KR101110046B1 - 고려인삼의 품종간 및 화기삼과의 구별을 위한 발현유전자 유래 ｓｓｒ 프라이머 세트 및 이들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 국내 및 국외에서 재배되는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 식별과 미국 및 캐나다 등지에서 생산되는 미국삼 (화기삼: Panax quinquefolium)과 고려인삼을 식별할 수 있는 70종의 SSR (simple sequence repeat) 마커로써 모두 인삼의 유전체 서열 정보에 기반하여 제작하였다. 이들 프라이머쌍 중 64쌍은 발현하는 유전자의 서열 정보 (Expressed Sequence Taq: EST) 를 기반으로 제작한 것이며 6쌍은 BAC end sequence 정보를 이용하여 제작되었다. 70쌍 중 22쌍은 국내에서 육성된 고려인삼의 품종간 식별이 가능하여 품종간 혹은 재래혼계의 혼입 판별이 가능하여 각 품종 내 순도유지 및 향상에 활용할 수 있으며 고순도 우수 품종의 생산을 통한 명품 인삼의 생산과 생산된 인삼의 품질 인증에 활용할 수 있다. 나머지 48쌍을 포함한 전체 70쌍은 고려인삼과 화기삼을 DNA 수준에서 식별할 수 있어 고려인삼의 산업 보호 및 국제경쟁력 향상에 활용할 수 있다. 또한 나아가 모든 마커는 인삼의 우량한 품종 선발과 육성, 유전육종 및 유전체 연구에 크게 기여할 수 있다.
고려인삼, 화기삼, 프라이머 세트, 키트
Description
본 발명은 고려인삼의 품종간 및 화기삼과의 구별을 위한 발현유전자 유래 SSR 프라이머 세트 및 이들의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 서열번호 1 내지 140으로 표시된 70개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하는 방법에 관한 것이다.
고려인삼 (Panax ginseng)은 아시아 극동지방에서 자생하는 약용식물로, 자생지 분포 형태가 우리나라의 삼국시대에 고구려의 영토 및 한반도와 일치하며, 고대의 많은 문헌 기록에서 엿볼 수 있듯 역사적으로 명성이 높으며, 전통적으로 국제 인삼 시장에서 고려인삼의 가치와 품질이 고가로 인정되는 바, 한국이 인삼의 종주국이라고 할 수 있다 (최광태 외 <최신고려인삼>, 한국인삼연초연구원, 1996).
인삼의 육종은 채종까지 3년, 생육상과 뿌리의 형질 등을 조사하여 우량개체를 선발하는데 5~6년의 기간이 소요되는 등의 특수성으로 인해 품종 육성까지 수십 년이 걸리는 어려움이 있다 (조재성 외 <최신인삼재배>, 선진문화사, 1998). 이러한 난관 속에서도 한국인삼연초연구원으로부터 순계 분리 육종을 통해 천풍, 연풍 등 8개 품종이 개발되어 등록되어 있으나, 증식속도가 느리고 종자의 증식량이 낮은 인삼의 생식 특성으로 인해 종자 생산체계가 제대로 확립되지 못하여 실제 농가에 보급되는 비율은 미미한 실정이다. 또한 육성된 우수 품종들 간의 식별 방법과 기존의 재래 혼계종과의 식별 방법은 생육 과정 중에 경험적인 형태적 관찰을 통해서만 이루어지고 있기 때문에 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되는 실정이다.
형태적으로 구분하는 방법에 있어서도, 파종 후 많은 시간이 지나서야 식별이 가능하기 때문에 이를 악용하여 재래 혼계종의 종자를 개발된 품종의 종자로 둔갑하여 비싼 값에 판매하는 행위가 일어나고 있으며, 이로 인한 농가의 피해가 증가하리라 예상되고 있다. 개발된 품종들에 있어서도 품종간 식별이 어려운 단점 및 증식 과정의 비의도적 오염과 혼입 등에 의해 품종의 균일도가 현저히 낮아 명품 인삼을 생산하는데 장애 요인으로 지적되고 있다. 또한, 6년에 걸쳐 생산한 생산품은 뿌리 부위만 유통이 되기 때문에 우수한 품종의 생산품과 우수하지 않은 품종 및 재래혼계종의 식별이 생육 단계가 아닌 생산품에서 가능하여야 하는데 이에 대한 기반 기술은 거의 없는 상태이며 이를 위한 최선의 방법은 품종을 DNA 수준에서 식별할 수 있는 마커의 활용이다.
비단 국내 인삼뿐만 아니라, 중국, 미국, 캐나다, 독일, 벨기에, 호주 등지에서도 인삼의 재배가 확대됨에 따라 고려인삼과 다른 종인 화기삼 (Panax quinquifolius) 등이 분말 등의 가공된 형태로 들어와 고려인삼으로 둔갑하는 문제가 발생하고 있으며, 우리나라의 고려인삼이 밀반출되어 역수입되는 등의 문제점이 대두되고 있다. 이러한 문제들을 해결하는 데 있어 모든 생물이 고유하게 가지는 DNA 정보의 활용은 단시간에 재현성 높은 결과를 줄 수 있다는 점에서 매우 유용하다고 할 수 있다.
최근 다양한 분자생물학적 기법의 발달과 더불어 생물정보학적 영역의 진보도 빠르게 이루어짐에 따라 인간, 동물뿐 아니라 식물에서도 다양한 마커 시스템이 개발되고, 방대한 유전체 정보가 생산되고 데이터베이스화되어 활용되고 있지만, 인삼에서 이와 같은 영역의 연구는 거의 미비한 실정이다. 약용식물로 널리 알려진 인삼은 약리적 성분이나 효능에 관한 연구는 활발하게 진행되어 왔으나 육종이나 유전학, 유전체학 등과 관련된 부분은 연구가 매우 미흡한데, 그 원인으로는 한 세대의 진전에 소요되는 연한이 3~4년으로 길며, 종자증식속도 또한 개체 당 40립 정도로 느리고, 환경에 대한 생육의 변이가 크다는 점 등을 들 수 있으며 이러한 문제들로 인해 체계적 관리가 어려운 실정이다.
또한 아시아의 극동지방에서만 자생해 오던 인삼을 재배화하였기 때문에 유전자원이 극히 제한적이며, 약배양이나 영양번식과 같은 육종에 있어 보조적으로 활용할 수 있는 수단의 부재 역시 인삼의 유전육종적 연구를 어렵게 하는 요인이 되고 있다. 유전학이나 유전체학적 측면에서 이루어진 인삼의 연구성과에 대해 살펴보면, 인삼에서 주요한 약리적 효능을 내는 성분인 진세노사이드(ginsenoside)의 합성경로와 연관된 유전자에 관한 연구 (Jung et al., 2003, Plant Cell Rep. 22: 224-230), 종 구분을 위한 DNA 마커 개발 (Ha et al., 2002, J Agric Food Chem 50: 1871-1875), BAC (bacterial artificial chromosome) 라이브러리 제작과 그로부터 밝혀진 2000여개의 BAC end 서열 (Hong et al., 2004, Mol Gen Genomics. 271: 709-716), EST (expressed sequence tag) 라이브러리 제작으로 밝혀진 6000여개의 서열 (Kim et al.,2006, Plant Cell Rep. 25: 599-606) 정도를 들 수 있지만, 이러한 정보들은 약 3000Mb로 추정되는 인삼 유전체의 1%에도 미치지 못하는 미미한 수준이라 할 수 있다.
SSR (Simple sequence repeat) 혹은 microsatellite는 유전자좌에서 보이는 다형성으로, 단순 반복 염기서열의 반복 횟수 차이로 관찰된다. 생물의 유전체에 존재하는 많은 수의 simple sequence repeat (SSR) 들을 microsatellite라고 하는데 microsatellite는 2 - 6개의 뉴클레오티드가 단순 반복되어 있는 경우가 많고 이는 DNA 복제시 불균형 교차 등으로 인해 생성되는 것으로 알려져 있으며, 단순반복서열의 반복수는 식물의 종간 혹은 종내에도 다양한 차이를 보이기 때문에 다형성의 수준이 높은 multi-allelic, co-dominant 마커이고 재현성도 뛰어나다. Microsatellite는 그 주위의 DNA 염기서열로부터 고안된 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시킬 수 있으며, 증폭된 산물은 단순 염기서열 반복수의 차이로부터 다형성을 보인다. 현재 인간, 생쥐에서 고밀도로 포 화된 SSR 유전자지도가 작성되어 있고, 벼와 콩 등의 작물에서도 포화 유전자지도가 작성되어 있으며, 식물에서 가장 많이 발견된 반복염기서열은 AT, AG와 AC의 순으로 그 빈도가 높은 것으로 알려져 있다 (Mogante et al., 2002, Nature Genetics 30: 194-200).
화기삼의 세계 인삼 잠식과 더불어 중국 역시 고려인삼이 자신들의 고유한 브랜드라고 주장하면서 백두산 (장백산) 개발과 함께 인삼을 중국의 대표적인 브랜드로 삼으려는 계획을 추진함에 따라 인삼 종주국으로서의 우리나라 위상이 크게 흔들리고 있는 것이 현실이며, 따라서 우리나라의 고려인삼의 가치를 드높임과 동시에 국내 품종의 개발, 증식, 보급 및 국내삼과 외국삼의 구분, 그리고 고려인삼의 대용품으로 쓰이는 Panax 속의 다른 식물들과의 구분 방법 등이 절실히 요구된다.
한국특허등록 제10-842434호에는 인삼에서 유래된 SSR 프라이머 및 이의 용도가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-742712호에는 인삼과 화기삼 간의 종간 다형성을 나타내는 마이크로새틀라이트 마커, 및 이를 증폭하기 위한 프라이머가 개시되어 있으나, 본 발명과는 SSR 정보 수집 과정이 다를 뿐 아니라 본 발명에 활용한 인삼의 유전체 정보는 모두 발현되는 유전자의 서열을 기반으로 하여 제작하여 보다 안정적일 뿐 아니라 활용성이 크며 국내 인삼 품종에 대한 식별법을 제시하고 품종내 개체간의 차이도 식별할 수 있다는 점에서 차이가 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 현재까지 알려진 인삼 DNA 염기서열을 수집하거나 본 연구실에서 생산한 발현유전자서열 (EST) 정보를 데이터베이스화하고, 서열들로부터 SSR motif를 찾아내어 그 주변의 서열로부터 프라이머를 제작하여 PCR하고 전기영동을 통해 다형성을 확인하여, 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 국내 고려인삼의 품종 식별 및 화기삼과의 종간 구분을 위한 인삼 서열 기반 SSR 마커를 제공하며, 이는 고려 인삼의 종 내에서 품종 및 재래혼계 간 구분에 있어 형태적인 구분에서 벗어나 DNA 수준에서 식별 가 능하도록 국내에서 육성된 고려인삼 품종의 순도 향상, 종자증식 및 보급체계 개선, 품종의 식별 및 보호, 새로운 품종육성에 활용, 인삼제품의 기원 식별 및 혼입 방지 및 우수 품종의 인삼근의 선별 이용을 통한 차별화된 명품화 제품 생산 등에 사용되어 고려인삼의 산업 발전 및 국제경쟁력 향상에 매우 큰 도움을 줄 것이다.
또한, 본 발명은 적은 양의 시료를 가지고 고려인삼, 화기삼, 죽절삼 등 인삼과 그 대용품의 구분을 쉽게 할 수 있을 뿐만 아니라 국내 농가에 보급되고 있는 인삼의 품종구분, 동일 품종의 개체 분석을 통한 이형주의 식별 및 제거를 통한 품종의 순도 향상, 이를 이용한 우수 품종의 종자보급체계 향상, 생산된 인삼 뿌리로부터 품종 식별을 통한 고려인삼 제품의 명품화 등에도 유용하게 사용할 수 있기 때문에, 인삼 종주국으로서 국내 인삼 산업을 활성화하는데 적용할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 140으로 표시된 70개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 140으로 표시된 70개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어져 있으며, 홀수로 표시된 서열번호가 정방향 프라이머이며, 짝수로 표시된 서열번호가 역방향 프라이머이다.
본 발명은 국내에서 육성된 고려인삼의 품종 간 구분 및 같은 인삼 속 식물 중 화기삼 및 전칠삼(중국삼) 그리고 죽절삼 (일본삼) 과의 식별에 사용할 수 있는 SSR 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고려인삼과 화기삼, 전칠삼과의 식별 뿐 아니라 고려인삼내에서 품종간 식별이 가능한 프라이머 서열 pgs0001~0022와 고려인삼과 다른 종과 식별하는데 활용할 수 있는 프라이머 서열 ps0001~0048이다. 이들 모든 프라이머 조합은 다형성이 가장 많이 생성되는 단순반복서열 (simple sequence repeat)의 주변서열로부터 제작하였으며, PCR을 통해 증폭하여 전기영동을 통해 산물을 확인함으로써 품종간 혹은 개체간 혹은 종간 식별하는 방법으로 이를 이용한 목적에 활용하는 방법에 적용될 수 있다. 본 발명은 모두 인삼의 유전체 서열 정보에서 기반하여 제작하였으며 이중 64개는 발현하는 유전자의 서열정보 (EST)에서 기반하여 안정적이며 현재 국내에서 육성된 인삼 품종들 간에 다형성을 보여줄 뿐만 아니라, 품종 구분의 방법을 제시하고, Panax 속의 다른 종인 화기삼 (Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)과도 다형성을 보여주는 마커를 제공하여 기존에 개발된 발명과 차이가 있으며 보다 많은 마커를 제공하여 품종식별, 순도유지, 종자보급체계 개선, 제품 감별 및 인삼제품의 혼입 방지 등 다양한 분야에 활용도가 높다.
상기 올리고뉴클레오티드는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이 루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(25개 뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 4의 프라이머(27개 뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 140으로 표시된 70개 쌍의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.
70개 쌍의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 더욱 정확하게 구별할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 44로 표시된 22개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 45 내지 140으로 표시된 48개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng) 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 고려인삼(Panax ginseng) 품종은 금풍, 연풍, 천풍, 고풍, 황숙 또는 자경일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인삼 근연종은 화기삼(Panax quinquefolius), 전칠삼(Panax notoginseng) 또는 죽절삼(Panax japonicus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하 기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 화기삼(Panax quinquefolius)을 포함하는 인삼 근연종 (전칠삼;Panax notoginseng, 죽절삼;Panax japonicus 등)을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반 응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 고려인삼(Panax ginseng) 품종은 금풍, 연풍, 천풍, 고풍, 황숙 또는 자경일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인삼 근연종은 화기삼(Panax quinquefolius), 전칠삼(Panax notoginseng) 또는 죽절삼(Panax japonicus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입 되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 게놈 DNA는 동일 품종내 여러 개체로부터 추출된 DNA를 혼합한 것일 수 있다. 인삼 품종들은 유전적으로 균일성 (homogeneity)이 낮기 때문에 품종간 식별을 위해 각 품종내에 15개체로부터 각각 DNA를 추출하고 동일한 비율로 DNA를 혼합하여 PCR의 재료로 사용하여 품종간 다형성을 보이는 프라이머를 조사할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 인삼 시료의 준비 및 게놈
DNA
의 추출
주요 실험 재료로 KT&G 실험 포장에서 수집한 금풍, 연풍, 천풍, 고풍의 네 품종과 고려인삼의 재래혼계인 자경, 황숙, 서양의 화기삼을 이용하였다. 인삼 품종들은 유전적으로 균일성 (homogeneity)이 낮기 때문에 품종간 식별을 위해 각 품종내에 15개체로부터 각각 DNA를 추출하고 동일한 비율로 DNA를 혼합하여 PCR의 재료로 사용하여 품종간 다형성을 보이는 프라이머를 조사하였다. 인삼 게놈 DNA의 추출은 CTAB 방법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980)을 통해서 실시하였다.
실시예 2: 본 발명의 프라이머의 디자인
인삼 서열의 정보 수집은 NCBI의 Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) 를 비롯한 각종 공공 데이터베이스를 대상으로 이루어졌으며, 수집된 인삼 서열 정보의 데이터베이스는 본 발명자들의 연구실 홈페이지 (http://im-crop.snu.ac.kr/)에 구축되어 있다. 뿐만 아니라 본 연구실에서 생산한 천풍, 금풍, 고풍의 발현 유전자 서열정보도 같이 데이터베이스화하였다.
데이터베이스화한 서열들과 다형성이 나타난 서열들 중 EST (expressed sequence tag) 서열이 많은 부분을 차지하고 있기 때문에, 유전자 관련 정보를 추정하기 위하여 NCBI의 BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Translations&PROGRAM=blastx&BLAST_PROGRAMS=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=)를 이용하여 유사성이 있는 단백질을 검색하였다.
수집된 서열로부터 repeat motif의 screening은 RepeatMasker를 통해 수행되었다 (A.F.A. Smit, R. Hubley & P. Green RepeatMasker at http://repeatmasker.org). 본 프로그램은 DNA 서열에서 산재되어있는 반복서열과 low complexity를 가진 서열을 추려내는 것으로 염기서열의 단순 반복 (Simple Repeat) 이나 전위인자 (transposon)와 유사성이 있는 서열과 같은 것들을 screening한다.
이 프로그램을 통하여 screening 된 서열들 중 단순반복을 가진 서열을 추려내고, 그로부터 SSR을 가진 서열들을 대상으로 Primer3((S. Rozen and H. J. Skaletsky[http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html]))를 이용, SSR의 주변 서열로부터 프라이머쌍을 제작하였다 (표 1 및 표 2).
표 1. 고려인삼 종내 품종간 및 Panax 속의 이종간 다형성을 나타내는 프라이머와 대상 유전자 정보
표 2. 고려인삼 종 내에는 동일하면서 Panax 속의 다른 종과 다형성을 나타내는 프라이머와 대상 유전자 정보
실시예 3: 본 발명의 프라이머를 이용한 고려인삼 품종간 및 화기삼의 구별
본 발명은 고려인삼의 품종 및 화기삼 간에 DNA 수준에서의 다형성을 확인할 수 있는 SSR 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 관한 것으로 공개된 인삼 서열의 정보 수집 및 SSR 탐색, SSR 주변 서열을 이용한 SSR을 증폭시킬 수 있는 프라이머 제작, 제작된 프라이머와 인삼 DNA를 이용한 PCR, 다형성을 시각화하기 위한 전기영동과정을 포함하고 있다. 하기에서 특별히 언급하지 않으면, 일반적인 분자생물학적 기술에 따라 통상적인 조건에서 실험을 수행한 것이다.
전체 150개 이상의 프라이머쌍을 제작하여 공시된 8 종류의 품종 이상에 대해 다형성 조사를 하였으며 도 1과 같이 고려인삼 품종간 혹은 화기삼과 다형성을 보이는 프라이머쌍을 선발하였다. 선발된 프라이머쌍들을 이용하여 품종내 개체간 변이 (유전적 균일성)에 대해 조사하였다. 고풍, 금풍, 자경, 황숙, 천풍의 개체 별 DNA를 표 1의 pgs0001, pgs0002, pgs0003 프라이머쌍을 이용하여 각각 PCR하여 품종 혹은 혼계종에 따라 나타나는 PCR 산물을 확인하였다 (도 2 내지 도 4). 빨간색 별이 표시된 개체는 각 품종에서 주요하게 나타나는 산물과 다른 산물이 증폭된 개체를 의미한다. 자경은 원래 재래 혼계이기 때문에 다양한 형태의 유전형이 나타나는 것이 자연스러운 현상이나, 자경에서 유래한 고풍의 경우에는 pgs0001과 pgs0003 프라이머쌍들로부터 증폭된 산물들을 보면, 품종으로 등록되어 있음에도 유전적으로 매우 잡박하다. 반면, 종실의 색깔이 노란색인 황숙은 재래혼계이지만 대부분 재배되고 있는 붉은색 종실의 품종에 비해 선발이 용이하기 때문에 비교적 변이가 낮은 것으로 파악되지만 여전히 변이체가 존재한다. 공식적으로 등록이 된 인삼 품종에서 나타나는 개체간 이질성(heterogeneity)은 인삼의 생육 특성인 긴 세대 주기, 충매나 풍매 등 자연교잡에 대한 관리의 어려움 등으로 인하여 품종이 완전히 고정되지 않았기 때문에 나타나거나 종자의 관리 과정에서의 혼입에 의한 것으로 판단되며 이런 특성은 인삼의 우수한 품종을 통한 명품화 혹은 우수 브랜드 인삼근의 생산에 있어 매우 큰 장애요인으로 생각된다. 또한 지금까지 개발된 인삼의 품종 감별 마커들은 대부분 단일 개체만 가지고 품종간 식별을 조사한 것으로 이러한 문제점에 대해 간과하였을 것으로 보이며 본 실험실에서 연구를 수행하였을 때 재현성이 없는 것으로 판단되었다. 따라서 유전적으로 고정이 완전히 되지 않은 인삼 품종의 식별을 할 수 있는 마커를 개발하기 위해서는 본 연구와 같이 동일 품종내 여러 개체로부터 추출된 DNA를 혼합한 DNA를 PCR의 재료로 사용할 때 각 품종을 대표하면서 품종간 차이를 식별할 수 있는 마커로 개발할 수 있다고 판단된다.
본 발명은 위와 같은 실험 방법을 통해 인삼으로부터 DNA 추출, 제작된 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응, 산물의 시각화를 위한 전기영동으로 이루어지며, 전기영동은 PCR 성공 여부의 확인과 다형성 확인을 위한 2% 아가로스 젤에서 전기영동을 수행하며, 대부분의 프라이머쌍에서 고려인삼 내에서는 다형성을 보이지 않으므로 더 높은 분리능을 가진 5% 변성 아크릴아미드 젤이나 9% 아크릴아미드 젤에서 전기영동을 수행하였다.
표 1은 고려인삼 종 내와 고려인삼과 화기삼 종 간에 모두 다형성을 나타내는 프라이머쌍의 목록이며 도 5는 표 1의 프라이머쌍을 이용한 실험 결과이다. 레인 별로 금풍, 황숙, 연풍, 천풍, 고풍, 자경의 15개체 DNA 혼합물 및 화기삼 5개체의 DNA 혼합물을 대상으로 PCR하여 고려인삼 종 및 화기삼과의 종간 다형성을 보여준다. 하나의 마커에서는 서로 다른 품종이나 재래혼계 간에 같은 산물이 나타나 기도 하나, 서로 다른 마커 간의 조합을 통해 품종 혹은 재래혼계의 식별이 가능하다. 이를테면, pgs0011에서 황숙과 연풍, 고풍은 구분이 모호하나 황숙, 연풍과 고풍은 pgs0005에서 식별이 가능하고, 황숙과 연풍은 pgs0008에서 가능하다. pgs0011의 경우 화기삼에서는 산물 크기의 차이가 아닌 증폭이 일어나지 않는 차이를 보여준다.
표 2는 고려인삼 내에서는 동일하지만 화기삼과는 다른 산물이 증폭되는 프라이머쌍의 목록이며 도 6은 표 2의 프라이머쌍을 이용한 실험 결과이다. 레인 별로 금풍, 황숙, 연풍, 천풍, 고풍, 자경의 15개체 DNA 혼합물 및 화기삼 5개체의 DNA 혼합물을 대상으로 PCR하여 고려인삼과 화기삼 사이의 종간 다형성을 보여준다. ps0001과 ps0002의 경우 화기삼에서는 산물 크기의 차이가 아닌 증폭이 일어나지 않는 차이를 보여준다.
상기에서 개발된 마커는 국외에서 수집된 다양한 인삼 품종 및 근연종에 대하여도 품종 및 종식별을 목적으로 사용할 수 있음을 조사하였다 (도 7). 고려인삼 품종 중 천풍 및 국외에서 수집된 고려인삼, 화기삼, 죽절삼의 DNA를 대상으로 실험하였을 때 Panax 속내 종 간의 다형성을 보여주며, 이는 종 구분과 유전적 거리, 계통 분석 등 다양한 용도로 활용할 수 있음을 보여준다 (도 7).
도 1은 각각 pgs0001(a), pgs0002(b), pgs0003(c) 프라이머쌍과 금풍, 황숙, 연풍, 천풍, 고풍, 자경 각각의 15개체 DNA 혼합물을 이용하여 실험한 결과이다 (1: 금풍, 2: 황숙, 3: 연풍, 4: 천풍, 5: 고풍, 6: 자경). 실험 재료로 여러 개체의 DNA 혼합물을 사용함으로써 품종 구분의 방법을 제시한다. (a)의 pgs0001로부터 나온 산물의 경우 각 품종 혹은 혼계 별로 패턴이 모두 다르다.
도 2는 pgs0001 프라이머쌍을 이용하여 고풍, 금풍, 자경, 황숙, 천풍의 개체별 DNA를 이용하여 실험한 결과이다. (a)에서 나타나는 서로 다른 산물들을 이용하여 천풍으로부터 증폭된 산물과 비교하였다. 천풍에서 주요하게 나타나는 것과 다른 산물을 별로 표시하였다. 고풍은 주요 산물을 판단할 수 없다.
도 3은 pgs0002 프라이머쌍을 이용하여 고풍, 금풍, 자경, 황숙, 천풍의 개체별 DNA를 이용하여 실험한 결과이다. (a)에서 나타나는 서로 다른 산물들을 이용하여 천풍으로부터 증폭된 산물과 비교하였다. 고풍, 금풍, 천풍에서 주요하게 나타나는 것과 다른 산물을 별로 표시하였다.
도 4는 pgs0003 프라이머쌍을 이용하여 고풍, 금풍, 자경, 황숙, 천풍의 개체별 DNA를 이용하여 실험한 결과이다. (a)에서 나타나는 서로 다른 산물들을 이용하여 천풍으로부터 증폭된 산물과 비교하였다. 금풍, 천풍에서 주요하게 나타나는 것과 다른 산물을 별로 표시하였다. 고풍은 주요 산물을 판단할 수 없다.
도 5는 표 1의 프라이머쌍을 이용한 실험 결과이다. 레인 별로 금풍, 황숙, 연풍, 천풍, 고풍, 자경의 15개체 DNA 혼합물 및 화기삼 5개체의 DNA 혼합물을 대 상으로 PCR하여 고려인삼 종 및 화기삼과의 종간 다형성을 보여준다 (1: 금풍, 2: 황숙, 3: 연풍, 4: 천풍, 5: 고풍, 6: 자경, 7: 화기삼). 품종 식별은 표 1을 참조한다.
도 6은 표 2의 프라이머쌍을 이용한 실험 결과이다. 레인 별로 금풍, 황숙, 연풍, 천풍, 고풍, 자경의 15개체 DNA 혼합물 및 화기삼 5개체의 DNA 혼합물을 대상으로 PCR하여 고려인삼과 화기삼 사이의 종간 다형성을 보여준다 (1: 금풍, 2: 황숙, 3: 연풍, 4: 천풍, 5: 고풍, 6: 자경, 7: 화기삼).
도 7은 네가지 프라이머쌍과 고려인삼 품종 중 천풍 및 국외에서 수집된 고려인삼, 화기삼, 죽절삼의 DNA를 이용하여 실험한 결과이다(1: 천풍-Panax ginseng, 2-3: 화기삼-Panax quinquifolium, 4: 러시아삼-Panax ginseng, 5: 일본 죽절삼-Panax japonicus, 6: 일본 미마끼-Panax ginseng, 7-8: 중국삼- Panax ginseng). (a) ps0001, (b) ps0003, (c) ps0002, (d) pgs0002
<110> SNU R&DB FOUNDATION
<120> EST-derived SSR primer sets for discrimination of Panax ginseng
cultivars and Panax quinquefolius and uses thereof
<130> PN09066
<160> 140
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 25
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<213> Artificial Sequence
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 26
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 25
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agcctagtgt gcagaagtaa agtgt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggggcttctc taatttacac cttta 25
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<211> 25
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aaagatgaaa acttgatgct tgttc 25
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atatgtggat gatttggaca ttttt 25
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<211> 25
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atgtttacta gctcgtgtgt gtgtg 25
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tggtctagaa cagaaaagat cgagt 25
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gtactgtctg tggtttgaat gattg 25
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tgaaccacat gatttacgat tagtg 25
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gacatatctg catggctttc ttaat 25
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aggacttcaa tgctagaact cagaa 25
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<211> 25
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<223> pgs0011 Reverse primer
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catgggctaa ataataaaag accaa 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gttatgaccg gtaaattagg ttggt 25
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caatccacat caagaccata ttaca 25
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actcatcaaa ctcaaaactg tctcc 25
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<211> 25
<212> DNA
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gcaccataca agaacaagaa aagat 25
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taattatatt tgtgttggca gacga 25
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<223> pgs0014 Reverse primer
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ctcggcatac aacatttaac ttacc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0015 Forward primer
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attagtagaa cgtacagccc aaacc 25
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tatggtaact ttaggctggt gtagc 25
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<212> DNA
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gagaaaattg aggaaccaaa caag 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0016 Reverse primer
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gttttctcca caactactgg ctct 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aaaattctgc tcacactctc tctgt 25
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<212> DNA
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<223> pgs0017 Reverse primer
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cggagttttt gaagataaga atcaa 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgs0018 Forward primer
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atttatatat cttcacgctg cttcg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0018 Reverse primer
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caaaaataag agatggagat ggaga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0019 Forward primer
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ctctctctct ctctctctca tctgc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0019 Reverse primer
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aaagaagaac cacaaacact aaacg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgs0020 Forward primer
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gtactatgga taaagctgga atgga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cggtaagtga cactaagaac aactg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgs0021 Forward primer
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tggatctatc cctaatctca acatc 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgs0021 Reverse primer
<400> 42
cttaaagtga ccaccacttt gtctt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pgs0022 Forward primer
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aaaatggttc caaattgtgc ttc 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> pgs0022 Reverse primer
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aaggtggaaa taaggagaga aaaga 25
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<212> DNA
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<400> 45
ttctctaaaa ctcgtatctt tctcaaa 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0001 Reverse primer
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aaacacggag gttttaattg ga 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0002 Forward primer
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aacgtgatgc atgtcgagag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0002 Reverse primer
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gcaccgagtt ttcccaagta 20
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<212> DNA
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<223> ps0003 Forward primer
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gtggaagagg caaaaccaag 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> ps0003 Reverse primer
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agccatgcta ggtctgttgg 20
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<223> ps0004 Forward primer
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atggagggga ccgattctat 20
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<220>
<223> ps0004 Reverse primer
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ctcaacggca gcagtagcc 19
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0005 Forward primer
<400> 53
tatccaccaa aacactactc atcct 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0005 Reverse primer
<400> 54
cctcttagac tcgtcattag gttca 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0006 Forward primer
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atttagcttg gctatatgtg aatgg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0006 Reverse primer
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ggacagaagt gaagcatttc atagt 25
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<223> ps0007 Forward primer
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tcctaaatta gcactaaacg cacat 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0008 Forward primer
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tagcttcaag tctcttttct tggtg 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0008 Reverse primer
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ttggactcct tctctcctta ttttt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0009 Reverse primer
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<213> Artificial Sequence
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<223> ps0010 Forward primer
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acaagaacaa ttgtcaaagg aagtc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0010 Reverse primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0011 Forward primer
<400> 65
tactctgttt cgtttggttt ttctt 25
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<220>
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atagaggaac tccaacagcc attat 25
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<213> Artificial Sequence
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tcggtaagga tatcatcaac aaaat 25
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tttttgataa agacaaggtc aaagc 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtattgctc gtgaactttg taact 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0014 Reverse primer
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caataggaag agaagaaaac caaca 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0015 Forward primer
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ggtattgctc gtgaactttg taact 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0015 Reverse primer
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gccactcagt actcaataaa gaagc 25
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<211> 25
<212> DNA
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ggaaacaggg gtagaagaag tgtat 25
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<212> DNA
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ttgatccaag gcactaaact aaaac 25
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tcgctatagc tattctggtc tatgg 25
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
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gaagtgatcc cagaagagaa tgtta 25
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<223> ps0018 Reverse primer
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atcattatat atcaagccga agcag 25
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ctatacctca gcaccagttt caaca 25
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<213> Artificial Sequence
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tatctgcgaa ttattttcca tgaat 25
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<212> DNA
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<220>
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gaaaacattt gtgtttcagt aggc 24
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<213> Artificial Sequence
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aatgagcttc aggtaaatat catcg 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0021 Forward primer
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ccaagccaca taaatctagg agtatc 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0021 Reverse primer
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aaaaacaaca agtgcagtta cacaa 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0022 Forward primer
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cacagtgagg aagaagaaga agaag 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0022 Reverse primer
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acctggaata ctttccaata ccg 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0023 Forward primer
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taataataat ttgatgcggt tccat 25
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<212> DNA
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<223> ps0023 Reverse primer
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ggtgttgtca attaggagag agaaa 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0024 Forward primer
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aaaatcaatc tcccataaat ttggt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0024 Reverse primer
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tgatgttttg aaacagaatc ttcaa 25
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<211> 25
<212> DNA
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agaatttgaa gatgatgaag aatcg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0025 Reverse primer
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<223> ps0027 Reverse primer
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atgacgttgt gcttttatag cttct 25
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<211> 25
<212> DNA
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taaagaatca aatctctccc tcctt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0028 Reverse primer
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ggcttttagt cggagtatct cttct 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0029 Forward primer
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gaattgggtg tttgagtttg tagtt 25
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gattttgtcc tccaacatta ttctg 25
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tactccttcc ccatttaatt tcttc 25
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<213> Artificial Sequence
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gagggcagtt ttggtagata ttttt 25
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gatgtgtgta tgtttggtgt aacttg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0031 Reverse primer
<400> 106
tatatgctta actcgcctct ttttg 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0032 Forward primer
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<213> Artificial Sequence
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<223> ps0032 Reverse primer
<400> 108
caatgtatgg aggaaggttt atttg 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> ps0033 Forward primer
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cgaattctga ttcttgacat ttctt 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0033 Reverse primer
<400> 110
cgaaatatgg agtaagacgc tgtat 25
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0034 Forward primer
<400> 111
ggaggtctat ttaggaggtg tgaat 25
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0034 Reverse primer
<400> 112
ttttcctcct ttttctcatt ctctt 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0035 Forward primer
<400> 113
tacattggaa aaccctaaac cagta 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0035 Reverse primer
<400> 114
cgcataactg tggaaaagat aaact 25
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0036 Forward primer
<400> 115
gtgaagcttg aacacttaga agagg 25
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0036 Reverse primer
<400> 116
tcatcatact ttgctaacac gtcac 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0037 Forward primer
<400> 117
aaaacgaaga aaatgttaca agtgc 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0037 Reverse primer
<400> 118
gtatcaccac aacatcaaat tacca 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0038 Forward primer
<400> 119
gcttatcttg cctgataatg tccta 25
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0038 Reverse primer
<400> 120
caacatgtaa ttacgtctct catgc 25
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0039 Forward primer
<400> 121
caatttcttc cgtataaacc aattt 25
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0039 Reverse primer
<400> 122
actcctacct gcacaatttg aatac 25
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0040 Forward primer
<400> 123
agtggcaact ctagagaaac tatgc 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0040 Reverse primer
<400> 124
atacgttaca tggcagctga atact 25
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0041 Forward primer
<400> 125
caaaaggctt gctctatatt gtgat 25
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0041 Reverse primer
<400> 126
tccagtcatt aatacttgca acaaa 25
<210> 127
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0042 Forward primer
<400> 127
tctccttctg ctggtagtaa aaatg 25
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0042 Reverse primer
<400> 128
ataaattctg catctacggt gtagc 25
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0043 Forward primer
<400> 129
tgatccagtt caatttcttg ttttc 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0043 Reverse primer
<400> 130
ataatctttc aatttcccgt acaca 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0044 Forward primer
<400> 131
aataatacca cagtacccac cgttt 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0044 Reverse primer
<400> 132
catagcacag agttgcttaa tttca 25
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0045 Forward primer
<400> 133
attgttgaag aaattggttg tttgt 25
<210> 134
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0045 Reverse primer
<400> 134
ctgagttcat ttcctggaac atagt 25
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0046 Forward primer
<400> 135
actgtttatg actggctcta cagtg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0046 Reverse primer
<400> 136
gtaccgtcca tgacataaca taaca 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0047 Forward primer
<400> 137
taaattcact ttgtgtgtgt gtgtg 25
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0047 Reverse primer
<400> 138
gttcttgatc gtgattcttt tcaag 25
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0048 Forward primer
<400> 139
gggagactaa ttttctttgc ttttc 25
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ps0048 Reverse primer
<400> 140
ttctgatgag ttctgtgtag gagtg 25
Claims (8)
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1 내지 44로 표시된 22개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 서열번호 45 내지 140으로 표시된 48개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 고려인삼(Panax ginseng) 품종은 금풍, 연풍, 천풍, 고풍, 황숙 또는 자경이며, 상기 인삼 근연종은 화기삼(Panax quinquefolius), 전칠삼(Panax notoginseng) 또는 죽절삼(Panax japonicus)인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하기 위한 키트.
- 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 고려인삼(Panax ginseng)의 품종간 및 인삼 근연종을 구별하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 동일 품종내 여러 개체로부터 추출된 DNA를 혼합한 것을 특징으로 하는 방법.
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