 단백질은 하기 (1) 또는 (2)의 아미노산 분석을 갖는 7S 단백질:

(1)

g/100g 건조물 아미노산 MW (1) 아미노산 7S 133.1 아스파르트산 11.50 119.1 트레오닌 3.30 105.1 세린 4.50 204.2 트립토판 1.40 146.1 글루탐산 21.20 75.1 글리신 5.40 89.1 알라닌 4.40 121.1 시스틴 1.20 117.1 발린 5.80 149.2 메티오닌 1.70 131.2 이소류신 5.10 131.2 류신 8.60 181.2 티로신 2.60 165.2 페닐알라닌 4.90 155.2 히스티딘 1.60 146.2 리신 3.10 174.2 아르기닌 7.90 115.1 프롤린 5.80 합: 100.00 평균 aa MW (1) 134.86 무수 MW (2) 116.85 주: (1) "유리" 아미노산의 분자량
(2) 고분자 아미노산의 중량평균분자량

(2)

아미노산 요약: g/100g 아미노산 소수성: 깁스:kJ/100g: 아미노산 7S - 아스파르트산^* 11.5 1.40 트레오닌^e 3.3 - 세린 4.5 6.96 트립토판^e 1.4 - 글루탐산^* 21.2 - 글리신 5.4 2.35 알라닌 4.4 3.45 시스틴^e 1.2 5.35 발린^e 5.8 3.64 메티오닌^e 1.7 9.56 이소류신^e 5.1 7.32 류신^e 8.6 5.30 티로신 2.6 6.33 페닐알라닌^e 4.9 1.35 히스티딘^e 1.6 - 리신^e 3.1 - 아르기닌^e 7.9 9.44 프롤린 5.8 합: 100.0 필수 aa 합: 44.6 % 소수성 aa: 46.4 소수성 kJ/100g: 279.3 주: e = 11 필수 아미노산, aa = 아미노산,
^*글루탐산 및 아스파르트산은 아미드화된 글루타민 및 아스파라긴을 포함한다.

청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 교질 입자덩어리가 캐놀라 기름 씨 가루(meal)로부터 추출된 캐놀라 단백질의 농축된 식염수 용액을 pH 5 내지 6.8의 산성 조건 하에서 희석함으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 7S 단백질.
켈달 질소 (N)×6.25에 의해서 결정된 것으로 90wt% 또는 그 이상의 단백질 함량을 갖는 캐놀라 단백질 분리물을 제공하고;

캐놀라 단백질 분리물을 가용화시키고;

수득된 단백질 용액을 조제용 고압 액체 크로마토그래피, 또는 분자 크기에 기초하여 단백질을 분리하는 동등한 방법으로 처리하고;

개별적인 선택된 캐놀라 단백질을 함유하는 용리제의 분획을 수집하고;

선택된 분획을 한외여과하여 용리제의 체적을 감소시키고;

농축된 용리제를 투석하여 가용화 물질을 제거하고;

투석물을 건조시켜 개별적인 캐놀라 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 2S, 7S 및 12S 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2 개의 상이한 캐놀라 단백질의 혼합물을 함유하는 캐놀라 단백질 분리물로부터 개별적인 캐놀라 단백질을 분리 및 정제하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 캐놀라 단백질 분리물이 켈달 질소 (N)×6.25에 의해서 결정된 것으로 100wt% 또는 그 이상의 단백질 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 캐놀라 단백질 분리물이 60 내지 98wt%의 7S 단백질, 1 내지 15wt%의 12S 단백질 및 0 내지 25wt%의 2S 단백질인 단백질 프로파일을 나타내는 것이며, 7S 단백질, 12S 단백질, 또는 7S 및 12S 단백질을 분리 및 정제하도록 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서, 캐놀라 단백질 분리물이 88 내지 98wt%의 7S 단백질, 1 내지 10wt%의 12S 단백질 및 0 내지 6wt%의 2S 단백질인 단백질 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 캐놀라 단백질 분리물이 60 내지 95wt%의 2S 단백질, 5 내지 40wt%의 7S 단백질 및 0 내지 2wt%의 12S 단백질인 단백질 프로파일을 나타내는 것이며, 2S 단백질을 분리 및 정제하도록 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10에 있어서, 캐놀라 단백질 분리물이 70 내지 95wt%의 2S 단백질, 5 내지 30wt%의 7S 단백질 및 0 내지 2wt%의 12S 단백질인 단백질 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
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