KR101087572B1

KR101087572B1 - 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR101087572B1
Application number: KR1020100010506A
Authority: KR
Inventors: 장선일; 목지예; 박광현
Original assignee: 참살이 모악골 영농조합법인
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2011-11-28
Also published as: KR20110090615A

Abstract

본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물{Composition for preventing or treating atopic dermatitis}

아토피 피부염(AD: atopic dermatitis)은 만성적으로 재발과 완화가 반복적으로 일어나는 알러지성(allergy) 피부습진(eczema)으로 피부 건조증(dry skin), 염증(inflammation) 및 가려움증(itching)이 주 증상으로 나타난다(Spergel JM, Paller AS. Atopic dermatitis and the atopic march. J Allergy Clin Immunol. 2003;112(6 Suppl): S118-127). 아토피 피부염 환자는 심한 가려움증에 시달려 피부를 긁게 되는데, 이로 인해 홍반(erythema), 팽진(wheal), 발진(rashes), 까짐(erosion), 잔물집(vesicle), 농포(pustule) 및 태화선(lichenification)이 형성되어 피부 건조증을 더욱 유발한다. 피부과학(dermatology) 측면에서 아토피 피부염은 면역학적, 유전적, 약리학적, 생리학적, 및 환경적 등 다인자적 요인(poly-factors)에 의해 발병되며, 병인과 발병기전(etiology and pathogenesis)은 감염, 스트레스, 계절과 기후 변화, 자극 및 알러젠(allergen) 등에 의해 호전과 악화가 반복적으로 나타난다(Leung DY, Bieber T. Atopic dermatitis. Lancet. 2003; 361(9352): 151-160).

아토피 피부염은 만성적인 염증성 피부질환(chronically relapsing inflammatory skin disease)으로 영ㆍ유아부터 성인에까지 광범위하게 유발되며, IgE 매개 감작(IgE-mediated sensitization)에 의한 외인성 형태(extrinsic form, 70-80%)와 비 IgE 매개 감작(non-IgE-mediated sensitization)에 의한 내인성 형태(intrinsic form, 20-30%) 등 2가지 형태로 분류된다(Novak, N, and Bieber, T. 2003. Allergic and nonallergic forms of atopic diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 112: 252-262; 및 Schultz-Larsen F, Hanifin JM. Epidermiology of atopic dermatitis. Immunol Allergy Clin North Am . 2002; 22: 1-24). 외인성 아토피 피부염에서 피부 호밍 수용체(skin homing receptor)를 발현하는 메모리 T 세포와 피부 림프구 관련 항원(CLA: cutaneous lymphocyte-associated antigen)은 Th2 사이토카인을 과잉생산하는데, IL-5 뿐만 아니라 IgE 생산에 동형 전환(isotype switching)을 유도하는 것으로 알려진 IL-4 및 IL-13의 생산을 촉진하여 호산구의 발달 및 생존에 영향을 주는 것으로 보고되었으며, CLA^＋ T 세포는 Th2 세포의 기능을 억제하여 IFN-γ(Th1 사이토카인)을 비정상적으로 매우 적게 생산하는 것으로 알려졌다(Leung DY, Boguniewicz M, Howell MD, Nomura I, Hamid QA. New insights into atopic dermatitis. J Clin Invest. 2004; 113(5): 651-657).

한편 일산화질소(NO: nitric oxide)는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로서, NOS(NO synthase)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성된다. NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 생체가 아토피 피부염과 같이 염증상태에 빠지게 되면 iNOS(inducible NOS)가 발현되어 많은 양의 NO를 생산한다(Choi BM, Pae HO, Jang SI, Kim YM, Chung HT. Nitric oxide as a pro-apoptotic as well as anti-apoptotic modulator. J Biochem Mol Biol. 2002;35(1):116-26). 더불어 사이클로옥시게나아제(COX: cyclooxygenase)는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타노이드(prostanoid)로 전환시키는 효소로 알려졌는데, COX-1과 COX-2에 의해 합성된 적은 양의 프로스타노이드는 생체의 항상성 유지에 필요하지만, 과량의 프로스타노이드는 NO와 비슷하게 활성화된 대식세포에서 COX-2의 발현이 촉진되어 많은 양의 PGE₂를 생산하게 된다(Veale D., Rogers S., Fitzgerald O., Br . J. Dermatol ., 132, 3238 (1995)). 이렇게 생성된 NO와 PGE₂와 같은 염증촉진 매개물은 아토피 피부염을 더욱 악화시키는 것으로 알려졌다(Bruch-Gerharz D., Fehsel K., Suschek C., Michel G., Ruzicka T., Kolb-Bachofen V., J. Exp . Med ., 184, 20072012 (1996); 및 Bruch-Gerharz D., Ruzicka T., Kolb-Bachofen V., J. Invest . Dermatol ., 110, 17 (1998)).

또한 생체에서 아토피 피부염과 같이 염증반응이 진행되면 NO와 PGE₂ 뿐만 아니라 O₂ ^- 및 과산화수소(H₂O₂) 등 일련의 반응산소 중간물질(ROS: reactive oxigen species)이 대량생산되고 산화적 스트레스가 가중되어 염증반응을 더욱 촉진시킨다(Briganti S, Picardo M. Antioxidant activity, lipid peroxidation and skin diseases. What’ new. J Eur Acad Dermatol Venereol 2003;17:663e9). 따라서 산화적 스트레스로부터 생체의 항상성을 유지하기 위해 필요한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD: superoxide dismutase), 카탈라아제(caltalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GPX: glutathione peroxidase) 등 생체 효소의 활성이 계속된 염증반응에 의해 감소하게 된다(Zhao J, Lahiri-Chatterjee M, Sharma Y, Agarwal R. Inhibitory effect of a flavonoid antioxidant silymarin on benzoyl peroxide-induced tumor promotion, oxidative stress and inflammatory responses in SENCAR mouse skin. Carcinogenesis 2000;21:811e6).

케모카인(chemokine)은 저분자 단백질로 알려진 화학주성(chemoattractants)을 나타내는 상과(superfamily)로 알려져 있으며, 단백질의 구조와 기능에 따라 C, CC, CXC 및 CX3C 등 4가지 아과(subfamily)로 나눌 수 있다. 이들 케모카인은 염증부위에 백혈구를 침윤시켜 염증반응을 더욱 유발하는 작용을 한다. CTACK/CCL27(Cutaneous T cell-attracting chemokine)은 피부에 특이적으로 작용하는 대표적인 Th2 케모카인으로 염증부위로 Th2 세포를 이동시켜 침윤을 유도한다. CTACK/CCL27은 CCR10을 통하여 그 효과를 나타낸다(Homey B, Alenius H, MA, Soto H, Bowman EP, Yuan W, McEvoy L, Lauerma AI, Assmann T, BE, Lehto M, Wolff H, Yen D, Marxhausen H, To W, Sedgwick J, Ruzicka T, Lehmann P, Zlotnik A. CCL27-CCR10 interactions regulate T cell-mediated skin inflammation. Nat Med. 2002; 8(2): 157-165). 특히 AD 환자의 혈청에서 CTACK/CCL27이 매우 높은 양으로 검출되어 AD와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 최근에 알려졌다(Nakazato J, Kishida M, Kuroiwa R, Fujiwara J, Shimoda M, Shinomiya N. Serum levels of Th2 chemokines, CCL17, CCL22, and CCL27, were the important markers of severity in infantile atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 2008; 19(7): 605-613).

NC/Nga은 DBA/2 계열의 마우스로 X 선 조사에 대한 높은 감수성과 난백 알부민 주사에 의한 과민성 쇼크(anaphylactic shock)의 높은 감수성 등 면역생리학적인 특징을 가지고 있으며, 화학항원(chemical antigen)과 집먼지 진드기(house dust mite)와 같은 생물학적 항원(biological antigen) 등으로 인간의 AD와 유사한 피부질환을 유발시킬 수 있어 AD의 병인 및 치료 약물의 평가에 많이 활용되고 있다(Suto H, et al., NC/Nga mice: a mouse model for atopic dermatitis. Int Arch Allergy Immunol. 1999; 120: 70-75).

개구리밥이라 불리우는 부평초(Spirodela polyrhiza)는 개구리밥과(Lemnaceae)에 속하는 다년생초로 연못이나 논물에 떠서 자라는 물풀이다. 가을에 물 위에 있던 잎에서 만들어진 겨울눈이 물 속에 가라앉았다가 다음해 봄 물위로 떠올라 번식한다. 줄기와 잎이 없이 1장의 잎처럼 생겼는데 길이 5∼8 ㎜, 너비 4∼6 ㎜ 정도로 둥그렇다. 부평(浮萍)은 식물 전체를 햇빛에 말린 것으로 한방에서는 해열, 이뇨 및 코피 등의 치료에 쓰며 불에 덴 피부에 바르면 좋다. 또한 오줌내기약, 땀내기약 및 곪은 것을 푸는 약으로 사용하며, 민간에서는 신선한 잎을 피부백반, 종양, 단독 및 문둥병 등에도 사용한다.

창이자는 도꼬마리(Xanthium strumarium)의 열매를 말하는데 민간에서는 나병, 축농증, 비염 및 관절염 등의 치료약으로 사용한다.

약모밀이라고 불리우는 어성초(Houttuynia cordata)는 삼백초과에 속하는 다년생 초본으로 아시아 동남부에 많이 분포하는 여러해살이약초이다. 어성초의 효능은 청열해독, 이뇨, 소종작용으로 폐렴, 수종, 임병, 습진 및 개선 등의 증상을 치료하며 이외에도 백일해, 피부병, 급성 또는 만성 비염, 만성 건조성 비염 및 인후염 등에 일정한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 항산화작용, 인플루엔자 바이러스에 대한 억제효과, 항종양, 항백혈병, 고지혈억제 및 간보호작용 등이 있는 것으로 알려졌다.

민들레(Taraxacum mongolicum)라 불리우는 포공영은 해열, 소염, 이뇨, 건위작용, 위궤양, 혈행개선, 담즙 생성 증가, 이뇨제, 빈혈, 통풍, 류머티즘, 간질환, 변비, 유방의 종양 및 노화 방지 등에 효과가 있는 것으로 알려졌다.

수세미(Luffa cylindrica)는 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 덩굴성 1년생초로 줄기는 덩굴성으로 각 마디에서 덩굴손을 내어 다른 물체를 감으면서 올라간다. 줄기의 절단면에서 나오는 수액에 글리세린, 메틸알코올 및 붕산 등을 적당히 섞어 피부미용과 화장수로도 사용되며, 열매는 통경, 최유, 혈행부전치료, 진해 및 이뇨에 사용하고, 덩굴줄기의 액체를 조제하여 사과락(絲瓜絡)이라고 하는 약품의 재료로 사용하기도 한다.

도라지라 불리는 길경(Platycodon grandiflorum)은 풍부한 섬유질과 칼슘, 철분을 비롯하여 단백질, 당질, 지질, 무기질, 비타민과 사포닌 등이 들어 있는 우수한 알칼리성 식품으로 천식, 결핵 등 호흡기질환 예방과 치료에 좋은 것으로 알려졌다.

황금(Scutellaria baicalensis)은 바이칼린(bicalin)과 바이칼레인(bicalein)이 풍부하게 함유되어 있고, 우고닌(wogonin) 등이 함유되어 있어 소화관 연동 운동 능력을 항진하여 소화 흡수를 촉진하고 즙 분비를 촉진하여 간기능을 강화시킨다. 바이칼린과 바이칼레인은 혈관 투과성 항진을 억제하고 소염작용이 강하여 혈관의 염증성충혈, 울혈을 완화한다. 또한 우고닌은 헴옥시게나아제-1(HO-1: heme oxygenase-1)을 유도하는 유도체로서 상처 치유뿐만 아니라 항알러지 및 항산화 효과가 매우 좋은 것으로 알려졌다.

본 발명자들은 아토피 피부염의 예방 또는 치료 효능을 갖는 천연물을 찾고자 노력한 결과, 집먼지 진드기(Df: Dermatophagoides farinae) 항원을 이용하여 NC/Nga 마우스를 대상으로 인간과 유사한 아토피 피부염을 유발하고, 여기에 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약재 추출물을 경구 투여할 경우 혈청 내 IgE, CTACK/CCL27, NO 및 PGE₂ 생산량을 감소시키며, 귀조직의 SOD, 카탈라아제 및 GPX 등 항산화 효소의 활성을 증가시키는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연물로 구성되고 아토피 피부염의 증상을 완화시키거나 예방할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 복합 생약재 추출물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 및 아질산염소거능이 우수하였고, 아토피 피부염 유발 마우스에서 SOD, 카탈라아제 및 GPX 활성을 증가시켰으며, 혈청 내 IgE, CTACK/CCL27, NO 및 PGE₂ 생산량을 감소시켰다.

도 1a 및 1b는 DPPH 라디칼 소거능을, 도 1c 및 1d는 아질산염소거능을, 도 1e 및 1f는 SOD 활성을 측정한 결과를 각각 보여준다.
도 2는 Df 항원 면역에 의한 AD 유도 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 귀의 부종에 미치는 효능을 보여주는 것으로, 도 3a는 피부병변 개선 효과를 보여주고, 도 3b는 귀두께 변화를 관찰한 결과를 보여준다.
도 4는 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 피부 조직 변화를 관찰한 결과를 보여준다.
도 5는 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 혈청 내 IgE 생산량 변화를 보여준다.
도 6은 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 혈청에 특이적으로 작용하는 CTACK/CCL27의 생산량 변화를 보여준다.
도 7a 및 7b는 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 혈청 내 NO와 PGE₂ 생산량 변화를 각각 보여준다.
도 8a 내지 8c는 귀조직의 SOD, 카탈라아제 및 GPX 등 항산화 효소의 활성을 측정한 결과를 각각 보여준다.

본 발명은 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 이때, 상기 생약재들은 2:2:2:0.5:0.5:1:2 내지 1:2:1:0.5:0.1:1:3의 중량비로 혼합될 수 있으며, 가장 바람직하게는 모두 동량으로 혼합하여 사용한다. 부평초, 창이자, 어성초, 황금은 항산화 효과와 항염증요과가 뛰어난 물질로 알려져 있기 때문에 그 혼합 비율을 높이는게 바람직하며, 포공영, 수게미 및 길경은 항염증효과나 항염증효과가 크지 않지만 이들의 작용은 면역 및 생리적 반응을 조절할 수 있는 중요한 작용을 하기 때문에 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 복합 생약재 추출물은 각 생약재를 따로 추출한 후 혼합할 수도 있고, 생약재를 모두 혼합한 상태로 한꺼번에 추출할 수도 있다. 본 발명에서는 상기 생약재를 당업계에 잘 알려진 방법으로 물 또는 유기용매로 추출할 수 있다. 본 발명에 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 이때, 추출온도는 10∼30℃가 바람직하며, 1∼14일간 추출할 수 있다. 상기 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.

본 발명에 의한 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물은 그 제형이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 약학 조성물 또는 건강식품 조성물일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 약학적 제제의 제형에는 특별히 한정되지 않으나, 경구투여용으로 구강용 또는 주사약제가 가능하며, 식품 첨가물로도 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 또는 입자, 유화액, 연질 또는 경질 캡슐, 시럽 또는 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 담아서 완성품을 제조할 수 있다.

경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 및 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말 및 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴 및 아카시아 등의 결합제; 및 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 및 탈크 등의 윤활제와 같이, 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 섞여진 상태로 제조될 수 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용할 수도 있다. 경질 캡슐은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘 및 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질 캡슐은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol) 및 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀 및 올리브 오일 등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth) 및 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 상기 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료 및 감미료 등을 더 함유할 수 있다.

유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀 및 세틸알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유할 수 있다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료 및 감미료 등을 더 함유할 수 있는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제 및 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제로는 예를 들어, 감미료, 향신료 및 착색제 등을 들 수 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것 등이 있다.

시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨 및 수크로오스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합하여 제조될 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후 직장에 투여할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물이 건강식품 조성물이 경우에는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 제빵, 드링크, 유지류, 아이스크림, 과자, 떡, 스넥류, 이유식, 주류, 조미료류, 레토르트 또는 통조림 등 각종 조리가공식품류, 비타민 복합제 또는 건강 기능성 식품류 등으로 제형화될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 복합 생약재 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 복합 생약재 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물로는 포도당 및 과당 등의 단당류, 말토오스 및 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린 및 시클로덱스트린 등과 같은 다당류, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있다. 상술한 것 이외의 감미료로서 천연 감미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1∼20 g, 바람직하게는 약 5∼12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0∼20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 복합 생약재 추출물의 투여량은 당업자의 수준 내의 범위에서 한정될 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 10 내지 400 mg/kg, 바람직하게는 50 내지 200 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 복합 생약재 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 1∼90 중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 이는 정제 및 연질 캡슐 제조 시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 1∼60%, 경질 캡슐의 제조 시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 1∼90%일 수 있는 점을 고려하여, 상기 복합 생약재 추출물을 1∼90%로 함유하는 건강식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

<시약 및 재료>

Df 항원은 연세대학교 알레르기연구소(서울)로부터 구입하였다. IgE ELISA 키트는 Shibayagi사(일본)로부터 구입하였으며, 마우스 CTACK/CCL27 ELISA 키트는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. 헤마톡실린(Haematoxylin), 에오신(eosin)과 콩고레드(Congo red) 및 기타 시약은 시그마사(Sigma, ST Louis, MO)로부터 구입하였다.

<통계>

모든 실험값은 평균±표준오차로 표시하였으며, 통계분석은 ANOVA와 스튜던트 t-테스트(Student’s t-test)로 처리하였으며, 유의성 한계는 P<0.05로 정하였다.

[실시예 1] 복합 생약재 추출물의 제조

잘 건조한 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금을 모두 동일한 양으로 배합한 복합 생약재 300 g를 1,000 ml의 메탄올이 들어있는 비이커에 주입하고 밀봉하여 1주일간 방치한 후 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과한 다음 농축기(Eyela, 일본)로 농축한 후 -70℃에서 동결기(본디로, 일심렙)에서 건조하여 38 g을 얻은 다음 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 복합 생약재 추출물은 DMSO(Sigma, USA)에 녹여 사용하였으며, 마우스 귀에 도포할 때는 에탄올에 녹여 생리식염수를 90%를 주입하여 사용하였다.

[시험예 1] 항산화 효과

본 발명에 의한 복합 생약재 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 DHHP 라디칼, 아질산염(NO) 및 SOD 활성을 각각 측정하였다.

<전자공여능(DPPH 라디칼 소거능)>

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; Sigma, USA) 라디칼 소거능은 Blois의 방법(Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature, 1958; 181: 1199-1200)으로 측정하였다. 실시예 1의 복합 생약재 추출물을 MeOH로 녹여 최종 농도가 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖가 되도록 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 0.3 mM DPPH 500 ㎕를 넣어 총 양이 1 ㎖가 되도록 하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA 판독기(Bio-Tek, USA)로 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 1a에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능은 하기 수학식 1에 따라 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로는 합성 항산화제로 잘 알려진 BHT(butylated hydroxy toluene) 800 ㎍/㎖를 사용하였다.

도 1a의 결과에서, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 200 ㎍/ml의 농도에서 양성대조군인 BHT와 유사한 효능을 보였고, 400 ㎍/ml과 800 ㎍/ml에서는 BHT 보다 우수한 효능을 보였다.

또한 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 복합 생약재와 각 생약재를 800 ㎍/ml 씩 단독으로 사용한 후 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 결과, 도 1b에서 보여지는 바와 같이 복합 생약재의 DPPH 라디칼 소거능이 생약재들을 단독으로 사용한 것보다 월등히 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<아질산염(nitrite) 소거능>

Gray와 Dugan의 방법(Gray JI, Dugan JRL. Inhibition of N-nitrosamine formation in model food system. J Food Sci. 1975; 40: 981-985)에 따라 일정 농도의 실시예 1의 복합 생약재 추출물 1 ㎖에 1 mM NaNO₂ 용액 1 ㎖를 가한 뒤 0.1 N HCl과 0.2 M 시트레이트 완충액을 이용하여 각각 pH 1.2, 3.0 및 6.0으로 보정한 다음 총 부피를 10 ㎖로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 각 반응액 1 ㎖를 취하여 2% 아세트산 3 ㎖와 30% 아세트산 용액으로 용해한 그리스 시약(1% 술파닐산(sulfanilic acid) : 1% 나프틸아민 = 1 : 1) 0.4 ㎖를 가하고 잘 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후 ELISA 판독기(Bio-Tek, USA)로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 소거능은 하기 수학식 2에 따라 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 산출하였으며, 그 결과를 도 1c에 나타내었다.

도 1c의 결과에서, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물은 농도 의존적으로 NO 소거율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 복합 생약재와 각 생약재를 800 ㎍/ml 씩 단독으로 사용한 후 NO 소거율을 비교한 결과, 도 1d에서 보여지는 바와 같이 복합 생약재의 NO 소거율이 생약재들을 단독으로 사용한 것보다 월등히 우수한 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 DPPH와 NO와 같은 프리라디칼(free radical)에 대한 추출물의 효과를 확인한 후 항산화 효소인 SOD의 활성을 측정하였다.

SOD(Superoxide dismutase) 활성 측정은 Marklund 등의 방법(Marklund S, Marklund G. Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1975; 47: 468-474)으로 측정하였다. 일정농도의 실시예 1의 복합 생약재 추출물 0.2 ㎖, Tris-HCl 완충액[50 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl) aminomethane) + 10 mM EDTA, pH 8.5] 3 ㎖, 7.2 mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.2 ㎖을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시키고 1 N HCl 1 ㎖를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 피로갈롤의 양은 420 nm에서 UV/VIS 분광광도계(Bekman, Germany)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, SOD 유사활성은 하기 수학식 3에 따라 시료 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 산출하였으며, 그 결과를 도 1e에 나타내었다.

도 1e의 결과에서, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물은 농도 의존적으로 SOD 활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 복합 생약재와 각 생약재를 800 ㎍/ml 씩 단독으로 사용한 후 SOD 활성을 비교한 결과, 도 1f에서 보여지는 바와 같이 복합 생약재가 생약재들을 단독으로 사용한 것보다 SOD 활성을 월등히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 피부병변과 귀 부종 개선 효과

<동물사육>

5주령의 수컷 NC/Nga 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로부터 구입하여 1주간 SPF(specific pathogen-free) 상태에서 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험에 사용하였다.

<면역>

Df 항원 면역에 의한 AD 유도는 Matsuoka 등(Matsuda H, et al., Development of atopic dermatitis-like skin lesion with IgE-hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 1997; 9: 461-466)과 Yamamoto 등(Yamamoto M, H. et al., A Novel Atopic Dermatitis Model Induced by Topical Application with Dermatophagoides Farinae Extract in NC/Nga Mice. Allergol Int. 2007; 56(2): 139-148)의 방법을 약간 변형하여 도 2와 같이 설계한 후 수행하였다.

도 2의 과정을 간략히 살펴보면, 8주령의 NC/Nga 마우스를 대상으로 3일간은 Df 항원 없이 0∼100 mg/ml의 복합 생약재 추출물(실시예 1)만 20 ㎕ 씩 양쪽 귀에 도포한 후 약물이 귀 부종에 미치는 영향을 조사한 결과 약물 자체가 귀부종에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 그 후 마우스의 양쪽 귀를 스카치테이프로 강하게 붙여 잔털을 제거한 다음 Df 항원 20 ㎕(10 mg/ml)을 1주일에 2회 씩 4주간 도포하였다. 대조군과 각 실험군에 사용된 마우스는 각각 5마리를 배정하여 실험하였다. 대조군은 10% 에탄올이 들어 있는 생리식염수만 20 ㎕을 각각 양쪽 귀에 도포하였고, 실시예 1의 복합 생약재 추출물 25∼100 mg/ml를 에탄올에 녹이고 생리식염수를 첨가하여 대조군과 같이 알콜 농도가 10% 되도록 하여 각 농도의 시료를 1일에 1회씩 4주간 도포하였다. 마지막으로 Df 항원으로 면역과 동시에 시료를 투여한 다음 24시간 후에 마우스를 에테르로 마취하고 복강을 절개하여 간문맥으로부터 혈액을 얻어 실온에 1시간 동안 방치하여 혈액을 응고시켰다. 응고된 혈액은 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청은 -70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

<피부병변의 평가>

피부병변 상태는 1주 간격으로 4주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 피부의 건조상태(dryness), 스켈링(scaling), 미란(erosion), 찰과상(excoriation), 및 출혈 등을 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 병변이 가벼운 상태에서 매우 심한 상태를 1점에서 15점으로 구분하여 피부 병변을 평가하였으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a의 결과에서, Df 항원을 도포하였을 때 피부 병변은 2주때 점차 나타나 시간이 지날수록 악화되었으나, 본 발명에 의한 실시예 1의 복합 생약재 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 피부 병변이 개선됨을 확인하였다. 이때, 복합 생약재 추출물 25 mg/ml 도포군에서는 3주까지 피부 병변이 개선되지 않았지만, 4주에는 유의적으로(p<0.05) 개선되었고, 50 mg/ml과 100 mg/ml 도포군에서는 2주때부터 유의적으로 피부 병변이 개선되었다(p<0.5, p<0.01).

또한 귀의 부종에 미치는 추출물의 효과를 알아보기 위하여, 마우스의 귀 두께를 측정하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b의 결과에서, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물의 농도에 의존적으로 귀의 부종이 개선되었으며, 이는 상기 피부병변의 개선 효과와 일치하는 것이다.

<피부조직관찰>

한편 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물이 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 피부조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여 4주간 실시예 1의 복합 생약재 추출물과 Df 항원을 처리한 후 24시간에 마우스를 희생시키고 귀 조직을 적출하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 먼저, 실험 과정에 따라 대조군과 실험군을 대상으로 희생시키고, 귀 조직을 약 10x10 mm를 적출하여 클립을 이용하여 평평하게 유지하고 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)로 고정하고 일련의 과정을 통하여 파라핀 블록을 제작한 후 5 ㎛ 간격으로 피부조직을 종단면으로 절편하였다. 조직학적 검사와 백혈구 침윤을 검사하기 위해서 H&E(hematoxylin & eosin) 또는 콩고레드로 염색하여 저배율(x40)에서 관찰하고 확대하면서 x200 현미경 시야에서 사진을 찍어 제시하였고, 백혈구의 침윤을 확인하기 위해서 x400 현미경 시야에서 검경하였다(Olympus, 일본).

도 4의 결과에서, 대조군에 비해서 Df 항원만 처리된 실험군에서는 백혈구가 매우 많이 침윤되어 염증반응이 매우 심하게 진행됨을 알 수 있었다. 그러나 Df 항원과 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물이 함께 도포된 실험군에서는 농도에 의존적으로 백혈구 침윤상태가 완화됨을 확인할 수 있었고 귀 조직이 대조군과 유사하게 현저히 개선됨을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 혈청 내 IgE 및 CTACK/CCL27 생산량에 미치는 효과

혈청 내 Df 항원에 대한 IgE와 CTACK/CCL27의 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 혈청 내 IgE 총량은 상기 시험예 2에서 획득한 마우스 혈청을 25배 희석하여 각 웰에 주입하고 Shibayagi사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 준하여 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에서, 대조군의 혈청 IgE 생산량은 베이스 수준이었지만, Df 항원만 도포된 실험군은 IgE의 생산량이 증가된 반면, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물 50 mg/ml(p<0.05) 및 100 mg/ml(p<0.01)이 도포된 실험군에서는 농도에 의존적으로 IgE의 생산량이 현저히 줄어들었다.

또한 혈청 내 CTACK/CCL27의 정량은 상기 시험예 2에서 획득한 혈청을 10배로 희석하여 각 웰에 주입하고 R&D사가 제공하는 표준 시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6의 결과에서, 대조군의 혈청 CTACK/CCL27 생산량은 베이스 수준이었지만, Df 항원만 도포된 실험군은 CTACK/CCL27의 생산량이 현저히 증가된 반면, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물 50 mg/ml(p<0.05) 및 100 mg/ml(p<0.01)이 도포된 실험군에서는 농도에 의존적으로 CTACK/CCL27의 생산량이 현저히 줄어들었다. 이러한 추출물의 효과는 피부병변 및 귀의 염증상태를 개선하는데 CTACK/CCL27의 억제를 통해서 일어남을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 혈청의 NO와 PGE₂ 생산량 변화

혈청 내 염증 매개물인 NO와 PGE₂ 함량을 측정하기 위하여 NO는 바이오비전사가 제공하는 분석 키트와 측정 방법에 따라 수행하였다. PGE₂는 R&D 시스템사가 제공하는 ELISA 분석 키트와 방법에 따라 각각 측정하였다. 즉, 혈청을 10배 또는 25배 희석하여 각 웰에 주입하고 R&D 시스템사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 준하여 측정하였으며, 그 결과를 도 7a 및 7b에 각각 나타내었다.

도 7a 및 7b의 결과에서, 대조군의 혈청의 NO와 PGE₂는 베이스 수준이었지만 Df 항원만 도포한 실험군에서는 NO와 PGE₂가 현저히 증가되었다. 그러나 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물이 투여된 실험군에서는 추출물의 농도에 의존적으로 감소하였다. 특히, 복합 생약재 추출물 50 mg/ml(p<0.05) 및 100 mg/ml(p<0.01)이 도포된 실험군에서는 NO와 PGE₂의 생산량이 현저하게 감소하였다.

[시험예 5] SOD, 카탈라아제 및 GPX 활성 측정

SOD, 카탈라아제 및 GPX의 활성의 측정은 Calbiochem사(CA, USA)가 제공하는 분석 키트를 사용하여 회사가 제공하는 방법에 준하여 수행하였다. 앞서 준비된 조직 용출 시료를 대상으로 Biorad사(CA, USA)가 제공하는 단백질 정량 키트를 활용하여 단백질을 정량하였다. 그 후 Calbiochem사가 제공하는 방법대로 수행하여 Multiple spectrophotomer (Molecular Devise, CA USA)을 활용하여 SOD(450 nm), 카탈라아제(540 nm) 및 Gpx (340 nm)의 활성을 측정하였다. SOD의 활성은 ml당 Unit로, 카탈라아제는 ml/min 당 nM로, Gpx는 ml/min 당 nM로 각각 계산하였으며, 그 결과를 도 8a 내지 8c에 나타내었다.

도 8a 내지 8c의 결과에서, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물이 투여된 실험군에서는 추출물의 농도에 의존적으로 SOD, 카탈라아제 및 GPX의 활성이 증가하였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약 추출물은 그 자체로 DPPH와 NO와 같은 자유라디칼을 제거하는 효과가 우수하였고, SOD 활성을 촉진하였다. 또한 아토피 피부염 유발에 원인이 되는 Df 항원으로 처리된 모델 마우스에서 피부병변 및 염증개선효과 뿐만 아니라 아토피 피부염에 특징적으로 매우 높게 나타나는 IgE와 CTACK/CCL27의 생산량을 현저히 억제시켰다. 더불어 아토피 피부염에 노출되면 산화적 스트레스에 빠지게 되는데, 본 발명에 의한 복합 생약재 추출물을 투여한 결과 O₂ ^- 및 H₂O₂를 효과적으로 제거하는 SOD와 카탈라아제의 활성을 증가시켰으며, 생체 내에서 자유라디칼을 가장 효과적으로 제거하는 GPX의 활성도 증가시켰다. 따라서, 본 발명에 의한 부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약 추출물은 아토피 피부염 예방 또는 치료에 유용한 것임을 확인할 수 있었다.

Claims

부평초, 창이자, 어성초, 포공영, 수세미, 길경 및 황금으로 이루어진 복합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 복합 생약재 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 1∼90 중량%로 함유됨을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 조성물.