KR101034009B1

KR101034009B1 - 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 피부미백용 조성물

Info

Publication number: KR101034009B1
Application number: KR1020080130387A
Authority: KR
Inventors: 이용화; 배성윤; 이응지; 손락호; 남궁우; 김재기; 윤동영
Original assignee: 주식회사 백옥생
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2011-05-11
Also published as: KR20100071609A

Abstract

본 발명은 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산(3-β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-4-oic acid)을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물 및 복령피로부터 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

복령피, 피부미백, 멜라닌 생성 억제

Description

3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 피부미백용 조성물{Skin whitening composition comprising 3-β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-4-oic acid}

인간의 피부색은 피부 내부의 멜라닌 색소의 농도 및 분포에 따라 결정된다. 정상 상태에서는 멜라닌의 과다 생성이 일어나지 않지만, 피부가 자외선, 환경 오염, 스트레스 등과 같은 외부 자극이나 호르몬, 염증 유발인자 등과 같은 내적 요인에 대해 반응하면 멜라닌 색소가 과다 생성되고, 정상적으로 피부로부터 배출되지 못하고 피부에 축적되면 색소 침착이 유발된다.

최근 환경오염, 오존층의 파괴로 인한 자외선의 증가 등으로 인하여, 피부에 대한 자극이 증가되면서 피부의 건강, 특히 미백에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있다. 주로 멜라닌 색소의 합성에서 주요한 속도 결정 단계를 수행하는 티로시나아 제(tyrosinase) 활성을 억제하는 작용제들이 피부미백을 위해 개발되어 이용되고 있다. 대표적으로, 천연물에서 수득된 하이드로퀴논(hydroquinone), 코직산(kojic acid), 아스코르빈산(ascorbic acid) 및 그 유도체 등이 티로시나아제 활성의 억제에 의한 피부미백과, 햇볕에 의한 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증 개선의 목적으로 연고, 에센스 등의 화장료에 첨가제로 이용되었다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만, 피부에 대한 자극성이 높아 안전성 문제로 인해 화장료로 사용되지 못하고 있으며, 코직산은 용액 내에서 불안전하여 화장료의 제조공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 또한 아스코르빈산은 산화하기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제가 발생이 되어 미백 원료로는 적합하지 않다. 따라서, 멜라닌 색소의 과다 생성을 억제하고, 피부에 대한 독성이 낮으며 안정성이 높은 피부미백용 활성 물질에 대한 요구가 여전히 존재한다.

따라서, 본 발명자들은 높은 미백 활성 및 안전성을 갖는 미백 활성 물질을 탐색하여, 복령피 추출물에서 분리, 정제한 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산이 세포독성 없이 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피부 독성이 낮고, 안정성 및 피부미백 활성이 높은 활성 물질을 포함하는 피부미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 복령피로부터 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부미백용 조성물에 유효성분으로 포함되는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 피부 세포의 흑화를 방지하는 활성이 우수할 뿐 아니라, 물질 자체의 안정성이 매우 우수하여 그 활성이 장기간 유지되며, 피부 자극이 거의 없는 안전성이 매우 우수한 물질이다. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 복령피로 추출, 정제될 수 있으며, 본 발명의 이전에는 멜라닌 생성 억제 활성은 물론, 피부미백제로서의 용도에 관해 전혀 보고된 바 없었다.

복령피로부터 추출 및 정제한 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 공지된 피부미백 활성 물질들과 비교할 때, 멜라닌 생성 억제 효과가 현저하게 우수하다. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산, 공지된 미백 활성 물질인 알부틴 및 코직산를 각각 여러 농도로 함유시킨 배지에서 B16F10 멜라노마 세포를 72시간 배양한 후 흑화 정도를 비교한 결과, 알부틴은 100㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 세포의 흑화 억제 활성을 보이고(IC₅₀=84㎍/㎖), 코직산은 150㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 세포의 흑화 억제 활성을 보이는 반면(IC₅₀=124㎍/㎖), 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 이들보다 훨씬 낮은 5㎍/㎖의 농도(IC₅₀=3.8㎍/㎖)에서 유의성 있는 세포의 흑화 억제 활성을 보였다.

일반적으로 생약 조추출물 자체를 피부미백용 조성물의 유효성분으로 사용하는 경우, 조추출물 내에는 미백 활성 물질 외에도 다른 성분들이 포함되어 있기 때문에, 일부 성분들이 미백 활성 물질과 바람직하지 않은 반응에 의해 미백 활성이나 안정성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있고 또는 원하는 미백 활성을 위해 첨가되어야 하는 유효 성분의 양이 증가되어 피부미백용 조성물의 제조에 제한 요인이 될 수 있다. 실제로 멜라닌 생성 억제 실험에서 복령피의 조추출물은 IC₅₀=12.8㎍/㎖인 반면, 복령피로부터 추출, 분리 및 정제된 3-베타-히드록실라노스타- 7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 IC₅₀=3.8㎍/㎖이어서 조추출물보다 훨씬 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 것으로 확인하였다.

본 발명에 따른 피부미백용 조성물에서 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 화학적으로 합성되거나 또는 복령피를 포함한 천연 약재로부터 추출, 정제된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 피부미백용 조성물에서 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10.0중량%인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 10.0중량%이다. 함량이 0.0001중량% 미만이면 뚜렷한 멜라닌 생성 억제 효과 및 미백효과를 기대하기 어려우며, 10.0중량%를 초과하면 함량 증가에 따른 효과 증진이 크지 않다. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 피부미백 효과를 위하여 사용하는 경우, 사용 목적에 따라 그 농도를 달리하여 피부미백용 조성물을 제조할 수 있지만, 일반적인 피부미백용 조성물의 제제, 즉 로션이나 크림 등에는 상기 함량으로 이용된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 피부미백용 조성물은 화장수, 크림, 팩, 파운데이션, 및 메이크업 베이스로 구성되나, 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 피부미백용 조성물은 유효 성분인 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 외에, 유기용매, 용해제, 농축 제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온성 또는 비이온성 유화제, 충전제, 보존제, 습윤제, 오일, 염료, 리포좀 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 이와 같은 성분들은 화장품에 통상적으로 사용되는 양으로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 복령피로부터 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 복령피로부터 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 제조하는 방법은

복령피를 극성 용매에 첨가하고 가열 추출하는 단계,

상기 복령피 추출액을 농축하고 물에 용해시켜 추출물 수용액을 수득하는 단계,

상기 추출물 수용액에 동일 부피의 노르말 헥산을 첨가하고 분배를 실시하여 수층을 수득하는 단계,

상기 수층에 동일 부피의 클로로포름을 첨가하고 분배를 실시하여 클로로포름층을 수득하는 단계,

상기 클로로포름층을 진공 건조시켜 건 추출물을 수득하는 단계,

상기 건 추출물을 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계, 및

상기 정제된 추출물을 메탄올에서 재결정시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조방법은 복령피를 극성 용매에 첨가하고 가열 추출하는 단계를 포함한다.

상기 가열 추출하는 단계에서 극성 용매는 에탄올, 메탄올, 부틸렌글리콜 및 물로부터 선택되거나 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 가열 추출하는 단계는 30-80℃의 온도에서 2-10시간 동안 수행되며, 2-5회 또는 필요에 따라 그 이상 반복 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조방법은 가열 추출에 의해 수득된 복령피 추출액을 농축하고 물에 용해시켜 추출물 수용액을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 추출물 수용액을 수득하는 단계에서 복령피 추출액의 농축은 회전 증발 또는 진공건조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조방법은 상기 수득된 추출물 수용액에 동일 부피의 노르말 헥산을 첨가하고 분배를 실시하여 수층을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 노르말 헥산에 의한 분배 단계는 2-4회 또는 필요에 따라 그 이상 반복 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조방법은 상기 수득된 수층에 동일 부피의 클로로포름을 첨가하고 분배를 실시하여 클로로포름층을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 클로로포름에 의한 분배 단계는 2-4회 또는 필요에 따라 그 이상 반복 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조방법은 복령피로부터 가열추출, 노르말 헥산 및 클로로포름에 의한 분배 및 진공 건조에 의해 수득된 건 추출물을 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함한 다. 상기 건 추출물을 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계는 클로로포름:메탄올(50:1, 구배농도)을 용리액으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득하는 단계, 상기 분획을 클로로포름:메탄올(50:1, 구배농도)을 이용하여 박층 크로마토그래피에 의해 전개시켜 분리하고 멜라닌 생성 억제 활성이 가장 높은 분획을 선별하는 단계, 상기에서 선별된 분획을 세파덱스 컬럼 및 메틸렌클로라이드:메탄올(1:1) 용액을 용리액으로 이용하여 분자량에 따라 분리하여 분획을 수득하는 단계, 상기 분획을 메틸렌클로라이드:메탄올(1:1) 용액을 이용하여 박층 크로마토그래피에 의해 전개시켜 분리하고 분획을 수득하고 멜라닌 생성 억제 활성이 가장 높은 분획을 선별하는 단계, 상기에서 선별된 분획을 C₁₈-수지를 충진제로 하고 물:아세토니트릴:메탄올(10:70:20)을 용리액으로 이용한 역상 컬럼크로마토그래피에 의해 정제하여 분획을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 정제 단계에서, 멜라닌 생성 억제 활성이 가장 높은 분획을 선별하는 단계는 각 분획에 의한 멜라닌 생성 억제 활성을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 멜라노마 세포를 각 분획을 포함하는 배지에서 배양한 후 생성된 멜라닌의 양을 측정하여 멜라닌 생성 억제 활성을 결정할 수 있다.

상기 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계는 수득하고자 하는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 수율 및 활성에 따라 필요한 만큼 반복될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21- 오익산의 제조는 하기와 같이 수행될 수 있다. 복령피에 극성 용매, 예를 들면 에탄올, 메탄올, 부틸렌글리콜 또는 물 단독 또는 이들의 혼합액을 가하고 약 70℃에서 4시간 가열하여 3회 추출을 수행한다. 상기 추출액을 회전 진공 농축기를 이용하여 약 40-70℃에서 증발시키고 농축하여 수득된 추출물에 물을 가하여 용해시킨 후 노르말 헥산을 동일 부피로 가하여 분배를 실시한다. 상기에서 수득된 수층을 동일 부피의 클로로포름으로 3회 반복 분배 추출한다. 수득된 클로로포름 층을 진공 건조하여 추출물을 얻고, 실리카겔 컬럼(Merck, Art 7734) 및 클로로포름:메탄올(50:1, 구배농도)을 용리액으로 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한다. 이때 용리액을 250㎖씩 분획하여 전개시키고 얻은 각각의 분획물을 동일 용리액을 이용한 박층크로마토그래피(Merck, Art 5554)에 의해 확인하여 분리한 후 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 선별한다. 선별된 분획을 메틸렌클로라이드:메탄올(1:1)을 용리액으로 하여　세파덱스 컬럼에서의 크로마토그래피에 의해 분리한다. 이때 용리액을 15㎖씩 분획하여 전개시키고 수득한 각각의 분획물을 동일 용리액을 이용한 박층 크로마토그래피(Merck, Art 5554)를 실시하여 분리한 후 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 모아　물:아세토니트릴:메탄올(10:70:20)을 용리액으로 하여 C₁₈-수지를 충진제로 한 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득한다. 이때 용리액은 20㎖ 단위로 분획하여 전개시키고 얻은 각각의 분획물에 대하여 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 모아 증발시키고 메탄올에서 재결정을 실시하여 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 무색의 결정체로 수득한다.

본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물은 멜라닌 생성의 억제에 의한 피부미백 효과가 뛰어나며 독성이나 부작용에 대한 우려 없이 안전하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 제조

(1) 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 분리 및 정제

복령피 950g에 에탄올 5ℓ를 가하고 약 70℃에서 4시간 가열한 후 여과하여 그 여과액을 얻었다. 이 여과액을 진공 건조하여 추출물 73g을 얻었다. 추출물 중 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 함량은 약 1.3%이었다.

상기에서 수득된 추출물 73g을 물 1.5ℓ에 녹인 후 노르말 헥산을 동일 부피로 첨가하여 분배 추출을 3회 반복하여 수층을 수득하였다. 상기에서 수득된 수층을 동일 부피의 클로로포름으로 분배 추출을 3회 반복하여 클로로포름 층을 수득하였다. 상기에서 수득된 클로로포름 층을 진공 건조하여 31.7g의 추출물을 얻었다. 상기에서 수득된 건 추출물을 클로로포름:메탄올(50:1, 구배농도)을 용리액으로 이용한 실리카겔 컬럼(Merck, Art 7734) 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이때 용리액을 250㎖씩 분획하여 전개시키고 얻은 각각의 분획물을 동일 용리액을 이용한 박층크로마토그래피(Merck, Art 5554)를 실시하여 분리한 후 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 선별하였다. 선별된 분획을 메틸렌클로라이드:메탄올(1:1)을 용리액으로 하여　세파덱스 컬럼에서의 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이때 용리액을 15㎖씩 분획하여 전개시키고 수득한 각각의 분획물을 박층 크로마토그래피(Merck, Art 5554)를 실시하여 분리한 후 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 모아　물:아세토니트릴:메탄올(10:70:20)을 용리액으로 하여 C₁₈-수지를 충진제로 한 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득하였다. 이때 용리액은 20㎖ 단위로 분획하여 전개시키고 얻은 각각의 분획물에 대하여 멜라닌 생성 억제력을 평가하여 그 활성이 가장 높은 분획을 모아 증발시키고 메탄올에 용해시키고 침전시킨 후 약 8g의 정제물을 수득하였다. 상기 정제물 중 무색의 결정체인 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 함량은 약 40%정도였다.

(2) 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 구조 확인

상기 (1)에서 수득된 생성물을 시료로 NMR System: 500 Spectrophotometer(Varia, Palo Alto, CA)를 이용한 NMR분석을 수행하여 표 1의 데 이터를 수득하고(LC/ESI/MS m/z = 454[M-H]-), 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산으로 확인하였다. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 백색의 무정형 분말로서, 그 구조는 하기 화학식 1과 같았다.

<화학식 1>

표 1. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 ¹H, ¹³C-NMR 데이터

Carbon	¹H-NMR(500MHz)	¹³C-NMR(125MHz)
1	-	36.71
2	-	29.03
3	3.46(t, 7.8)	78.37
4	-	39.70
5	-	50.10
6	-	23.90
7	5.63(br d, 5.89)	121.65
8	-	143.17
9	-	146.97
10	-	38.20
11	5.39(br d, 5.89)	116.99
12	-	36.38
13	-	44.62
14	-	50.84
15	-	31.96
16	-	27.65
17	-	48.52
18	1.02(3H,s)	16.63
19	1.08(3H,s)	23.33
20	2.68(td, 10.8, 3.1)	49.36
21	-	178.96
22	-	33.65
23	-	27.11
24	5.34(1H, br t, 7.13)	125.23
25	-	132.10
26	1.68(3H, s)	26.14
27	1.64(3H, s)	18.09
28	1.23(3H, s)	29.19
29	1.14(3H, s)	16.98
30	1.07(3H, s)	26.22

실시예 2. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 세포독성 및 피부미백 활성

실시예 1에서 제조된 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 세포 독성 및 피부미백 효과를 확인하기 위해 B16F10 멜라노마 세포를 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, Sigma Chemical Co. USA) 분석 및 멜라닌 생성 저해 분석을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 B16F10 멜라노마 세포는 멜라닌을 분비하는 마우스에서 유래된 세포주이며, 미국세포주은행(ATCC)으로부터 구입하여 사용하였다.

(1) 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 세포독성

3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 세포독성을 평가하기 위해 B16F10 멜라노마 세포에 대해 MTT 분석을 실시하였다. 트립신 처리(trypsinization)에 의해 회수한 B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제(페니실린+스트렙토마이신, Lonza)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 현탁시킨 후 96-웰 조직배양용 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액(5×10³ 세포/웰)을 접종한 다음, 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 5시간 배양하였다. 5시간 배양 후 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 DMSO에 용해시킨 용액을 하기 표 2에 열거한 농도별로 처리한 후 72시간 더 배양하였다. 배양이 끝난 후 생리 식염수에 용해시킨 MTT 용액 20㎕(4㎎/㎖)을 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 200㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO, dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 595㎚에서 농도 별로 흡광도를 측정하였다. 상기 세포독성 시험에서 대조군은 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 용액 대신, 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 용해시키기 위해 이용한 DMSO로 처리한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 처리하였다.

하기 식을 이용하여 세포 생존율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나 타내었다.

세포 생존율 (%) = 100 - (1 - 각 시료의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100

표 2. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 세포독성

시료		평균 세포 생존율 (%)
DMSO (대조군)		100
3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산	1.0㎍/㎖	112
	2.5㎍/㎖	109
	5.0㎍/㎖	103
	10.0㎍/㎖	97
	20.0㎍/㎖	95

(2) 세포 펠렛(pellet)의 색 관찰

B16F10 멜라노마 세포는 멜라닌을 생성하며 생성된 멜라닌의 양에 따라 세포의 색이 결정된다. 따라서, 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 미백효과를 확인하기 위해, 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산으로 처리한 B16F10 멜라노마의 세포 펠렛의 색을 관찰하였다.

B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태혈청과 1% 항생제(페니실린+스트렙토마이신, Lonza)를 첨가한 DMEM에 현탁시킨 후, 조직배양용 배지를 담은 24-웰 플레이트의 각 웰에 상기 세포현탁액(4×10⁴ 세포/웰)을 접종하고 5시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone) 및 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)가 보충된 DMEM에 각각 1.0㎍/㎖, 2.5㎍/㎖ 및 5㎍/㎖ 농도로 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산를 첨가하고 72시간 동안 배양하였다. 음성 대조군은 시료 대신 시료를 용해시키기 위해 사용한 DMSO를 배지에 첨가하여 배양하고, 양성 대조군은 알부틴을 100㎍/㎖ 농도로 첨가하여 배양하였다. 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 펠렛을 회수하고 그 색을 육안으로 관찰하였다.

도 1은 관찰된 세포 펠렛의 색을 보여준다. 도 1에서 A는 DMSO 처리 대조군이고 B는 양성 대조군인 알부틴 100㎍/㎖ 처리군, C는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 1.0㎍/㎖ 처리군, D는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 2.5㎍/㎖ 처리군, E는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 5.0㎍/㎖ 처리군이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 세포 펠렛의 색은 DMSO 처리 대조군 및 알부틴 처리 대조군 대비 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 처리군의 경우 훨씬 더 엷었고, 이는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 멜라닌 생성 억제 활성이 알부틴에 비해 훨씬 높다는 것을 보여준다.

(3) 멜라닌 생성 저해율 측정

실시예 1에서 제조된 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 미백효과를 검정하기 위해, B16F10 멜라노마 세포에 대한 멜라닌 생성 저해율을 측정하였다.

B16F10 멜라노마 세포의 멜라닌 생성 저해 효과 측정은 하기와 같이 수행하였다. B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태혈청과 1% 항생제(페니실린+스트렙토마이신, Lonza)를 첨가한 DMEM에 현탁시킨 후, 조직배양용 배지를 담은 24-웰 플레이트 의 각 웰에 상기 세포현탁액(4×10⁴ 세포/웰)을 접종하고 5시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone)와 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)가 보충된 DMEM 배지에 독성을 유발하지 않는 농도(1-20㎍/㎖)로 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 첨가한 배지로 교체하여 72시간 동안 배양하였다. 음성 대조군은 시료 대신 시료를 용해시키기 위해 사용한 DMSO를 처리하고, 양성 대조군은 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 대신, 기존에 멜라노마에서 멜라닌 저해 효과를 갖는 것으로 알려진 알부틴과 코직산을 농도 별로 처리하여 사용하였다. 배양 후 멜라닌 함량을 측정할 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내의 멜라닌 정량은 Lotan(Cancer Res., 40:3345-3350, 1980)의 방법을 변형하여 실시하였다. 원심분리에 의해 수득된 세포 펠렛에 1N NaOH + 10% DMSO를 첨가하여 멜라닌을 추출하고 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정하였다.

하기 식을 이용하여 멜라닌 생성 저해율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에서, IC₅₀은 멜라닌 생성 저해율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 지표이며 값이 작을수록 멜라닌 생성 저해율이 높다는 것을 나타낸다.

멜라닌 생성 저해율(%) = 100 - (각 시료의 흡광도/음성 대조군의 흡광도 X 100)

표 3. 멜라닌 생성 저해

시료	IC₅₀ (㎍/㎖)
알부틴(양성 대조군 1)	84
코직산(양성 대조군 2)	126
3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산	3.6

(4) 인 비트로 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 활성 저해 시험

티로시나아제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화 과정을 촉진하여 멜라닌의 생성에 관여하는 효소이다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 티로신의 산화에 의해 멜라닌이 형성되는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S.H., J. Biochem., 24:161-168, 1966)을 응용하여 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산의 미백 효과를 평가하였다. 각 시료를 하기 표 4에 표시된 농도로 2㎕씩 넣은 후, 0.1M 인산완충액(potassium phosphate buffer, pH 6.5) 185㎕, 2000U 머쉬룸 티로시나아제 15㎕을 섞어 183㎕씩 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후 L-티로신 용액 15㎕를 첨가하고 37℃에서 5 내지 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제에 대한 저해율을 측정하였다. 상기 티로시나아제 활성 저해 시험에서 음성 대조군은 시료 대신 시료를 용해시키기 위해 이용한 용매 DMSO만을 첨가하여 같은 방법으로 측정하였다. 양성 대조군은 코직산을 40㎍/㎖ 농도로 처리하여 같은 방법으로 측정하였다. 하기 식을 이용하여 티로시나아제 활성의 저해율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

티로시나아제 활성 저해율(%) = 100-(각 시료의 흡광도/음성대조군의 흡광도 x 100)

표 4. 티로시나아제 활성의 저해

시료		티로시나아제 활성 저해율 (%)
코직산 (40㎍/㎖ 양성 대조군)		74
3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산	20㎍/㎖	34
	40㎍/㎖	55

(5) 인 비보 티로시나아제 활성 저해 시험

본 실시예에서는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 의 인 비보 티로시나아제 활성 저해 시험을 통해 미백 효과를 평가하였다.

B16F10 멜라노마를 10% 우혈청과 1% 항생제(페니실린 스트렙토마이신, Lonza)를 첨가한 DMEM에 현탁시킨 후, 조직배양용 배지를 담은 6-웰 플레이트의 각 웰에 상기 세포현탁액을 5×10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 5시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 하기 표 5에 표시된 농도로 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 용액을 처리하여 72시간 동안 배양했다. 대상 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 원심 분리하여 세포를 회수하고 세포용해 용액 (PBS + TritonX-100)으로 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해액을 원심분리하여 수득한 세포 용해물 80㎕에 L-도파 20㎕를 넣고 37℃에서 5 내지 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제에 대한 저해율을 측정하였다. 상기 인 비보 티로시나아제 활성 저해 시험에서 음성 대조군은 시료 대신 시료를 용해시키기 위해 이용된 DMSO를 넣은 것을 제외하고는 동일한 방법으로 처리하였다. 양성 대조군은 알부틴을 100㎍/㎖ 농도로 처리한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 처리하였다. 하기 식를 이용하여 인 비보 티로시나아제 활성 저해율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 표시하였다.

인 비보 티로시나아제 활성 저해율 (%) = 100 - (각 시료의 흡광도/음성대조군의 흡광도 x 100)

표 5. 인 비보 티로시나아제 활성 저해

시료		티로시나아제 활성 저해율 (%)
알부틴 (100㎍/㎖, 양성 대조군)		51
3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산	5㎍/㎖	26
	10㎍/㎖	43

(6) 갈색 기니아 피그(Brown guinea pig)에 대한 피부미백 활성 확인

갈색 기니아 피그는 사람과 같이 자외선, UV, 알레르기 반응 등에 의해 색소침착이 발생하는 동물이다. 갈색 기니아 피그는 털과 피부의 빛깔이 동일하기 때문에 털의 빛깔이 균일하게 갈색인 것을 고르면 제모한 뒤에 광범위한 부위를 피부에 대한 활성 시험을 위해 사용할 수 있다. 하기에 기재된 방법으로 색소 침착을 유발하고, 그 색소 침착 부위에 미백제를 도포하는 방법에 의해, 색소 침착의 개선 효과를 평가할 수 있다. 또한, 이 방법에 의해 색소 침착의 개선 효과가 확인된 물질은 사람의 자외선 색소 반에서의 평가에도 효과가 나타날 확률이 높기 때문에 일차 인 비보 활성 시험으로 유용하게 사용될 수 있다.

① 자외선 색소반의 형성

자외선(UVB)에 의한 색소침착의 유발은, 갈색 기니아피그의 배후의 털을 제거한 피부에 3×3cm의 정방형의 개구부가 6개 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착시킨 후, SE 램프(파장 290∼320nm, Toshiba)로 자외선(UVB)을 1,350 mJ/㎠ 조사하였다. 조사 후, 알루미늄 호일을 벗겨내고, 하기의 도포법으로 시험물질의 미백효과를 평가하였다. 자외선 조사 후 색소 침착은 2 내지 3일 후에 나타나며, 약 1 내지 2주 후에 정점에 도달한다. 생성된 자외선 색소반의 색조가 동일하며 얼룩이 생기지 않는 것이 중요하고, 자외선 색소반의 형성이 좋지 않은 개체는 좋은 결과를 위해 쓰지 않는 편이 좋다.

② 미백제의 도포

자외선 조사 후 미백제의 도포는 색소 침착이 정점에 도달하는, 즉 색소 침착이 유발된 후 약 10일 후에 시작하였다. 도포 횟수는 l일 1회 또는 2회로 하여, 30일간 도포를 계속하였다. 도포 물질은 표 6의 시험물질을 부형제(프로필렌글리콜:에탄올:정제수=5:3:2의 혼합용매)에 누적 자극이 나타나지 않는 농도로 용해시킨 것으로, 면봉으로 도포하며 도포 부위와 구별되는 다른 부위에 부형제만을 도포하여, 이를 대조군으로 하였다.

③ 효과의 판정

Chroma Meter CR-400(Minolta, Japan)을 사용하여 피부의 흑백 정도를 측정함으로써, 미백 효과를 판정하였다. 색을 표시하는 데에는 L^* a^* b^* 표색계를 사용하였으며, 본 실시예에서는 주로 L^*값을 지표로 사용하였다. L^*값은 정해진 백판으 로 교정하며, 측정은 1개 부위당 5회 이상 측정하여 색소 침착부를 균등하게 측정한다. 도포 시작 시점과 완료 시점의 피부색의 차이(△L^*)를 하기 식에 따라 계산하여, 이를 표 6에 나타내었다. 미백 효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L^* 의 비교로 판정하는데, △ L^* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소에 대한 미백 효과가 우수한 경우이고, 1.5 정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

△L^* = 도포 30일 후의 L^* 값 - 도포 개시할 때의 L^*값

표 6. 갈색 기니어 피그에서의 피부미백 효과

시료 (2%)	미백 효과 (△L^*)
부형제 (비히클, 음성대조군)	0.77
알부틴 (양성대조군)	1.09
3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산	2.13

실시예 3. 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 피부미백용 조성물

상기 실시예 1의 방법에 의해 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산과 통상적인 방법으로 제조한 화이트닝 크림 조성물을 준비하였다. 준비된 미백용 크림 조성물 100g에 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 1g 혼합하여 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 미백 활성 물질로 포함하는 미백용 크림 조성물을 제조하였다. 대조군는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 제외한 나머지 성분만으로 동일한 방법 에 의해 미백용 크림을 제조하였다.

상기에서 제조된 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 시험군 미백용 크림 및 대조군 미백용 크림의 피부미백효과 및 피부자극을 평가하기 위하여, 하기와 같이 관능시험을 실시하였다.

건강한 남녀 20명을 대상으로 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 시험군 미백용 크림과 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하지 않은 대조군 미백용 크림을 일반적인 사용방법에 따라 3개월 동안 사용하여 피부자극 및 미백 효과를 평가하게 하였다. 특히 피부의 미백효과는 대조군 크림을 기준으로 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산을 포함하는 크림이 나타내는 미백효과를 상대적으로 평가하게 하였다, 관능평가는 매우 우수(5점), 우수(3점), 보통(0점), 나쁨(-3점), 매우 나쁨(-5점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 표시하였다. 하기 표 7에서 피부자극 항목은 피부자극이 없는 정도를 나타낸다.

평가항목인 피부자극은 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 등의 현상에 대한 평가이며, 미백효과는 상대적으로 피부의 맑아짐 및 밝아짐 정도에 대한 평가이다.

표 7. 피부미백 및 자극에 대한 관능 시험

	피부자극		미백효과 (대조군 크림 대비 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 함유 크림의 효과)
	3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 함유 크림	대조군 크림
1	4	5	4
2	4	5	5
3	4	4	5
4	5	4	3
5	4	4	4
6	4	5	4
7	4	3	4
8	4	4	4
9	3	4	4
10	5	5	5
11	5	4	4
12	3	4	4
13	4	5	4
14	4	5	4
15	4	3	4
16	4	3	5
17	3	5	4
18	5	5	3
19	4	4	5
20	5	4	5
평균	4.1	4.25	4.25

상기 표 7에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21 오익산을 포함하는 미백용 크림에 대한 피부자극 평가점수는 4.25점으로 매우 우수하게 평가되어, 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21 오익산을 포함하지 않는 대조군과 마찬가지로 피부자극 정도가 낮아 피부 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 대조군 대비 본 발명에 따른 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21 오익산을 포함하는 미백용 크림의 상대적인 피부미백효과는 평가점수 4.25점으로 대조군 대비 미백효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

도 1은 미백 활성 물질로 처리한 후 수득된 세포 펠렛의 색을 보여준다. A는 DMSO 처리 대조군이고 B는 양성 대조군인 알부틴 100㎍/㎖ 처리군, C는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 1.0㎍/㎖ 처리군, D는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 2.5㎍/㎖ 처리군, E는 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산 5.0㎍/㎖ 처리군을 나타낸다.

Claims

3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산(3-β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-4-oic acid)을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산(3-β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-4-oic acid)은 복령피로부터 추출되고 정제된 것인 피부미백용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산(3-β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-4-oic acid)은 복령피로부터 물, 에탄올, 메탄올 및 부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매를 이용하여 추출되는 것인 피부미백용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3-베타-히드록실라노스타-7,9(11),24-트리엔-21-오익산은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 내지 10 중량%의 양으로 포함되는 것인 피부미백용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부미백용 조성물은 화장 수, 크림, 팩, 파운데이션, 및 메이크업 베이스로 구성된 군으로부터 선택되는 제형인 것인 피부미백용 조성물.