KR102474794B1

KR102474794B1 - 약초 복합추출물을 함유하는 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102474794B1
Application number: KR1020200085975A
Authority: KR
Inventors: 박지호; 박기원
Original assignee: (주)아크
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-12-06
Also published as: KR20220007987A

Abstract

본 발명은 선별한 복합약초를 이용한 반려동물 등의 아토피 피부질환을 개선 내지 완화시키는 동물 사료 첨가제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분작용을 최소화하며, 효과를 향상시킨 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 경기도지역협력연구센터 지원사업의 "[GRRC-응용5]의·약·화학 소재의 산업화 응용 연구(2/2)"[연구과제번호: 20192228]의 지원에 따른 결과물이다.

Description

약초 복합추출물을 함유하는 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 및 이의 제조방법{ANIMAL FEED ADDITIVE COMPOSITION CONTAINING HERBAL COMPLEX EXTRACT FOR IMPROVING ATOPIC DERMATITIS AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 선별한 약초의 복합추출물을 함유하는 아토피 피부질환을 개선 내지 완화시키는 동물 사료 첨가제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장기간 복용에 따른 부작용을 최소화하며, 아토피 개선 내지 완화효과를 향상시킨 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제에 관한 것이다.

고령화와 1인가구 급증에 따른 인구구조 변화, 소득증가 등에 따라 반려동물을 보유하는 가구가 크게 증가하고 있는 추세이며 단순히 키우는 애완동물에서 삶의 동반자로 변화하고 있다. 이를 반영하듯 국내 반려동물 관련 시장규모는 2012년 9,000원억원, 2015년에는 1조 8,000억원, 2020년에는 5조 8,000억원으로 예상되어 앞으로도 꾸준히 시장의 성장이 기대된다.

시장의 증가세와 달리 현재 펫푸드시장의 70% 이상이 외국산 브랜드이다. 이에 국산품에 대한 낮은 신뢰도를 향상시키고, 소비자들의 니즈파악을 선행하여 수입의존도를 낮추고 국산품의 점유율을 높인 수 있는 방안이 필요한 실정이다. 아토피는 환경의 급격한 변화, 유전적인 요인, 면역학적 이상 및 피부보호막의 이상 등의 원인으로 인해 발생하는 만성 재발성 염증 피부질환으로 비단 인간뿐만 아니라 반려동물들에게도 아토피 피부염 발병률이 증가하고 있어 이를 완화하는 치료법에 대한 관심이 높아지고 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1674572호 대한민국 등록특허공보 제10-1978761호

본 발명은 천연물을 원료로 한 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물은 자초, 어성초 및 부평초 혼합물의 추출물을 포함한다.

상기 혼합물은 자초, 어성초, 부평초를 1 : 4.5 : 2.5의 중량비로 혼합한 것 일 수 있다.

상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으며, 상기 추출물은 동결건조 추출물일 수 있다.

상기 추출물은 1 일(day) 단위 30mg/kg의 용량으로 경구 투여하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 사료는 상기의 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 함유한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물 제조방법은 자초, 어성초 및 부평초를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 추출물을 건조하는 단계를 포함한다.

상기 혼합물은 자초, 어성초 및 부평초를 1 : 4.5 : 2.5의 중량비로 혼합한 것일 수 있다.

상기 추출물은 상기 혼합물을 에탄올 추출하는 것일 수 있다.

상기 추출물의 건조는 동결건조 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 효율적이며 효과적인 아토피 피부염 완화방법을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 복합추출물을 제공함으로써, 복합추출물을 구성하는 단일추출물과 대비하여, 독성이 개선되며 단일추출물 대비 아토피 개선작용이 향상되는 효과가 있다.

또한, 장기간 복용에도 부작용이 적으며, 효과가 향상된 아토피 피부질환 개선 조성물을 제공하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 오존을 이용한 향 제거 및 살균 공법 추가함으로써, 약초 특유의 냄새로 인한 반려동물의 섭취거부를 줄일 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물의 제조방법을 순차적으로 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 각 추출물의 HepG2 세포에서 독성 테스트 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스의 피부조직 표피층의 두께를 관찰한 이미지를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스의 피부조직 표피층의 두께 측정 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스의 등 피부조직을 관찰한 이미지를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스의 등 피부조직에 대하여 비만세포 수의 계수 결과를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스(처리군)의 긁는(Scratching) 횟수에 따른 결과값을 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스(처리군)의 아토피 유발 내지 개선과 관련하여 육안 평가를 위한 등 부위의 촬영 결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 누드 마우스(처리군)에 대한 아토피 증세의 육안평가(SCORAD) 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 누드 마우스(처리군)에서 추출물의 면역반응에 대한 효과를 알아보기 위해 immunoglobulin E(IgE)의 수치를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 누드 마우스(처리군)의 체중변화를 도시한 것이다.

이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

아래 설명에서 사용되는 용어는, 연관되는 기술 분야에서 일반적이고 보편적인 것으로 선택되었으나, 기술의 발달 및/또는 변화, 관례, 기술자의 선호 등에 따라 다른 용어가 있을 수 있다. 따라서, 아래 설명에서 사용되는 용어는 기술적 사상을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 되며, 실시예들을 설명하기 위한 예시적 용어로 이해되어야 한다.

또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 설명 부분에서 상세한 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 아래 설명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가지는 의미와 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 이해되어야 한다.

한편, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의하여 한정되지 않는다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다．

한편, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 아토피 피부질환 개선용 동물 첨가제 조성물은 가축동물, 야생동물, 반려동물의 아토피 피부질환 개선 내지 완화하기 위한 것일 수 있으며, 상기 반려동물은 강아지, 고양이, 토끼 등 사람이 가까이 두는 동물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 동물 사료 첨가제는 가축동물의 생산성 향상, 반려동물의 건강을 증진 및/또는 유지시키거나 신체 컨디션 유지를 위해 첨가되는 물질을 의미한다.

상기 추출물은 1 일(day) 단위 30 mg/kg의 용량으로 경구 투여하는 것일 수 있으며, 상기 30 mg/kg의 투여 용량은 1 일(day) 기준 투여 개체의 중량(kg) 대비 상기 추출물의 건조된 분말을 30 mg으로 경구 투여하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 사료는 본 발명의 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물을 함유할 수 있다. 본 발명의 동물 사료는 당업계에 공지되거나 시판되는 임의의 배합사료에 본 발명의 동물 사료 첨가제를 추가함으로써 구성될 수 있으며, 상기 배합사료는 급여하는 동물의 종류에 따라 그 조성 및 제조방법을 달리할 수 있으며, 본 발명에서 그 조성 및 제조방법을 특별히 제한하지 않는다

또한, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 반려동물 아토피 피부질환 개선 동물 사료 첨가제 조성물 제조방법의 순서도를 도시한 것으로, 도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제 조성물 제조방법은 자초, 어성초 및 부평초를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계(S100); 상기 혼합물을 추출하여 추출물을 수득하는 단계(S200); 및 상기 추출물을 건조하는 단계(S300)를 포함한다.

상기 추출물을 수득하는 단계(S200)는 에탄올에서 추출하는 것일 수 있다.

상기 추출물을 건조하는 단계(S300)는 동결건조 하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예. 복합추출물의 제조

자초(Lithospermum　erythrorhizon), 어성초(Houttuynia cordata), 부평초(Spirodela polyrhiza)를 1 : 4.5 : 2.5의 중량비로 혼합하여 추출하였다.

자초 2.13 kg, 어성초 9.56 kg 및 부평초 5.3 kg을 배합한 후, 배합한 혼합물 17 kg을 70 % EtOH 200 L에 넣어 100 ℃에서 2 시간(h) 동안 추출하였다. 이후, 추출액 20 L까지 농축한 후 동결건조하여 추출물을 수득하였다.

실험예. 간세포 독성 평가

본 발명에 사용한 RAW 264.7 세포는 설치류 유래 대식세포주로 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위해서 10% 열 불활성 FBS, 100 units/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기(CO₂ incubator BB 15, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Germany)에 배양하였다.

추출물의 HepG2 cell 내 독성은 MTT법(MTT assay)을 이용하였다. 추출물의 독성 평가를 위해 96-well plate에 1.0Х10⁴ cells/well로 분주하여 3시간 배양하였으며, 배지 제거 후, 추출물은 100 μg/mL (ppm)의 농도로 100 μL씩 분주하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 시약 100 μL을 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, DMSO를 50 μL씩 분주하여 보라색의 포마잔(formazan)을 용해시켰으며, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200, TECAN Austria GmbH, Grodig, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 독성은 대조군(control)의 세포 생존율 대비 90% 이상의 생존율을 보인 농도로 설정하였다.

자초, 어성초, 부평초 각각의 추출물과 이 3가지를 혼합한 실시예의 복합추출물('복합물')의 독성을 평가하기 위해 HepG2 세포에서 독성 테스트를 진행하였다. 독성 테스트 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2를 참조하면, 모든 추출물은 100μg/mL의 농도로 처리하였으며, 그 결과 실시예의 복합추출물('복합물') 90.41±2.56 %, 자초 105.45±6.52 %로 유의한 차이는 없었으나, 어성초(46.02±7.89 %)와 부평초(76.58±10.41 %)는 실시예의 복합추출물('복합물')로 처리하였을 때보다 생존율이 유의하게 낮게 나타나 추출물의 단독처리보다 실시예의 복합추출물('복합물')로 처리하였을 때 독성이 낮아짐을 확인하였다

실험예. 아토피 억제능 평가

아토피의 유도

아토피를 유발시키는 DNCB(dinitrochlorobenzene) 용액은 아세톤 : 올리브오일을 3 : 1의 비율(v/v)로 혼합된 용액에 희석하여 1%와 0.5% DNCB 용액을 제조한다. 제조된 DNCB 용액은 아토피 유도 대상군에 대하여 첫 주에는 매일 1% DNCB용액 150㎕를 등 부위에 도포하여 면역반응을 유발한다. 그리고 다음 3주간 주 3회 0.5% DNCB용액 150㎕를 등 부위에 동일하게 도포하여 접촉성 피부염을 서서히 유도한다.

실험군 및 추출물의 처리

아토피를 유발시키지 않은 대조군('Control'), DNCB 용액으로 아토피 반응을 유발시킨 비교군('DNCB'), DNCB 용액으로 아토피 반응을 유발시킨 후 본 발명에서의 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물'), DNCB 용액으로 아토피 반응을 유발 시킨 후 자초 단일추출물을 투여한 실험군 2('DNCB+자초'), DNCB 용액으로 아토피 반응을 유발시킨 후 어성초 단일추출물을 투여한 실험군 3('DNCB+어성초'), DNCB 용액으로 아토피 반응을 유발시킨 후 부평초 단일추출물을 투여한 실험군 4('DNCB+부평초')으로 각각의 그룹을 분류한 뒤, 처리군으로 각 그룹 당 6마리의 누드 마우스(BALB/c nude mice)(4주령)에 대하여 실험을 진행하였다. 각각의 대조군, 비교군 및 실험군은 하기 표 1에서와 같이 정리될 수 있다.

구분	처리 항목	표시
대조군	아토피를 유발시키지 않음	'Control'
비교군	DNCB용액으로 아토피 반응 유발	'DNCB'
실험군 1	DNCB 용액으로 아토피 반응 유발 후, 복합추출물(실시예) 투여	'DNCB+복합물'
실험군 2	DNCB 용액으로 아토피 반응 유발 후, 자초 단일추출물 투여	'DNCB+자초'
실험군 3	DNCB 용액으로 아토피 반응 유발 후, 어성초 단일추출물 투여	'DNCB+어성초'
실험군 4	DNCB 용액으로 아토피 반응 유발 후, 부평초 단일추출물 투여	'DNCB+부평초'

대조군('Control')은 누드 마우스에 대하여 4주간 매일 PBS(Phosphate Buffer Saline)을 100㎕씩 경구투여 하였다.

비교군('DNCB')은 누드 마우스에 대하여, 대조군('Control')과 동일하게 4주간 매일 PBS를 투여하였으며 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간(1주차) 매일 도포한 후 나머지 3주간(2 내지 4주차) 0.5% DNCB 150㎕를 주 3회 도포하였다.

본 발명의 실시예의 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')의 경우, 누드 마우스에 대하여 실시예의 복합추출물을 30mg/kg의 양으로 4주간(1 내지 4주차) 매일 경구투여 하며, 비교군('DNCB')과 동일한 과정으로 DNCB 용액을 도포하였다.

단일추출물을 투여한 실험군 2 내지 4('DNCB+자초', 'DNCB+어성초', 'DNCB+부평초')은 누드 마우스에 대하여, 각각의 단일추출물(자초, 어성초, 부평초) 30mg/kg의 양으로 4주간(1 내지 4주차) 매일 경구투여 하며, 비교군('DNCB')과 동일한 과정으로 DNCB 용액을 도포하였다.

상술한 각 처리군의 내용을 정리하면 하기 표 2와 같다.

구분	처리 항목
대조군	1 ~ 4 주차: 매일 PBS(Phosphate Buffer Saline) 100㎕ 경구투여
비교군	1 주차: 매일 PBS(Phosphate Buffer Saline) 100㎕ 경구투여 + 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간 매일 도포 2 ~ 4 주차: 매일 PBS(Phosphate Buffer Saline) 100㎕ 경구투여 + 등 부위에 0.5% DNCB 150㎕ 주 3회 도포
실험군 1	1 주차: 실시예의 복합추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간 매일 도포 2 ~ 4 주차: 실시예의 복합추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 0.5% DNCB 150㎕ 주 3회 도포
실험군 2	1 주차: 자초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간 매일 도포 2 ~ 4 주차: 자초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 0.5% DNCB 150㎕ 주 3회 도포
실험군 3	1 주차: 어성초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간 매일 도포 2 ~ 4 주차: 어성초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 0.5% DNCB 150㎕ 주 3회 도포
실험군 4	1 주차: 부평초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 1% DNCB 150㎕를 1주간 매일 도포 2 ~ 4 주차: 부평초 단일추출물을 30mg/kg 매일 경구투여 + 등 부위에 0.5% DNCB 150㎕ 주 3회 도포

조직 병리학적(Histology) 분석_조직화학염색

실험군에 대하여 각 추출물을 투여한 누드 마우스(처리군)를 희생시킨 다음, 등 피부(back skin) 조직을 떼어 내어 10% 중성포르말린에서 24시간 고정하였다. 그 후, 등 피부조직을 파라핀으로 포매(embedding)하고 5 μm 두께로 절단하여 슬라이드에 붙여 37°에서 overnight으로 말렸다.

누드 마우스(처리군)의 등 피부조직 표피층의 두께 변화는　헤마톡실린-에오신(Hematoxyline-Eosin) 염색으로 관찰하였으며, 헤마톡실린-에오신 염색을 한 조직은 100배율에서 관찰하여 카메라(ZEISS Axio Cam, Carl ZEISS co., Oberkochen, Germany)가 구비된 광학현미경(Olympus BX51, Olympus Optical Co., Tokyo)을 이용하여 표피의 두께를 측정하였다

조직 중 비만세포는 0.25% 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하여 관찰하였고, 톨루이딘 블루에 양성인 비만세포는 200배율에서 세포를 계수(count)하여 세포수(cells)/mm²로 표현하였다.

추출물 처리에 따른 누드 마우스(처리군) 표피층의 두께변화

DNCB 용액에 의해 아토피가 유도된 누드 마우스(처리군)는 피부조직 표피층의 세포의 과증식으로 인해 각질층이 두껍게 형성이 된다. 따라서 헤마톡실린-에오신 염색을 통해 누드 마우스(처리군)의 등 피부조직의 표피층의 두께를 관찰하여 각 추출물의 아토피 완화정도를 평가할 수 있다. 표피층의 관찰이미지를 도 3에 도시하였으며, 표피층의 측정한 두께를 도 4에 도시하였다.

도 3 및 도 4를 참조하면, 대조군('Control')의 표피층의 두께는 26.16±2.43 μm이고, 비교군('DNCB')의 표피 층 두께는 104.78±0.91 μm, 실험군 1('DNCB+복합물')은 41.96±2.51 μm으로 측정되었다.

대조군('Control')과 대비하였을 때, 비교군('DNCB')의 표피층 두께가 불균일하게 상당히 두꺼워졌으며, 실험군 1('DNCB+복합물')은 대조군('Control') 보다는 두껍지만 비교군('DNCB') 보다는 얇으며 표면 두께가 균일하고 표층이 부드럽게 형성되어 회복되고 있음을 관찰하였다.

또한, 실험군 2('DNCB+자초')는 74.89±2.29 μm, 실험군 3('DNCB+어성초')은 88.33±1.47 μm, 실험군 4('DNCB+부평초')는 70.98±1.84 μm으로 DNCB군보다는 표피층의 두께가 얇아졌지만, 본 발명의 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')의 두께보다는 두꺼운 것을 관찰할 수 있다.

따라서 본 발명의 복합추출물이 자초, 어성초, 부평초 각 각을 처리한 것보다 아토피의 개선에 있어서, 보다 더 효과적임을 확인할 수 있다.

추출물 처리에 따른 비만세포 수의 변화

아토피 피부염은 항원의 침투에 피부 보호막의 기능이상을 막기위해 비만세포가 활성화되며, 세포수가 증식이 된다. 따라서, DNCB 용액에 의해 아토피가 유발된 누드 마우스의 피부에서 비만세포의 수를 관찰하기 위해 누드 마우스(처리군)의 등 피부조직을 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하여 추출물을 처리한 군들과 비교하여, 관찰한 이미지를 도 5에 도시하였으며, 비만세포 수의 계수 결과를 도 6에 도시하였다.

도 5 및 도 6을 참조하면, 대조군('Control')은 비만세포의 수가 33.67±3.67개였고, 비교군('DNCB')은 94.50±11.90개로 대조군에 비해 약2.8배 정도 증가하였다. 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')은 49.33±3.92개로 대조군에 비해서는 높았으나 비교군에 비해서는 유의성 있게 낮았다.

또한, 단일추출물을 투여한 실험군 2('DNCB+자초')는 58.50±1.87개, 실험군 3('DNCB+어성초')은 60.50±6.39개, 실험군 4('DNCB+부평초')은 81.00±4.95개로, 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')과 대비하였을 때 비만세포의 수가 증가하였다. 이를 통하여 본 발명의 복합추출물의 아토피 개선 효과가 자초, 어성초, 부평초 단일추출물 보다 우수함을 확인할 수 있다.

행동실험 및 육안 평가(the Scoring Atopic Dermatitis (SCORAD) 지표)

누드 마우스(처리군)의 가려움(itching), 홍반(erythema), 피부 벗겨짐(excoriation), 건조피부 및 딱딱한 껍질(dryness/crusting) 총 4개의 평가 항목을 육안 평가법으로 관능 평가 실시하여 측정한다. 각 평가 항목은 (없음: 1, 약함: 2, 중간: 3, 심함: 4)의 점수로 점수를 산정하여, 산정된 점수를 합산하여 각 군 및 개체의 아토피 유발 내지 개선 정도를 측정한다.

가려움(itching)의 경우 빈 케이지에 넣어 30분간 영상 레코딩 후, 긁는(scratching) 횟수를 영상을 통해 육안으로 측정함으로써 점수를 산정하였다.

추출물 처리에 따른 누드 마우스(처리군)의 긁는 횟수 측정

아토피를 유도하는 항원이 피부내로 침투하게 되면 면역반응에 의해 침투된 부위를 계속해서 긁게되고 긁은 부위에 상처가 남으로 각질층이 두껍게 형성되며 추출물이 면역반응을 감소시킨다면 아토피로 인한 긁는 행위를 감소시켜준다. 따라서, 누드 마우스(처리군)의 긁는(Scratching) 횟수에 따른 결과값을 도출하여 이를 도 7에 도시하였다.

도 7을 참조하면, 대조군('Control')의 횟수는 9.6±1.03 이고, 비교군('DNCB')은 42.40±0.93, 본 발명의 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')은 15.00±1.41이었다.

또한, 실험군 2('DNCB+자초')는 23.80±1.77, 실험군 3('DNCB+어성초')은 22.80±2.90, 실험군 4('DNCB+부평초')는 21.60±1.91 이었다.

대조군('Control')에 비해 비교군('DNCB')의 횟수가 확연히 증가하여 아토피 유발이 정상적으로 이루어졌음을 알 수 있다.

또한, 비교군('DNCB')과 대비하여 복합추출물을 처리한 실험군 1('DNCB+복합물')의 결과를 보았을 때, 대조군('Control')에서 측정되었던 값만큼 긁는(scratching) 횟수가 감소하여 DNCB 용액으로 인한 아토피 유발에 대하여 본 발명의 복합추출물이 아토피 개선 효과를 갖는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 자초, 어성초, 부평초의 효과보다 복합추출물의 효과가 향상되었음을 도 7에서 확인할 수 있다.

SCORAD 점수로 평가한 추출물의 효과비교

누드 마우스(처리군)의 아토피 유발 내지 개선과 관련하여 육안 평가를 위한 등 부위의 촬영 결과를 도 8에 도시하였다.

도 8을 참조하면, 대조군('Control')과 대비하여 비교군('DNCB')의 각 처리군(누드 마우스)에서 확연하게 아토피가 유발되었으며, 홍반 및 피부 벗겨짐, 딱딱한 피부껍질 등 대표적인 아토피 증세가 육안으로 확인할 수 있다.

육안평가(SCORAD)는 추출물들의 처리에 따른 효과 비교를 수치화하기 위해 도입한 방법으로 아토피 증세의 강도를 평가하는데 널리 쓰여진다. 평가 항목은 긁는 횟수, 홍반, 피부 벗겨짐, 피부껍질의 강도 총 4개의 합산 값을 결과로 도출하여, 누드 마우스(처리군)에 대한 아토피 증세의 도출된 결과를 도 9에 도시하였다.

도 9를 참조하면, 대조군('Control')의 점수는 4.80±0.20 이고, 비교군('DNCB')은 15.40±0.40, 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')은 7.00±0.45 이었다.

또한, 실험군 2('DNCB+자초')는 9.80±0.80, 실험군 3('DNCB+어성초')은 12.00±1.18, 실험군 4('DNCB+부평초')는 9.40±1.03 이었다.

대조군('Control')에 비해 비교군('DNCB')의 점수가 확연히 높아 아토피 유발이 정상적으로 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 비교군('DNCB')과 대비하여 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')의 결과를 보았을 때, 점수가 절반 정도로 확연히 줄어들어 DNCB로 인한 가려움, 홍반, 피부 벗겨짐 그리고 건조 및 딱딱한 피부 등의 아토피로 인한 증상에 대하여 본 발명의 복합추출물이 개선효과를 보인다는 것을 관찰할 수 있다. 또한 복합추출물이 자초, 어성초, 부평초에서의 점수 보다 유의적으로 더 낮게 산정되는 바, 이를 통하여 단일 추출물보다 복합추출물이 아토피 개선에 보다 더 좋은 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있다.

혈중 Immunoglobulin E(IgE) 양 측정

아토피 피부염에서 항원물질이 피부를 통해 유입되면 Th-2 cell에서 이를 감지하여 IgE를 생성하여 이후 면역반응을 일으킨다. 따라서 아토피를 유도한 누드 마우스에서 추출물의 면역반응에 대한 효과를 알아보기 위해 immunoglobulin E(IgE)의 수치를 측정하였다.

각 추출물을 투여한 누드 마우스(처리군)를 호흡마취 시킨 다음, 안와정맥 채혈 방법으로 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 상온에서 30분 정도 응고시킨 후, 원심분리기(14000rpm, 4℃, 15min)를 사용해 혈액으로부터 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 실험에 이용하기 전까지 -80 ℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 이후, 보관된 혈청을 녹여 Mouse IgE ELISA kit(ab 157718, Abcam, USA)을 이용해 각 시료의 IgE의 양을 측정하였다. 측정결과를 도 10에 도시하였다.

도 10을 참조하면, 대조군('Control')에서의 IgE의 값은 0.083±0.004ng/mL이고, 비교군('DNCB')은 0.265±0.018ng/mL으로 대조군('Control')에 비해 2배 이상 증가하여 나타났고, 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')은 0.129±0.012ng/mL으로 대조군('Control') 보다 약간 높지만 비교군('DNCB')과 대비하여 유의성 있는 낮은 값을 가지고 있다.

또한, 실험군 2('DNCB+자초')는 0.151±0.055ng/mL, 실험군 3('DNCB+어성초')은 0.194±0.068ng/mL, 실험군 4('DNCB+부평초')는 0.134±0.021ng/mL으로 비교군('DNCB')보다 낮은 수치를 보이나, 복합추출물 처리한 실험군 1('DNCB+복합물') 보다 높은 값을 보였다. 이를 통하여, 본 발명의 복합추출물이 면역반응의 불균형을 약화시킨다는 것을 알 수 있다.

실험예. 실험동물의 체중변화 관찰

아토피가 발현되지 않은 대조군('Control'), 아토피 반응을 유발시킨 비교군('DNCB'), 본 발명에서의 복합추출물을 투여한 실험군 1('DNCB+복합물')의 누드 마우스(처리군)의 체중을 0 내지 6 주(week) 동안 1 주일(week) 단위로 측정하면서 실험군 1('DNCB+복합물')에 대해서는 본 발명의 추출물(복합사료)를 투여하였으며, 이를 도 11에 도시하였다.

도 11을 참조하면, 각 누드 마우스(처리군)의 체중은 평균 17.4g으로 각 처리군 사이에 차이가 없었다.

한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시 예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

Claims

동물사료 첨가제의 제조방법에 있어서,
상기 동물사료 첨가제 제조방법은 자초, 어성초 및 부평초를 1 : 4.5 : 2.5의 중량비로 혼합한 다음,
상기 혼합물 17kg을 70% 에탄올 200L에 넣어 100℃에서 2 시간(h) 동안 추출한 후,
상기 추출액이 20L가 될때까지 농축하고 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제의 제조방법
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제 1 항의 방법으로 제조된 아토피 피부질환 개선용 동물 사료 첨가제를 함유하는 동물 사료.
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