KR101205097B1

KR101205097B1 - 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품

Info

Publication number: KR101205097B1
Application number: KR1020110020000A
Authority: KR
Inventors: 양재헌; 김대근
Original assignee: 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2011-03-07
Publication date: 2012-11-27
Also published as: KR20120101897A

Abstract

본 발명은 아토피성 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알로에를 추출 및 발효시킴으로서 유효성분의 피부침투력 및 항산화활성을 높이고, 항염 및 항알러지 효능을 증진시킬 수 있는 발효추출물을 제조하고, 이를 함유한 화장품을 개발하기 위한 목적으로 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품에 관한 것이다.
이를 위한 본 발명에 따른 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효추출물의 제조방법은, 알로에 껍질 1.0kg을 취하고 에탄올(EtOH) 2리터(L)를 넣어 50 ~ 60℃에서 8시간동안 가끔씩 흔들어 주면서 방치하는 단계; 에탄올 추출용액을 흔들어 주면서 여과지를 사용하여 감압으로 하여 여과하고 여액을 취하여 단계; 여과한 액을 감압농축기에 넣고 50 ~ 60℃에서 일정한 조건으로 감압 농축시켜 연조엑스 상태로 만드는 단계; 베타글루코시다제(β-glucosidase) 50,000unit를 10밀리리터의 물에 녹여 연조엑스에 가하고, 40 ~ 50℃에서 8시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 발효 및 가수분해시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.

Description

아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품{.}

본 발명은 아토피성 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 알로에를 추출 및 발효시킴으로서 유효성분의 피부침투력 및 항산화활성을 높이고, 항염 및 항알러지 효능을 증진시킬 수 있는 발효추출물을 제조하고, 이를 함유한 화장품을 개발하기 위한 목적으로 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 화장품에 관한 것이다.

알로에는 백합과(Liliaceae)에 속하는 알로에속의 다년생 열대식물로서 원산지는 주로 아프리카이며 현재 600여종이 세계 각지에 분포 또는 재배되고 있다. 우리나라에서 주로 재배되고 있는 알로에는 알로에 베라(A. barbadensis Mill.)와 알로에 아보레센스(A. arborescens Mill .), 알로에 사포나리아(A. saponaria Haw .) 등이다. 알로에는 오래전부터 민간약으로 사용되기 시작하여 주로 고미 건위 및 완하제로 이용되어 왔다. 모두 정도의 차이는 있으나 항염증작용, 항궤양 및 세포재생작용, 항균 및 항진균작용, 항바이러스작용, 혈당개선작용, 위액분비억제작용, 간세포보호작용, 사하작용, 면역조절작용, 항암작용 등을 가지고 있다.

알로에가 가장 많이 활용되고 있는 분야는 화장품으로써 피부보습 기능이 뛰어나고 항염작용, 항알러지작용, 항산화작용 및 피부 연화작용이 탁월하여 어린이로부터 노인에 이르기까지 다양한 층에서 쓰이고 있다.

특히 아토피 피부염은 만성질환으로써 화장품 종류에 따라 민감한 반응을 나타내기 때문에 알로에 추출물을 아토피 피부염에 사용하기위한 연구가 끊임없이 이어져 왔다.

아토피 피부염 (Atopic dermatisis, AD)은 소양감을 동반하는 만성 재발성 피부질환으로 약 50%의 환자에서 1세 이전에 시작되며 30%정도가 1세에서 5세 사이에 발병하는 것으로 알려져 있다. 아직까지 아토피 피부염의 기전은 완전히 밝혀지지 않았지만, 단순포진이나 종두증과 같은 바이러스 감염에 대한 취약성과 특정 미생물 항원에 대한 지연형 면역 반응의 감소, IgE의 생산 증가, 접촉 알레르겐에 대한 감수성 감소, 분열 촉진제와 항원에 대한 임파구의 반응 감소, 과립구와 단핵구의 화학주성 감소 등 여러 가지 면역학적인 이상 소견들이 보고되어 있다. 또한, 이 질환의 유병율과 난치성 성인 아토피 피부염으로의 진행이 산업화 된 사회에서 점차 증가하는 추세에 있으며, 이는 아토피 피부염의 발생에 유전적 요인과 함께 산업화와 같은 환경적인 요인이 중요하다는 근거가 된다. 이 질환의 특징은 소양증, 가려움, 태선화, 발진, 인설, 전신 건조 등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다.

아토피 피부염의 치료는 피부염에 대한 기본적인 방법과 유발인자를 규명하여 제거하는 방법들이 적용되고 있다. 일반적으로 병원에서 아토피 피부염 환자의 치료에는 스테로이드제, 타크로리무스나 피메크로니무스와 같은 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 항히스타민제, 시클로스포린(cyclosporin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 아자치오프린(azathioprine)과 같은 면역억제제 등의 약제가 사용되고 있다. 국소 스테로이드제는 병변이 급성으로 악화될 때 증상을 신속하고 효과적으로 호전시킬 수 있으나, 지속적으로 사용 시 부신억제를 유발할 수 있으며 피부위축, 모세혈관 확장, 색소침착 저하, 스테로이드성 여드름, 다모증, 성장장애 등의 우려가 있어 단기간 사용과 표피가 얇거나 혈관이 많은 부위 등 민감한 피부에는 사용하는데 제한이 있다.칼시뉴린(Calcineurin)억제제의 경우 기존 치료에 보조적으로 사용할 수 있을 뿐 아니라 국소스테로이드제의 사용으로 인해 발생할 수 있는 문제점을 최소화하여 스테로이드성 내성환자, 눈이나 얼굴, 생식기 주변 등의 피부가 연약한 부위에 적용이 가능하나 2차 치료제로서 2세 이상 소아에서 단기간 사용에 한하여 허가되어 사용되고 있다.

아토피 치료용 약제를 사용하면서 장기적인 안목으로 아토피 예방 및 개선에 도움이 되는 화장품의 개발이 필요하다고 볼 수 있다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 아토피성 피부에 부작용을 나타내지 않으면서 장기간 사용 시 아토피 예방 및 개선에 도움을 주는 화장품의 개발에 관한 것이며, 피부알러지, 소양증, 접촉성 피부염, 미생물에 의한 피부염증, 피부발진 및 아토피질환으로부터 손상된 피부를 보호하고 예방하며 개선하기 위하여, 알로에 추출물에 효소를 가하여 발효 및 가수분해시키고, 여기에 황금 발효추출물, 어성초 발효추출물 등을 복합하여 바디로션, 바디클린저, 페이셜크림 및 바디크림 등 다양한 종류의 화장품을 개발하는데 그 목적이 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효추출물의 제조방법은, 알로에 껍질 1.0kg을 취하고 에탄올(EtOH) 2리터(L)를 넣어 50 ~ 60℃에서 8시간동안 가끔씩 흔들어 주면서 방치하는 단계;

에탄올 추출용액을 흔들어 주면서 여과지를 사용하여 감압으로 하여 여과하고 여액을 취하여 단계;

여과한 액을 감압농축기에 넣고 50 ~ 60℃에서 일정한 조건으로 감압 농축시켜 연조엑스 상태로 만드는 단계;

베타글루코시다제(β-glucosidase) 50,000unit를 10밀리리터의 물에 녹여 연조엑스에 가하고, 40 ~ 50℃에서 8시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 발효 및 가수분해시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 알로에 발효추출물을 이용하여 제조되는 화장품은, 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음, 정제수 40kg, 글리세릴스테아레이트 6kg, 피이지100스테아레이트 4kg, 소르비탄스테아레이트 3kg, 폴리소르베이트20 3kg, 디메치콘 0.5kg, 트리에탄올아민 1kg, 카프릴릭카프릴트리글리세라이드 4kg, 카보머941 1kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 이소도데칸 0.5kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 3kg, 디카프릴카보네이트 3kg, 스테아릴알코올 5kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 0.5kg, 디스테아디모늄헥토라이트 1kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 3kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디로션 기제를 조제한 후 상기 알로에 가수분해 추출 혼합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디로션을 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음, 정제수 50kg, 라우린산 6kg, 미리스틴산 4kg, 모노알킬포스페이트 1kg, 옥시벤존 0.5kg, 글리콜디스테아레이트 4kg, 트리에탄올아민 1kg, 폴리쿠아테니움 1kg, 라우릴설폰산트리에탄올아민 1kg, 라우라마이드 DEA 1kg, 사이클로메치콘 0.5kg, 코카미드프로필베타인 2kg, K-쿠일가수분해콜라겐 1kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 피이지-7-글리세릴코코에이트 5kg, 글리세린 5kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 1kg, 디메치콘 0.5kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 3kg, 프로필렌카보네이트 1kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디클린저 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디클린저로 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음, 정제수 35kg, 글리세릴스테아레이트 5kg, 피이지100스테아레이트 3kg, 소르비탄스테아레이트 4kg, 폴리소르베이트20 3kg, 디메치콘 1kg, 트리에탄올아민 1kg, 화이트비스왁스 2kg, 카보머941 1kg, 부틸렌글라이콜 0.5kg, 이소도데칸 1kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 1kg, 디카프릴카보네이트 1kg, 스테아릴알코올 4kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 1kg, 디스테아디모늄헥토라이트 1kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 2kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 페이셜크림 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 페이셜크림으로 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음, 정제수 40kg, 스쿠알란 1kg, 세티아릴알코올 1kg, 마카다미아씨 오일 1kg, 포도씨 오일 0.5kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 폴리글타믹애씨드 1kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 1kg, 디카프릴카보네이트 0.5kg, 스테아릭애씨드 3kg, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 1kg, 스테아릴알코올 1kg, 페녹시에탄올 0.5kg, 녹차씨오일 0.5kg, 아라카딜 알코올 0.4kg, 베헤닐알코올 0.3kg, 아라카딜 글루코사이드 0.3kg, 세틸팔미테이트 0.2kg, 소르비탄올리베이트 0.5kg, 소르비탄 팔미테이트 1kg, 세테아릴 올리베이트 0.5kg, 피이지-32 0.2kg, 세라마이드-3 0.3kg, 디메치콘 0.5kg, 알란토인 0.2kg, 카보머 940 0.5kg 및 트리에탄올아민 0.1kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디크림 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디크림을 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적 및 효과는 이하의 상세한 설명으로부터 명확하게 되고, 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내는 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니다.

본 발명에 따른 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조되는 화장품에 의하면, 접촉성 피부염, 미생물에 의한 피부염증, 피부 알러지, 소양증, 피부발진 및 아토피 질환으로부터 손상된 피부를 보호하고 예방하며 개선하기 위하여, 알로에 발효 및 가수분해 추출물에 황금 가수분해 추출물, 어성초 벌효추출물, 알로에베라 등을 복합하여 바디로션, 바디클린저, 페이셜크림 및 바디크림 등 다양한 종류의 화장품을 개발한 결과 피부에 대한 침투력이 강하고 높은 항산화작용과 함께 그람양성 및 음성균에 대한 항균력이 높고 집먼지 진드기로 유발된 마우스의 아토피에 대하여 양호한 예방 및 개선 효과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 따른 하나의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 주요성분으로 적용되는 알로에는 백합과(Liliaceae)에 속하는 알로에속의 다년생 열대 식물로서 원산지는 주로 아프리카이며 현재 600여종이 세계 각지에 분포 또는 재배되고 있다.우리나라에서 주로 재배되고 있는 알로에는 알로에 베라(A. barbadensis Mill.)와 알로에 아보레센스(A. arborescens Mill.), 알로에 사포나리아(A. saponaria Haw.) 등이다.

알로에는 오래전부터 민간약으로 사용되기 시작하여 주로 고미 건위 및 완하제로 이용되어 왔다. 모두 정도의 차이는 있으나 항염증작용, 항궤양 및 세포재생작용, 항균 및 항진균작용, 항바이러스작용, 혈당개선작용, 위액분비억제작용, 간세포보호작용, 사하작용, 면역조절작용, 항암작용 등을 가지고 있는 것으로 알려저 있다.

알로에 중에 함유되어 있는 유효성분으로는 barbaloin, aloesin, aloenin, isobarbaloin, isoaloeresin, aloe-emodin 등이 보고되어 있다.

알로에베라 추출물에 대한 약리활성에 관한 연구로는 알로에 추출물이 carrageenan으로 유발된 흰쥐의 족부종에 대하여 뚜렷한 억제효과를 나타내고 시험관 내 실험(in vitro)에서 PGE₂의 생성을 억제시켰다고 발표된 바 있으며, 인체 직장점막에 대한 알로에 베라 겔의 항염효과에 대한 연구로서 알로에를 투여하였을 때 PGE₂의 생성을 억제시킴으로써 항염효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다.

알로에베라 겔의 마우스에 대한 면역조절작용 연구로는 알로에베라 추출물을 투여 시 항체생성을 촉진시키고 반점형성세포(plaque forming cell)의 수를 증가시킨다고 보고되어 있고, 알로에베라에 함유된 다당류의 면역조절에 대한 화학적 특성에 대한 연구에서는 알로에 중에 함유된 다당류성분들을 효소 및 산 가수분해를 통하여 구조적 특성을 규명한바 있다.

알로에의 활성성분으로 알려져 있는 barbaloin, aloesin, aloenin, aloe-emodin 등은 주로 알로에 식물의 껍질에 다량 함유되어 있으므로 본 발명에 사용된 알로에 식물의 사용부위는 주로 껍질의 추출물을 발효 및 가수분해 시킨다음 여기에 알로에 베라를 혼합하였다.

알로에와 함께 복합성분으로 함유되어 있는 황금 (Scutellaria Radix)은 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 다년생 초본식물인 속썩은 풀 (Scutellaria baicalensis GEORGI)의 주피를 벗긴 뿌리로 한방에서는 청열, 해독, 담즙배설 촉진, 항균, 이뇨, 완하, 죽상동맥경화 방지, 위액분비 억제, 진정, 혈압강하 작용 등의 목적으로 사용되어 왔다.

황금의 활성성분은 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein) 및 우고닌(Wogonine) 등으로서 약리작용에 대한 연구로는, 흰쥐의 간에서 지질산화작용을 억제함으로써 혈청 중 중성지방과 유리지방산의 함유량을 감소시키고 에탄올(EtOH) 섭취에 의해 유발된 고지혈증에 효과가 있음이 알려졌고, 또한 황금성분의 항산화 작용으로 산화에 의한 세포손상을 보호하고 활성산소 및 프리 레디컬(Free radical))에 의한 피부세포의 산화 및 손상을 방지하는 것으로 보고된 바 있다.

황금의 주성분인 바이칼린(Baicalin)은 플라보노이드 구조를 가지고 있고 항알러지, 항박테리아 및 항바이러스와 같은 다양한 생물학적 활성을 가지며, 그밖에 리포옥시지나제(lipoxygenase)의 저해, 마이크로솜의 지질 과산화반응 억제, 산소라디칼 생성의 저해, 그리고 최근 활성 산소종(H₂O₂, -OH 및 O₂ ^-) 으로 유도된 섬유아세포 손상의 억제 등의 항산화 활성이 보고되어 있다.

황금 중에 가장 함유량이 높은 바이칼린은 인체 및 동물의 대장균(E. coli)이 분비하는 베타 글루쿠로니다제(β-glucuronidase)에 의하여 가수분해되어 바이칼레인을 생성하면서 항산화활성, 항염효과, 항알러지효과, 피부손상 억제효과가 현저하게 증강되는 것으로 보고되어 있다.

또한, 어성초(Houttuynia cordata)는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 다년생 초본식물로 줄기는 가늘고 붉은 보랏빛을 띄며 잎은 심장모양이고 끝이 뾰족하며, 잎은 고구마나 메밀잎과 비슷하며, 잎과 줄기의 즙액에서 “생선비린내”와 매우 유사한 냄새가 있어 어성초(魚腥草)라 불리게 되었다. 어성초는 이뇨, 진통, 지혈, 조직재생, 혈관확장 및 지해작용을 하며, 본초강목, 동의보감, 식물학대사전에는 사열, 매독, 종기, 백독, 치질, 탈항에 효력이 있고 중금속 독을 없애준다고 하였다.

어성초의 약용성, 식용성 제고를 위한 기능성분 분리 및 이용기술의 연구 결과 어성초의 flavonoid 성분으로 quercetin, quercitrin, rutin 및 myricetin 등이 확인되어 있고 이들 성분 중 quercetin은 양파에도 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

어성초 및 양파에 함유되어 있는 quercetin 및 quercetin glycosides의 구조적 특성에 관한 연구 결과 이들 페놀성 화합물이 발암성 물질의 활성감소, 변이 암세포의 생육저해, 혈압 강하, 모세혈관 강화 등의 약리작용을 보고되어 있으며, quercetin의 약리작용으로는 과산화지질 형성 억제작용, 항바이러스, 항균효과, 항돌연변이 작용 등이 알려져 있다.

따라서 본 발명은 화장품제제의 주성분으로서 알로에 발효 및 가수분해추출물에 황금 가수분해 추출물, 어성초 발효추출물 및 알로에베라를 복합시킴으로써 항산화작용과 함께 항염, 항알러지, 소양억제, 접촉성 피부염 개선과 함께 항아토피효과를 증강시킬 수 있고, 어린이 및 유아의 피부에도 자극과 손상을 주지 않으며 독성이 없고 자극이 적은 안전한 기제를 사용함으로써 여성 및 민감성 피부에도 전혀 거부반응을 나타내지 않고, 피부보습과 유연성을 유지하면서 피부노화를 지연시킬 수 있는 처방을 구성하여 바디로션, 바디클린저, 페이셜크림 및 바디로션 등의 제제를 개발하였다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 아래와 같으며, 구성비율은 본원 발명에 해당되는 것이고, 구성량에 대해서는 ± 10% 범위에서 실시가 가능하다.

이하 본 발명에 따른 혼합물 또는 조성물의 작용 및 실험결과에 대해 설명한다.

1. 알로에 가수분해물 히드로겔의 제조

알로에 1㎏을 절개한 후 껍질과 황색 내피 분비물질을 취하고 50℃에서 3일간 통풍 건조시킨 다음 에탄올 600 ㎖ 를 넣고 60℃ 수욕상에서 6시간동안 진탕 추출하여 여과하였다. 여액을 감압 농축 후 동결 건조하여 알로에의 갈색 분말 (수율 15.4 %)을 얻어 시료로 사용하였다.

알로에 히드로겔의 제조는 먼저 알로에 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 프로필렌글리콜(propylene glycol), 라브라솔(labrosol) 및 에탄올을 순차적으로 가하여 혼합한 후 카르보폴 940(carbopol940)을 넣어 팽윤시키고 트리에탄올아민(triethanolamine)으로 pH 6.5로 조정하여 히드로겔을 제조하였다.

알로에 가수분해 히드로겔의 제조(이하 ALH 겔)는 알로에 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 베타글루코시다제(β-glucosidase) 1,000단위, 5,000단위를 각각 가하여 50℃에서 4시간 반응시킨 후에 알로에 가수분해물(ALH) 1%, 알로에 가수분해물(ALH) 5%를 제조하였다 (표 1 참조).

표 1. 알로에 가수분해물 히드로겔의 제조방법

2. 집먼지 진드기( DPE )를 이용한 피부염 유도 및 시료 처리

아토피 피부염의 유발은 8주령 된 Nc/Nga 생쥐의 목, 귀, 등 인접 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모가 끝나면 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치시킨 다음 4% SDS 용액을 제모 부위에 분무한 후, 0.5 % 트윈(Tween) 20과 인산완충용액(PBS)으 로 배양액을 만들어 여기에 집먼지 진드기 추출물 (D. pteronyssinus, DPE, 연세대학교 미생물학교실) 항원을 넣어 만든 1% 액을 1주일에 3번씩 8주간 50 ㎕씩 도포하여 아토피 피부염을 유발시켰다. 대조군에는 생리식염수를 적용하였고, 싸이클로스포린 A(cyclosporin A)는 10 ㎍씩 1일 1회 정맥주사로 8주간 투여하였고 알로에 가수분해물(ALH) 1%, 알로에 가수분해물(ALH) 5%는 8주간 피부에 도포하였다.

3. 면역 세포수 측정

주간 집먼지 진드기(DPE)를 도포하여 피부염이 유발된 마우스의 등 부위 피부조직을 일정량 취하여 잘게 잘라 콜라게나제(collagenase) 1 ㎎/㎖ (in 2% FBS + RPMI1640)을 넣고 37℃ 진탕용 (180 rpm, 20 min) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법을 4회 반복하였다. 배양된 상층액에 ACK 용액(8.3 g NH₄Cl, 1 g KHCO₃ in 1 ℓ of demineralized water + 0.1 mM EDTA)을 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시 D-PBS로 2회 세척한 후 0.04% 트리판블루(trypan blue)로 염색한 후 세포수를 측정하였다. 측정한 피부조직 침윤세포를 5 × 10⁵ 세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (Immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 PE-anti-CD3e, FITC-anti-CD69, FITC-anti-CCR3, PE-anti-Gr-1, FITC-anti-CD11b, PE-anti-Gr-1, PE-anti-B220 및 FITC-anti-IgE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 세척한 후 플로싸이토미터(flow cytometer)의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD3⁺/CD69⁺, CCR3⁺, B220⁺/IgE⁺, CD11b⁺/Gr-1⁺ 세포수를 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포수 (absolute cell number)를 산출하였다.

면역세포수를 관찰한 결과 피부에서는 정상군의 총 면역 세포수는 29 ± 2.5 (×10⁴/g), 대조군 119.5 ± 23.5 (×10⁴/g), CsA 투여군 52.0 ± 5.0 (×10⁴/g), ALH 5% 투여군 56.0 ± 7.0 (×10⁴/g), ALH 1% 투여군 55 ± 8.0 (×10⁴/g)으로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다 (표 2 참조).

피부에서의 CD3⁺/CD69⁺ 세포 수는 정상군은 2.2 ± 1.4 (×10⁴/g), 대조군 23.0 ± 1.9 (×10⁴/g), CsA 투여군 9.5 ± 0.5 (×10⁴/g), ALH 5% 투여군 7.5 ± 2.9 (×10⁴/g), ALH 1% 투여군 5.9 ± 3.5 (×10⁴/g)으로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

CCR3⁺ 세포 수는 정상군은 0.7 ± 0.3 (×10⁴/g), 대조군 9.4 ± 0.7 (×10⁴/g), CsA 투여군 5.3 ± 1.8 (×10⁴/g), ALH 5% 투여군 5.4 ± 1.6 (×10⁴/g), ALH 1% 투여군 4.4 ± 1.1 (×10⁴/g)으로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

CD11b⁺/Gr-1⁺ 세포 수는 정상군은 1.0 ± 0.8 (×10⁴/g), 대조군 9.2 ± 0.8 (×10⁴/g), CsA 투여군 2.2 ± 0.8 (×10⁴/g), ALH 5% 투여군 4.1 ± 1.3 (×10⁴/g), ALH 1% 투여군 3.4 ± 1.2 (×10⁴/g)으로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

B220⁺/IgE⁺ 세포 수는 정상군은 0.6 ± 0.3 (×10⁴/g), 대조군 6.4 ± 0.5 (×10⁴/g), CsA 투여군 3.3 ± 0.2 (×10⁴/g), ALH 5% 투여군 2.4 ± 0.9 (×10⁴/g), ALH 1% 투여군 1.9 ± 1.2 (×10⁴/g)으로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

표 2. 집먼지 진드기(DPE)로 유도된 Nc/Nga 마우스 피부 면역세포수

Nc/Nga mice model followed by the administration of ALH (5%, 1%/) for 8 weeks. The mice dorsal skin were removed and skin cell absolute number were measured by analyzed by flow cytometer. Values are represented as mean ± S.E. (n=4). Statistically significant value compared with Nc/Nga-normal mice group by student's t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

4. 사이토카인 측정

염증 사이토카인 분석을 위하여 집먼지 진드기로(DPE)로 유발된 아토피 피부염(atopy dermatitis-like skin)을 일으킨 Nc/Nga마우스의 실험 종료 후에 에텔로 마취하여 심장천자법으로 채혈 후 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에서 IL-6와 TNF-γ 농도 측정은 효소연결 면역세포 측정장치(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA, Biosource, USA)로 생산량을 측정하였다. 각 well에 Nc/Nga 마우스의 혈청 100 ㎕ (1/100 dilution)씩 분주하고 1 시간 동안 실온에서 반응 시킨 후 2회 세척용 완충용액으로 세척하였다. HRP-conjugeted Avidin 100 ㎕를 처리하고 1 시간 실온에서 반응 시킨 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30 분간 반응시킨 후 50 ㎕의 stop 용액을 처리하여 엘라이저(ELISA reader)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

비장세포 내 사이토카인 생성량 측정은 집먼지 진드기(DPE)를 도포하여 아토피 피부염이 유발된 마우스의 비장세포 (1 × 10⁴/well)를 anti-CD28 (1 ㎍/㎖)와 anti-CD3 (1 ㎍/㎖)로 코팅된 96-well plate에서 48시간 동안 배양하였다. 그리고 IL-4, IFN-γ를 ELISA kit법으로 측정하기 위하여 각 well에 비장세포 배양 상층액 100 ㎕씩을 분주하고 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2회 세척하고 비오틴 접합항원(biotin-conjugated antigen)을 넣어 30분간 반응시켰다. 다시 2회 완충용액으로 세척하여 HRP-conjugeted Avidin 100 ㎕를 처리하여 1 시간 실온에서 반응시킨 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30 분간 반응시킨 후 100 ㎕의 stop 용액을 처리하여 엘라이저(ELISA reader)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

혈청내 사이토카인 생성량을 측정한 결과 IL-6 생성량은 정상군은 137.9 ± 0.1 (pg/㎖), 대조군 200.6 ± 16.9 (pg/㎖), CsA 투여군 153.0 ± 3.72 (pg/㎖), ALH 5% 투여군 146.8 ± 4.23 (pg/㎖), ALH 1% 투여군 156.25 ± 2.2 (pg/㎖)으로, 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

혈중 TNF-α 생성량은 정상군은 8.2 ± 1.5 (pg/㎖), 대조군 36.3 ± 5.4 (pg/㎖), CsA 투여군 25.6 ± 3.0 (pg/㎖), ALH 5% 투여군 23.2 ± 1.1 (pg/㎖), ALH 1% 투여군 19.9 ± 0.3 (pg/㎖)으로 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다(표 3 참조).

표 3. 집먼지 진드기(DPE)로 유도된 Nc/Nga 마우스 혈청 및 비장 내 싸이토카인 생성량

To determine amount of IL-6 and TNF-α by ELISA, blood was collected from the retro-orbital plexus under ether anesthesia and serum was obtained by 10,000 rpm centrifugation and stored at -20°C until use. Splenocytes from Nc/Nga mice, were stimulated with anti-CD3 antibodies for 48 h. The culture supernatants were assayed for IL-4 and IFN-γ by ELISA. Amount of cytokines are shown in picogram per milliliter and values are represented as mean ± S.E. (n=4). Statistically significant value compared with Nc/Nga-normal mice group by student's t-test (*p<0.05, *p<0.01, ***p<0.001).

5. 혈청 중 면역글로블린 측정

혈청 중 면역글로블린 측정은 시료 투여 시점인 8주와 12주, 16주에 생쥐의 안와동맥에서 모세관(capillary tube)를 이용하여 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6,500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 30 ㎕의 혈청을 분리하였다. 엘라이저(ELISA kit)를 사용하여 혈청 내 IgE를 측정하였다. 항체를 완충 용액으로 희석하여 96-well plate에 코팅한 후 4℃에서 16시간 방치하였다. 각 well을 3회 완충 용액으로 세척한 후 혈청 (100배 희석)을 100 ㎕씩 분주하였다. 이를 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 완충 용액으로 2회 세척한 다음 HRP-conjugated Avidin 100 ㎕를 처리하고 1 시간 실온에서 반응시킨 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 반응시킨 후 50 ㎕의 stop 용액을 처리하고 엘라이저(ELISA reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 IgG1, IgG2a, IgG2b, 그리고 IgM의 혈청내 농도 측정은 실험 종료 후에 ELISA를 사용하여 측정하였다. 각 well에 혈청 100 ㎕ (1/200 dilution)씩 분주하고, 12 시간 동안 4 ℃ 냉장실에서 방치한 후 2회 완충용액으로 세척한 다음 비오틴 접합항체(biotin-conjugated antibody)를 넣고 30분간 반응시켰다. 다시 2회 완충용액으로 세척한 다음 HRP-conjugeted Avidin 100 ㎕를 처리하고 1 시간 실온에서 반응시킨 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30 분간 반응시킨 후 100 ㎕의 stop 용액을 처리하여 엘라이저(ELISA reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 IgE의 생성량 측정은 Nc/Nga 마우스의 눈에서 8주, 12주, 16주에 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 IgE 생성량을 측정하였다. 혈청 IgE 수치의 변화로 8주에서는 정상군은 492.5 ± 57.8 (ng/㎖), 대조군에서는 855.5 ± 68.5 (ng/㎖), CsA 투여군에서는 915.5 ± 131.0 (ng/㎖), ALH 5% 투여군에서는 947.5 ± 33.8 (ng/㎖), ALH 1% 투여군에서는 709.0 ± 83.9 (ng/㎖)로서 큰 차이가 없었으나 12주에서는 정상군은 734.4 ± 138.8 (ng/㎖), 대조군에서는 3,347.1 ± 30.5 ng/㎖), CsA 투여군에서는 3,041.5 ± 47.8 (ng/㎖), ALH 5% 투여군에서는 3,117.9 ± 82.9 (ng/㎖), ALH 1% 투여군에서는 3,180.9 ± 5.4 (ng/㎖)로서 유의성 있는 감소효과를 나타내기 시작하였고 그 효과가 16주까지 지속되었다.

혈청 중 IgG1 생성량은 정상군은 2,645.0 ± 85.2 (㎍/㎖), 대조군은 3,774.0 ± 76.4 (㎍/㎖), CsA 투여군은 3,238.5 ± 111.4 (㎍/㎖), ALH 5% 투여군은 3,691.0 ± 130.1 (㎍/㎖), ALH 1% 투여군은 3,706.0 ± 51.1 (㎍/㎖)로 생성량에 영향을 미치지 않았다.

IgM 혈중 농도는 정상군은 647.0 ± 30.9 (㎍/㎖), 대조군은 929.5 ± 37.6 (㎍/㎖), CsA 투여군은 458.5 ± 56.5 (㎍/㎖), ALH 5% 투여군은 714.0 ± 23.4 (㎍/㎖), ALH 1% 투여군은 680.5 ± 59.7 (㎍/㎖)로 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

IgG2a 혈중 농도는 정상군은 1,967.5 ± 55.9 (㎍/㎖), 대조군은 2,694.5 ± 33.8 (㎍/㎖), CsA 투여군은 1,473.0 ± 70.1 (㎍/㎖), ALH 5% 투여군은 2,283.5 ± 150.6 (㎍/㎖), ALH 1% 투여군은 2,153.0 ± 118.7 (㎍/㎖)로 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

IgG2b 혈중 농도는 정상군은 6,968.0 ± 46.1 (㎍/㎖), 대조군은 9,284.5 ± 355.8 (㎍/㎖), CsA 투여군은 6,191.5 ± 141.1 (㎍/㎖), ALH 5% 투여군은 7,907.0 ± 94.1 (㎍/㎖), ALH 1% 투여군은 7,324.0 ± 287.6 (㎍/㎖)로 대조군에 비하여 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다(표 4 참조).

표 4. 집먼지 진드기(DPE)로 유도된 Nc/Nga 마우스 혈청 중 면역항체 생성량

Blood was collected from the retro-orbital plexus under ether anesthesia and heparinized immediately thereafter. The plasma samples were assayed for amount of immunoglobulines by a sandwich ELISA. Values are represented as mean ± S.E. (n=4). Statistically significant value compared with Nc/Nga-control mice group by student's t-test (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

6. 알로에 및 황금 복합 히드로겔의 그람 양성 및 그람 음성균에 대한 항균력 측정

먼저 시험용 균을 뉴트리언트 한천(Nutrient agar) 및 구연산 디스옥시콜린한천(Desoxycholate citrate agar) 배양액의 탁도가 표준탁도기준(Tubidity Standard, Transmittance 35%)과 같도록 조절하여 시험균액으로 하였다.

시료용액으로 알로에 및 황금 복합 히드로겔을 수욕상에서 가온하여 녹이고 멤브란필터(membrane filter) 0.2㎛를 통과시킨 후 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25㎍/㎖가 되도록 2배씩 단계적으로 희석하여 각각 2㎖씩 뮬러힌톤한천배지(Mueller Hinton agar medium) 18㎖와 잘 혼화하여 굳힌 다음, 시험균액 5㎕씩을 자동분주기로 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 후 각 균에 대한 최소발육저지농도를 관찰하였다.

따로 멸균한 시험관에 뮬러힌톤브로스(Mueller Hinton broth) 8㎖, 시험균액 1㎖, 시료용액 (1000㎍/㎖) 1㎖씩을 가하여 37℃에서 18시간 배양한 다음 600nm에서 각각의 투과도를 측정하고 다음식에 의하여 세균의 성장억제율을 산출하였다. 시료를 가하지 않고 균액만 배양시킨 것을 대조군(Control)으로 하였다.

알로에 및 황금 복합 히드로겔의 그람 양성 및 음성균에 대한 세균 성장 억제율을 비교해보면 황금 추출물은 황색 포도상구균, 표피 포도상구균 등 그람 양성균에서 비교적 높은 항균력을 나타내었고 그람 음성균에서는 낮은 수치를 보여주었다. 한편 히드로겔의 항균력은 그람 양성 및 음성균에 모두 항균력을 나타내었으나 그 성장억제율은 낮은 편이었다.(표 5 참조)

표 5. 그람양성 및 그람음성균에 대한 알로에 및 황금 복합 히드로겔의 항균효과(%)

7. 아토피 피부염 유도 및 시료처리와 NC / Nga 생쥐에 유발된 아토피 피부염 억제효과 관찰 결과

먼저 8주령 된 NC/Nga 생쥐의 목, 귀, 등 인접 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모가 끝나면 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.

그리고 4% SDS 용액 제모 부위에 spray한 후, 0.5 % Tween 20과 PBS로 배양액을 만들어 영기에 집먼지 진드기(D. pteronyssinus)추출물(DPE, 연세대학교 미생물학교실, 서울) 항원을 넣어 만들었다. 1주일에 3번씩 8주간 10 mg/ml, 50 ㎕를 도포하였고, 실험군 ALH를 5%, 1%를 적당한 농도로 8주간 투여하였다 (8주부터 16주).

집먼지 진드기(DPE)를 도포하여 피부염이 유발된 생쥐를 3개의 그룹으로 나누고, 대조군에는 생리식염수를, 양성대조군에는 시클로스포린 A(cyclosporin A), 실험군에는 황금가수분해물을 5%, 1%의 농도로 8주간 (8주에서 16주까지) 피부에 도포 하였다. 약물 처리 4주 간격으로, 관능 평가를 실시하였는데, NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 윌콕손방법(Wilcoxon test)을 이용하였다.

육안 평가지수는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다. 평가 항목은 홍반 (Erythema), 가려움과 건조 피부 (Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종 (Edema & escoriation), 짖무름 (Erosion), 그리고 태선화 (Lichenification)로 나누었다. 이 각각의 항목은 없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3)으로 채점하였다.

그림 1을 참조하면, NC/Nga 생쥐에 유발된 아토피 피부염 억제 효과를 관찰해보면 그림 1A는 8 주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위의 사진이며, 그림 1B는 제모한 후 DPE를 8주간 도포한 후 사진으로, 각화현상이 진행되어 피부 염증이 심하게 나타내었다. 이에 반해 양성대조군인 CSA(그림 1C)는 복강 내 주사하였고, 상당한 호전현상을 나타내었다. 실험군인 황금가수분해물은 8주간 피부에 도포(그림 1D)한 결과, 대조군에 비하여 긁는 행동이 상대적으로 감소하였고, 또한, 각화, 태선화, 피부탈락 증상, 피부염 증상 등이 현저히 호전되었음을 확인할 수 있었다.

그림 1. 집먼지 진드기로 유도된 NC/Nga 마우스의 아토피 피부염에 대한 알로에 및 황금 복합물의 치료효과

또한, 상기 표 6을 참조하면, 4주마다 피부염의 심화 정도를 관능적 방법에 의하여 측정한 결과, 대조군은 8주 2.1 ± 0.4, 12주 2.5 ± 0.16, 16주 2.6 ± 0.2, CsA는 8주 1.8 ± 0.41, 12주 1.7 ± 0.25, 16주 0.9 ± 0.4, 황금 가수분해물 5% 는 8주 1.5 ± 0.16, 12주 1.7 ± 0.3, 16주 0.8 ± 0.1,황금가수분해물 1% 는 8주 1.4 ± 0.24로, 12주 2.0 ± 0.35, 16주 1.6 ± 0.4로 12주부터 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

표 6. 집먼지 진드기로 유도된 NC/Nga 마우스의 아토피 피부염에 대한 알로에 및 황금 복합물의 육안평가지수

Effects of ALH on clinical skin features and severity in DPE-induced dermatitis model of NC/Nga mice Clinical skin index of dermatitis was defined as the sum of the individual scores graded as 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate) and 3 (severe) for each of five signs and symptoms (itch, erythema/hemorrhage, edema, excoriation/erosion and scaling /dryness) : Symptoms were evaluated by skin dryness, eruption and wound on the three parts of the body: ear, face and head, and back Statistically significant value compared with NC/Nga-CT mice grouup by t-test (***p<0001)

8. 아토피 피부염 유도 및 시료처리와 NC / Nga 생쥐의 피부 및 귀의 현미경관찰 결과

실험 종료 후에, 왼쪽 귀 끝부분, 등 쪽 목 부분의 피부을 떼어내어 10% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 2시간 동안 고정하였다.

그 조직을 파라핀으로 포맷하였고, 5μm 부분의 두께로 블록(block)을 만들었다. 조직 부분은 염증을 일으키는 표피(epidermis), 진피(dermis), 케라티노사이트(keratinocytes), 호증구(neutrophils), 에오시노필(eosinophil) 및 그 외 다른 세포와 부종을 식별하는 헤마톡실린 및 에오신(hematoxyline and eosin, H&E) 염색과 비만세포 (mast cells)를 염색하는 톨루이딘(toluidine) 염색을 시행하였다.

면역화학 조직염색 (immuno histochemical stain)은 블록(block)을 만들고, 여기에 랫트안티마우스(rat anti-mouse) CD4 mAb (RM4-5; PharMingen, San Diego, CA), 랫트안티마우스(rat anti-mouse) CCR3 mAb (53-6.7; Becton Dickinson, Mountain View, CA) 항체를 사용하였다.

조직 절편을 4μm 두께로 세절한 후 프루브온 플러스 슬라이드(probe-on plus slide, Fisher Scientific, U.S.A)에 부착시켜 건조시켰다.

그리고 탈파라핀 (Deparaffinized) 후 함수시키고, 0.01M 구연산 완충액(citrate buffer pH 6.0)을 이용해 마이크로웨이브오븐(microwave oven)에 15분간 전처리 하였다.

조직 내 과산화효소의 작용을 억제하기 위하여 3% 과신화수소수에 10분간 처리한 후, 조직 내의 항원과 비특이적 단백결합을 억제하기 위해 정상 혈청으로 단백질을 차단시켰다. 그리고 일차 단일 항체에 1시간 동안 부착시킨 다음 완충액으로 수세하였다.

실험 종료 후 마우스의 피부와 귀의 일부를 절단한 후 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin) 염색과 톨루이딘(toluidine blue) 염색을 통하여 조직의 일반형태 변화와 귀의 두께를 관찰한 결과 H&E 염색을 한 대조군(그림 2 B)의 피부와 귀에서는 표피(epidermis/dermis)가 부종으로 현저하게 확장되었고, 백혈구의 침윤도 관찰되었다.

이에 비해 알로에 황금 복합물 투여군 (그림 2 D)에서는 대조군에 비하여 표피의 두께가 상대적으로 줄었고, 백혈구의 침윤이 현저히 감소하여 부종이 감소됨을 알 수 있었다.

비만세포(mast cell)를 염색하는 톨루이딘(toluidine) 염색에서는 대조군 (그림 2 F)은 진피(dermis) 주변에 비만세포 (화살표)가 많이 침윤된 것을 알 수 있다.

그러나 알로에 황금 복합물 투여군 (그림 2 H)에서는 사진에서 나타난 바와 같이 대조군에 비하여 비만세포를 거의 관찰 할 수 없었다.

또한, 400배 광학 현미경에서 화석해성 장치를 통해 귀조직의 두께를 측정한 결과, 정상군은 21.1 ± 1.4 (x10/μm), 대조군이 129.5 ± 2.5 (x10/μm), CsA는 57.4 ± 7.3 (x10/μm), 알로에 황금 복합물 5% 투여군이 37.1 ± 0.3 (x10/μm), 알로에 황금 복합물 1% 투여군이 62.2 ± 1.5 (x10/μm)로 나타나 대조군에 비하여 알로에 황금 복합물 투여군에서 귀의 두께가 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. (표 7 참조)

그림 2. 아토피 피부염으로 유도된 NC/Nga 생쥐의 피부 및 귀의 현미경 관찰 결과

Ear

H & E toluidine blue

Skin

H & E toluidine blue

Histologic examination of ear and skin lesion in DPE-induced dermatitis model of NC/Nga mice The animals were administrated with saline (control) or SBE for 8 weeks Ear, skin biopsy was stained with hematoxylin and eosin (H&E) and toluidine blue (A, E; normal B, F: cotrol, C, G: CsA, D, H; SBE) for examining inflammatory cells and mast cell, respectively Bright microscopy (Nikon, Japan, orignal magnification, ear x 200, skin x 400)

표 7. 아토피 피부염으로 유도된 NC/Nga 생쥐의 귀 두께 비교

Ear thickness of NC/Nga mice by DPE stimulation After atopy dermatitis ear in NC/Nga mice model followedby the administration ofCsA, and Scutellariae extracts for 8 weeks (Nikon, Japan, orignal magnification, ear x 400)

Claims

알로에 껍질 1.0kg을 취하고 에탄올(EtOH) 2리터(L)를 넣어 50 ~ 60℃에서 8시간동안 가끔씩 흔들어 주면서 방치하는 단계;
에탄올 추출용액을 흔들어 주면서 여과지를 사용하여 감압으로 하여 여과하고 여액을 취하여 단계;
여과한 액을 감압농축기에 넣고 50 ~ 60℃에서 일정한 조건으로 감압 농축시켜 연조엑스 상태로 만드는 단계;
베타글루코시다제(β-glucosidase) 50,000unit를 10밀리리터의 물에 녹여 연조엑스에 가하고, 40 ~ 50℃에서 8시간 동안 흔들어 주면서 반응시켜 발효 및 가수분해시키는 단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 개선효과를 나타내는 알로에 발효 및 가수분해 추출물의 제조방법.
제1항에 의해 제조된 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음,
정제수 40kg, 글리세릴스테아레이트 6kg, 피이지100스테아레이트 4kg, 소르비탄스테아레이트 3kg, 폴리소르베이트20 3kg, 디메치콘 0.5kg, 트리에탄올아민 1kg, 카프릴릭카프릴트리글리세라이드 4kg, 카보머941 1kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 이소도데칸 0.5kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 3kg, 디카프릴카보네이트 3kg, 스테아릴알코올 5kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 0.5kg, 디스테아디모늄헥토라이트 1kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 3kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디로션 기제를 조제한 후 상기 알로에 가수분해 추출 혼합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디로션을 제조하는 것을 특징으로 하는 알로에 발효 및 가수분해 추출물을 이용하여 제조된 화장품.
제1항에 의해 제조된 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음,
정제수 50kg, 라우린산 6kg, 미리스틴산 4kg, 모노알킬포스페이트 1kg, 옥시벤존 0.5kg, 글리콜디스테아레이트 4kg, 트리에탄올아민 1kg, 폴리쿠아테니움 1kg, 라우릴설폰산트리에탄올아민 1kg, 라우라마이드 DEA 1kg, 사이클로메치콘 0.5kg, 코카미드프로필베타인 2kg, K-쿠일가수분해콜라겐 1kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 피이지-7-글리세릴코코에이트 5kg, 글리세린 5kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 1kg, 디메치콘 0.5kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 3kg, 프로필렌카보네이트 1kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디클린저 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디클린저로 제조하는 것을 특징으로 하는 알로에 발효 및 가수분해 추출물을 이용하여 제조된 화장품.
제1항에 의해 제조된 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물을 얻은 다음,
정제수 35kg, 글리세릴스테아레이트 5kg, 피이지100스테아레이트 3kg, 소르비탄스테아레이트 4kg, 폴리소르베이트20 3kg, 디메치콘 1kg, 트리에탄올아민 1kg, 화이트비스왁스 2kg, 카보머941 1kg, 부틸렌글라이콜 0.5kg, 이소도데칸 1kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 1kg, 디카프릴카보네이트 1kg, 스테아릴알코올 4kg, 글리세릴베헤네이트 1kg, 페녹시에탄올 1kg, 디스테아디모늄헥토라이트 1kg, 소르비탄세스퀴올레이이트 2kg, 메칠파라벤 0.3kg, 프로필파라벤 0.2kg, 디소디움이디티에이 0.5kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 페이셜크림 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 페이셜크림으로 제조하는 것을 특징으로 하는 알로에 발효 및 가수분해 추출물을 이용하여 제조된 화장품.
제1항에 의해 제조된 알로에 발효 및 가수분해 추출물 100g을 취하고, 황금 가수분해 추출물 200g, 어성초 발효추출물 100g 및 알로에베라 20kg을 균일하게 혼합하여 알로에 발효 및가수분해 추출 복합물을 얻은 다음,
정제수 40kg, 스쿠알란 1kg, 세티아릴알코올 1kg, 마카다미아씨 오일 1kg, 포도씨 오일 0.5kg, 부틸렌글라이콜 1kg, 폴리글타믹애씨드 1kg, 글리세린 5kg, 디에칠헥실카보네이트 1kg, 디카프릴카보네이트 0.5kg, 스테아릭애씨드 3kg, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 1kg, 스테아릴알코올 1kg, 페녹시에탄올 0.5kg, 녹차씨오일 0.5kg, 아라카딜 알코올 0.4kg, 베헤닐알코올 0.3kg, 아라카딜 글루코사이드 0.3kg, 세틸팔미테이트 0.2kg, 소르비탄올리베이트 0.5kg, 소르비탄 팔미테이트 1kg, 세테아릴 올리베이트 0.5kg, 피이지-32 0.2kg, 세라마이드-3 0.3kg, 디메치콘 0.5kg, 알란토인 0.2kg, 카보머 940 0.5kg 및 트리에탄올아민 0.1kg을 혼합하고, 70 ~ 75℃에서 4시간 동안 가온하면서 혼합하여 바디크림 기제를 조제한 후 상기 알로에 발효 및 가수분해 추출 복합물과 함께 호모게나이저에 투입하여 3,000 ~ 3,500 알피엠으로 30분 동안 균질화시켜 바디크림을 제조하는 것을 특징으로 하는 알로에 발효 및 가수분해 추출물을 이용하여 제조된 화장품.