KR101083045B1

KR101083045B1 - 길경 추출물로부터 분리한 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 ｄ를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101083045B1
Application number: KR1020090087288A
Authority: KR
Inventors: 김영식; 하인진; 이은정
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2011-11-16
Also published as: KR20100120614A

Abstract

길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D 강화 분획물은 지방세포 분화 억제 효과가 탁월하므로, 상기 조성물은 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

길경 추출물, 길경 사포닌 분획물, 플라티코딘 D, 지방세포 분화, 지질대사 질환

Description

길경 추출물로부터 분리한 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 Ｄ를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the platycoside saponins isolated from the root of Platycodon grandiflorum and its platycodin Ｄ enriched-saponin fraction obtained by enzymatic conversion, intervening the lipid metabolic disorders}

본 발명은 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] arey VJ. et al., Body fat distribution and risk of non-insulin-dependent diabetes mellitus in women, The nurses' health study, Am J Epidemiol, 145, pp.614-619, 1997

[문헌 2] Golay A. et al., Obesity and NIDDMP, the retrograde regulation concept, Diabetes Rev, 5, pp.69-82, 1997

[문헌 3] Hotamisligil GS. et al., Tumor necrosis factor a, a key component of the obesity-diabetes link, Diabetes, 43, pp.1271-1278, 1994

[문헌 4] Biol. Pharm. Bull., 11, p.2114, 2008

[문헌 5] Eur. J. Pharmacol., 537, p.1, 2006

[문헌 6] Life Sci., 76, p.2315, 2005

[문헌 7] Int. J. Cancer, 261, p.2674, 2008

[문헌 8] Cancer Lett., 261, p.98, 2008

[문헌 9] Am. J. Chin. Med., 32, p.257, 2004

[문헌 10] Planta Med., 68, p.794, 2002

[문헌 11] Arch. Pharm. Res., 27, p.1048, 2004

[문헌 12] Eur. J. Pharmacol., 537, p.1, 2006

[문헌 13] J. Food Sci., 73, p.195, 2008

[문헌 14] Chem Pharm Bull, (Tokyo) 54, p.557, 2006

[문헌 15] Chem. Pharm. Bull, (Tokyo) 54, p.1285, 2006

[문헌 16] J. Chem. Soc. Perkin Trans., I, p.661, 1984

[문헌 17] Planta Med., 71, p.566, 2005

[문헌 18] Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 20, p.1957, 1972

[문헌 19] Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 24, p.1965, 1972

[문헌 20] Kubota T., Chem. Commun., p.1313, 1969

[문헌 21] 대한민국 등록번호 제10-0564927호

[문헌 22] 대한민국 등록번호 제10-0750333호

[문헌 23] 대한민국 등록번호 제10-0696647호

[문헌 24] Hahn J., Nutr., 130, p.2760, 2000

[문헌 25] 대한민국 특허 출원 10-2008-0081605호

[문헌 26] J. Choromatgr. 27, p.A 1135, 2006

[문헌 27] Bradford MM., et al., Ann Biochem, 72, pp.248-254, 1976

일반적으로 비만은 체내에 과잉상태인 에너지가 지방으로 축척되어 체지방이 비정상적으로 많아 대사 이상이 유발되어 나타나는 현상으로써, 산업사회에서 비만은 가장 흔한 영양학적 문제로, 미국 통계에 의하면 미국 국민의 1/3, 어린이의 20%가 비만 환자로 보고되고 있으며, 제2형 당뇨병 환자의 70% 이상이 비만하고, 최근 우리나라에서는 식습관이 서구화되고, 문화수준이 향상됨에 따라 단순 비만자가 현저히 증가하고 있다. 이러한 비만은 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 지방간 및 당뇨 등 대사성질환에 관련된 합병증의 발생에 관여하거나 악화시키는 원인이 되므로, 비만은 미리 예방하는 것이 좋으며, 비만증이 된 경우에는 체지방의 감소와 지질대사의 개선을 통하여 신체대사가 원활하게 이루어지도록 조절하는 것이 각종 질병의 예방과 건강을 위하여 매우 중요하다.

구체적으로, 비만은 체내 에너지 대사가 비정상적인 기전으로 조절되고, 그에 따라 잉여에너지를 지방세포에 저장하게 되는데, 지방 세포의 크기가 늘어나면서 지방축척이 증가되는 비대성 비만과, 지방세포의 수가 늘어나서 지방축척이 증가되는 증식성 비만으로 나눌 수 있다. 이 중 비대성 비만의 경우 각각의 지방 세포에 축적할 수 있는 지방의 용량에 한계가 있기 때문에 중증 비만이 되는 경우는 많지 않으나, 증식성 비만의 경우 지방 세포의 수가 늘어나므로 많은 지방 양을 저장할 수 있어 중증 비만증이 될 수 있다.

비만증에서 에너지 대사는 지질이 주가 되며 지질 분해와 지질 합성이 모두 증가된다. 지질 분해의 증가와 그에 따른 유리 지방산의 이용 증가는 비만, 특히 복부 비만의 특징이며, 지방 용적과 지질 산화 간에 높은 상관관계가 관찰되어 지방 용적의 증가가 혈중 유리 지방산치 및 지질 산화 증가의 원인으로 생각된다. 지질 산화는 비만의 초기에도 증가되어 관찰되며, 공복시나 당부하 후에도 증가되어 있다.

많은 전향적 연구를 통해서도 비만이 내당 능력 장애 및 인슐린비의존형 당뇨병에 선행한다는 사실이 관찰되었다(Carey VJ. et al., Body fat distribution and risk of non-insulin-dependent diabetes mellitus in women, The nurses' health study, Am J Epidemiol, 145, pp.614-619, 1997). 프라밍함(Framingham) 연구에서는 비만한 사람에서 내당 능력 장애가 빈발함이 관찰되었고, 대부분의 연구들에서 내당 능력 장애를 갖는 비만한 사람들은 인슐린비의존형 당뇨병 발생의 고위험군임이 관찰되었다.

비만으로부터 당뇨병으로의 진행에 관한 정확한 기전은 알려져 있지 않으나 인슐린 저항성의 증가가 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다. 펠버(Felber) 등은 역학적 관찰들에 근거하여 비만한 사람을 경구 당 부하 검사 시 혈당과 인슐린 반응에 따라 정상 내당능군, 내당능 장애군, 고인슐린혈증을 보이는 당뇨군 및 저인슐린혈증을 보이는 당뇨군의 네 군으로 분류하였고, 비만에서 당뇨병으로의 진행도 이러한 과정을 거친다고 하였다(Golay A. et al., Obesity and NIDDMP, the retrograde regulation concept, Diabetes Rev, 5, pp.69-82, 1997).

여러 정황적 증거들을 고려할 때 지방세포가 인슐린 저항성의 발생에 기여할 것으로 생각되는데, 즉 지방세포에서 분비되는 인자들 혹은 대사 전달자(metabolic messenger) 들이 근육 및 간에서 인슐린의 작용을 억제할 것으로 여겨진다. 이러한 인자로써 가장 먼저, 그리고 널리 인정받고 있는 것이 지방 조직에 저장된 중성 지방으로부터 가수분해되어 나오는 유리 지방산이다. 그 외에 최근 지방세포에서 분비되는 TNF-α및 렙틴(leptin)등도 비만에서 인슐린 저항성의 원인으로 제시된 바 있다(Hotamisligil GS. et al., Tumor necrosis factor a, a key component of the obesity-diabetes link, Diabetes, 43, pp.1271-1278, 1994).

비만효과에 관련된 효능 평가는 3T3-L1 섬유아세포가 지방세포로 분화시 지방이 분화된 상태에서 축적된 지방을 소비하거나, 새로이 합성될 지방을 억제하는 방법을 이용한 연구가 진행되고 있으나, 천연물로부터 세포수준에서 결과가 동물실험상에서 동일하게 재현되지 못한다는 단점이 있으며 또한, 현재 비만치료제로서 제니칼(orlistat)과 리덕틸(sibutramine)이 가장 많이 사용되고 있으나, 소장에서 리파아제를 억제하는 제니칼은 지방변, 가스생성등의 부작용이 잘 알려져 있고, 리덕틸의 경우에는 교감신경계의 세로토닌과 노르아드레날린 농도를 증가시킴으로써 두통, 구갈, 식욕부진, 불면증 등의 부작용이 보고되고 있기 때문에 더욱 안전하고 새로운 기전의 치료약이 요구되고 있는 실정이다.

길경은 초롱꽃과Campanulaceae)의 식물인 도라지(Platycodon grandiflorum A. DC.)의 뿌리로 일반적으로 한국에서는 길경(Kilkyoung), 중국에서는 지겡(Jiegeng), 일본에서는 기쿄(Kikyo)로 불리우며 전통적인 동양 의약품으로 사용 되어 왔다. 길경은 주로 거담, 진해작용, 기침 및 기관지염의 치료제로 사용되어왔으며, NF-kB와 NO assay를 통한 항염증 효과(Biol. Pharm. Bull., 11, p.2114, 2008; Eur. J. Pharmacol., 537, p.1, 2006; Life Sci., 76, p.2315, 2005) 항암효과(Int. J. Cancer, 261, p.2674, 2008; Cancer Lett., 261, p.98, 2008), 통증완화효과(Am. J. Chin. Med., 32, p.257, 2004; Planta Med., 68, p.794, 2002), 소화효소분비 억제효과(Arch. Pharm. Res., 27, p.1048, 2004), 콜레스테롤 대사 개선효과(Eur. J. Pharmacol., 537, p.1, 2006; J. Food Sci., 73, p.195, 2008) 가 있는 것으로 알려져 있다.

길경의 주요 약리성분으로 길경사포닌들이며, 전체의 약 2% 함유되어있는 올레아난(oleanane) 계열의 트리테르펜 사포닌인 길경 사포닌(platycosides; platycoside A, platycodin D₂, D₃, D, polygalacin D 등)으로 지금까지 30여종 이상이 알려져 있다(Chem Pharm Bull, (Tokyo) 54, p.557, 2006; Chem. Pharm. Bull, (Tokyo) 54, p.1285, 2006; J. Chem. Soc. Perkin Trans., I, p.661, 1984; Planta Med., 71, p.566, 2005). 주요 사포게닌의 형태는 기본적으로 배당체의 4번 위치에 알코올기의 결합 유무에 따라 플라티코디게닌 (platycodigenin)을 배당체로 하는 사포닌과 폴리갈라식산(polygalacic acid)을 배당체로 하는 사포닌이며, 이들 사포닌의 3번과 28번에 결합되어 있는 당들의 종류와 수에 따라 여러 길경 사포닌들이 최근까지 보고되었다(Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 20, p.1957, 1972; Akiyama T., Chem. Pharm. Bull., 24, p.1965, 1972; Kubota T., Chem. Commun., p.1313, 1969) 이 중 플라티코딘 D, D₃와 플라티코사이드(platycoside) E, 폴리갈라신 D가 함량적으로 길경의 주성분이다.

특히, 상기 플라티코딘 D는 길경(Platycodon grandiflorum A. DC.)의 주요 약리성분을 가지는 사포닌으로써, 항세포사멸(anti-apoptosis, 대한민국 등록번호 제10-0564927호), 콜레스테롤 저하(cholestrol-lowering), 대한민국 등록번호 제10-0750333호) 항염증(anti-inflammation, 대한민국 등록번호 제10-0696647호)의 효능이 알려져 있어, 약물학적 가치가 큰 단일성분(Hahn J., Nutr., 130, p.2760, 2000)으로 잘 알려져 있으나, 이러한 플라티코딘 D의 단점, 즉 극성이 높고 유사한 구조를 가지고 있는 많은 종류의 사포닌이 포함되어 있어 분리시 수율이 급격히 떨어지는 점을 보완하여 본 발명자에 의해 컬럼을 고속으로 회전시켜 물질의 분리효율을 극대화시킨 고속향류크로마토그래피를 이용하여 단시간에 길경사포닌-고함유 분획물 및 이 분획물로부터 더욱 정제된 플라티코딘 D를 대량으로 분리 및 생산하는 방법이 특허 출원이 된 바 있으나(대한민국 특허 출원 10-2008-0081605호), 상기의 다양한 효과에도 불구하고 원래의 길경 사포닌내 함유된 플라티코딘 D의 함량이 매우 적기 때문에 많은 제한이 있다.

상기 문헌의 어디에도 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D를 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 조성물이 교시되거나 기재된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 길경추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D를 이용하여, 지방세포 분화 억제 효과를 측정한 결과, 지방세포 분화 개선능이 우수하여 지질대사 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 길경 추출물로부터 분리되는 플라티코딘 D가 다량 함유된 신규 길경 사포닌 분획물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 길경을 추출하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 역상수지, 순상수지, 폴리스티렌계, 또는 이온교환수지 컬럼으로부터 선택된 하나 이상의 분리방법을 이용하여 길경 사포닌 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 분획물을 효소에 의하여 생전환 시킨 단일 길경 사포닌 화합물, 특히 단일의 플라티코딘 D 성분만을 대량으로 분리하는 제 3단계 공정을 통하여 제조되는 플라티코딘 D 50.0∼98.0(w/w)%, 플라티코딘 E 0∼35.0(w/w)%, 및 플라티코딘 D₃ 0∼20.0(w/w)%를 함유하는 약효가 증강된 신규의 길경 사포닌 분획물을 제공한다.

또한 본 발명은 길경 추출물로부터 분리되는 상기 길경 사포닌 분획물 또는 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 분리된 길경 사포닌 화합물을 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 길경 추출물로부터 분리되는 상기 길경 사포닌 분획물 또는 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 분리된 길경 사포닌 화합물을 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 길경을 추출하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 역상수지, 순상수지, 폴리스티렌계, 또는 이온교환수지 컬럼으로부터 선택된 하나 이상의 분리방법을 이용하여 길경 사포닌 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 분획물을 효소에 의하여 생전환 시킨 단일 길경 사포닌 화합물, 특히 단일의 플라티코딘 D성분만을 대량으로 분리하는 제 3단계 공정을 포함하는 길경 추출물로부터 길경 사포닌 화합물을 대량으로 분리하는 분리 및 생산 방법을 제공한다.

본원에서 정의되는 “효소”는 일반적인 당성분 분해효소로서, 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 만노시다제, 글리코시다제, 갈락토시다제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제 등이 바람직하며_,보다 바람직하게는, 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제, 보다 더 바람직하게는 글루코시다제 또는 셀룰라아제를 포함한다.

본원에서 정의되는 “길경 사포닌 화합물”은 플라티코사이드 A, 플라티코딘 D₂, 플라티코딘 D₃,플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E, 플라티코딘 D, 디아피오-플라티코딘 D, 플라티코딘 D₃, 2-O-아세틸 플라티코딘 D, 3-O-아세틸 플라티코딘 D, 2-O-아세틸 플라티코딘 D₂, 3-O-아세틸 플라티코딘 D₂, 2-O-아세틸 플라티코딘 D₃, 3-O-아세틸 플라티코딘 D₃, 폴리갈라신 D₂, 폴리갈라신 D_3,폴리갈라신 D 또는 디아피오-플라티코딘 D₃등이며_,바람직하게는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃또는 플라티코딘 D, 보다 바람직하게는 플라티코딘 D를 포함한다.

상기 지질대사 질환은 비만, 당뇨병, 고콜레스테롤증, 고지혈증, 저지질증, 지방단백질증 또는 동맥경화, 바람직하게는 비만 또는 당뇨병을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

보다 구체적으로는, 상기 제조공정의 제 1단계의 길경 추출물을 수득하는 단계는, 예를 들어, 건조된 길경 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 1 내지 20 시간, 바람직하게는 3 내지 15 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출법으로 약 1 내지 7회, 바람직하게는 2 내지 5회 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 길경 추출물을 얻을 수 있다.

상기 제 2단계의 길경 사포닌 분획물을 수득하는 단계는, 예를 들어, 상기 1단계에서 얻은 길경 추출물을 역상수지(C18), 순상수지(실리카겔), 폴리스티렌(Diaion계) 및 이온교환수지 컬럼 등과 같은 고분자 합성수지, 바람직하게는 폴리스티렌(Diaion계)에 흡착시켜 물 및 알콜 혼합용매, 바람직하게는, 물 및 메탄올 혼합용매를 유출용매로 이용하여 극성 용매로부터 얻은 극성 물질을 제거하고, 상기 유출용매보다 극성이 낮은 성분들을 유출시키는 단계를 통하여 보다 극성이 낮은 용매로부터 본 발명의 길경 사포닌 분획물을 얻을 수 있다.

상기 제 3단계의 단일 길경 사포닌 화합물을 수득하는 단계는, 예를 들어, 상기 2단계에서 얻은 길경 사포닌 분획물을 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 만노시다제, 글리코시다제, 갈락토시다제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제 등이 바람직하며_,보다 바람직하게는, 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제, 보다 더 바람직하게는 글루코시다제 또는 셀룰라아제 효소를 첨가하여 약 20 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 40℃에서, 6시간 내지 48시간, 바람직하게는 약 24 시간 동안 반응시키는 효소반응공정(생전환)을 통하여 본 발명의 고함량의 길경 사포닌 화합물들, 예를 들어, 플라티코딘 D의 함량이 50 내지 99%인 성분을 얻을 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제 공한다.

본 발명의 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소를 첨가한 고함량의 길경 사포닌 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg 으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 유효성분으로 함유하는 지질대사 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 지질대사 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 망초 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 길경 사포닌 화합물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용 할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소에 의하여 생전환 시킨 고함량의 플라티코딘 D는 탁월한 지방세포 분화 억제 효과를 지니므로, 지질대사 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. HPLC 실험 준비

HPLC 분석에 사용한 모든 시약은 J. T. Baker (USA)의 HPLC용 용매를 구입하여 사용하였으며, 길경 사포닌의 성분을 확인하기 위한 HPLC에는 펌프(HITACHI L-6200)와 자동시료주입기 (autoinjector, Shimadzu SIL-9A), 증기화광산란 검출기 (ELSD, Sedex 75)를 사용하였으며, 물(90%): 아세토니트릴(10%) 경사법 (gradient) 방식으로 리텐션 타임(retention time) 60 min, 1ml/min로 흘려 주고, Agilent에서 제조된 역상(reversed-phase) C18 칼럼(Zorbax SB-Aq c18, 150 X 4.6mm I.D., 5μ m 입자)을 이용하여 단일 길경 사포닌을 분리하며, 순도측정 시 HPLC로 확인하였다(J. Chromatogr. 27, p.A 1135, 2006).

실시예 1. 길경 추출물의 제조

1-1. 길경 30% 메탄올 추출물의 제조

경동시장에서 판매되고 있는 (주)이레제약에서 제조 및 포장한 절단된 형태 그대로의 건조 길경을 1kg을 구입한 후 5L 반응조에 담고 여기에 30% 메탄올 3L를 넣고 속슬렛 추출(Soxhlet extract)법으로 3시간씩 100℃에서 3회 가열하여 추출한 후 어드벤텍(ADVANTEC) 종이필터를 이용하여 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 분말 형태의 길경 30% 메탄올 추출물 350g(이하, ‘ME’이라 함)을 얻었다.

1-2. 길경 열수 추출물의 제조

경동시장에서 판매되고 있는 (주)이레제약에서 제조 및 포장한 절단된 형태 그대로의 건조 길경을 1kg을 구입한 후 5L 반응조에 담고 여기에 100% 증류수 3L를 넣고 속슬렛 추출(Soxhlet extract)법으로 3시간씩 100℃에서 3회 가열하여 추출한 후 어드벤텍(ADVANTEC) 종이필터를 이용하여 여과하고, 이 여과액을 감압증류기(EYELA, JP/N-1000)를 이용하여 농축 후 동결 건조하여 분말 형태의 길경 열수 추출물 500g(이하, ‘WE’이라 함)을 얻었다.

실시예 2. 길경 사포닌 분획물의 제조

상기 실시예 1-2의 WE(길경 열수 추출물)의 극성성분을 제거하기 위해서, 상기 실시예 1-2에서 얻은 WE 200g을 다시 물(증류수) 15L에 용해시켜서 고분자 합성수지(Diaion HP-20 겔)에 1.5kg으로 채워진 칼럼(100×10㎝)을 물: 메탄올 용매계를 이용한 크로마토그래피를 실시한 후 물과 30% 메탄올 각 15L로 세척하여 다당체를 비롯한 극성물질을 제거한 후 다시 100% 메탄올 15L로 흘려서 얻은 분획을 감압증류기와 동결건조기(Eyela, JP/N-1000)를 사용하여 감압 농축하여 길경 조사포닌 약 4g (이하, CS 라 함)을 얻었다.

실시예 3. 길경 조사포닌의 분석

상기 실시예 2에서 얻은 극성성분이 제거된 CS(길경 조사포닌) 중 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹이고, 용해된 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (1ml Norm-ject syringe, Henke Sass Wolf, Germany)와 PVDF 주사기필터(0.45㎛, PVDF syringe filter, Whatma n, USA)를 사용하여 샘플 전처리를 한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다.

실험결과, 5mg CS에 함유된 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.26, 0.16, 0.67 mg로 나타났다. 또한, 상대적인 양은 23.8, 14.9, 61.3 %로 나타났다.

참고예 2. 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

2-1. 글루코시다제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

아몬드에서 유래한 베타 글루코시다제(G0395)를 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고, 1 unit은 pH 5.0과 온도 37℃에서 살리신(salicin)으로부터 분당 1.0 μmole의 글루코오즈를 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1mg당 4.6 unit의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 베타글루코시다제 고체형 5 units (1.09mg; 4.6u/1mg) 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후, HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 가지고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.17, 0.19, 0.84 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 14.2, 15.5, 70.3 %로 나타났다.

2-2. 글루코시다제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

아몬드에서 유래한 베타 글루코시다제(49290)로 플루카(Fluka)에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고, 1 unit은 pH 5.0과 온도 37℃에서 살리신(salicin)으로부터 분당 1.0 μmole의 글루코오즈를 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1mg당 8.92 unit의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 베타글루코시다제 고체형 5 units (0.56 mg; 8.92u/1mg) 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shaking incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 가지고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.25, 0.17, 0.76 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 21.2, 14.4, 64.3 %로 나타났다.

2-3. 셀룰라아제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

트리코데르마 리제이에서 유래한 고체형의 셀룰라아제(C8546)로 시그마에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고 1 unit은 pH 5.0과 온도 37℃에서 셀룰로오즈(cellulose)로부터 1시간 안에 1.0 μmole의 글루코오즈를 유리시키는 정도를 나타내며 구입한 효소는 1mg당 6 unit의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후 용해된 시료에 셀룰라아제 고체형 5 units (0.83mg; 6u/1mg) 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 가지고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.0, 0.0, 1.58 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 0.0, 0.0, 100 %로 나타났다.

2-4. 셀룰라아제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

트리코데르마 리제이에서 유래한 액체형의 셀룰라아제(C2730)로 시그마에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고 1 unit은 pH 5.0과 온도 37℃에서 셀룰로오즈(cellulose)로부터 1시간 안에 1.0 μmole의 글루코오즈를 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1mg당 6 unit의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 셀룰라아제 액체형 5 units (5.96 ㎕)와 1 unit (1.19 ㎕; 0.84 unit/㎕) 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 가지고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 활성도 5 unit에서는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.0, 0.0, 1.49 mg 그리고 상대적인 비율은 각각 0.0, 0.0, 100 %로 나타났으며, 1 unit에서는 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 상대적인 비율이 각각 0, 5.7, 94.3 %로 나타났다.

2-5. 갈락토시다제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

아스페리길러스 오리제에서 유래한 갈락토시다제(G5160)로 시그마에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고, 1 unit은 pH 4.5과 온도 30℃에서 락토오즈를 분당 1.0 μmole 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1mg당 10 unit의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 갈락토시다제 0.5mg (5 unit; 10u/1mg) 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 갖고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.06, 0.15, 1.24 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 4.2, 10.6, 85.3 %로 나타났다.

2-6. 글루크로니다제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 유래한 글루크로니다제(G7646)로 시그마에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고 1 unit은 pH 6.8과 온도 37℃에서 페놀프탈레인 글루크로나이드로부터 페놀프탈레인을 시간당 1.0 ㎍ 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1g 단백질(protein) 당 5,292,000 unit 의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 글루크로니다제 5 units 를 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담근 후 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 갖고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.30, 0.18, 0.77 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 24.2, 14.2, 61.6 %로 나타났다.

2-7. 글루크로니다제 효소에 따른 조사포닌의 성분변화와 플라티코딘 D의 증가효과

헬릭스 포마티아에서 유래한 글루크로니다제(G7017)로 시그마에서 구입하였다. 효소의 활성도는 유니트(U; unit)로 나타내고, 1 unit은 pH 6.8과 온도 37℃에서 페놀프탈레인 글루크로나이드로부터 페놀프탈레인을 시간당 1.0 ㎍ 유리시키는 정도를 나타내며, 구입한 효소는 1g 단백질(protein) 당 1,145,000 unit 의 활성도이다.

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 5㎎을 1.5mL 에펜도르프 튜브(AXYGEN Scientific, USA)에 담고 1mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 글루크로니다제 5 units 를 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담근 후 시료를 1ml 전체플라스틱주사기 (norm-ject syringe)와 PVDF 주사기필터(PVDF syringe filter)를 사용하여 샘플을 전처리한 후 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 데이터를 갖고 플라티코사이드 E와 플라티코딘 D₃, 플라티코딘 D의 각 양을 정량하고 세 개의 물질의 절대적인 양을 mg 그리고 상대적인 비율을 %로 나타내었다.

실험결과, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃및 플라티코딘 D의 절대적인 양은 각각 0.24, 0.18, 0.76 mg으로 나타났다. 상대적인 비율은 20.4, 15.4, 64.2%로 나타났다.

실시예 4. 셀룰라아제 효소를 이용한 고함량 플라티코딘 D의 제조

극성물질을 제거한 상기 실시예 2의 CS 2 g을 1 L 의 용기에 담고 400 mL의 증류수에 녹인 후, 용해된 시료에 상기 참고예 2-4의 셀룰라제 액체형 240 ㎕ (201.6 unit)효소를 첨가하여 37.5℃ 왕복진탕배양기(shake incubator)에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후 100℃ 물에 3분 정도 담그고, 반응결과물을 Diaion-HP20 충진물로 채워진 컬럼 크로마토그래피에 주입하여 물로 시작하여 100% 메탄올의 용매조성 (물, 30% 메탄올, 100% 메탄올)을 이용하여 100% 메탄올 분획을 모은 후, 분획은 감압증류장치를 이용하여 메탄올을 제거하고 농축한 후 동결건조하여 효소를 첨가한 고함량의 플라티코딘 D (이하, ‘GPD’이라 함) 을 얻었다.

플라티코사이드 E, 디아피오-플라티코사이드 E, 플라티코딘 D₃, 폴리갈라신 D 또는 디아피오-플라티코딘 D₃의 피크가 HPLC 크로마토그램에서 시간의 경과에 따라 줄어들고 결국에는 사라졌다. 또한, 동시에 플라티코딘 D와 디아피오-플라티코딘 D가 증가하는 것을 관찰할 수 있는데, 이는 플라티코딘 D의 C-3번 위치에 글루코오즈 1개, 2개가 더 붙어 있는 플라티코딘 D₃,와 플라티코사이드 E의 글루코오즈가 셀룰라제에 의해 떨어져서 위의 화합물들은 플라티코딘 D로 전환이 되며, 디아피오-플라티코사이드 E와 디아피오-플라티코틴 D₃ 역시 디아피오-플라티코딘 D로 모두 전환된다.

실험예 1. 지방세포 분화 억제 효과

지방전구세포 (pre-adipocytes), 3T3-L1 세포(American Tissue Culture. Collection, ATCC)를 10% 우아혈청(bovine calf serum)이 들어있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 세포배양 한 후, 6웰 플레이트에 웰 당 4 x 10⁴ 개수의 세포를 2ml에 현탁(suspension)하여 분주(seeding) 한다. 동일 배지에서 약 24 ~36시간 동안 배양한 다음, 지방전구세포의 배양시 세포밀도가 90%가 되면 3T3-L1의 경우 10μg/ml 인슐린(insulin), 0.5mM 아이비엠엑스(IBMX, 3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 μM 덱사메타손(Dexamethasone), 10% 우태혈청(Fetal Bovine Serum)이 포함된 DMEM 배지로 갈아주고 48 ∼ 55시간 정도 처리하여 성숙한 지방세포로의 분화를 유도한다. 이때 상기 실시예 에서 얻은 WE(길경 열수추출물) 4ug/ml, CS(조사포닌) 4ug/ml, PD(플라티코딘 D) 5μM, GPD (효소를 첨가한 플라티코딘 D) 4ug/ml들을 DMSO에 녹인 후 동일 농도의 DMSO가 각각의 농도 처리군에서 사용되도록 함께 처리하였고, 대조군(이하, ‘DM’ 이라 함)으로는 10μg/ml 인슐린(insulin), 0.5mM 아이비엠엑스(IBMX, 3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 μM 덱사메타손(Dexamethasone)만을 넣은 후 동일한 조건으로 DMSO에 녹여 동일농도로 처리한다. 분화유도를 시작하고 48시간 후에 10 μg/ml 인슐린(insulin)이 포함된 10% FBS/DMEM 배지로 다시 교환하면서 약물도 다시 처리하고, 48시간 후에 10% FBS/DMEM 배지로 다시 갈아주었다.

1-1. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)

지방세포로 유도 후 5-6일째, 세포주에서 단백질을 추출한 후 우태혈청을 사용한 브래드포드(Bradford) 방법(Bradford MM., et al., Ann Biochem, 72, pp.248-254, 1976)을 이용하여 정량하였다. 단백질 20g을 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 12% 불연속 SDS-PAGE(discontinuous sodium dodecylsulfate) - 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에서 전기 영동 하였고, 전기 영동된 단백질은 20 볼트에서 50분 동안 폴리-비닐리덴디플루오라이드(PVDF, Amersham Bioscience, USA) 막에 이동시켰다. 블로킹 완충액으로 TTBS (Tris-Tween buffered saline)에 5% 탈지분유를 녹여 30분간 실온에서 반응하여 차단하였고, c/EBP-α(Santacruz), PPAR-γ2(Santacruz) 항체들을 각각 3시간 동안 반응시킨 후 10분 간격으로 3회 세척하였다. 2차 항체 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP, (1:2,000 희석, Santacruz, USA)를 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척단계를 거쳐 다시 한번 TTBS로 10분간 3회 세척하였으며, 발색제인 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 2분간 반응하고 필름에 감광하여 나타난 밴드(band)의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.

그 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 c/EBP-α 및 PPAR-γ 발현정도가 PD > GPD > CS > WE 순으로 억제됨을 확인하였으나, 단일 화합물의 농도 uM을 함량 ug단위로 환산해 보았을 경우, PD(플라티코딘 D)는 약 6.12ug/ml로, GPD(효소를 첨가한 플라티코딘 D)보다 더 많은 함량을 나타내므로, 특히 GPD(효소를 첨가한 플라티코딘 D)가 대표적인 지방합성 단백질 cEBP-α 및 PPAR -γ 발현정도가 PD(플라티코딘 D) 보다 적어도 동일하거나 탁월한 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 2 참조 ).

1-2. 지방세포 분화의 억제 효과

지방세포로의 분화를 시작한지 8 내지 10일이 지난 후, Oil-red O 염색을 통해 생성된 지방을 확인한다. 인큐베이터 안에서 플레이트를 꺼내 세포를 관찰하고, 세포 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2~3회 세척하는데, 이때 너무 세게 PBS를 첨가하게 되면 세포가 떨어지므로 웰 벽을 데고 흐르도록 주입시킨다. 10% 포름알데하이드(formaldehyde) 1ml을 각 플레이트 에 넣고 세포를 실온에서 1시간동안 고정시키고, 10% 포르말린(Formalin)을 제거하고 증류수로 2~3회 세척하여 상기 참고예 2에서 제조한 0.5% Oil-red O 염색 시약 1ml을 각 플레이트에 넣고 실온에서 약 2시간 동안 염색한다. 염색후 염색시약을 걷어낸 후, 증류수로 세척한 뒤, 뚜껑을 열어 건조시킨 다음 이미지 스캔을 하고, 염색된 세포에 60% 이소프로판올(isopropanol)로 2~3번 염색시약을 세척한 다음, 광학 현미경으로 현상하였고, 염색이 완료된 셀을 4% 엔피-40(IGEPAL)용액을 1ml을 각 플레이트에 넣어 5분 정도 반응 시켜 염색약을 녹인 다음, 490nm에서 흡광도를 측정 및 정량하였다.

실험결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이 대조군은 3T3-L1이 지방세포로의 분화가 잘 이루어져 그 모양이 둥근 형태로 바뀌었고, 동시에 지방이 축척되기 시작하여 9일째에는 축척된 지방이 여러 층으로 보임을 알 수 있으며, 이는 오일 레드 O 염색 결과에서도 염색된 지방을 관찰할 수 있었던 반면, PD > GPD > CS > WE 순으로 지방세포 분화의 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 대조군을 기준으로 지방정도를 100%으로 환산하였을 때, WE(길경 열수추출물)는 78%, CS(조사포닌)는 62%, PD(플라티코딘 D)는 52%, GPD(효소를 첨가한 플라티코딘 D)는 55%로 나타났다(도 4 참조).

따라서, 상기와 같은 결과로 GPD의 양을 PD와 동일하게 하여 측정할 경우, 지방세포 분화의 억제 효과가 적어도 동일하거나 탁월한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명의 길경 추출물로부터 분리되는 길경 사포닌 분획물 및 이 분획물로부터 효소를 첨가한 고함량의 길경 사포닌 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

PD 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

WE 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정 제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

CS 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

GPD 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ 12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

PD 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수 에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

GPD 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E (분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요 국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

NRF-2010-8384

[부처명]

교육과학기술부

[연구사업명]

기초연구사업

[연구과제명]

길경사포닌 유사체의 분리, 동정 및 지방세포의 분화 조절

[주관기관]

서울대학교

[연구기간]

2010년 05월 01일 ~ 2013년 04월 30일

도 1는 셀룰라아제효소로 처리한 길경(도라지) 조사포닌의 성분분석 결과를 나타낸 도이고,

도 2는 WE, CS, PD 및 GPD의 c/EBP-α및 PPAR-γ 발현정도를 나타낸 도이며,

도 3은 WE, CS, PD 및 GPD의 오일 레드 O 염색 결과에 따른 지방세포 분화의 억제 효과를 나타낸 도이고,

도 4는 WE, CS, PD 및 GPD의 오일 레드 O 염색 결과에 따른 지방세포 분화의 억제 효과를 수치화하여 비교하여 나타낸 도이다.

Claims

길경을 추출하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 역상수지, 순상수지, 폴리스티렌계 또는 이온교환수지 컬럼으로부터 선택된 하나 이상의 분리방법을 이용하여 길경 사포닌 분획물을 수득하는 제 2단계; 상기 분획물을 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 만노시다제, 글리코시다제, 갈락토시다제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제 효소에 의하여 생전환 시킨 단일 플라티코딘 D 화합물을 함유하는 제 3단계 공정을 통하여 제조되는 플라티코딘 D 50.0 ~ 98.0(w/w)%, 플라티코딘 E 0 ~ 35.0(w/w)% 및 플라티코딘 D₃ 0 ~ 20.0(w/w)%를 함유하는 약효가 증강된 신규의 길경 사포닌 분획물.
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건조된 길경 건조중량의 1 내지 30배 부피량(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여, 0 내지 100℃, 실온에서 1 내지 20시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출법의 추출방법으로, 1 내지 7회 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 길경 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계에서 얻은 길경 추출물을 역상수지(C18), 순상수지(실리카겔), 폴리스티렌계(Diaion계) 및 이온교환수지 컬럼과 같은 고분자 합성수지에 흡착시켜 물 및 알콜 혼합용매를 유출용매로 이용하여 극성 용매로부터 얻은 극성 물질을 제거하고, 상기 유출용매보다 극성이 낮은 성분들을 유출시키는 단계를 통하여 보다 극성이 낮은 용매로부터 길경 사포닌 분획물을 얻는 제 2단계; 상기 2단계에서 얻은 길경 사포닌 분획물을 글루코시다제, 셀룰라아제, 락타아제, 만노시다제, 글리코시다제, 갈락토시다제, 나린지나제, 헤스페리디다제 또는 글루크로니다제 효소를 첨가하여 20 내지 50℃에서, 6시간 내지 48시간 동안 반응시키는 효소반응공정(생전환)을 통하여 단일 플라티코딘 D 화합물을 함유하는 분획물을 얻은 제 3단계 공정의 길경 사포닌 화합물을 분리하는 분리방법.
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