KR101034567B1 - 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상황버섯 추출물, 영지버섯 추출물 및 ALA(5-aminolevulinic acid)를 포함하는 혼합물이 리포좀에 내포된 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 약물 전달 시스템의 피부 침투 효과가 개선되어 탈모 방지 및 발모 촉진용 유효 성분의 효과가 극대화된 효과를 기대할 수 있다.

탈모, 발모, 상황버섯, 영지버섯, ALA, 리포좀

Description

탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템{Drug Delivery System and Compositions of Preventing Loss of Hair and Promoting Growth of Hair}

본 발명은 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템에 관한 것이다.

산업발전과 환경오염, 스트레스, 고령화의 진전에 따라 탈모증이나 박모증이 점차 심화되고 있으며, 웰빙시대를 맞이하여 삶의 질과 외모에 대한 관심이 고조되고 있다. 두피로부터 모발이 빠지는 탈모증은 여러 가지 요인에 의해 발생되는 것으로, 유전적인 체질이나 남성 호르몬의 작용과 같은 내적인 요인 또는 일상생활에서의 정신적인 스트레스, 두피에서의 과산화지질의 축적과 같은 외적인 요인이 있으며, 이러한 요인들이 복잡하게 관여하여 탈모증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 남성형 탈모뿐만 아니라 여성들의 비만성 탈모를 비롯하여 젊은 층에서의 탈모가 점차 확산되어가는 추세에 있으며, 이러한 탈모현상을 개선하기 위해 많은 종류의 모발성장 또는 발모제가 시판되고 있다.

시판중인 탈모 및 발모제 제품은 의약품의 경우, 미국의 식품의약국(FDA)으 로 부터 탈모치료제로 허가를 받은 약물은 두 종류로써, 바르는 치료제인 미녹시딜은 혈관 확장작용에 의해 그리고 경구용은 피나스테리드를 주제로 한 남성호르몬의 활성화 억제작용에 의해 탈모방지 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 현재 시판중인 모발성장 또는 발모제의 경우, 호르몬제 적용에 따른 부작용 문제, 또는 모근이 활성화 되어있는 부위에서만 효과를 나타내기 때문에 탈모방지에는 효과가 있지만 장기간 휴지기 상태에 있는 모발의 성장 즉 발모효과는 미미하거나, 지속적으로 먹거나 발라주어야만 효과를 발휘하는 등의 문제가 있어 탈모증이나 박모증 해결을 위한 경제적이고 안정적인 기술개발이 필요한 상황이다.

현재 시판중인 모발성장 또는 발모제에 사용되는 주요 성분은 두피에 충분한 혈액을 순환시키기 위한 염화카프로니움, 미녹시딜 및 각종 식물의 추출물을 주성분으로 하는 혈관 확장제나, 모유두에 부착하여 모발을 탈락시키는 남성호르몬의 작용을 억제하기 위한 에스트로겐, 에스트라지올, 프로게스테론 등의 여성호르몬제 또는 펜타데칸산, 피나스테라이드 등의 남성호르몬 활성화 억제제가 있다.

그러나 이들 대부분의 모발성장, 발모제들은 탈모의 방지에는 어느 정도 효과를 나타내지만 발모와 관련된 효과는 만족스럽지 않은 것으로 알려져 있다. 즉, 이들 제제는 모근이 활성화 되어 있는 부위에서 주로 효과를 나타내기 때문에 장기간의 휴지기 상태에 있는 모발의 성장 즉 발모효과는 높지 않아 이미 탈모가 진행되어 모낭이 위축된 박모 두피에는 효과가 크지 않은 것으로 알려져 있다.

한편, 천연추출물을 포함한 샴푸나 화장품 등의 경우 단순하게 추출물을 포 함하고 있거나 항균 기능에 초점이 맞춰져 있어서 초기 발모나 세균성 탈모증상에는 일부 효과를 보이는 제품이 있기는 하지만 지속적인 발모효과를 보이지 못하고 있고, 천연추출물이 제품 내에서 산패하거나 기능성을 상실하는 경우가 많아서 제품에 대한 소비자 신뢰도가 비교적 낮은 상황이다.

아울러 제품에 포함된 천연추출물 등의 유효성분 함량 대비 제품가격이 너무 높게 산정되어 있기 때문에 사용효과가 뚜렷하지 않은 고가제품으로 인해 탈모 및 박모에 시달리고 있는 많은 사람들이 제품을 믿고 사용할 수 있는 기반이 미흡한 상황이다.

더욱이 제품 내 발모 유효성분 함량만큼 중요한 것이 제품에 포함되어 있는 유효성분의 모낭 세포 전달 효율이지만, 약물전달시스템이 적용된 제품은 아직 개발 상용화되지 못하고 있기 때문에 천연추출물 함유제품의 효능이 불규칙하거나 성능을 나타내지 못하는 원인이 되고 있다.

국외 제품의 경우도 탈모방지에는 어느 정도 효과가 있지만 휴지기 발모효과가 미비하거나 탈모방지나 발모에 대한 객관적인 성능지표가 제시되지 못하고 있으며, 성능 대비 고가의 가격과 사용기간 중 성능확인이 용이하지 않기 때문에 제품 사용기간 중 중도 포기하는 등의 문제점으로 개발제품의 범용성이 뒷받침되지 못하고 있는 상황이다.

현재 시판중인 모발성장 또는 발모제와 달리 호르몬제 적용에 따른 부작용 문제, 또는 모근이 활성화 되어있는 부위에서만 효과를 나타내기 때문에 탈모방지에는 효과가 있지만 장기간 휴지기 상태에 있는 모발의 성장 즉 발모효과는 미미하 거나, 지속적으로 먹거나 발라주어야만 효과를 발휘 하는 등의 문제가 있어 탈모증이나 박모증 해결을 위한 경제적이고 안정적인 기술 개발이 필요한 상황이다.

이에 본 발명의 발명자들은 식물 및 한약재 등으로부터 탈모 및 박모에 효과가 있는 유효성분 스크리닝 및 추출기술과 그리고 피부흡수에 유리한 제형화 기초기술을 개발할 수 있었다.

본 발명의 발명자들은 자가 면역기능을 증진시키는 것으로 알려진 베타-글루칸(ß-glucan)과 비타민 B12, heme, 클로로필(chlorophyll)의 중간체로 알려진 ALA(5-aminolevulinic acid)을 가장 효과적으로 추출 및 분리정제 또는 합성할 수 있는 소재 및 방법에 대하여 연구하였으며, 이들 단위성분의 효능과 혼합성분의 효능에 대한 비교연구를 통하여 발모제 개발을 위한 최적 성분을 확인코자 하였다.

따라서, 본 발명은 탈모 및 박모에 효과가 있는 천연추출물 등의 유효성분의 효능을 검증하고 이러한 유효성분의 모낭세포 전달효율을 극대화하는 기술개발에 대한 것으로, 기존 시판중인 모발성장제 또는 육모제의 단점을 보완하고 탈모증이나 박모증 해결을 위한 경제적이고 안정적인 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일례로서 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은, 상황버섯 추출물, 영지버섯 추출물 및 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid, 이하, ALA)를 포함하는 혼합물이 리포좀으로 안정화된 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 탈모방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은 상황버섯 추출물과 영지버섯 추출물 및 ALA로 이루어진 혼합물을 포함한다.

본 발명은 발모 유효성분인 베타-글루칸(β-glucan)을 가장 효과적으로 확보하기 위하여 베타-글루칸 함유 천연물들을 검색하고 천연물의 추출 및 분리정제와 관련한 문헌연구를 수행하고, 베타-글루칸 추출 및 분리정제를 수행하였으며, ALA 제법연구를 통하여 본 발명의 목적에 맞는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 개발기술을 확립하고 제조기술을 개발하였다.

상기 베타-글루칸은 버섯류(Fungi), 효모류(Baker's Yeast), 곡류(cereals) 등에 함유되어 있는데, 효모로부터 추출된 베타-글루칸은 물에 용해되지 않으므로 두피로의 흡수가 제대로 이루어지지 않아 모낭을 충분히 활성화 시키지 못하며, 조성물에 침전되므로 상품으로서의 가치를 떨어뜨리는 단점이 있다. 또한 곡립 내 세포벽 물질의 약 70%를 구성하는 베타-글루칸은 귀리, 보리 등의 곡류에 특히 많이 함유되어 있는데 이들 베타-글루칸의 구조는 모낭의 활성이 이루어지지 않기 때문에 발모제 및 육모제 개발에 적합하지 않다.

한편 버섯류에 함유된 베타-글루칸은 수용성이기 때문에 두피로의 흡수가 용이하고 모낭의 활성 효과가 뛰어나다. 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯, 차가버섯, 아가리쿠스 버섯 등에는 글루칸(glucan), 쉬조필란(Schizophyllan), 헤테로글리칸(heteroglycan), 레티난(lentinan), 크레스틴(krestin), 갈락토만난(galactomannan) 등의 다당체(Polysacchride)가 함유되어 있는데, 특히 상황버섯의 주요 다당체 성분은 베타-글루칸이다. 상황버섯(Phellinus linteus)은 분류학적으로 소나무 비늘버섯과(Hymenochaetace)의 진흙버섯속(Phellinus)으로 국내에서 많이 재배되고 있다.

상황버섯의 약리작용으로는 위암, 식도암, 십이지장, 결장암, 직장암 등의 소화기 계통의 암과, 간암 수술 후 화학 요법을 병행할 때의 면역기능을 항진시키며, 자궁출혈, 월경불순, 장출혈 오장기능을 활성화시키고 해독작용을 한다고 보고되고 있다. 상황버섯이 이러한 효능을 나타내는 핵심 성분은 상황버섯 속에 함유되어 있는 베타-글루칸 때문임이 알려져 있다.

영지버섯(Ganoderma lucidum)은 담자균류 민주름버섯목 구멍장이버섯과에 속하는 버섯으로 예로부터 자양강장, 진정, 진통, 항종양, 혈압강하, 동맥경화, 기관지염, 만성관절염, 급만성 간염 등의 치료에 약제로 쓰여져 왔다. 영지버섯에서 추출한 수용성 다당체(Polysaccharides)를 암 유발 마우스에 투여하였을 때 육종이 87.6% 억제된다는 보고가 있었으며, 다른 연구들에서도 영지버섯 추출물이 항암 및 면역증진에 효과가 있다고 보고되었다. 이러한 영지버섯의 주요 다당체 성분으로는 베타-글루칸, 헤테로글리칸(Heteroglycan), 만노글루칸(mannoglucan), 글리코 펩타이드(glycopeptide) 등이 있다.

본 발명에서는 휴지기 상태의 모낭세포를 활성화시키는 베타-글루칸 함량이 높은 버섯류에 해당하는 상황버섯과 영지버섯을 추출하여 정제하고, 추출 단위성분 및 혼합성분의 두피흡수 촉진 제형을 적용하여 발모 동물실험에 이용하였다.

상기한 상황버섯과 영지버섯 추출물을 제조하기 위해서는 일반적인 천연물 추출법을 적용할 수 있을 것이다. 일반적인 천연물 추출법으로는 고상액상분리(Solid-Liquid Separation), 초임계 유체추출(Supercritical fluid extraction), 용매추출(Solvent extraction) 등이 이용된다.

본 발명에서는 상기한 여러 추출방법 중 가장 일반적이고 추출 단계가 간단하며 다당류 추출에 가장 효율적인 용매 추출법(solvent extraction)을 사용하여 유효 성분을 추출하였으며 필요에 따라 원심 분리를 이용한 고상액상분리(Solid-Liquid Separation)법을 함께 사용하였다.

용매 추출법에서는 추출에 이용할 다양한 용매를 선택할 수 있는데 어떤 용매를 선택해야 발모에 가장 효능이 있는 물질을 추출하기에 적합한지 알아보기 위해 용매 추출법에 주로 이용되는 메탄올 추출과 에탄올 추출, 그리고 뜨거운 물을 이용한 열수 추출을 실시하여 각각의 추출물을 얻었으며 이들 추출물을 이용하여 실험동물을 이용한 발모 효능실험을 진행 하였다.

한편, 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템에 포함되는 세번째 성분인 ALA는 탄소 5개의 지방족 화합물로 생물체 내에 클로로필 및 Heme을 포함하는 모든 테트라피롤(tetrapyrrole) 생합성 과정의 필수적인 전구체로서, 생 체 내에서 테트라피롤은 여러 단계를 거쳐서 헤모글로빈, 클로로필, 비타민 B12 등의 조효소인 Heme으로 생합성 된다.

ALA의 이러한 생합성 경로의 특징에 따라 식물생장촉진제, 제초제, 또는 살충제 등 농업적으로 응용할 수 있고, 암 치료제나 뇌종양 진단 등 의학적 응용, 그리고 화장품 첨가물이나 Heme 구조를 포함한 효소의 생산 등 공학적으로 응용할 수 있다. ALA는 친환경적인 생물농약 및 식물생장촉진제로서, 식물에 처리시 식물의 생장과 발달을 조절하는데, ALA를 저농도로 처리할 경우 무, 강낭콩, 보리, 감자, 마늘, 벼, 옥수수 같은 작물 등에서 무처리구 보다 10 ~ 60% 생육이 촉진되며, 이러한 촉진 효과는 클로로필 함량 증가, 광합성 활성 증대 및 호흡작용 억제를 통해 기인되는 것으로 보고되었다.

의약부문에서 ALA는 미생물 저항성 약품 및 피부암 치료제 등 생물학적인 활성물질로 이미 사용되고 있어, FDA에서 허용한 악성종양치료용 광역학치료법(Photodynamic theraphy, PDT)의 광민감제로서 널리 알려지고 있다. ALA는 Heme 생합성 경로를 통해 전구물질인 광민감제(Phtosensitizer) 프로토포르피린(protoporphyrin) Ⅸ를 형성하며 짧은 시간동안 작용을 나타낸 후 빠르게 대사된다. 프로토포르피린 Ⅸ가 광민감제로 활성화되기 시작하면 형광을 나타내고 세포 독성을 나타내게 되는데 이를 활용하여 암의 진단이나 치료의 목적으로 사용한다.

본 발명에서 사용되는 ALA는 상기한 다양한 방법으로 제조된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 배아세포를 함유한 옥수수추출물의 당 발효 및 분리정제법과 촉매반응을 이용한 합성법 연구를 진행하여 수득한 ALA 성분을 사용하는 것이 좋으나, 이로써 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은 리포좀으로 안정화된 시스템이다.

약물전달 시스템(drug delivery system, DDS) 기술은 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로서 약물의 부작용을 줄이고, 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며, 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하려는 기술을 총칭한다.

세포막은 세포 내외로 분자의 수송을 조절하는 관문으로, 소수성의 지질 이중층이기 때문에 친수성물질의 수송이 어렵다. 또한, 지질층의 세포간극은 30 ~ 80nm로 사슬체인의 경우 표피층을 통과하기 전에 각질 세포막에 융합 흡수되어 진피층까지 들어가기 어려워서 피부흡수를 통해 진피층까지 유효성분을 전달시키기 위해서는 적절한 제형의 개발 및 적용이 필요하다.

본 발명에서는 발모유효성분의 두피흡수 촉진을 위한 제형을 선정하기 위해 친수성과 친유성 추출성분의 성능검증을 진행하였으며, 그 결과, 본 발명의 발모유효성분은 친수성 정제물이 좋은 효능을 보였고, 따라서 적용 가능한 제형은 친수성물질을 효과적으로 포집하여 안정적 제형을 유지할 수 있는가와 제형의 입자 사이즈가 나노미립자로 형성될 수 있는가에 초점을 맞추었다.

리포좀의 성질은 그 구성성분인 지질의 구조 및 배열과 밀접한 관계가 있으며 거대분자 수준에서 극성의 머리기와 장쇄 탄화수소를 가지므로 양친매성이다. 따라서 리포좀의 형태는 알킬쇄의 영향을 고려함으로써 분자수준에서 이해될 수 있 다.

포스페이트(Phosphate), 포스파티디(Phosphatidy), 미에린(Mierine) 등 지질구조를 가진 천연 또는 합성물질들이 리포좀을 형성하는 기본적인 물질이며, 리포좀은 천연의 포스포리피드(Phospholipid), 반합성, 합성된 리피드(Lipids)에 의하여 만들어진다. 이런 리피드(lipids) 물질들을 살펴보면 포스파티디(Phosphatidy), 글리세롤 포스페이트(Glycerol Phosphate), 모이에티(Moiety), 포스파티딜 미에린(Phosphatidyl Mierine) 등 지질구조를 가진 천연 또는 합성 물질들이 리포좀을 형성하는 기본 물질이라고 할 수 있다. 리포좀을 만드는 알킬쇄는 회합하여 이중층을 만드는데 이것은 격자의 결손으로 여러 가지 꼬임을 가지는 트란스와 고쉬 블록구조로 되어있다.

인지질의 머리기를 수화하는 물 분자의 수와 물-지질의 상호작용의 강도는 리포좀의 형성과 성질에 강하게 영향을 미친다. 전형적으로 하나의 포스파티딜콜린 분자는 23개의 물 분자와 회합되어 있다. 이 중 11개의 분자는 지질의 내부에 함유되어 있고, 12개의 분자는 머리기를 수화시킨다. 내부 수화셀을 차지하는 물 분자는 아주 단단히 결합되어 있어서 0℃ 부근에서도 얼지 않으며 그 다음 물 분자들은 주 수화 셀을 차지하고 있는데 결화되지 않은 채로 내부에 갇혀 있다. 한편 탄화수소쇄 간의 소수성 상호작용과 머리기들 간의 정전기적 반발력은 서로 반대로 작용하는 힘이며 이들은 지질의 자체 회합을 초래하는 원인이 된다.

일반적으로 리포좀은 그 크기가 너무 클 경우에는 안정성이 저하되고 반면에 크기가 너무 작을 경우에는 약물 및 영양소의 수용력이 감소하기 때문에 약물 운 반체 및 영양소 전달체로 사용하는 리포좀의 종류는 주로 단일층(unilamellar)이며, 그 크기는 80 ~ 200 nm이다.

리포좀의 입자는 표피층을 침투하기가 용이하여 피부 경피 흡수를 극대화하기 위한 제제로써 주로 연구되고 있다. 즉 피부에 대한 흡수 친화성이 작은 수용성 유효성분을 리포좀 내에 봉입하여 피부에의 침투성을 높이고 서방성을 부여하는 것이 리포좀의 주된 목적이라 할 수 있다.

본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은, 상황버섯 추출물, 영지버섯 추출물 및 ALA를 유효성분으로 함유하며, 이들 유효성분의 혼합물은 리포좀으로 안정화되어 있다.

상기 상황버섯 추출물과 영지버섯 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 물과 저급 알코올의 혼합용매 중에서 선택된 어느 하나를 사용하여 추출된 것을 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하기로는 열수 추출물을 사용하는 것이 좋다.

상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 총 중량 중 상황버섯 추출물은 5 내지 50 중량%, 바람직하기로는 10 내지 20 중량% 사용하는 것이 목적달성을 위해 좋으며, 영지버섯 추출물은 5 내지 50 중량%, 바람직하기로는 10 내지 20 중량% 사용하는 것이 목적달성을 위해 좋다.

상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 총 중량 중 ALA는 50ppm 내지 2 중량%, 바람직하기로는 100ppm 내지 1 중량% 사용하는 것이 목적달성을 위해 좋다.

본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템에서 리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 단일층 또는 이중층 구조를 갖는 리포좀을 의미하며, 평균입자지름이 50 내지 100 nm, 바람직하기로는 50 내지 70 nm 범위인 것이다.

상기 리포좀은 1가 또는 다가 알콜, 인지질, 지방산, 오일 및 물을 포함하는 혼합물에 의하여 제조되며, 1가 또는 다가 알콜로는 에탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 통상적으로 당업계에서 공지된 성분들을 사용할 수 있고, 인지질, 지방산, 오일은 수소첨가 레시틴(Hydrogenated lecithin, HyL), 불포화 레시틴(Unsaturated lecithin, UsL), 리소레시틴(Lysolecithin, LyL), 수소첨가 리소레시틴(Hydrogenated Lysolecithin, HyLL), 피토스핑고신(Phytosphingosine, PhyS), 가수분해된 콜라겐(Hydrolyzed collagen, HyC), 마카다미아 너트 오일(Macadmia nut oil, MNO), 호호바 오일(Jojoba oil, JO), 히노키 오일(Hinoki oil) 등 당업계에서 공지된 성분들을 사용할 수 있다.

상기 성분 외에 세라마이드 Ⅲ, 피토스핑고신(phytosphingosins ; PhyS), 콜레스테롤 및 소듐 히아루로네이트(sodium hyaluronate, NaHy) 등을 사용하여 리포좀 막을 강화시킬 수 있을 것이다.

상기 리포좀은 1가 또는 다가 알콜 10 내지 45 중량%, 인지질 1 내지 5 중량%, 지방산 1 내지 5 중량%, 오일 0.5 내지 5 중량% 및 물 40 내지 70 중량% 을 포함하는 혼합물에 의하여 제조될 수 있다.

리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 바람직하기로는 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)의 통과압력 8,000 ~ 12,000 psi, 통과온도 50 ~ 60 ℃, 통과횟수는 3 ~ 4회 조건에서 이루어지는 것이 좋다.

상기한 리포좀은 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 총 중량 중 10 내지 45 중량%, 바람직하기로는 15 내지 25 중량% 범위로 사용되는 것이 좋다.

상기한 리포좀은 상황버섯 추출물, 영지버섯 추출물 및 ALA의 혼합물을 안정하게 포집할 수 있으며, 이렇게 제조된 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은 안정성이 우수하며, 피부침투효과를 극대화하는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은 두피관리용 세럼제, 분사제, 두피팩 제품 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 상기 두피관리용 제품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 구체적으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용제, 비타민, 안료, 향료, 각종 보조제 및 담체 등을 본 발명의 목적을 저해하지 않는 수준에서 사용할 수 있을 것이다.

상기한 본 발명에 의하면, 호르몬제 적용에 따른 부작용 문제가 발생되지 않고, 모근이 활성화 되어있는 부위는 물론 휴지기 상태의 모근에도 작용할 수 있으므로, 탈모방지 및 발모효과가 탁월한 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템의 제공이 가능한 효과가 있다.

또한 본 발명에 의하면, 약물의 지속력이 우수하여 지속적으로 먹거나 발라주지 않더라도 탈모방지 및 발모 촉진 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면, 두피관리용 세럼제, 분사제, 두피팩 제품 등의 다양한 제형화가 가능하므로 높은 상업성을 기대할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 추출물의 제조

실험에 사용된 상황버섯은 논산 황산벌농장에서 구입하였고, 영지버섯은 경기 양평의 가나농산에서 구입하였다. 구입한 상황버섯은 잘게 자른 후, 분쇄기로 분쇄하여 분말 형태로 만들어 실험에 사용하였다. 이는 추출물의 표면적을 넓혀 보다 효율적인 추출을 하기 위함이다.

1) 상황버섯 메탄올 추출물

상황버섯 메탄올 추출물은 상황버섯 1kg을 2cm 크기로 자른 후 분쇄기를 이용하여 분말 상태로 만들어 95% 메탄올 10L를 가한 후 24시간 동안 교반하며 냉침 추출을 하였다. 이 과정을 3회 반복 하였다. 추출된 용액은 Advantec No.2 여과지를 이용하여 여과 한 후 감압 농축하여 40℃ 열풍 건조기에서 건조 하였다. 건조된 추출물의 무게는 46.331g 이었다.

2) 상황버섯 에탄올 추출물

상황버섯 에탄올 추출물은 상기한 방법에 95% 에탄올을 사용한 것 외에 다른 것은 동일하게 조정하였다. 건조된 추출물의 무게는 20.729g 이었다.

3) 상황버섯 열수 추출물

상황버섯 열수 추출물은 상황버섯 1kg을 2cm 크기로 자른 후 분쇄기를 이용하여 분말 상태로 만들어 초순수 10L를 가한 후 100℃에서 72시간동안 열 수 추출을 실시하였다. 추출된 용액은 Advantec No.2 여과지로 감압 여과한 후 중탕하여 농축을 하였다. 농축 후에는 40℃ 열풍 건조기에서 건조 하였다. 건조된 추출물의 무게는 42.213g 이었다.

4) 영지버섯 열수 추출물

영지버섯 열수 추출물은 영지버섯 1kg을 잘게 분쇄하여 초순수 10L를 가한 후 100℃에서 72시간동안 열 수 추출을 실시하였다. 추출된 용액은 Advantec No.2 여과지로 감압 여과 한 후 중탕하여 농축을 하였다. 농축 후에는 40℃ 열풍 건조기에서 건조 하였다. 건조된 추출물의 무게는 36.536g이었다.

실시예 2. 베타-글루칸의 동정

상황버섯 열수 추출물 0.1g에 0.4U의 α-아밀라제(amylase)를 첨가하고 55℃에서 10분간 반응시켜 추출물에 포함된 α-1,4 결합의 글루칸을 제거하였다. 추출물에 포함된 단백질을 제거하기 위해 2.8× 10^-3 U의 프로테아제(protease)를 처리 하였으며, 추출물에 포함된 α-1,4 또는 α-1,6 결합의 포도당을 제거하기 위해 1× 10⁴ U의 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)를 처리한 후, 80% 에탄올을 가하여 침전물을 얻었다. 침전물에 잔존하는 고분자 물질 중에서 베타-글루칸만을 정량하기 위하여 얻어진 침전물에 1N HCl 4ml을 가하여 100℃에서 2시간 가수 분해하여 생성되는 유리당을 정량하였다. 베타-글루칸의 함량은 다음과 같은 식으로 결정하였다.

[수학식 1]

상기한 방법으로 추출한 상황버섯 열수 추출물 0.1g 에는 약 23.8%의 베타-글루칸이 포함 되어 있음을 확인하였다.

베타-글루칸을 분리하기 위하여, 상황버섯 열수 추출물 10g을 500ml 의 초순수로 희석하고 여과하여 정제한 후 72시간 동안 투석하였다. 투석되지 않은 추출물을 40℃에서 열풍 건조하여 단백다당체를 얻었으며, 단백다당체의 수율은 0.27%였다. 순수한 단백다당체를 분리하기 위해 3단계의 정제를 차례로 실시하였다. 먼저 단백다당체를 이온교환 수지인 DAEA-셀룰로오스(Cellulose)로 산성다당체로 분리하였다. 분획을 위해 컬럼 크로마토그래피 시스템(column chromatography system)을 이용하였으며 DEAE-셀룰로스 레진(celluose resin)을 2.5× 30cm의 컬럼에 충진하여 단백다당체를 주입하고 2M NaCl로 전개하여 산성다당체 분획을 얻었으며 염분을 제거하기 위하여 24시간 동안 투석한 후 농축하였다. 그 후 수퍼로스(Superose) 6 HR 16/50에 의해 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 통해 산성고분자다당체로 분리하였다. 분리된 산성고분자다당체는 HiTrap Con A에 의해 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)하여 1.961g의 베타-글루칸을 분리하였다.

상기한 결과로부터 얻어진 베타-글루칸의 수율은 82.4%로 유효성분 수득물 목표치인 80% 이상의 수득율을 얻을 수 있었다.

분리정제된 베타-글루칸은 인하대학교 공동기기 센터에 1H NMR 분석을 의뢰하여 구조를 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 3. 약물 전달 시스템의 제조

리포좀 제조에 사용한 성분들을 표 1 및 표 2에 나타내었다. 추출성분은 상황버섯과 영지버섯을 열수 추출하여 분리정제한 수득물인 상황버섯 열수 추출물(PLW) 및 영지버섯 열수 추출물(GW)와 당사에서 합성한 ALA(5-aminolevulinic acid)를 사용하였고, 리포좀 제형을 만들기 위해 프랑스 Lucas Meyer사의 불포화 레시틴(unsaturated lecithine ; UsL), 수소첨가 레시틴(hydrogenated lecitin ; HyL), 일본 Kyowa hakko kogyo사의 수소첨가 리소레시틴(hydrogenated lysolecithin ; HyLL)을 사용하였다. 막 강화제는 두산바이오텍의 세라마이드 Ⅲ, 피토스핑고신(phytosphingosins ; PhyS), Croda사의 콜레스테롤 및 바이오랜드사의 소듐 히아루로네이트(sodium hyaluronate, NaHy)를 사용하였다.

리포좀의 막을 강화시키기 위하여 하나의 친수그룹과 두 개의 친유그룹을 가진 HyL, UsL을 사용하였다. HyL은 친수그룹과 친유그룹의 크기가 비슷하여 평행한 라멜라 구조를 형성할 수가 있다. 또한 UsL은 친유그룹이 구부러진 형태로 존재하기 때문에 산패되기 쉽고, 단독으로 사용할 경우 경시에 따른 안정성을 확보하기가 쉽지 않다. 따라서 최근의 기술들은 이 두 성분을 혼합하여 사용하는 기술을 많이 응용하고 있다. 또한 HyLL은 친수 그룹이 크면서 알킬(alkyl) 체인은 하나인 구조를 형성하고 있기 때문에 친수성 활성이 크고 유화력도 우수하다. 클레스테롤은 친유성 성질이 강하므로 이 성분을 적절히 사용할 경우 좀 더 안정한 소낭( vesicle)을 얻을 수 있다. 세라마이드와 PhyS는 두 개의 알킬 체인이 있으면서 아민이 붙어있어 리포좀의 캡슐막을 강화하는데 도움이 된다.

이러한 성분들은 피부에 아주 우수한 친화력을 가질 뿐만 아니라 보습 및 장벽 강화에 도움이 되는 성분이므로 피부에 좋은 효과를 줄 수 있다.

리포좀을 미세 균질화시키기 위하여 Microfluidics사(USA)의 마이크로풀루이다이저(microfluidizer M-110Y)를 사용하였다.

발모유효성분 건조고형 수득물을 에탄올에 넣고 40~60℃ 온도에서 교반하면서 용해시키고, HyL, UsL, HyLL, Ceramide, PhyS와 콜레스테롤을 넣어 용해시킨 다음 정제수를 넣어 90 ~ 95℃에서 습윤시켰다. 이 때 용해된 인지질 성분의 소낭(vesicle) 형성과 용해된 발모유효성분의 소낭(vesicle) 내부로 포집 안정성이 향상될 수 있도록 용기를 밀폐하여 30분간 습윤반응을 진행시켰다. 이것을 70℃까지 냉각하여 1회~3회 마이크로풀루이다이저를 통과시켰다.

통과액을 45℃까지 냉각시킨 후 NaHy를 첨가하여 점도를 조절하면서 30℃까지 냉각하여 24시간 숙성시켜 물성을 측정하였다. 안정성은 밀폐된 용기에 담아서 일광, 4℃, 25℃, 40℃ 및 UV램프가 달린 40℃ 배양기(incubator)에서 측정하였다. 입자크기에 따른 경표피 흡수효과를 알아보기 위하여 조성물의 조건을 달리하여(Table 4. 참조) Lot no. 1 ~ Lot no. 4 시료을 제조하였고, 그 결과 Lot no. 1 조성물을 통해 합성된 입자는 평균 42~76nm 입자크기를 나타내 Nano-PGA60로 명명하였고, Lot no. 2는 175~234nm 입자크기를 나타내 Nano-PGA200, Lot no. 3는 Nano-PGA500(473~641nm)로 명명하였다. Lot no. 4는 리포좀 제형이 아닌 에멀젼(emulsion) 제형이기 때문에 O/W emulsion PGA50,000(42~59)로 명명하였다.

[표 1] 발모유효성분을 함유한 nano vesicles과 o/w emulsion의 조성

No.	Ingredients(INCI Name)	various capsulation (중량%)
		Lot no. 1	Lot no. 2	Lot no. 3	Lot no. 4
1	Hydrogenated lecithin (HyL)	0.5	1.0	2.0	-
2	Unsaturated lecithin (UsL)	0.5	1.0	2.0	-
3	Lysolecithin (LyL)	0.5	0.5	1.0	-
4	Phytosphingosine (PhyS)	0.1	0.1	0.1	-
5	Ceramide Ⅲ	0.05	0.05	0.05	-
6	Cholesterol	0.1	0.1	0.05	-
7	Polysorbate 60	-	-	-	2.0
8	PLW	10.0	10.0	10.0	10.0
9	GW	10.0	10.0	10.0	10.0
10	5-aminolevulinic acid	0.01	0.01	0.01	0.01
11	Ethanol (EtOH)	20.0	20.0	20.0	20.0
12	D. I. Water	58.21	56.21	49.76	47.96
13	Na-hyaluronate (NaHy)	0.03	0.03	0.03	0.03
14	Macadamia nut oil (MNO)	-	1.0	3.0	5.0
15	Jojoba oil (JO)	-	-	2.0	5.0
Total		100.00	100.00	100.00	100.00
* Lot no. 1 ; Nano-PGA60(42~76nm), Lot no. 2 ; Nano-PGA200(175~234nm), Lot no. 3 ; Nano-PGA500(473~641nm), Lot no. 4 ; O/W emulsion-PGA50,000(42~59)

안정한 리포좀을 제조하기 위한 최적 조건을 찾기 위하여 본 연구진은 일반 에멀젼을 만들어 4℃, 25℃, 40℃에 UV가 조사되는 인큐베이터(incubator)에 4주간 보관하면서 물리적 변화를 측정하였다.

나노 사이즈의 리포좀은 마이크로풀루이다이저(microfluidizer)를 사용하여 제조하였다. 소낭(Vesicle)의 중요성분인 HyL, UsL과 HyLL의 함량을 변화시키면서 리포좀을 제조하였으며, 제조한 리포좀의 종류와 구성성분을 표 5에 나타내었다.

[표 2] 인지질을 이용한 nano capsulation 최적 조성

No.	Ingredients	various nano capsulation (중량%)
		S1	S2	S3	S4	S5	S6
1	Hydrogenated lecithin (HyL)	1.0	-	0.3	0.5	0.8	1.0
2	Unsaturated lecithin (UsL)	-	1.0	0.3	0.5	0.8	1.0
3	Hydrogenated Lysolecithin (HyLL)	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7
4	Phytosphingosine (PhyS)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
5	Ceramide Ⅲ	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
6	Cholesterol	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
7	PLW	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
8	GW	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
9	5-aminolevulinic acid	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
10	Ethanol (EtOH)	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
11	Hydrolyzed collagen (HyC)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
12	Water	58.04	57.94	58.24	57.74	57.04	56.54
Total		100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

제조된 리포좀의 경우, HyL과 UsL의 농도가 각각 1.0 중량%인 S1과 S2 소낭(vesicle)의 입자크기는 비교적 작게 나타났으나 안정성은 떨어지는 결과를 보였다. 그러나 HyLL의 농도를 0.5 중량%로 증가시켜 제조한 S3, S4의 경우에는 S1과 S2 보다 입자가 다소 크게 나타났지만 안정성은 우수하게 나타났으며, S4가 S3 보다 더욱 작은 입자를 형성함을 알 수 있었다. HyLL의 농도를 0.6중량%, 0.7중량%로 증가시킨 S5, S6의 경우에는 다중 라멜라 형태로 전환되어 입자가 크게 나타났다.

즉, 입자크기가 작을 경우에는 캡슐의 벽막이 약하게 형성되므로 안정성이 떨어지게 되며, HyLL의 농도가 증가하면 나노캡슐 형태 보다는 다중 라멜라 구조가 형성됨으로써 그 입자 크기가 커지는 것을 관찰할 수 있었다. 위 결과를 통하여 시료 S4가 최적임을 확인할 수 있었다.

마이크로풀루이다이저의 통과온도, 통과횟수, 작업압력의 변화에 대한 시료 S4의 입자 크기를 도 2에 나타내었다.

도 2의 (a)는 표 2의 시료 S4에 대한 온도의 영향을 나타낸 것이다. 온도를 20℃부터 70℃까지 변화시키면서 vesicle의 크기를 측정한 결과, 입자의 평균크기가 20℃에서는 63.2nm, 40℃에서는 64.6nm, 50℃에서는 65.3nm, 60℃에서는 62.7nm로 나타나 온도는 입자크기에 큰 영향이 없다는 것을 확인할 수 있었다.

도 2의 (b)는 마이크로풀루이다이저 통과 횟수에 따른 시료의 입자크기를 나타낸 것이다. 온도는 60℃로 고정하였는데, 그 이유는 챔버 통과시 시료 온도가 너무 낮을 경우에는 석출이 일어날 수 있고, 온도가 너무 높을 경우에는 발모유효성분 또는 캡슐의 벽막에 사용된 인지질 성분들이 변화될 수 있기 때문이다.

통과 횟수는 1회부터 6회까지 하여 각 통과할 때마다 시료를 채취하여 입자의 크기를 측정하였다. 그 결과 소낭(vesicle)의 크기는 1회(82.4nm), 2회(68.2nm), 3회(60.2nm), 4회(59.5nm), 5회(60.4nm), 6회(64.8nm)으로 나타났다. 즉, 1회, 2회 통과시의 입자는 더욱 작아지나 3회부터 6회 통과까지 변화가 거의 없는 것으로 나타났는데, 이것은 아마도 소낭(vesicle)을 구성하는 인지질들의 분자량과 구성성분의 특성에 의한 것으로 사료된다. 따라서 통과횟수는 경제성과 효율성을 고려하여 3회로 고정하였다.

시료의 통과 압력조건을 변화시키면서 실험한 결과를 도 2의 (c)에 나타내었다. 온도는 60℃, 통과횟수는 3회로 고정하였다. 압력이 5,000psi에서 10,000psi으로 증가함에 따라 입자는 점점 작아져서 10,000psi에서는 매우 균일하고 미세한 입자가 형성됨을 알 수 있었고, 입자의 평균 크기는 60.2nm이었다. 또한 12,000psi와 15,000psi에서는 입자의 평균 크기가 각각 60.6nm와 52.5nm로 더욱 감소하였으나 장비의 온도가 상승하고, 통과 시에 부하가 걸려 통과시간이 길어지게 되고, 발모유효성분 및 인지질 성분의 안정성 감소를 우려하여 10,000psi로 고정하여 수행하였다.

상기 실험을 통하여 나노캡슐에 대한 마이크로풀루이다이저의 최적 운전조건은 통과압력 10,000psi, 통과온도 60℃, 통과횟수는 3회임을 알 수 있었다.

실시예 4. 리포좀의 확인 및 물성 측정

1) 리포좀의 확인

리포좀의 모양과 구조는 SEM(JSM-5410LV, JEOL, Tokyo, Japan)과 TEM (MorgagniTM268, philips Corp. Eindhoven, the Netherlands)을 사용하여 관찰하였다.

SEM은 리포좀 소낭(vesicle)의 모양과 크기를 관찰하기 위하여 이용하였다. 측정방법은 우선 시료를 질소가스를 이용하여 진공 챔버에 넣어 -400± 5℃에서 동결 건조한 다음, 순금 막으로 코팅한 입자 표면에 전자를 충돌시켜 방출되는 2차 전자를 3차원으로 관찰할 수 있도록 전처리 하였다.

TEM은 리포좀의 구조를 관찰하기 위하여 이용하였으며, Nano-PGA60의 구조는 시료를 건조시킨 다음 발색시약으로 염색하여 초박편 절단기로 절단한 후, 적절한 배율로 확대하여 관찰하였다. 이를 이용하여 입자의 미세구조를 판단하여 그 모양을 확인하였다.

SEM을 이용하여 시료 S4에 대한 미세표면의 구조를 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 (a)는 15,000배 배율로 확대 촬영한 사진으로, 3차원 이미지 형상을 통하여 구형의 소낭(vesicle)이 형성되었음을 알 수 있으며, 입자 사이즈가 대략 62.5nm로 관찰되었다. 도 3의 (b)는 7,500배 배율의 사진으로, 작은 입자들이 구형 형태의 캡슐을 형성하고 있음을 알 수 있으며, 이 입자들의 평균크기는 64.3nm이다. 도 3의 (c)는 시료 S4를 동결건조하여 반으로 자른 단면을 나타내는 사진이다. 사진에서 보는 바와 같이 입자가 구형 형태로 캡슐을 형성하고 있음을 확인할 수 있다. 이 입자크기는 입자 측정기로 측정한 경우의 값과 비교시 약간의 차이가 있는 것으로 나타났는데, 이것은 동결 건조하는 과정에서 나타나는 오차인 것으로 추측된다.

도 4는 리포좀의 구조를 관찰한 TEM 사진으로, (a)는 50,000 배율로 확대하여 관찰한 사진이며, (b)는 80,000 배율로 확대하여 촬영한 사진이다. 그림에서 약간 일그러진 구형의 구조이지만 전반적으로 구형의 소낭(vesicle)이 만들어졌음을 알 수 있다. 특히, (a) 사진에서는 아주 작은 입자들은 구형의 모양임을 알 수 있으며, 입자의 평균크기는 58.7nm이며, (b) 사진에서의 입자의 평균크기는 61.8nm 이었다.

2) 리포좀의 입자크기 측정

리포좀의 입자크기 측정은 광산란장치인 Malvern system(Malvern PCS 4700, Malvern instruments, U. K.)을 사용하였으며, 시료는 측정 각도를 90로 하여 10회씩 측정하였으며 평균값을 사용하였다.

Malvern system은 파장이 633nm인 He-Ne laser(Siemens, LGK 7626)와 PMT(PCS100), stepmotor controller(PCS7), correlator(K7032ES), pump/filter unit(PR98), temperature controller(PCS8)로 구성되어 있으며, 광산란 데이터는 Malvern 4700 softwate로 분석하였다.

표 2의 S1 ~ S6, 6개 시료에 대하여 입자크기를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 제조시의 입자크기는 92.1nm(S1), 58.7nm(S2), 68.9nm(S3), 60.2nm(S4), 74.8nm(S5), 120.5nm(S6)로 HyL과 UsL을 혼합하여 사용한 시료 S4에서 더욱 안정하고 비교적 작은 입자 크기를 얻을 수 있었다. 특히, 본 연구에서는 HyLL, PhyS, 세라마이드(ceramide) Ⅲ와 콜레스테롤(cholesterol)을 벽막 강화제로 사용하여 발모유효성분이 안정하게 캡슐 안으로 침투되고 벽막을 강화하도록 하였다.

표 2의 시료 S4를 6개월 동안 실온에 보관하면서 그 안정성을 표 1의 O/W emulsion-PGA50,000과 비교 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 초기의 S4 입자크기는 60.2nm, 6개월 경과 후의 입자크기 60.4nm~63.8nm로 거의 변화하지 않았다. 그러나 O/W emulsion-PGA50,000의 경우, 초기에는 50.0이었으나 시간이 경과함에 따라 입자크기는 점점 증가하여 6개월 경과 후에는 72.53로 나타났다. S4의 경우에는 입자가 나노캡슐화 되어 있기 때문에 캡슐화 되어 있는 발모유효성분의 용해성이 증가되었을 뿐만 아니라 합일 현상도 발생하지 않아서 안정하다고 할 수 있다. 그러나 O/W emulsion-PGA50,000과 같이 일반 유화제로 제조된 에멀젼은 온도 및 시간에 따라 유화입자 크기가 계속 증가하여 합일 및 분리현상이 관찰되었다.

따라서 발모유효성분을 안정화시키기 위해서는 일반 에멀젼 제형보다는 나노 크기의 캡슐 형태를 적용하는 것이 적합한 것으로 나타났다.

3) 리포좀의 현탁도 측정

시료의 현탁도는 스펙트로포토메터(spectrophotometer)를 사용하여 측정하였다. 증류수를 표준 시료로 하였으며, 입자별로 검량선을 설정하였다.

시료의 현탁도가 낮아지는 것은 입자가 합일되어 투명에서 반투명 또는 유백색으로 변화한다는 것으로 발모유효성분의 안정성이 낮아짐을 의미한다. 리포좀 나노캡슐의 입자크기 변화에 따른 현탁도를 측정하였다. 측정시료는 표 1의 조성을 기준으로 제작된 시료에 대하여 측정하였다. 시료의 현탁도는 정제수의 현탁도를 기준으로 하여, 입자크기 변화에 따른 현탁도를 측정하였다.

기준 시료인 정제수의 현탁도는 46FAU이었으며, Nano-PGA60은 42FAU로 정제수 보다는 약간 낮게 나타났으나 육안으로 판단할 경우에는 정제수와 비슷한 정도의 투명도를 나타내는 것으로 판단되었다. Nano-PGA200의 현탁도는 34FAU, Nano-PGA500은 25FAU로 백탁상태를 나타내었다. O/W emulsion PGA50,000 시료에서는 18FAU로 아주 진한 우유 빛의 액상으로 낮은 현탁도를 보였다.

이상의 결과를 통하여 시료의 입자가 커질수록 현탁도는 낮아져서 불투명한 백탁계를 형성하는 것을 알 수 있었다.

따라서 60nm의 Nano-PGA60의 현탁도는 정제수와 유사한 투명성을 나타냄으로 발모유효성분에 대한 안정성 뿐만 아니라 외관상의 투명성에서도 우수함을 알 수 있었다.

4) 리포좀의 안정성 측정

입자 안정성 측정은 제타 포텐셔메터(zeta potentiometer, Malvern, zata-sizer 2000, U. K.)를 사용하였으며, DTS0050 표준 저하액을 측정하여 ±5mV 범위 안의 값을 확인한 후 증류수로 깨끗이 세척하여 제타전위를 측정하였다. 한 시료에 대하여 5회씩 측정하여 평균값을 사용하였다.

시료 S4의 마이크로풀루이다이저 통과 횟수에 따른 제타 포텐셜(zeta potential) 변화 값을 측정하여 도 7에 나타내었다. 그림에서 보는바와 같이 마이크로풀루이다이저를 통과하지 않은 경우의 제타 포텐셜(zeta potential)의 값은 -12.5mV, 1회 통과시 -27.4mV, 2회 통과시 -32.8mV, 3회 통과시 -37.8mV로 나타났다. 마이크로풀루이다이저의 통과 횟수가 3회까지는 제타 포텐셜(zeta potential) 값이 -12.5mV에서 -37.8mV으로 그 절대값이 증가하다가 4, 5, 6회에서 -36.8mV으로 감소하는 것으로 나타났다. 그 이유는 과도하게 횟수만을 증가할 경우 입자가 합일이 일어나기 때문으로 사료되며, 과도한 물리적 힘에 의하여 인지질의 구조가 불안정한 상태가 되어 결국 제타 포텐셜(zeta potential)이 낮아지고 그 안정성이 감소하는 것으로 판단할 수 있다. 일반적으로 화장품 산업에서는 제타 포텐셜(zeta potential) 절대 값이 25mV 이하인 경우에는 그 계가 불안정하다고 판정하고 있으며, 30.0mV 이상인 경우에는 경우에 따라서 다를 수 있으나 안정하다고 판정하고 있다.

5) 리포좀의 pH 조절

리포좀의 pH 조절은 0.01N HCl과 0.01N NaOH로 하였으며, pH 측정은 pH 메터(Orion model 420A)로 하였다. 리포좀의 현탁도는 증류수를 표준시료로 하고 입 자별로 검량선을 설정하여 스펙트로메터(spectrometer, HACH DR/4000U)을 사용하여 측정하였다.

나노캡슐의 pH는 0.01N HCl과 0.01N NaOH를 사용하여 조절하였다. 나노캡슐로 만든 시료가 산성일 경우는 0.01N HCl을 한방울씩 적하하면서 교반하여 요구하는 pH가 될 때까지 조절하여 입자크기 변화에 대한 영향을 측정하였다. 알칼리성일 경우는 0.01N NaOH를 이용하여 위와 동일한 방법으로 측정하였다. 측정은 pH 3.5에서 pH 11까지의 범위에서 나노캡슐의 입자크기 변화를 관찰하였다.

① pH 변화에 따른 입자크기 변화

pH 변화에 따른 시료 S4의 입자크기 변화를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이 pH 6.5에서의 입자크기는 60.4nm이었다. pH가 6에서 3.5로 산성의 상태로 변함에 따라 입자크기는 97.5~149.6nm로 입자의 크기가 증가하는 경향을 나타내고 있다. 또한 알칼리성 상태인 pH 10.5와 pH 11에서도 입자크기가 67.2~75nm로 증가하는 것을 알 수 있다. 그 이유는 강한 산성이나 강한 알칼리성 상태에서는 나노캡슐의 구조가 불규칙하게 배열하면서 입자가 형성되기 때문인 것으로 사료된다. 그러나 pH 6에서 10범위인 약산성 및 약알칼리 범위에서의 입자크기는 약 67.2~63.7nm로 변하지 않고 일정함을 확인할 수 있었다.

따라서 피부의 pH와 친화력 및 입자의 안정성을 고려하여 pH 6.5에서 나노사이즈의 리포좀을 제조하는 것으로 결정하였다.

② pH 변화에 따른 탁도 변화

pH 변화에 따른 탁도의 변화를 도 9에 나타내었다. 기준인 정제수의 탁도는 43.4FAU이며, pH 6.5에서의 시료 S4의 현탁도는 37.2FAU이었다. pH가 6.5에서 3.5로 산성화 상태로 변함에 따라 현탁도는 37.5FAU에서 20.4FAU로 감소하면서 불투명한 상태를 나타냈다. 또한 pH가 10, 11인 염기성 상태에서도 현탁도는 36.4FAU에서 19.4FAU로 감소하면서 산성에서 보다 불투명한 상을 나타냈다.

이것은 S4의 현탁도는 산성인 pH 5 이하에서는 나노캡슐이 파괴되어 내부에 봉입되었던 물질이 외부로 흘러나와 뿌옇게 흐려지며, 알칼리성인 pH 10 이상에서도 유사한 원인에 의하여 뿌옇게 흐려져 현탁도에 영향을 준 것으로 사료된다.

한편, pH 6~10 범위에서의 현탁도는 37.2~36.4FAU로 시료 S4의 초기 현탁도와 차이가 없었다. 따라서 제품에 응용할 경우에는 나노캡슐의 안정성과 피부의 pH를 함께 고려하여 pH 6~7 범위로 유지하는 것이 좋을 것으로 사료된다.

실시예 5. 리포좀의 피부 흡수성 측정

리포좀 캡슐의 크기에 따른 발모유효성분의 경표피 흡수량을 측정하였다. 경표피 흡수 실험시 사용할 수용상의 조건을 확인하기 위하여 정제수, 포스페이트 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline, PMS, pH=7.4), 0.5%의 tween 20(polysorbate 20, Uniqema), 1%의 tween 20의 용액에 각각 발모유효성분 균일혼합물인 PGA가 포화되도록 과량 첨가한 후 32℃ 조건에서 3일 동안 교반하여 방치한 후, 수용액을 여과하여 용액 중에 녹아있는 PGA를 HPLC로 정량하였다.

경표피의 흡수실험은 프란쯔 디퓨전 셀(Franz diffusion cell, 유효면적: 0.64cm2, 수용상의 부피: 5.2mL)을 사용하여 싱크조건(sink condition)하에서 실험 하였다. 수용상은 1% tween 20을 사용하였다. 시료를 채우는 부분 밑에 분리된 표피를 올려놓은 후 측정한다. 이 방법은 약학분야에서 전달 시스템(delivery system)으로 가장 많이 사용하는 방법을 그대로 응용하였다.

경표피 침투실험을 위하여 4주령의 헤어리스 마우스(hairless mouse)로부터 표피층만을 적출한 다음, 표피층이 위에 오도록 한 후 프란쯔 디퓨전 셀(franz diffusion cell)에 장착하기에 적당한 크기로 자른다. 프란쯔 디퓨전 셀에 수용상을 채우고 32± 0.5℃로 유지시킨 다음, 헤어리스 마우스 스킨의 표피층이 위로 향하게 장착하고 클램프로 고정시킨다. 피부에 표피층에 시료를 각각 1g씩 도포하여 피부 투과실험을 실시하였다. 피부를 확산장치에 장착하고 실험이 진행되는 동안 자석교반기를 이용하여 600rpm으로 수용상을 교반하였다. 투과된 약물의 정량을 위하여 도포 후 일정 시간이 경과된 시점에서 수용상 0.25mL를 취한 후 HPLC로 정량하고, 프란쯔 디퓨전 셀은 다시 수용상으로 채워넣었다. 시료는 나노캡슐의 크기에 따른 경표피의 침투량을 측정하기 위하여 42~76nm, 175~234nm, 473~641nm와 42~59(O/W emulsion) 등 4종류를 사용하였다. 동일한 방법으로 각각의 시료를 24시간 동안 일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 경표피의 투과량을 HPLC로 측정하였다.

1) 입자의 크기에 따른 경표피 침투

발모유효성분 PGA 균일성분 함량이 0.2%인 Nano-PGA60(42~76nm), Nano-PGA200 (175~234nm), Nano-PGA500(473~ 641nm), O/W emulsion-PGA50,000(42~59)인 시료를 제조하여 경표피 침투실험을 실시하였다.

경표피 침투실험은 24시간 동안 수행하였다. 0.5% tween 20, 1% tween 20 용액을 사용한 수용액에서는 각각의 용해도가 90.17, 275.71μg/mL로 나타났다. 피부투과실험에 사용한 시료 1g 중 PGA는 2mg 존재하며 24시간 경과 후 최대 50%가 투과된다고 가정할 경우, 수용상 5.2mL에서의 PGA 농도는 192.3μg/mL가 된다. 따라서 피부투과실험에는 이 수치보다 높은 용해도를 나타내는 1% tween 20을 수용상으로 사용하였다. 피부투과실험 후 24시간 경과 뒤의 PGA 누적피부 투과량은 12~15μg/0.636 ㎠으로서, 이것을 농도로 환산하면 2.3~2.9μg/mL로서, 1% tween 20 수용액 중에서의 용해도에 비해 1/10에 불과하므로 실험기간 동안 싱크 컨디션(sink condition)이 잘 유지되도록 하였다.

도 10에 시료들이 24시간 동안 피부에 투과된 값을 나타내었다. 24시간 뒤 단위 피부면적당 누적된 PGA 투과량은 Nano-PGA60, Nano-PGA200, Nano-PGA500, O/W emulsion-PGA 50,000의 경우 각각 26.80, 19.45, 16.67, 10.03mg/㎠이었으며, 정상상태의 선형추세선으로부터 얻어진 각각의 피부투과 속도는 0.93, 0.67, 0.63, 0.71mg/㎠hr 이었다. 이 경우 전체적인 지연시간은 0시간에 가까워 제형 적용 초기부터 피부투과가 이루어졌음을 알 수 있었다. Nano-PGA60이 상대적으로 다소 높은 피부투과속도를 나타낸 것은 그 입자 크기가 60nm의 초미립자 상태로서 PGA를 봉입한 채 피부투과에 관여했기 때문인 것으로 사료된다.

2) 시간경과에 따른 경표피 침투

시간경과에 따른 경표피의 침투량을 도 11에 나타내었다. 실험에 사용된 피부는 헤어리스 마우스의 전체 피부(whole skin)로, 피부 두께 0.7mm에 대하여 침투 량을 계산하였다. 환산 결과 Nano-PGA60, Nano-PGA200, Nano-PGA500, O/W emulsion-PGA50,000의 침투량은 2, 4, 6, 8, 10, 24시간 경과 후에 각각 약 100~140, 150~230, 200~290, 260~360, 320~420, 600~730으로 점점 증가하는 것으로 나타났다.

시간에 따른 단위 면적당 투과량은 Nano-PGA60, Nano-PGA200, Nano-PGA500, O/W emulsion-PGA50,000의 경우 2, 4, 6, 8, 10, 24시간 경과 후에 각각 약 1.5~5.4, 2.3~6.9, 3.2~8.7, 5.7~12.8, 8.2~14.2, 10.3~26.8μg/㎠으로 나타났다.

특히, Nano-PGA60에 대한 24시간 동안 투과된 양은 2, 4, 6, 8, 10, 24시간 경과 후 각각 168.9, 215.8, 272.1, 400.4, 444.2, 838.3으로 가장 우수한 경표피 투과율을 보였다. Nano-PGA200에 대한 24시간 동안의 투과량은 2, 4, 6, 8, 10, 24시간 경과 후 각각 120.7, 188.9, 219.6, 285.0, 351.3, 608.4의 경표피 흡수율을 보였다. Nano-PGA500의 24시간 동안의 투과량은 2, 4, 6, 8, 10, 24시간 경과 후 각각 103.9, 152.9, 211.5, 276.9, 346.3, 521.4의 경표피 흡수율을 보였다. 그러나 O/W emulsion-PGA50,000에 대하여는 2시간 경과 후에는 46.92μg/㎠, 4시간 경과 후에는 71.94μg/㎠, 6시간 경과 후에는 100.11μg/㎠, 8시간 경과 후에는 178.29μg/㎠, 10시간 경과 후에는 256.51μg/㎠, 24시간 경과 후에는 384.75μg/㎠의 경표피 흡수율을 나타내었다.

이상의 결과를 통하여 나노캡슐 중에서 입자 크기가 42 ~ 59nm인 Nano-PGA60이 가장 많은 경표피 흡수율을 보임으로써 나노캡슐의 입자가 작을수록 경표피의 흡수가 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 경표피 흡수는 Nano-PGA60, Nano-PGA200, Nano-PGA500, O/W emulsion- PGA50,000 중 피부흡수 최적 제형은 Nano-PGA60임을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 동물실험에 의한 효능 검증

발모, 양모 및 탈모예방 연구에 이용되는 실험법으로는 실험동물을 이용한 in vivo 평가와 모낭세포 및 조직배양을 이용한 in vitro 평가 등이 주로 이용되고 있다.

in vitro 평가에서는 모낭을 구성하고 있는 핵심 세포인 모유두세포(dermal papilla cell)와 외모근초세포(outer root sheath cell)의 배양을 통해 모낭에서의 분화기전을 연구하지만, 이 방법은 모낭조직 내에서의 세포간의 상호작용과 모낭조직과 주위를 둘러싼 진피조직과의 상호작용, 그리고 혈액 순환이 배제되는 등 모발성장에 직, 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 많은 요소들이 배제되어 있어 한계성을 지니고 있다. 따라서 각종 생화학적 평가를 통해 탐색되는 많은 약물들의 실제 효과를 검증하기 위해서는 실험동물을 이용한 효능평가 및 임상실험 등이 주로 이용되고 있다.

본 실시예에서 사용된 C57BL/6 mouse는 털이 검정색이고, 자발적 탈모(spontaneous alopecia)가 일어나는 특징을 지니고 있으며, 또한 멜라노사이트(melanocyte)가 모낭에만 한정적으로 존재하고 멜라닌(melanin) 합성이 모발 성장주기(hair growth cycle)와 잘 일치되어 피부색으로 모발의 성장주기를 판정할 수 있는 장점을 가져 모발 생리 연구에 널리 이용되고 있다.

1) 실험 방법

본 실시예에서는 발모유효성분 중 베타-글루칸 함유추출물인 상황버섯과 영지버섯 추출물, 그리고 ALA 성분과 이들 물질의 단일 또는 혼합성분 리포좀 제형의 발모 효과 및 육모 효과의 검증을 위해 예비실험을 비롯하여 3회에 걸쳐 동물 실험을 실시하였다.

실험동물은 일반적으로 발모촉진실험에 가장 많이 사용되는 등쪽 피부의 색이 분홍색을 보이며 휴지기 체모를 가진 생후 5주된 C57BL/6 수컷 마우스를 오리엔트 바이오에서 분양받아 인천대학교 미생물학과 동물사육실 환경에 적응시킨 후에 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도(21~23℃), 습도(40~60%), 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 동물사육실에서 무균음수와 사료(오리엔트바이오)를 자유롭게 공급받았으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.

육모 촉진효과를 관찰하기 위해 6주령의 C57BL/6 마우스를 Dietyl Ether로 마취시키고 배부의 검정색 털을 일차적으로 Animal Hair Clipper로 제거한 후, 니크린 제모약(일동제약, Korea)을 사용하여 나머지 털을 완전히 제거하고 깨끗이 닦아주었다. 제모 후 다음 날부터 매일 1회씩 제모 된 부위에 각 군별로 치료제를 도포하였다.

[표 3] 동물실험 적용 발모유효성분 리포좀 제형 성분표

No.	Ingredients	various nano capsulation (중량%)
		S4	S7	S8	S9	S10	S11	S12
1	Hydrogenated lecithin (HyL)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
2	Unsaturated lecithin (UsL)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
3	Hydrogenated Lysolecithin (HyLL)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
4	Phytosphingosine (PhyS)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
5	Ceramide Ⅲ	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
6	Cholesterol	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
7	PLW	10.0	-	10.0	-	20.0	10.0	-
8	GW	10.0	-	-	10.0	-	10.0	10.0
9	5-aminolevulinic acid	0.01	0.01	-	-	-	-	0.01
10	Ethanol (EtOH)	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
11	Hydrolyzed collagen (HyC)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
12	Water	57.74	77.74	67.75	67.75	57.75	57.75	57.75
Total		100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

① 발모 1차 동물실험

단위추출성분의 발모효능을 확인하기 위하여 별도의 제형처리 없는 시료에 대한 실험을 실시하였으며, 그 결과를 다음 도 13에 나타내었다. 도 13에서 D군은 음성 대조군으로 초순수만을 도포하였고, A 군은 ALA 10,000 ppm을 도포하였고, PLM 군은 건조된 상황버섯 메탄올 추출물(PLM)을 초순수에 녹여 중량비가 20%가 되도록 제조하여 도포하였으며, PLE 군은 건조된 상황버섯 에탄올 추출물(PLE)을 초순수에 녹여 중량비가 20%가 되도록 제조하여 도포하였다. PLW 군은 건조된 상황버섯의 열수 추출물(PLW)을 초순수에 녹여 중량비가 20%가 되도록 제조하여 도포하였고, M군은 양성 대조군으로 마이녹실액 3%(현대약품)을 도포하였다.

② 발모 2차 동물실험

단위추출성분의 리포좀제형 적용을 통한 발모효능을 확인하기 위하여 수행되었으며, 그 결과를 다음 도 14에 나타내었다. 도 14에서 D군은 음성 대조군으로 초 순수만을 도포하였고, A 군은 ALA, P 군은 상황버섯 열수추출물(PLW), G 군은 영지버섯 열수추출물(GLW)을 리포좀 제형으로 만든 표 3의 시료 S7, S8, S9 를 각각 도포하였으며, M 군은 양성 대조군으로 마이녹실액 3%(현대약품)을 도포하였다.

③ 발모 3차 동물실험

발모유효성분 혼합성분의 리포좀제형 적용에 따른 발모효능을 확인하기 위하여 수행되었으며, 그 결과를 다음 도 16에 나타내었다. 도 16에서 D군은 음성 대조군으로 초순수만을 도포하였고, P20 군은 상황버섯 열수 추출물을 20 중량% 사용한 S10, PG 군은 상황버섯 열수 추출물(PLW)과 영지버섯 열수추출물(GLW)을 10 중량% 씩 혼합한 S11, PGA 군은 상황버섯 열수 추출물(PLW)과 영지버섯 열수추출물(GLW) 각각 10 중량%와 ALA 0.01 중량% 혼합한 S4, GA 군은 영지버섯 열수추출물(GLW) 10 중량%와 ALA 0.01 중량% 혼합한 S12의 리포좀 제형을 도포하였으며, M 군은 양성 대조군으로 마이녹실액 3%(현대약품)을 도포하였다. 상기 S10, S11, S4 및 S12는 표 3에 성분표를 나타내었다.

2) 분석 방법

① 발모상태의 관찰

발모상태를 확인하기 위하여 실험 시작 후 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 12일, 14일 및 15일에 털이 자라는 상태를 육안적으로 확인하였다. Ether를 이용하여 마우스를 가볍게 흡입 마취한 후 배부를 디지털 카메라로 사진 촬영을 하여 털이 자란 상태를 육안적으로 판단하여 털이 거의 자라지 않은 군, 약간 자란군, 거의 다 자란군 등 4단계로 분류하였다. 동일한 마우스를 구분하기 위해서는 유성 필기구를 사용하여 꼬리에 각기 다른 색깔을 표시하여 구분 하였다.

② 육모지수의 측정

육모 상태를 정량적으로 비교 검증하기 위해서, 디지털 카메라로 배부를 촬영한 다음 영상을 컴퓨터에 저장하고 NIH의 “ImageJ" software(ver. 1.42)를 사용하여 측정하였다. 육모 지수(Hair regrowth index, HRG index)는 C57BL/6 마우스는 털이 검정색이고 멜라닌 생성이 모발 성장 주기와 일치하므로 털이 자라남에 따라 육안적으로 피부의 색이 분홍색으로부터 회색, 짙은 회색 및 검정색으로 변해가는 단계를 이용하여 다음과 같이 계산하였다.

각각의 실험동물에서, 제모 되어 발모가 관찰되지 않는 분홍색 피부 상태는 4등급으로 0점, 모낭으로부터 털이 자라기 시작하여 피부가 회색을 띠면 3등급으로 1점, 피부 바깥쪽으로 털이 다시 자라 나온 것을 육안으로 확인할 수 있는 상태는 2등급으로 2점, 털이 완전히 자라 검정색이 된 것은 1등급으로 3점을 부여하였다. 다음으로 배부의 제모된 전체 면적에 대하여 각각 등급 별로 털이 자란 면적 비율을 측정하고, 각각의 면적 비율에 점수를 곱한 총합을 육모지수로 하였다. 그러므로 육모지수는 최소값 0%에서 최대값 300%를 나타나게 된다[도 12].

③ 고해상도 모발분석시스템에 의한 모발 분석

본 출원인에 의해 개발되고 있는 고해상도 모발분석시스템(Hi-Quality Hair Analysis Program System)인 Liyarn's scalp & hair clinic system을 이용하여 각 군 간의 모발을 분석하였다. 모발 분석은 실험 시작 후 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 12일, 14일 및 15일에 실시되었으며, 매 측정시 같은 부위에서 각 군 6마리의 모발 의 두께를 측정하였다. 측정값은 각 군별로 평균을 내어 비교 분석 하였다. 실험일 1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 12일, 14일 및 15일째 각 군의 마우스를 Ether로 흡입 마취 후 Liyarn's scalp & hair clinic system을 이용하여 분석을 시행 하였다.

3) 통계분석

발모 면적비율, 모발 밀도 및 성모 비율 측정치에 대한 통계분석은 Student's T-test 방법을 사용하여 p<0.05에서 대조군에 대해 검정하였으며, 각 군 간의 상관관계는 Duncan의 다중범위검증(Duncan's multiple range test) 방법으로 전문통계 소프트웨어를 사용하여 검증하였다.

3) 실험 결과

(1) 1차 동물실험 결과

(가) 발모상태의 육안적 변화

1차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 다음 도 13 에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 실험 4일째 실험동물의 배부 상태를 관찰 한 결과 모든 군에서 분홍빛의 피부색을 보였으며 특별한 발모 진행 경과를 관찰 할 수 없었다. 실험 8일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과, 모든 군에서 부분적으로 발모가 진행되기 시작하여 발모가 진행된 부분에서는 회색빛의 피부색을 보였으며, PLM군과 PLW군 및 M 군의 마우스는 전체적으로 회색빛의 피부색이 관찰되었다.

실험 13일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과, 일부 마우스에서는 머리 쪽과 꼬리 쪽의 일부 부분에서 발모 시작 상태인 회색빛의 피부색을 관찰할 수 있었으며, 배부 중간의 일부 부분에서 털이 길게 자라나 발모율이 높은 것을 관찰 할 수 있었다. D 군 마우스의 경우 일부에 발모가 시작되는 상태를 나타내었고, A 군 마우스의 경우 전체적으로 발모가 시작되는 상태를 나타내었으며, PLM 군 마우스는 일부분을 제외하고는 전체적으로 발모가 진행되어 일부에는 털이 길게 자라서 제모하지 않은 부분과 유사한 성모상태를 나타내었으며, PLE 군, PLW 군 및 M 군 마우스는 전체적으로 발모가 진행되었고 배부 중간에 털이 길게 자라나왔음을 확인할 수 있었다.

실험 16일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과, 마우스에서는 전체적으로 발모가 진행되었으며, D 군의 경우 전체적으로 발모가 진행되나 털이 길게 자라지는 않았으며 제모부분이나 제모 가장자리 부분에는 발모가 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다. A 군 마우스는 전체적으로 발모가 진행되었으나 주변의 털보다는 일부분의 길이가 짧게 나타남을 확인하였다. PLM 군 마우스는 전체적으로 길게 발모되었으나 일부 마우스의 경우 털이 길게 자라지 않은 마우스도 발견되었다. PLE 군 마우스는 전체적으로 발모되었으나 발모된 면적의 일부에 털이 길게 자라나지 않음을 확인하였다. PLW 군 마우스는 전체적으로 발모가 되었고 중앙부분의 털은 길게 자라 제모하지 않았던 털처럼 성모가 되었음을 확인하였다. M 군 마우스는 전체적으로 털이 고르게 자랐지만 하단 일부분의 털만 성모로 관찰되어 상단 부분과 중앙부분의 털은 성모보다 짧게 자란 것을 관찰할 수 있었다.

(나) 1차 동물실험 발모면적지수

디지털 카메라를 이용한 발모면적의 육안적 관찰과 발모면적을 측정하여 발모지수에 대해 분석한 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4] 1차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
1차_D1	합	3384	14468	-	1196	19048
	퍼센트	17.77%	75.96%	-	6.28%	100%
	발모지수	53.31%	151.92%	-	0%	205.23%
1차_D2	합	7651	1773	5707	959	16090
	퍼센트	47.55%	11.02%	35.47%	5.96%	100%
	발모지수	142.65%	22.04%	35.47%	0%	200.16%
1차_A1	합	9630	8813	-	829	19272
	퍼센트	49.97%	45.73%	-	4.30%	100%
	발모지수	149.91%	91.46%	-	0%	241.37%
1차_A2	합	5847	10660	-	357	16864
	퍼센트	34.67%	63.21%	-	2.12%	100%
	발모지수	104.01%	126.42%	-	0%	230.43%
1차_PLM1	합	7103	7554	6408	-	21065
	퍼센트	33.72%	35.86%	30.42%	-	100%
	점수	101.16%	71.72%	30.42%	-	203.3%
1차_PLM2	합	-	12895	5869	-	18764
	퍼센트	-	68.72%	31.28%	-	100%
	발모지수	-	137.44%	31.28%	-	168.72%
1차_PLE1	합	12563	11448	279	-	24290
	퍼센트	51.72%	47.13%	1.15%	-	100%
	발모지수	155.16%	94.26%	1.15%	-	250.57%
1차_PLE2	합	2679	10468	6985	576	20708
	퍼센트	12.94%	50.55%	33.73%	2.78%	100%
	발모지수	38.82%	101.1%	33.73%	0%	173.65%
1차_PLW1	합	2572	13777	835	-	17184
	퍼센트	14.97%	80.17%	4.86%	-	100%
	발모지수	44.91%	160.34%	4.86%	-	210.11%
1차_PLW2	합	7410	10342	2243	-	19995
	퍼센트	37.06%	51.72%	11.22%	-	100%
	발모지수	111.18%	103.44%	11.22%	-	225.84%
1차_M1	합	5560	16201	936	-	22697
	퍼센트	24.5%	71.38%	4.12%	-	100%
	발모지수	73.5%	142.76%	4.12%	-	220.38%
1차_M2	합	3511	17195	648	-	21354
	퍼센트	16.44%	80.52%	3.03%	-	100%
	발모지수	49.32%	161.04%	3.03%	-	213.39%

[표 5] 1차 동물실험 군별 평균 발모면적지수

군	평균 발모면적지수
1차_D	202.695%
1차_A	235.9%
1차_PLM	186.01%
1차_PLE	212.11%
1차_PLW	217.975%
1차_M	216.885

디지털 카메라를 이용한 발모 면적의 육안적 관찰과 발모 면적을 측정하여 발모지수에 대해 분석한 결과 235.9%으로 A 군이 제일 높은 발모율을 나타내었으며, 두 번째로는 217.975%로 PLW 군, 세 번째로는 216.885%로 M 군, 네 번째로는 212.11%로 PLE 군, 다섯 번째로는 202.695%로 D 군, 마지막으로는 186.01%로 PLM 군이 가장 낮은 발모율을 나타내었다.

특히 A 군과 PLW 군은 양성대조군인 M군 보다 높은 발모율을 나타내어 향후 발모치료제로서 개발 가능성이 있다고 사료된다. PLE 군은 음성대조군인 D 군 보다는 높은 발모율을 나타내었지만 개체 당 발모율이 일정하지 않아 오차가 크게 났으며, PLM 군은 음성대조군인 D 군보다 낮은 발모율을 보여 PLM 군과 PLE 군은 발모제로서 적합하지 않다는 결론을 얻었다.

(다) 실험동물 이상유무 확인

[표 6] 1차 동물 실험 실험동물 무게 측정

		1일째	16일째
1군	D1	19.01g	22.881g
	D2	18.72g	21.993g
2군	A1	19.26g	22.790g
	A2	20.68g	24.425g
3군	PLM1	20.64g	24.516g
	PLM2	19.63g	24.275g
4군	PLE1	20.06g	24.307g
	PLE2	20.19g	23.630g
5군	PLW1	19.71g	24.159g
	PLW2	19.92g	24.789g
6군	M1	18.81g	22.274g
	M2	20.14g	23.824g

실험이 진행되는 동안 실험동물이 스트레스를 심하게 받거나 질병에 걸리는 등의 경우에는 실험동물의 체중이 줄어들거나 이상행동을 하는 것을 관찰 할 수 있 다. 실험이 진행되는 동안 매일 실험동물의 이상행동 유무를 확인하였으며 어떠한 이상 징후도 관찰 할 수 없었다. 또한 실험 시작일과 마지막 일에 실시한 체중 측정결과에서 모든 동물의 체중이 증가하여 실험으로 인한 스트레스나 질병이 없는 것으로 사료된다.

(2) 2차 동물실험 결과

(가) 발모상태의 육안적 변화

2차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 다음 도 14 에 나타내었으며, 2차 발모실험 발모상태의 고배율 관찰한 결과는 도 15 에 나타내었다.

도 14에 의하면, 실험 1일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과 D 군, A군, P 군, G 군, M 군 모두 분홍빛의 피부색으로 발모에 대한 특별한 변화를 관찰 할 수 없었다. 실험 7일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과 D 군 마우스는 전체적으로 분홍빛의 피부색을 보였으며 중앙부분에 옅은 회색빛의 피부색을 관찰 할 수 있었다. A 군 마우스는 전체적으로 분홍색의 피부를 보였으며 중앙의 일부에서 회색의 피부를 보여 일부에서 발모가 시작되었음을 알 수 있었다. P 군 마우스는 5마리 모두 전체적으로 회색의 피부를 보여 발모가 시작됨을 알 수 있었다. G 군 마우스는 전체적으로 회색의 피부를 관찰 할 수 있어 발모가 시작됨을 알 수 있었으며,특히 하단 부분에서 원형 모양으로 짙은 회색의 털이 자란 것을 확인 할 수 있었다. M 군 마우스는 모두에서 전체적으로 회색의 피부를 보여 발모가 시작되었음을 알 수 있었으며, 일부 마우스는 짙은 회색의 털이 부분적으로 자란 것을 확인 할 수 있었 다.

실험 12일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과 D 군 마우스는 모두에서 전체적으로 발모가 일어난 것을 관찰 할 수 있었으나 모든 마우스에서 가장자리에는 발모가 일어나지 않는 것을 확인하였다. A 군 마우스는 공통적으로 제모된 부위 가장자리에 얇은 띠 모양으로 발모가 진행되지 않은 부분을 관찰할 수 있었다. P 군 마우스는 5마리 모두에서 전체적으로 발모가 일어난 것을 관찰하였으며 일부 마우스는 상단과 하단의 부분적으로 얇은 띠 부분을 제외한 전체 부분에서는 발모가 진행된 것을 확인 할 수 있었다. 특히 중앙의 왼쪽과 오른쪽 부분의 털이 더 길게 자란 것을 관찰할 수 있었다. G 군 마우스는 5마리 중 1 마리가 상단과 하단의 얇은 띠 부분을 제외한 전체 부분에서 발모가 관찰되었으며 왼쪽과 오른쪽의 털이 더 길게 자란 것을 확인 할 수 있었다. 나머지 마우스의 경우 얇은 띠 없이 전체적으로 발모가 진행된 가운데 상단부분 보다는 중앙과 하단 부분에서 털이 더 길게 자란 것을 확인 할 수 있었다. M 군 마우스는 5마리 모두에서 털이 자라 나와 발모가 전체적으로 고르게 진행되었음을 확인 할 수 있었다.

실험 15일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과 D 군 마우스는 제모한 부위의 가장자리는 얇은 띠 모양으로 발모가 관찰되지 않고 전체적으로 발모가 진행되었으며, 5 마리 중 1 마리의 경우 전체적으로 발모가 진행된 가운데 머리 쪽과 꼬리 쪽으로 약간의 미 발모 부위가 있었다. A 군 마우스는 미발모 부위가 없이 전체적으로 발모되었으며 중앙 부분의 털은 길게 자라 성모가 되었다. P 군 마우스는 전체적으로 고르게 발모가 진행 되었으며 중앙의 왼쪽과 오른쪽 일부의 털은 제모 되지 않은 주변의 털처럼 성모가 되어 높은 발모율을 확인 할 수 있었다. 5 마리중 2 마리의 마우스는 머리쪽과 꼬리쪽 일부분에서 발모를 관찰할 수 없었지만 중앙에서 꼬리쪽까지 제모 면적의 1/2에 해당하는 면적의 털이 길게 자라 성모가 되었다. G 군 마우스는 전체적으로 고르게 발모가 진행되었으며 미 발모 부분은 관찰 할 수 없었다. 특히 중앙에서부터 꼬리 쪽에 이르기까지 약 1/2 부분의 털이 성모로 자라 높은 발모율을 보였다. M 군 마우스는 미 발모 부위 없이 전체적으로 고른 발모 진행을 관찰 할 수 있었다. 특히 꼬리 쪽 부분의 털이 길게 자라 성모로 자라 높은 발모율을 보였다.

상기한 발모 2차 동물실험 결과를 종합해 보면 D 군은 5마리 모두에서 미발모 부위를 관찰 할 수 있었으며 그 부위도 다른 군에 비해 넓어 제일 낮은 발모율을 보였다. A 군도 D군과 마찬가지로 미 발모 부위를 관찰 할 수 있었으나 5마리 중 3마리에서 미 발모 부위가 있었으므로 D 군 보다는 발모율이 좋은 것으로 사료된다. P 군은 3마리의 마우스에서 아주 얇은 띠 모양으로는 발모가 관찰되지 않았다. 그러나 5마리 모두에서 고른 발모를 관찰 할 수 있었고 미 발모 부위의 면적이 적기 때문에 D 군과 A 군 보다는 발모율이 좋은 것으로 사료된다. M 군에서는 미발모된 마우스가 없었고, G 군에서는 실험동물 모두에서 미 발모 부위 없이 전체적으로 고른 발모율을 보였다. 또한 G 군에서는 M 군 보다 털이 길게 자라 성모가 된 부위의 면적이 넓으므로 M 군 보다는 G 군의 발모율이 좋은 것으로 사료된다.

(나) 2차 동물실험 발모면적지수

디지털 카메라를 이용한 발모면적의 육안적 관찰과 발모면적을 측정하여 발 모지수에 대해 분석한 결과를 표 7에 나타내었다.

[표 7-1] 2차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
2차_D1	합	3375	19304	-	1453	24132
	퍼센트	13.99%	79.99%	-	6.02%	100%
	발모지수	41.97%	159.98%	-	0%	201.95%
2차_D2	합	5233	14618	-	3347	23188
	퍼센트	22.53%	63.04%	-	14.43%	100%
	발모지수	67.59%	126.08%	-	0%	194.67%
2차_D3	합	3796	13865	440	829	20015
	퍼센트	18.97%	69.27%	2.2%	4.26%	100%
	발모지수	56.91%	138.54%	2.2%	0%	197.65%
2차_D4	합	3907	15554	-	1837	21298
	퍼센트	18.34%	73.03%	-	8.63%	100%
	발모지수	55.02%	146.06%	-	0%	201.08%
2차 D5	합	1816	17244	-	260	19320
	퍼센트	9.4%	89.25	-	1.35%	100%
	점수	28.2%	178.5%	-	0%	206.7%
2차_A1	합	10754	10421	-	3985	25160
	퍼센트	42.74%	41.42%	-	15.84%	100%
	발모지수	128.22%	82.84%	-	0%	211.06%
2차_A2	합	6536	14118	1120	1448	23222
	퍼센트	28.15%	60.8%	4.82%	6.24%	100%
	발모지수	84.45%	121.6%	4.82%	0%	210.87%
2차_A3	합	8347	16224	1354	444	26369
	퍼센트	31.65%	61.53%	5.14%	1.68%	100%
	발모지수	94.95%	123.06%	5.14%	0%	223.15%
2차_A4	합	13011	13001	-	-	26012
	퍼센트	50.02%	49.98%	-	-	100%
	발모지수	150.06%	99.96%	-	-	250.02%
2차_A5	합	6533	12769	-	3335	22634
	퍼센트	28.86%	56.42%	-	14.73%	100%
	발모지수	86.58%	112.84%	-	0%	225.84%

[표 7-2] 2차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
2차_P1	합	3920	19543	229	-	243692
	퍼센트	16.55%	82.49%	0.97%	-	100%
	발모지수	49.65%	164.98%	0.97%	-	215.6%
2차_P2	합	9479	19010	-	-	28490
	퍼센트	33.27%	66.73%	-	-	100%
	발모지수	99.81%	133.46%	-	-	233.27%
2차_P3	합	12573	11115	642	1212	25542
	퍼센트	49.23%	43.52%	2.51%	4.74%	100%
	발모지수	147.69%	87.04%	2.51%	0%	237.24%
2차_P4	합	10335	11474	-	-	21809
	퍼센트	47.39%	52.61%	-	-	100%
	발모지수	142.17%	105.22%	-	-	247.39%
2차_P5	합	7899	18949	-	-	26848
	퍼센트	29.42%	70.58%	-	-	100%
	점수	88.26%	141.16%	-	-	229.42%
2차_G1	합	15095	6850	-	-	21945
	퍼센트	68.79%	31.21%	-	-	100%
	발모지수	206.37%	62.42%	-	-	268.79%
2차_G2	합	15348	9638	-	-	24986
	퍼센트	61.43%	38.57%	-	-	100%
	발모지수	184.29%	77.14%	-	-	261.43%
2차_G3	합	15031	8658	-	-	23689
	퍼센트	63.45%	36.55%	-	-	100%
	발모지수	190.35%	73.1%	-	-	263.45%
2차_G4	합	15299	9738	-	-	25037
	퍼센트	61.11%	38.89%	-	-	100%
	발모지수	183.33%	77.78%	-	-	261.11%
2차_G5	합	15430	9226	-	-	24656
	퍼센트	62.58%	37.42%	-	-	100%
	발모지수	187.74%	74.84%	-	-	262.58%

[표7-3] 2차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
2차_M1	합	11940	12135	-	-	24075
	퍼센트	49.59%	50.41%	-	-	100%
	발모지수	148.77%	100.82%	-	-	249.59%
2차_M2	합	7122	18709	235	-	26066
	퍼센트	27.32%	71.78%	0.9%	-	100%
	발모지수	81.96%	143.56%	0.9%	-	226.42%
2차_M3	합	8502	18394	-	-	26896
	퍼센트	31.61%	68.39%	-	-	100%
	발모지수	94.83%	136.78%	-	-	231.61%
2차_M4	합	9743	16557	-	-	26300
	퍼센트	37.05%	62.95%	-	-	100%
	발모지수	111.15%	125.9%	-	-	237.05%
2차_M5	합	7700	18456	-	-	26156
	퍼센트	29.44%	70.56%	-	-	100%
	점수	88.32%	141.12%	-	-	229.44%

[표 8] 2차 동물실험 군별 평균 발모면적지수

군	평균 발모면적지수
2차_D	200.41%
2차_A	218.904%
2차_P	232.584%
2차_G	263.472%
2차M	234.822%

(다) 실험동물 이상유무 확인

[표 9]발모 2차 실험동물 무게

	1일째	8일째	15일째
D1	19.55g	20.85g	21.72g
D2	20.51g	21.22g	21.66g
D3	18.31g	20.30g	20.61g
D4	20.82g	21.41g	20.60g
D5	19.34g	20.73g	20.85g
A1	20.05g	21.45g	21.44g
A2	18.96g	20.45g	20.45g
A3	20.00g	21.84g	22.52g
A4	20.00g	21.64g	23.57g
A5	19.15g	19.91g	20.82g
P1	21.44g	22.09g	22.65g
P2	20.14g	21.67g	22.71g
P3	18.72g	20.58g	21.52g
P4	18.99g	20.18g	19.98g
P5	20.91g	22.25g	23.44g
G1	20.06g	21.52g	22.21g
G2	19.66g	21.59g	22.39g
G3	19.76g	21.73g	22.71g
G4	19.40g	21.42g	21.98g
G5	19.24g	20.96g	21.54g
M1	20.21g	23.38g	23.96g
M2	19.96g	22.62g	23.26g
M3	19.40g	22.50g	22.94g
M4	19.97g	23.08g	24.20g
M5	19.65g	21.43g	23.18g

실험이 진행되는 동안 매일 실험동물의 이상행동 유무를 확인하였으며 어떠한 이상 징후도 관찰 할 수 없었다. 또한 실험 시작일과 마지막 일에 실시한 체중 측정결과에서 모든 동물의 체중이 증가하여 실험으로 인한 스트레스나 질병이 없는 것으로 사료된다.

(3) 3차 동물실험 결과

(가) 발모상태의 육안적 변화

3차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 다음 도 16에 나타내었으며, 3 차 발모실험 발모상태의 고배율 관찰한 결과는 도 17에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 실험 1일째 실험동물의 배부를 관찰한 결과 모든 군의 마우스에서 분홍빛의 피부색으로 발모에 대한 특별한 변화를 관찰 할 수 없었다.

실험 7일째 실험동물의 배부를 관찰 한 결과 D 군의 마우스에서는 전체적으로 분홍빛의 피부색을 보여 발모가 아직 시작되지 않았음을 확인 할 수 있었다. P 20 군 마우스는 머리 쪽 일부에서 분홍빛의 피부색을 볼 수 있었고, 그 부분을 제외한 전체에서는 회색빛의 피부색을 볼 수 있어 발모가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. PG 군 마우스는 전체적으로 분홍빛의 피부색을 보였으며 중앙의 일부분에서 회색빛의 피부색을 보여 발모가 시작되려 함을 확인할 수 있었다. PGA 군 마우스는 전체적으로 회색빛의 피부색을 보여 발모가 시작되며 일부분에서는 털이 자란 것을 확인 할 수 있었다. GA 군 마우스는 머리 또는 꼬리 쪽 일부분에서 분홍빛의 피부색을 보였지만 중앙 전체에서는 회색빛의 피부를 보였으며 특히 중앙의 아래 부분에서는 털이 자라 나온 것을 관찰할 수 있었다. M 군 마우스는 전체적으로 옅은 회색빛의 피부색을 보여 발모가 시작되고 있음을 알 수 있었다. 특히 중앙의 일부분에서는 털이 자라나온 것을 확인할 수 있었다.

실험 12일째 실험동물의 배부를 관찰 한 결과 D 군 마우스는 전체적으로 발 모가 진행되었으나 제모한 가장자리 부분에서는 얇은 띠 모양의 미발모 부위가 관찰 되었다. P20 군 마우스는 머리 쪽 또는 꼬리 쪽의 일부분에서 분홍빛의 피부색을 보였고 배부 중앙의 왼쪽과 오른쪽에서는 털이 자라나온 것을 확인 하였다. 배부 중앙 부분에서는 회색빛의 피부색을 볼 수 있어 발모가 시작되고 있음을 알 수 있었다. PG 군의 마우스는 꼬리 쪽의 일부분을 제외하고는 전체적으로 발모가 진행된 것을 관찰 할 수 있었고 중앙과 머리 쪽의 털이 길게 자라 성모가 된 것을 확인 할 수 있었다. PGA 군 마우스는 전체적으로 발모가 진행되었으며 털이 길게 자라 나왔고 미 발모 부위는 없었다. GA 군 마우스는 제모된 부위의 가장 자리는 얇은 띠 모양으로 미 발모 상태였으나 전체적으로는 털이 자란 것을 관찰 할 수 있었다. M 군 마우스는 제모 되었던 피부가 짙은 회색을 보여 전체적으로 고르게 발모가 진행된 것을 관찰 할 수 있었으며, 5 마리 중 2 마리의 경우 제모된 가장 자리의 얇은 띠 모양의 미 발모 부위가 있었다.

실험 15일째 실험동물의 배부를 관찰 한 결과 D 군 마우스는 전체적으로 발모가 진행이 되었으나 제모된 부위의 가장자리 부분은 얇은 띠 모양으로 미 발모 상태임을 확인하였다. P20 군 마우스는 미 발모 부분을 관찰 할 수 없었으며 전체적으로 털이 고르게 자라 높은 발모율을 보였다. 5 마리 중 2 마리의 경우 꼬리 쪽의 일부분이 얇은 띠 모양으로 회색 피부 상태였고 머리 쪽 부분의 털은 밀도가 높지 않았으나 그 외 나머지 부분에서는 털이 길게 자라 성모가 된 것을 확인 할 수 있었다. PG 군 마우스는 5 마리 중 4 마리의 경우 꼬리 또는 머리쪽 일부 제모된 부분에 얇은 띠 모양으로는 발모가 관찰되지 않았으나 그 부분을 제외한 부분에서 는 고르게 발모가 진행되었음을 확인하였다. 5 마리 중 1 마리는 미발모 부분이 없이 전체적으로 발모가 진행되었으며 면적의 약 1/2에 해당하는 부분의 털은 성모로 자라 높은 발모율을 보였다. PGA 군 마우스는 전체적으로 고르게 발모가 진행되었으며 미발모 부위는 없어 발모율이 좋음을 확인 하였다. 특히 면적의 약 2/3에 해당하는 부분의 털은 성모로 자라 우수한 발모율을 확인 하였다. GA 군 마우스는 꼬리 쪽의 얇은 띠 모양으로 미 발모 부위가 있었으나 그 부분을 제외한 나머지 부위에서는 고르게 발모가 진행 되었다. 중앙의 왼쪽과 오른쪽의 일부분의 털은 성모로 자란 것을 관찰 할 수 있었다. M 군 마우스는 미발모 부분이 관찰되지 않았으며 전체적으로 고르게 발모가 진행되었음을 확인할 수 있었으나, 털이 성모 상태로 길게 자라나지는 않았다.

3차 동물실험 결과를 종합해 보면 D 군은 4마리 모두에서 공통적으로 가장자리의 얇은 띠 모양으로 미 발모 부위가 관찰 되었고 발모가 진행이 된 부분의 털도 성모 상태로는 진행되지 않아 가장 낮은 발모율을 보였다. P20 군의 경우 4마리 중 3마리에서는 가장자리의 얇은 띠 모양의 미 발모 상태가 관찰 되었으나 3번 마우스에서는 미발모 상태가 발견되지 않았고 전체적으로 털이 고르게 자랐으므로 1군 보다는 높은 발모율을 나타내었다고 사료된다. GA 군은 4마리의 실험동물 중 4마리 모두에서 가장자리의 얇은 띠 모양으로 미 발모 부위가 관찰 되었지만 P20 군의 1마리보다 많은 3마리에서 고르게 발모가 진행이 되어 P20 군 보다 GA 군이 더 높은 발모율을 나타내었다고 사료된다. PG 군은 4마리 중 2 마리의 마우스의 털이 짧은 상태였지만 발모가 고르게 진행되었으며 1 마리의 마우스는 미 발모 부위가 있었으 나 일부분의 털은 성모로 자란 것을 관찰 할 수 있었고 특히 1 마리의 경우 상당부분의 털이 성모로 자라 GA 군보다 PG 군이 발모율이 더 높다고 사료된다. M 군과 PGA 군은 4마리 모두에서 높은 발모율을 나타내었으나 M군에서는 1 마리의 마우스에서만 성모 상태로 자란 털을 확인 할 수 있었고 PGA 군에서는 2 마리의 마우스에서 약 2/3에 해당하는 면적에서 성모상태의 털을 관찰 할 수 있었으므로 M 군 보다 높은 발모율을 보였다고 사료된다.

(나) 3차 동물실험 발모면적지수

디지털 카메라를 이용한 발모면적의 육안적 관찰과 발모면적을 측정하여 발모지수에 대해 분석한 결과를 표 9에 나타내었다.

[표 9-1] 3차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
3차_D1	합	-	20288	1007	2297	23592
	퍼센트	-	85.99%	4.27%	9.74%	100%
	발모지수	-	171.98%	4,27%	0%	176.25%
3차_D2	합	-	21311	-	3039	24350
	퍼센트	-	87.52%	-	12.48%	100%
	발모지수	-	175.04%	-	0%	175.04%
3차_D3	합	-	18326	1322	4114	23762
	퍼센트	-	77.12%	5.56%	17.31%	100%
	발모지수	-	154.24%	5.56%	0%	159.8%
3차_D4	합	-	18148	469	2921	21538
	퍼센트	-	84.26%	2.18%	13.56%	100%
	발모지수	-	168.52%	2.18%	0%	170.07%
3차_P201	합	-	14380	6482	1231	22093
	퍼센트	-	65.09%	29.34%	5.57%	100%
	점수	-	130.18%	29.34%	0%	159.52%
3차_P202	합	-	19292	650	1651	21593
	퍼센트	-	89.34%	3.01%	7.65%	100%
	발모지수	-	178.68%	3.01%	0%	181.69%
3차_P203	합	-	25016	228	-	25244
	퍼센트	-	99.1%	0.9%	-	100%
	발모지수	-	198.2%	0.9%	-	199.1%
3차_P204	합	-	18776	2901	860	22537
	퍼센트	-	83.31%	12.87%	3.82%	100%
	발모지수	-	166.62%	12.87%	0%	179.49%
3차_PG101	합	-	20681	444	302	26012
	퍼센트	-	96.52%	2.07%	1.41%	100%
	발모지수	-	193.04%	2.07%	0%	195.11%
3차_PG102	합	14282	13072	318	-	27672
	퍼센트	51.61%	47.24%	1.15%	-	100%
	발모지수	154.83%	94.48%	1.15%	-	250.46
3차_PG103	합	-	23184	-	1134	24318
	퍼센트	-	95.34%	-	4.66%	100%
	발모지수	-	190.68%	-	0%	190.68%
3차_PG104	합	-	19754	1273	1046	22073
	퍼센트	-	89.49%	5.77%	4.74%	100%
	발모지수	-	178.98%	5.77%	0%	184.75%

[표 9-2] 3차 동물실험 발모면적지수

군		3점면적	2점면적	1점면적	0점면적	합계
3차_PGA101	합	8015	21246	-	-	29261
	퍼센트	27.39%	72.61%	-	-	100%
	발모지수	82.17%	145.22%	-	-	227.39%
3차_PGA102	합	8646	14788	364	-	23798
	퍼센트	36.33%	62.14%	1.53%	-	100%
	발모지수	108.99%	124.28%	1.53%	-	234.8%
3차_PGA103	합	19870	8719	81	-	28670
	퍼센트	69.31%	30.41%	0.28%	-	100%
	발모지수	207.93%	60.82%	0.28%	-	269.03%
3차_PGA104	합	24514	-	248	493	25255
	퍼센트	97.07%	-	0.98%	1.95%	100%
	발모지수	291.21%	-	0.98%	0%	292.19%
3차_GA101	합	4008	20296	245	378	24927
	퍼센트	16.08%	81.42%	0.98%	1.52%	100%
	점수	48.24%	162.84%	0.98%	0%	212.06%
3차_GA102	합	-	23799	-	289	24088
	퍼센트	-	98.8%	-	1.2%	100%
	발모지수	-	197.6%	-	0%	197.6%
3차_GA103	합	-	14462	5780	1729	21971
	퍼센트	-	65.82%	26.31%	7.87%	100%
	발모지수	-	131.64%	26.31%	0%	157.95%
3차_GA104	합	9033	12664	-	320	22017
	퍼센트	41.03%	57.52%	-	1.45%	100%
	발모지수	123.09%	115.04%	-	0%	238.13%
3차_M1	합	-	24854	234	-	25088
	퍼센트	-	99.07%	0.93%	-	100%
	발모지수	-	198.14%	0.93%	-	199.07%
3차_M2	합	11501	15775	-	-	27276
	퍼센트	42.17%	57.83%	-	-	100%
	발모지수	126.51%	115.66%	-	-	242.17
3차_M3	합	15618	10874	306	925	27723
	퍼센트	56.34%	39.22%	1.1%	3.34%	100%
	발모지수	169.02%	78.44%	1.1%	0%	248.56%
3차_M4	합	-	23645	133	406	24184
	퍼센트	-	97.77%	0.55%	1.68%	100%
	발모지수	-	195.54%	0.55%	0%	196.09%

[표 10] 3차 동물실험 군별 평균 발모면적지수

군	평균 발모면적지수
3차_D	170.29%
3차_P20	179.95%
3차_PG10	205.25%
3차_PGA10	255.85%
3차_GA10	201.435%
3차M	221.47%

(다) 실험동물 이상유무 확인

[표 11] 발모 3차 실험동물 무게

	1일째	8일째	15일째
D1	20.18g	19.43g	21.08g
D2	19.57g	20.17g	20.61g
D3	19.35g	20.24g	20.52g
D4	20.27g	20.97g	21.52g
P201	19.92g	19.84g	20.49g
P202	18.53g	19.87g	18.95g
P203	20.62g	22.02g	21.88g
P204	19.91g	20.78g	21.22g
PG101	20.91g	22.39g	21.87g
PG102	19.65g	22.06g	22.28g
PG103	20.86g	21.56g	22.85g
PG104	20.35g	21.24g	21.69g
PGA102	20.00g	21.63g	21.40g
PGA102	19.40g	22.21g	20.65g
PGA103	20.09g	21.22g	22.86g
PGA104	19.81g	21.22g	21.54g
GA101	20.03g	20.10g	21.62g
GA102	20.07g	21.60g	22.51g
GA103	20.80g	22.13g	22.34g
GA104	20.35g	21.34g	21.69g
M1	19.83g	22.44g	23.55g
M2	19.88g	23.53g	24.57g
M3	19.98g	21.57g	22.35g
M4	19.12g	21.35g	22.18g

실험이 진행되는 동안 매일 실험동물의 이상행동 유무를 확인하였으며 어떠한 이상 징후도 관찰 할 수 없었다. 또한 실험 시작일과 마지막 일에 실시한 체중 측정결과에서 모든 동물의 체중이 증가하여 실험으로 인한 스트레스나 질병이 없는 것으로 사료된다.

실시예 7. Field test에 의한 효능 검증

휴지기 모낭의 발모유도 효과를 확인하기 위하여 정수리 및 앞이마 박모 상태가 20여년 이상 지속되어온 68세 남성을 대상으로 평균입경 60nm size의 PGA 리 포좀 제형을 이용하여 field test를 실시한 결과, 휴지기 모낭이 활성화되면서 정수리 가장자리 부분에서 발모가 진행되어 정수리 부위의 박모면적을 상당부분 축소시켜나감을 확인할 수 있었다[도 18]. 특히, 본 시험 남성의 경우 유전형 탈모 및 박모가 상당기간 진행되어온 경우로써, 본 발명자가 예측한 유전형 박모증에 자가면역기능 활성화 성분이 효능을 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

아울러 퍼머약 부작용으로 앞이마부위 1~2 ㎠ 탈모가 진행된 63세 여성을 대상으로 평균입경 60nm size의 PGA 리포좀 제형을 이용하여 field test를 실시하였고, 그 결과 시험여성의 앞이마 부위 탈모가 치료제 도포 2개월 만에 효과를 발현하기 시작하여 6개월 만에 탈모부위가 복원됨을 확인할 수 있었다. 또한, 스트레스로 인한 가르마 부위의 탈모로 가르마 부위에 눈에 띄는 박모현상을 가지고 있는 38세 여성을 대상으로 상기 샘플을 적용한 결과, 2개월 만에 효과를 발현하기 시작하여 4개월 만에 증상이 상당히 호전됨을 확인할 수 있었다.

특히, 본 성분을 적용한 경우의 가장 큰 특징은 증상이 완전히 사라진 경우, 치료제를 계속 적용할 필요가 없었다는 것으로, 상기 두 여성의 경우는 증상이 어느 정도 호전되어 새로 나게 된 잔머리가 굵어지는 시점부터 치료제를 도포하지 않아도 새로 자라나온 머리가 빠지는 현상이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 테스트에 참여한 남성의 경우는 연령이 비교적 높고 박모 상태가 상당기간 지속되어왔기 때문에 모낭활성화에 상당한 시간이 요구됨을 확인할 수 있었으며, 새로 자라나온 얇은 머리카락이 2~3차례 빠지고 다시 나는 과정을 반복하면서 점차 굵은 머리카락이 자라나게 됨을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 피부 자극성 테스트

피부에 흡수되는 약물 또는 기능성 화장품등에 포함된 각종 유효성분들과 제형의 인체 안전성 여부를 객관적인 시험법으로 검증하는 표준화된 안전성 검사지침이 식품의약품안전청과 국립환경과학원, 농촌진흥청 등에 고시된 방법에 의하여 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템의 피부 자극성 테스트를 수행한 결과 피부에 안정적인 것으로 확인되었다.

도 19에는 한국생활환경시험연구원에 의뢰하여 얻어진 시험성적서를 첨부하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템은 무해한 것으로 확인되었다.

도 1은 상황버섯 추출물로부터 분리된 베타-글루칸의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이.

도 2는 Microfluidizer를 이용한 nano-capsulation 제조 조건에 다른 리포좀 입자의 변화를 나타낸 그래프이다[(a)통과온도, (b)통과압력, (c)통과횟수 ].

도 3은 SEM을 이용하여 시료 S4의 구조를 확인한 사진이다[(a) max x 15,000(평균 사이즈 62.5nm), (b) max x 7,500(평균 사이즈 64.3nm),(c) max x 30,000(평균 사이즈 62.3nm)]

도 4는 TEM을 이용한 시료 S4의 구조를 확인한 사진이다[(a) max x 50,000(평균 사이즈 58.7nm), (b) max x 80,000(평균 사이즈 58.7nm)].

도 5는 표 2의 S1 ~ S6 sample의 입자크기를 나타낸 그래프이다.

도 6은 표 2의 S4 시료의 저장중 입자크기의 변화를 나타낸 그래프이다[40 ℃, 6 개월].

도 7은 표 2의 S4 시료의 Microfluidizer 통과회수에 따른 Zeata potential 변화를 나타낸 그래프이다[(60℃, 10,000psi)].

도 8은 표 2의 S4 시료의 pH 변화에 따른 입자크기의 변화추이를 나타낸 그래프이다.

도 9는 표 2의 S4 시료의 pH 변화에 따른 탁도의 변화추이를 나타낸 그래프이다.

도 10은 Hairless mouse를 이용한 리포좀 제형 및 emulsion 제형의 경표피 흡수 시험결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 Hairless mouse를 이용한 리포좀 제형 및 emulsion 제형의 시간에 따른 경표피 침투 추이를 나타낸 그래프이다.

도 12는 발모실험시 (A) 피부상태에 따른 피부 상태 점수, (B) 발모 면적지수 계산에 따른 발모율에 대한 예시를 나타낸 것이다.

도 13은 1차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 나타낸 것이다.

도 14는 2차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 나타낸 것이다.

도 15는 2차 발모실험 발모상태의 날짜별 고배율 관찰사진을 나타낸 것이다.

도 16은 3차 동물실험의 치료제 및 날짜별 발모추이 비교사진을 나타낸 것이다.

도 17는 3차 발모실험 발모상태의 날짜별 고배율 관찰사진을 나타낸 것이다.

도 18은 발모유효 추출 분리정제 물질 제형의 박모상태 두피적용 field test 결과를 나타낸 사진이다.

도 19a,19b,19c는 한국생활환경시험연구원에 의뢰하여 얻어진 시험성적서이다.

Claims (8)

1. 상황버섯 추출물 5 내지 50 중량%, 영지버섯 추출물 5 내지 50 중량% 및 ALA 50 ppm 내지 2 중량% 범위를 포함하는 혼합물이 리포좀으로 안정화된 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 상황버섯 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 물과 저급 알코올의 혼합용매 중에서 선택된 어느 하나를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 영지버섯 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 물과 저급 알코올의 혼합용매 중에서 선택된 어느 하나를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 청구항 1에 있어서,

   상기 리포좀은 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템 총 중량 중 10 내지 45 중량% 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템.
8. 청구항 7에 있어서,

   상기 리포좀은 평균입자지름이 50 내지 100 nm 인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약물 전달 시스템.

Images