CN112176002A - 胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用 - Google Patents

胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用，涉及微生物发酵技术领域。胶原基酒精发酵促进剂包括水解胶原蛋白，水解胶原蛋白的分子量为0.5kDa‑30kDa，上述分子量的水解胶原蛋白可以增加微生物对底物的利用，降低发酵终点的残糖量，提升乙醇产量，还可以大大缩短发酵时间，提高发酵效率。此外，该促进剂的存在能够缓解酵母在高浓度乙醇发酵时，所遭受的底物胁迫和产物抑制，使其正常发酵；与商用I号发酵促进剂相比，本发明的促进剂添加后，残糖含量更低，乙醇的产量更高。

Description

胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，且特别涉及胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用。
背景技术
生物乙醇作为一种环境友好型的可持续生产的生物能源，可以与常规汽油混合用于汽车燃料，从而减少化石燃料在能源系统中所占的比例。因此，生物乙醇被认为是一种典型的可替代运输燃油的具有战略重要性的液体燃料。酿酒酵母可将源于蔗糖基、糖蜜基、淀粉基、以及纤维素基生物质的葡萄糖通过发酵过程，转化为生物乙醇。相较于一般的酒精发酵，高浓度酒精发酵具有降低蒸馏能耗和减少废水处理等优点，因此日益受到人们的广泛的关注。然而，酿酒酵母在高浓度酒精发酵的前期会遭受到高浓度底物的渗透胁迫，随着乙醇的不断积累，在发酵后期酵母又会受到高浓度乙醇的产物抑制，结果导致发酵速率下降、菌体生长缓慢和残糖浓度较高等问题。
目前，解决该问题的方法主要是及时分离乙醇，可以通过优化发酵流程或改进设备的方法实现，通过分离乙醇能够减少产物抑制。此外，还可以采用基因改良的手段构建抗逆性更强的发酵菌株，或者用额外添加胁迫保护剂的方法，提高发酵菌株对环境胁迫的耐受性。基于特定的发酵工艺，添加胁迫保护剂简单、灵活、且易操作，是一种可行性比较高的有效提高乙醇产量的方法。
相容性溶质作为微生物环境胁迫的保护剂，主要包含糖类和氨基酸类。糖类是一种常见的胁迫保护剂，如蔗糖、海藻糖等，事实上，在高浓度酒精发酵的过程中，添加额外的糖并不能明显缓解菌株所遭受的胁迫。氨基酸类如脯氨酸等，虽然能提高酿酒酵母的胁迫耐受性，但酿酒酵母自身脯氨酸合成的能力有限，添加纯的脯氨酸价格昂贵，成本过高，不适宜工业化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原基酒精发酵促进剂及其制备方法，旨在显著提高乙醇产量，并提升发酵效率。
本发明的另一目的在于提供上述胶原基酒精发酵促进剂在微生物酒精发酵中的应用，以增强微生物对底物的利用，降低发酵终点残糖含量，缩短发酵时间。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种胶原基酒精发酵促进剂，其包括水解胶原蛋白，水解胶原蛋白的分子量为0.5kDa-30kDa。
本发明还提出一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其按照上述胶原基酒精发酵促进剂的组成进行原料配比，再将各组分混合。
本发明还提出上述胶原基酒精发酵促进剂在微生物酒精发酵中的应用。
本发明实施例的有益效果是：本发明实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂及其制备方法，其采用分子量为0.5kDa-30kDa的水解胶原蛋白为原料。发明人创造性地发现：上述分子量的水解胶原蛋白可以增加微生物对底物的利用，降低发酵终点的残糖量，提升乙醇产量，还可以大大缩短发酵时间，提高发酵效率。
需要说明的是，本发明实施例中所提供的酒精促进剂之所以能够提升乙醇产量，可能是由于该胶原基酒精发酵促进剂能够提升酵母在酒精发酵中的胁迫耐受性。水解胶原蛋白中的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的共同作用，能够显著提升酵母抵抗环境胁迫的能力，起到胁迫保护的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为发酵促进剂的添加对酿酒酵母乙醇发酵性能的影响。
图2为发酵促进剂的添加对酿酒酵母高浓度乙醇发酵过程的影响。
图3为本发明促进剂的添加对工业用酿酒酵母乙醇发酵性能的影响。
图4为氨基酸的添加对乙醇胁迫条件下酿酒酵母生长的影响。
图5为氨基酸的添加对乙醇胁迫条件下酿酒酵母形态的影响。
图6为比较本发明的发酵促进剂和商用发酵促进剂的乙醇发酵性能。
图7为比较本发明促进剂，与海藻糖和蔗糖的乙醇发酵性能。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的胶原基酒精发酵促进剂、及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明实施例提供了一种胶原基酒精发酵促进剂，其包括水解胶原蛋白，水解胶原蛋白的分子量为0.5kDa-30kDa，优选地，水解胶原蛋白的分子量为1kDa-10kDa。
发明人创造地采用水解胶原蛋白作为促进剂的原料，并且通过不断的试验探索发现，上述分子量范围的水解胶原蛋白用于微生物酒精发酵中能够显著提升微生物对底物的利用率，降低发酵终点残糖含量。值得注意的是，本申请实施例中所提供的胶原基酒精发酵促进剂还能够提升发酵速率，大幅度缩短发酵时间。
本发明实施例中所提供的胶原基酒精发酵促进剂采用水解胶原蛋白为主要原料，相对于其他蛋白而言，其氨基酸组成尤为独特，基本上所有的水解胶原蛋白均主要包括甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。甘氨酸的含量最高，约占水解胶原蛋白氨基酸总量的1/3，脯氨酸和羟脯氨酸约占1/5。其中，脯氨酸作为一种相容性溶质，对于酿酒酵母抵抗环境胁迫尤为重要；甘氨酸作为甘氨酸甜菜碱和谷胱甘肽的前体，在酿酒酵母的胁迫保护中也发挥了积极作用。事实上，乙醇的胁迫会损伤线粒体上的呼吸电子传递链，进而引起过量的活性氧自由基的生成，导致细胞的蛋白、脂质和DNA遭到氧化损伤，而谷胱甘肽则是酿酒酵母内常见的活性氧自由基清除剂。
发明人进一步对胶原基酒精发酵促进剂的成分做了优化，按重量份数计，其包括水解胶原蛋白90-99份、磷酸盐0.1-6份、镁盐0.01-2份、钠盐0.05-4份和钙盐0.001-2份；更优选地，其包括水解胶原蛋白92-95份、磷酸盐1-3份、镁盐0.1-1份、钠盐0.1-2份和钙盐0.01-1份。磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷的成分。无机盐作为微生物生理活性物质的组成成分或生理活性作用的调节物，对微生物的生长和产物合成有促进作用。比如镁离子是很多重要酶的激活剂，会影响蛋白质的合成。钙离子能控制细胞透性，钠离子与钾离子维持细胞渗透压有关。同时，钾离子也是很多酶的激活剂，可以促进糖的代谢。因此，磷酸盐、镁盐、钠盐和钙盐的加入进一步促进发酵过程的进行，有利于进一步增强微生物对底物的利用。
具体地，水解胶原蛋白是采用高温水解、酸水解、碱水解和酶水解中的至少一种水解方法对胶原蛋白进行水解提取而得；优选地，采用碱水解或酶水解的方式对胶原蛋白进行水解提取制备水解胶原蛋白。一般常用的水解方式均适合于制备水解胶原蛋白。但是，碱水解和酶水解的方式更加适宜；若采用高温水解则容易使水解胶原蛋白的分子量过大，影响溶解性；若采用酸水解的方式则后续需要调整相应的pH。在其他实施例中，也可以采用几种水解方式混合水解的方案，在此不做限定。
需要补充的是，高温水解、酸水解、碱水解和酶水解为现有的成熟工艺，可以参照现有技术。其中，高温水解可以是在60-200℃下水解24h，其为现有技术，在此不做过多赘述。酸水解可以采用盐酸、硫酸、硝酸、甲酸和乙酸；碱水解可以采用碳酸钠、氢氧化钠、碳酸钾、氢氧化钾、氧化钙和氧化镁。
酶水解可以采用以下工艺：采用蛋白酶进行水解，水解温度20℃-70℃，水解时间10min-72h，蛋白酶种类包含胃蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、protamex蛋白酶、胰蛋白酶、1398酶、风味蛋白酶、Alcalase酶或木瓜蛋白酶中的至少一种。具体地，可以在蛋白酶作用下于45℃水解9h，然后灭活酶终止反应，最后经干燥制得水解胶原蛋白。
需要补充的是，水解胶原蛋白可以采用市购产品，不限于本发明实施例中所提及的提取方法。
进一步地，水解提取过程所采用的胶原蛋白来自家畜、家禽或鱼类中的至少一种；家畜和家禽上的胶原蛋白来自动物皮、动物骨骼和动物肌腱中的至少一种；鱼类上的胶原蛋白来自鱼鳞和鱼鳍中的至少一种。从家畜、家禽或鱼类上水解提取的水解胶原蛋白均适合于作为胶原基酒精发酵促进剂的原料。
进一步地，磷酸盐选自磷酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的至少一种；镁盐选自氯化镁、硫酸镁和硝酸镁中的至少一种；钠盐选自氯化钠、硫酸钠和硝酸钠中的至少一种；钙盐选自氯化钙、硫酸钙和硝酸钙中的至少一种。以上几种常用的磷酸盐、镁盐、钠盐和钙盐均可以选择性加入，进一步促进发酵的进行，提高底物的利用率。
本发明实施例还提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其按照上述胶原基酒精发酵促进剂的组成进行原料配比，再将各组分混合即可。由于水解胶原蛋白的加入使制备得到的胶原基酒精发酵促进剂能够显著增强微生物对底物的利用，降低发酵终点残糖的含量，提高乙醇的产量，还可以大幅缩短发酵时间。
本发明实施例还提供上述胶原基酒精发酵促进剂在微生物酒精发酵中的应用，尤为适用于高浓度的酒精发酵。在微生物酒精发酵中所采用的碳源为葡萄糖、糖蜜、淀粉和纤维素中的至少一种；在微生物酒精发酵中所采用的酵母为酿酒酵母或活性干酵母。利用酵母对葡萄糖类原料进行酒精发酵，胶原基酒精发酵促进剂的加入能够进一步提升底物的利用率，还可以缩短发酵时间。
胶原基酒精发酵促进剂与发酵原料的质量比为0.01-13:100；优选为0.1-6:100。通过进一步优化胶原基酒精发酵促进剂的加入量使发酵速率进一步提升，并进一步提升了底物的利用率。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例中发酵过程中的葡萄糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法测定，乙醇浓度采用气相色谱法测定，酵母的生物量采用活菌计数法进行测定，细胞形态采用扫描电子显微镜观察。
以下实施例中水解胶原蛋白是采用市购产品，具体的水解方法不做具体的限定，但是要求水解胶原蛋白的分子量满足要求。
实施例1
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂，按质量份数计，其原料包括酸水解得到的水解胶原蛋白(重均分子量为1kDa)97份、磷酸钾0.2份、硫酸镁0.05份、氯化钠2.5份和硫酸钙0.25份。
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其包括将本实施例中的原料混合。
实施例2
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂，按质量份数计，其原料包括高温水解得到水解胶原蛋白(重均分子量为15kDa)90份、磷酸氢二钾5.8份、氯化镁1.6份、硝酸钠0.6份和氯化钙2份。
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其包括将本实施例中的原料混合。
实施例3
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂，按质量份数计，其原料包括酶水解得到水解胶原蛋白(重均分子量为10kDa)93份、磷酸二氢钾3份、硝酸镁0.4份、硫酸钠3.1份和氯化钙0.5份。
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其包括将本实施例中的原料混合。
实施例4
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂，按质量份数计，其原料包括酶水解得到水解胶原蛋白(重均分子量为5kDa)99份、磷酸氢二钾0.59份、氯化镁0.32份、硫酸钠0.08份和氯化钙0.01份。
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其包括将本实施例中的原料混合。
实施例5
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂，按质量份数计，其原料包括碱水解得到水解胶原蛋白(重均分子量为3kDa)95份、磷酸二氢钾1.8份、硫酸镁1.2份、氯化钠1.7份和硝酸钙0.3份。
本实施例提供一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其包括将本实施例中的原料混合。
对比例1
商用I号发酵促进剂，具体成分为：酵母抽提物为主要原料，还包含氨基氮、矿物质和维生素等。
对比例2
本对比例提供一种相容性溶质，与实施例1不同之处仅在于：海藻糖。
对比例3
本对比例提供一种相容性溶质，与实施例1不同之处仅在于：蔗糖。
试验例1
测试实施例1中的胶原基酒精发酵促进剂对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为180g/L，按发酵原料重量百分比添加13％的量添加实施例1中制备的发酵促进剂，酿酒酵母的初始活菌浓度为2.27*106CFU/mL。(2)对照组：不添加本发明的发酵促进剂。发酵时间为70h，测定活菌浓度和乙醇产量，结果如表1所示。
表1测试结果
组别 乙醇产量(％v/v) 活菌浓度(CFU/mL)
对照组 4.07 1.45*10<sup>7</sup>
实验组 8.05 3.40*10<sup>7</sup>
由表可知，不管是乙醇产量还是活菌浓度，实验组均明显高于对照组。可见，发酵促进剂的添加不仅可以促进细胞的生长，还可以提高乙醇的产量。
试验例2
测试实施例2中的胶原基酒精发酵促进剂对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为250g/L，按发酵原料重量百分比添加1％的实施例2制备的发酵促进剂，酿酒酵母的初始活菌浓度为5.27*107CFU/mL。(2)对照组：不添加本发明的发酵促进剂。发酵时间为96h，测定残糖含量和乙醇产量，结果如附图1所示。
由图1可知，添加该胶原基发酵促进剂后，24h、50h和96h的残糖量均大幅下降，且乙醇的产量大幅提高。实验组在50h的乙醇产量就已达到了对照组在96h也达不到的水平。可见，该发酵促进剂的添加可以提高酿酒酵母对底物的利用率，降低残糖含量。同时，可以提高乙醇的产量，缩短发酵时间，提高发酵效率。
试验例3
测试实施例3中的胶原基酒精发酵促进剂对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为287g/L，按发酵原料重量百分比添加3.0％的实施例3制备的胶原基发酵促进剂，酿酒酵母的初始活菌浓度为4.90*107CFU/mL。(2)对照组：不添加本发明的发酵促进剂。发酵时间为75h，测定残糖含量和乙醇产量，结果如附图2所示。
由图2可知，高底物浓度会抑制酿酒酵母发酵生产乙醇。发酵75h后，对照组的残糖含量还有135.74g/L，而实验组只有1.05g/L。可以看到，从23h到75h，残糖含量降低得很少。可见，发酵促进剂的加入可以提高酵母对底物的利用率，降低发酵液中残糖的含量。此外，对照组和实验组在75h的乙醇浓度分别为7.47％和13.84％(v/v)。这些结果表明，过高的底物浓度会抑制酵母对其的利用，从而阻碍乙醇的高效生产。而本发明的胶原基发酵促进剂的加入则可缓解这种抑制作用，实现高浓度乙醇发酵。
试验例4
测试实施例4中的胶原基酒精发酵促进剂对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为240g/L，按发酵原料重量添加0.5％的实施例4制备的胶原基发酵促进剂，实验菌株为工业用活性干酵母A。(2)对照组：不添加本发明的发酵促进剂。发酵时间为96h，测定残糖含量和乙醇产量，结果如附图3所示。
由图3可知，添加发酵促进剂后，残糖含量大幅下降。此外，发酵48h后，实验组的乙醇产量已达到9.79％(v/v)，而对照组仅有5.09％(v/v)。此外，本发明的胶原基促进剂不仅可提高该菌株的乙醇产量，还可以缩短发酵时间，提高发酵效率。
试验例5
探究氨基酸的添加对酿酒酵母乙醇胁迫耐受性的影响，测试结果见图4和图5。
具体方法如下：将含有15％(v/v)乙醇的无菌生理盐水培养基为对照，分别将2mM的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸添加到该培养基以考察氨基酸的添加对酿酒酵母乙醇胁迫耐受性的影响。在30℃，静置培养120h，测定该胁迫过程中酵母的活细胞浓度，以及在48h的细胞形态。
从图4和图5可以看出，相对于对照组而言，添加脯氨酸、甘氨酸以及羟脯氨酸后，酿酒酵母的活菌浓度均有所提高，且细胞形态也更加完整和饱满。可见，脯氨酸、甘氨酸以及羟脯氨酸的存在均有利于提高酵母细胞对乙醇胁迫的耐受性。
通过试验例的测试可知，本发明实施例中制备得到的胶原基促进剂能够提高乙醇产量，还可以缩短发酵时间，正是由于其中脯氨酸、甘氨酸以及羟脯氨酸的共同作用。
试验例6
测试实施例5中的胶原基酒精发酵促进剂与商用I号发酵促进剂对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为310g/L，按发酵原料重量分别添加5％的实施例5制备的发酵促进剂和对比例1的商用I号发酵促进剂。(2)对照组：不添加发酵促进剂。发酵时间为72h乙醇产量，结果如附图6所示。
由图6可知，在高浓度底物存在的条件下，对照组在72h的产量仅为7.74％(v/v)，加入商用I号促进剂后为12.67％(v/v)，而加入本发明的胶原基发酵促进剂后可以达到15.31％(v/v)。也就是说，本发明实施例中的胶原基酒精发酵促进剂可以在商用I号发酵促进剂的基础上再提升2.64％(v/v)。可见，相对于商用I号发酵促进剂而言，本发明的胶原基发酵促进剂在提高乙醇的产量上具有更大的优势。
试验例7
测试实施例5中的胶原基酒精发酵促进剂与相容性溶质海藻糖和蔗糖对酒精发酵的影响，具体如下：(1)实验组：葡萄糖初始浓度为320g/L，按发酵原料重量分别添加0.2％的实施例5制备的发酵促进剂，对比例2的海藻糖，以及对比例3的蔗糖。(2)对照组：不添加发酵促进剂。发酵时间为40h乙醇产量，结果如附图7所示。
由图7可知，在超高浓度底物存在的条件下，对照组在40h的产量为5.46％(v/v)，加入海藻糖和蔗糖这两种相容性溶质后，对乙醇浓度的提升效果并不明显。且蔗糖添加后，乙醇的产量反而下降，仅为5.18％。而本发明促进剂添加后，乙醇的浓度可达到7.50％。可见，相对于蔗糖和海藻糖而言，本发明的胶原基发酵促进剂在提高乙醇的产量上具有更大的优势。
综上，本发明提供的胶原基酒精发酵促进剂及其制备方法，其采用分子量为0.5kDa-30kDa的水解胶原蛋白为主要原料。发明人创造性地发现：水解胶原蛋白可以增加微生物对底物的利用，降低发酵终点的残糖量，提升乙醇产量，还可以大大缩短发酵时间，提高发酵效率。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，其包括水解胶原蛋白，所述水解胶原蛋白的分子量为0.5kDa-30kDa。
2.根据权利要求1所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，按重量份数计，其包括水解胶原蛋白90-99份、磷酸盐0.1-6份、镁盐0.01-2份、钠盐0.05-4份和钙盐0.001-2份；
优选地，其包括水解胶原蛋白92-95份、磷酸盐1-3份、镁盐0.1-1份、钠盐0.1-2份和钙盐0.01-1份。
3.根据权利要求1或2所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，所述水解胶原蛋白的分子量为1kDa-10kDa。
4.根据权利要求1或2所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，所述水解胶原蛋白是采用高温水解、酸水解、碱水解和酶水解中的至少一种水解方法对胶原蛋白进行水解提取而得；
优选地，采用碱水解或酶水解的方式对胶原蛋白进行水解提取制备所述水解胶原蛋白。
5.根据权利要求4所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，所述水解提取过程所采用的胶原蛋白来自家畜、家禽或鱼类中的至少一种；
优选地，所述家畜和所述家禽上的胶原蛋白来自动物皮、动物骨骼和动物肌腱中的至少一种；
优选地，所述鱼类上的胶原蛋白来自鱼鳞和鱼鳍中的至少一种。
6.根据权利要求2所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，所述磷酸盐选自磷酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的至少一种；
优选地，所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁和硝酸镁中的至少一种。
7.根据权利要求2所述胶原基酒精发酵促进剂，其特征在于，所述钠盐选自氯化钠、硫酸钠和硝酸钠中的至少一种；
优选地，钙盐选自氯化钙、硫酸钙和硝酸钙中的至少一种。
8.一种胶原基酒精发酵促进剂的制备方法，其特征在于，其按照权利要求1-7中任一项所述胶原基酒精发酵促进剂的组成进行原料配比，再将各组分混合。
9.权利要求1-7中任一项所述胶原基酒精发酵促进剂在微生物酒精发酵中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述胶原基酒精发酵促进剂与发酵原料的质量比为0.01-13:100；优选为0.1-6:100；
优选地，在所述微生物酒精发酵中所采用的碳源为葡萄糖、糖蜜、淀粉和纤维素中的至少一种；
优选地，在所述微生物酒精发酵中所采用的酵母为酿酒酵母或活性干酵母。
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