KR101001821B1 - 동물 유전자형 판별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 DNA 마아커의 존재에 대해(이들 유전자 자체의 서열 내에 존재하는 DNA 마아커는 제외됨) 소과 동물의 DNA를 시험하므로써, 이러한 동물의 우유가 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자 또는 단백질 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 지니는 지를 측정하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 단백질 β-카제인 A2 및 β-카제인 A1에 대한 DNA 마아커로서 SNP를 사용한다.

Description

동물 유전자형 판별 방법 {ANIMAL GENOTYPING METHOD}
본 발명은 유전자 자체에 대해 유전자형을 판별하는 것이 아니라, 물리적 형질의 변화를 결정하는 유전자의 영역에서 유전자형을 판별하고, 동물이 상기 유전자의 영역내의 DNA와 관련하여 유전자의 특정 변이체를 지니는 지의 여부를 결정함으로써 동물의 물리적 형질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 소과 동물이 β-카제인 A1 단백질에 대한 유전자 또는 β-카제인 A2 단백질에 대한 유전자를 지니고, 이로써 젖소가 우유에서 β-카제인 A1 또는 β-카제인 A2를 생성할 수 있는 능력을 지니는 지의 여부를 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
소비자들은 유제품 및 육류 제품과 같은 상품을 구매하는 경우에 고품질 및 저렴한 가격을 요구한다. 그러나, 많은 소비자들은 생산물 및 생산 시스템이 인체 건강에 대한 이점은 최대화하고 위험은 최소화하도록 다루어지며, 또한 환경 및 동물의 복지에 대해 해롭지 않다는 보장을 원한다.
동물의 유전학이 생산 및 생산물 품질, 및 보건, 환경 및 동물 복지 문제에 대해 상당한 영향을 미친다는 것은 널리 공지되어 있다. 유전학 시험을 이용함으로써 동물의 표현형을 측정할 수 있는 능력은 유익한 특성을 지닌 동물 및 동물 생산물을 신속히 확인해주고, 향상된 생산 및/또는 생산물 품질을 지닌 동물의 군을 형성하기 위한 유용한 도구이다. 동물은 경제적으로 이로운 동물 또는 동물 생산물 특성과 관련된 유전적 차이에 기초하여 그룹화될 수 있다. 낙농 업계의 경우, 중요한 특성의 예는 우유 생산량, 우유 단백질 함량, 지방 생산량, 및 건강과 관련된 우유의 특정 성분들이며, 예를 들어 β-카제인 A1 단백질의 부재 또는 포화 지방의 비율이다.
전형적인 유전자 시험으로, 관심의 물리적 형질과 관련된 단백질 또는 단백질의 군을 엔코딩하는 유전자의 DNA 서열은 공지될 것이다. DNA 샘플은 동물로부터 수득되며, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, DNA 단편 분석 및 데이터 처리의 조합을 이용하여 동물의 게놈내의 유전자에 대한 공지된 위치에 존재하는 DNA를 동정한다. 고도로 자동화된 시험은 유전자 또는 유전자 변이체의 존재, 이로써 물리적 형질을 나타낼 수 있는 능력이 다수의 동물에 대해 비교적 신속하고 효율적으로 결정될 수 있게 해준다.
동물의 특정 물리적 형질을 담당하는 유전자는 단일 누클레오티드 다형 (SNP)에 의해 확인될 수 있다. SNP는 동물의 게놈내의 특정 위치에 있는 DNA 서열이 또 다른 동물의 게놈내의 동일한 위치에 있는 DNA 서열과 하나의 누클레오티드만이 상이한 DNA 서열이다. 이와 같은 작은 차이가 어떤 동물은 특정한 물리적 형질을 나타내는 반면 또 다른 동물은 그렇지 않음을 의미할 수 있다.
SNP가 중요한 한 가지 예는 우유에서 β-카제인 단백질을 생성할 수 있는 젖소의 유전적 구성이다. 전형적으로, 젖소는 우유에서 β-카제인을 생성한다. 그러나, A1, A2, A3, B, C, D, E 및 F를 포함하는 몇몇 β-카제인 변이체가 알려져 있다. A2, A3, D, E 및 F 변이체와 A1, B 및 C 변이체 사이의 한 가지 차이점은 전자 그룹이 β-카제인 단백질의 67번 위치에서 프롤린 잔기를 지니는 반면, 후자 그룹은 67번 위치에서 히스티딘 잔기를 지닌다는 것이다. 이러한 차이점은 β-카제인 유전자의 코딩 영역의 200번 위치에서 누클레오티드 시토신에 의한 누클레오티드 아데닌의 치환에 의해 결정된다. 따라서, 동물의 β-카제인 단백질을 엔코딩하는 SNP를 동정하고 시험함으로써 두 그룹의 β-카제인 변이체를 구별하는 것이 가능하다.
인간 식이 중의 β-카제인 A1의 존재가 특정 질병, 특히 당뇨병 (Elliott, R. B., Harris, D. P., Hill, J. P., Bibby, N, J., Wasmuth, H. E., Type I (Insulin-Dependent) Diabetes Mellitus and Cow Milk: Casein Variant Consumption, Diabetologia 1999; 42:292-6; Wasmuth, H. E., Rosenbauer, J., Elliot, R. B., McLachlan, C., Erhardt, G., Giani, G., Kolb, H., β-Casein A1 Consumption and Incidence of Type 1 Diabetes in Germany. Kongress der Europaeischen Diabetesgesellschaft vom 28.-30.09.1999 in Bruessels/Belgium. Proceedings published in Diabetologia 42 (Suppl.1): A88; 1999) 및 관상동맥 심장병 (McLachlan, C.N. (2001) β-Casein A1, Ischaemic Heart Disease Mortality, and Other Illnesses.Med.Hypotheses 56(2):262-72)의 발병과 관련있음을 나타내는 다수의 보고서가 존재한다.
젖소의 우유에서 생산되는 β-카제인 변이체 또는 변이체들을 동정함으로서 젖소의 표현형을 결정하는 것 외에, 젖소가 특정 β-카제인 변이체를 생산하는 능력을 갖는지의 여부에 대한 정보를 제공하는 SNP를 동정함으로써 젖소의 유전자형을 판별하는 것이 공지되어 있다. β-카제인 A1 변이체가 존재하지 않으며 바람직하게는, 단지 β-카제인 A2 변이체만 존재하는 우유를 생산하는 우유 개체군 (milking herd)을 형성하기 위해 표현형을 기초로하여 젖소를 선택하는 방법은 PCT/NZ96/00039 (공개번호 WO 96/36239)에 기술되어 있다.
연구들은 SNP 또는 기타 DNA 변이 (탄뎀(tandem) 반복, 삽입-결실)가 질병, 동물 생산물의 품질, 또는 생산 이익을 예측하는데 가치가 있음을 보여주고 있다. 그러나 유전적 선택이 동물을 분류하거나, 가려내거나, 교배시키는데 사용되는 경우에, 단일 SNP 또는 형질의 사용을 기초로 한 선택 전략은 최적이 아니다. 이는 β-카제인 유전자 내의 SNP와 같은 SNP가 주변 DNA와 무작위적으로 관련되기 때문이다. 표현형이 결정된 SNP를 둘러싸는 DNA의 영역은 물리적 형질에 영향을 미치는 하나 이상의 기능을 엔코딩할 것이다. 그러므로 단일 SNP를 기초로 한 선택은 관심을 갖는 형질 외에 다른 형질을 부주의하게 선택할 수 있다.
본 발명자들은 유전자의 DNA를 동정하지 않고 β-카제인에 대한 유전자가 위치한 동물의 게놈의 영역에서 SNP 또는 반수체형(haplotype) (SNP의 조합)을 동정함으로써 소과 동물이 β-카제인 A1 단백질에 대한 유전자 또는 β-카제인 A2 단백질에 대한 유전자를 갖는지의 여부를 측정할 수 있음을 발견하였다.
그러므로, 본 발명의 목적은 동물의 β-카제인 유전자에 대한 동물의 표현형을 결정하는 방법을 제공하거나, 적어도 공지된 방법에 대한 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 발명의 기술
본 발명의 제 1 양태에서, 소과 동물이 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자 또는 단백질 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 갖는지의 여부를, 각각의 유전자 중에 하나의 DNA 마아커의 존재에 대한 거이 아닌 각각의 유전자에 대한 하나 이상의 DNA 마아커의 존재에 대해 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 DNA 마아커 각각은 단일 누클레오티드 다형 (SNP), 탄뎀 반복, 또는 삽입-결실을 나타낸다. 바람직하게는, 하나 이상의 DNA 마아커는 SNP를 나타낸다.
상기 방법이 황소 또는 젖소에 대한 β-카제인의 유전자형을 판별하기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명의 소과 동물은 바람직하게는, 젖소이다.
동물의 물리적 형질은 동물로부터 생산된 생산물의 품질 또는 양에 영향을 미치는 임의의 형질일 수 있거나, 동물의 질병 또는 질환, 또는 질병 또는 질환의 방지에 관한 것일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 형질은 우유 단백질 또는 우유 지방의 양 또는 조성을 포함하여, 소과 젖소로부터 우유를 생산하는 것에 관한 것이다. 하나 이상의 물리적 형질은 β- 또는 κ-카제인 변이 함량, 유장 함량, 단백질 함량, 지방 함량, 지방산 프로필, 컨쥬게이팅된 리놀레산 함량, β-락토글로불린 함량, 락토페린 함량, 체세포 수, 일일 우유 수율, 지방 수율, 단백질 수율, 및 우유, 지방 및 단백질의 최대 수유 수율을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서 물리적 형질은 소과 젖소의 우유 중에 β-카제인 A2의 존재 또는 부재에 있다. 대안적인 구체예에서, 물리적 형질은 젖소의 우유 중에 β-카제인 A1의 존재 또는 부재에 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 DNA 마아커는 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자에 대한 마아커이다. 본 발명의 대안적인 구체예에서 하나 이상의 DNA 마아커는 β-카제인 A2를 엔코딩하는 유전자에 대한 마아커이다.
시험 동물의 DNA는, 유핵 세포를 함유하거나 함유하였던 동물의 조직 바람직하게는, 동물의 혈액, 정액, 털 또는 젖으로부터 수득할 수 있다.
바람직하게는, SNP를 Bos taurus 소과 동물의 염색체 6으로부터 유도하였다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 DNA 마아커는 소과 동물의 β-카제인 단백질에 대한 유전자 영역에서 8개 SNP 군이다.
본 발명의 제 2 양태에서, 하기 단계를 포함하여, β-카제인 A1을 사실상 함유하지 않는 우유를 생성시키는 방법을 제공한다:
a) 하나 이상의 소과 젖소가 본 발명의 제 1 양태에 따른 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자 또는 단백질 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 갖는지의 여부를 측정하는 단계;
b) 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자를 갖는 않은 젖소를 선택하는 단계; 및
c) 선택된 젖소로부터 우유를 짜내는 단계.
바람직하게는, 이러한 방법에 의해 생성된 우유는, 사실상 모두 β-카제인 A2인 β-카제인을 함유하는 우유이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 각각의 젖소로부터 DNA를 시험하므로써 소과 젖소떼를 형성시키고, β-카제인 A2를 엔코딩하는 유전자는 가지나, β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자는 갖지 않는 젖소를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 제 1 양태의 방법에 따라 시험한 소과 젖소로부터 수득된 우유를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 우유를 함유하거나 이로부터 처리된 음식물 또는 식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 또는 처리되었던 동물로부터의 정액 또는 수정란을 제공한다. 바람직하게는, 정액 또는 수정란은 인공 재생 기술을 이용하여 자손을 생성시키는데 사용된다.
본 발명은 사용자가 유전적 차이에 기초하여 동물로부터 유래된 조직(예컨대, 혈액, 정자, 털 또는 젖), 또는 가축 집단을 분류시킬 수 있게 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이들 유전적 차이는 SPN 또는 SPN의 조합이다. 이러한 SPN의 용도, 및 사용자가 동물 집단을 분류가능하게 하는 것은 동물 표현형을 예상하는데 또한 이용될 수 있다.
우유 생성과 관련된 형질의 예로는 우유 수율, 우유 단백질 조성, 우유 지방의 양을 포함하며, 더욱 특이적 형질 예컨대, β-카제인 변이의 존재, 포화 지방 및 불포화 지방의 비, 및 우유에 존재하는 체세포의 수를 포함한다.
변이 카제인은 이들 단백질의 전반적 서열에 있어서 소수의 아미노산 변화에 의해 구별된다. 소과 가축에서, β-카제인의 A2와 A1간의 차이는 이들 단백질의 67번 위치에서 프롤린에서 히스티딘으로의 아미노산 단일 변화의 차이다. 관련 SNP는 Bos taurus 소과 동물의 염색체 6에서 발생한다.
기타 β-카제인 변이체가 67번 위치에서 프롤린과 상반되는 히스티딘을 갖지만, 이들은 일반적으로 중요하지 않은 변이이며, 본 발명을 설명하는데 있어서 이는 일반적으로 β-카제인 A1으로 간주된다. 유사하게는, 67번 위치에서 프롤린을 갖는 β-카제인 A2 이외에 이들 β-카제인 변이체는 일반적으로 중요하지 않은 변이이며, 일반적으로 β-카제인 A2로 간주된다.
가축 또는 가축으로부터 유래된 조직이 배타적으로 β-카제인의 A1 변이체(A1 동질접합체성), 배타적으로 A2 변이체(A2 동질접합체성), 또는 배타적으로 A1과 A2 변이체의 혼합물(A1/A2 이형접합체성)을 코딩하는 유전자를 갖는지의 여부가 측정될 수 있다. 이에 의해, β-카제인 A1을 단독으로, β-카제인 A2를 단독으로, 또는 이들 카제인 변이체 양자의 혼합물을 함유하는 우유를 생산하는 젖소를 선별할 수 있다. 또한, 이에 의해 β-카제인 A1을 단독으로, β-카제인 A2를 단독으로, 또는 이들 카제인 변이체 양자의 혼합물을 함유하는 우유를 생산하는 능력을 갖는 자손을 산출할 수 있는 것으로 젖소를 선별할 수 있다.
이러한 측면에서, 특정 물리적인 형질을 갖는, 예를 들어 β-카제인 A1 단백질이 존재하지 않거나, β-카제인 변이체의 β-카제인 A2만이 존재하는 것과 같은 특징을 갖는 우유를 생산하는 젖소떼가 형성될 수 있다.
본 발명의 부가적인 특징은, 일단 특정의 유전자형 또는 반수체형을 갖는 동물을 선택하고 이로부터 우유가 생산되기만 하면, 우유의 기원, 또는 우유 분말 및 가공 유제품과 같은 기타 생산물은 선택된 동물로부터 생산된 것으로서 입증될 수 있다는 점이다. 이는, 정말로 상기 우유가 목적하는 표현형 또는 반수체형 그룹의 동물로부터 비롯된다는 확신을 소비자에게 제공한다는 이점을 갖는다.
구체적으로, 본 발명자들은 SNP가 β-카제인 단백질 유형의 지표인 β-카제인 유전자 외부 영역에서 용이하게 동정될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이러한 SNP는 또한 β-카제인 대립 유전자와 연관된 건강상의 위험에 대한 지표, 또는 잠재적인 원인물질 또는 부분적인 원인물질이 된다. 8개의 SNP를 갖는 젖소 집단이동정되고 분석되었다. 이러한 SNP는 β-카제인을 엔코딩하는 유전자를 포함하는 젖소의 카제인 유전자 클러스터로부터 유래한다. 이러한 영역의 DNA는 약 200 내지 300 킬로베이스의 DNA로 구성된 것으로 추정된다. 상이한 개체 중에서 무작위적으로 연관된 이러한 8개의 SNP 중에서, 2 내지 28개의 가능한 조합체(또는 반수체형)의 이론적 수가 예상될 것이다. 놀랍게도, 이러한 SNP 및 이들 SNP의 서브셋을 사용하여 확인된 반수체형의 수는 무작위적일 것으로 예상되는 것보다 훨씬 더 적다. 따라서, 단지 소수의 SNP를 사용하여 젖소 집단을 반수체형 그룹으로 정확하게 분류하는데 SNP 사이의 특이적 연관의 발견을 적용할 수 있다. 이들 반수체형을 α-S1, α-S2, β- 및 κ-카제인 우유 단백질 변이체의 본질(identity)과 같은, 개체 또는 집단에서의 특이적 표현형을 예측하는데 사용할 수 있다는 점이 보다 중요하다.
SNP 반수체형과 생산 및 생산물 품질 특성 사이의 연관성을 조사하였다. 우유에 대해 특이적인 이들 특성에는, β- 또는 κ-카제인 변이체, 유당 %, 단백질 %, 지방 %, 지방산 프로파일 (C4 내지 C22), 컨쥬게이팅된 리놀렌산 함량 (CLA), 융점, β-락토글로불린 함량, 락토페린 함량, 체세포 수, 일일 우유 생산량, 지방 함량, 단백질 함량, 우유의 완전 유산염(full-lactation) 생산량, 지방 및 단백질과 연관된 특징이 포함된다.
카제인 영역의 반수체형과 생산 및 생산물 품질 특성, 예컨대 체세포 수, 지방 %, 단백질 %, β-카제인 생산량 및 지방산 프로파일 사이에는 현저한 연관성이 존재함이 확인되었다.
인접한 DNA 마아커와, 집단화된 이들 마아커 (즉, 반수체형)의 조합체 사이의 비무작위적인 연관성, 및 이들 마아커 및 반수체형과 물리적 형질사이의 관련성에 대한 정보는 하기와 같은 잠재적인 이점을 갖는다:
1. 단일 마아커에 기초하여 동물을 선택하는 선택 과정은 요망되지 않은 물리적 형질의 부주의한 증폭을 방지하거나 최소화시키도록 변형되는데, 이는 표현형에 대해, 알려지거나 알려지지 않은 영향에 대한 연관된 유전자 정보를 공동 선택함으로써 야기될 수 있다.
2. 게놈(반수체형)의 영역 내에서 SNP 대립 유전자의 특이적 조합을 동정하면, 상기 영역 내에서의 임의의 단일 SNP와 동등하거나 이보다 양호한 생산물 품질의 지표가 제공된다.
3. SNP 대립 유전자의 서브셋을 동정하면, 알려지거나 알려지지 않은 SNP의 보다 큰 그룹 내에서의 변형이 효율적으로 예측된다.
4. 어떤 이유에 있어서든 그 자체로는 유전자형이 판별될 수 없는 SNP의 본질이 유용한 정확도로 예측된다.
5. 게놈 영역내의 아직까지 발견되지 않은 신규한 DNA 변이체가 전형적으로 속하게 되는 상기 게놈 영역 내에서 일어나는 주요 연관성 그룹을 동정한다.
본 발명에 의해 SNP를 동정할 수 있게 되며, 하기와 같은 목적으로 SNP 및 SNP 반수체형을 사용할 수 있게 된다:
1. 최소의 SNP 시험을 사용하여, 특이적인 α-카제인 및/또는 β-카제인 및/또는 κ-카제인 변이체를 생산하는 동물을 효과적으로 선택하고, 분류하거나 그룹화시킬 수 있는 수단을 제공한다. 특히, 카제인 변이체와 연관된 유전자형 및 표현형은 소수의 연관된 SNP의 유전자형을 판별함으로써 얻어질 수 있다. 다수개의 유전자형 또는 표현형, 또는 시험이 불가능한 유전자형에 결합되는 연관된 마아커를 사용하면, 경제적이고 기술적인 이점을 제공할 수 있다.
2. 카제인 영역으로부터의 임의의 단일 SNP와 동등하거나 그 이상의, 젖소의 성능, 및 이에 따른 생산물 품질과 젖소 또는 젖소의 자손으로부터 생산된 우유의 건강에 대한 효과를 예측한다.
3. 최소수의 마아커를 사용하여 젖소 집단에서의 카제인 유전자 내 다량의 변이체를 분류함으로써, 예측된 성능 또는 생산물 품질에 따라 젖소를 분류하거나 그룹짓는 효율적인 수단을 제공한다.
4. 연관된 카제인 내 변이체 빈도의 변경을 최소화시키면서, 특이적인 카제인 유형 (예를 들어, β-카제인 A2)을 선택하는 효율적인 수단을 제공한다.
5. 특이적 집단 내 β-카제인 A2 동물의 비율을 동시에 증가시키면서, 다른 카제인 유전자 또는 연관된 형질을 선택하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명은 SNP 및 이 SNP가 어떻게 사용될 수 있는지를 발견하기 위한 과정 을 증명하는 하기 실시예를 참고하여 보다 자세하게 설명된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 평가된다. 당해 분야에서의 당업자는 이러한 과정이 일반적으로 동물의 게놈에서 유용한 SNP를 발견하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예
실시예 1: 집단에서 SNP의 동정
많은 개별적인 소로부터 αs1, αs2 및 β-카제인 유전자에서의 DNA 서열을 결정하고 분석하여 SNP를 동정하였다. 상기 서열을 비교하여 다형성 서열의 동정을 할 수 있었다.
올리고누클레오티드 프라이머 서열번호: 1 내지 서열번호: 14를 고안하고 합성하였다. 이러한 서열은 Bos taurus αs1(기탁번호 제 X59856호) 및 αs2(기탁번호 제 M94327호)서열의 공개된 서열을 기초로 하였다. 각 프라이머쌍을 또한 고안하여 생성된 PCR 생성물이 근접 말단에서 Xho1 및 EcoR1 제한 효소(restriction endonuclease)를 갖도록 하였다. PCR 증폭의 조건을 적당한 프라이머 쌍에 대하여 최적화하였다:
서열 번호: 1, 서열 번호: 2
서열 번호: 3, 서열 번호: 4
서열 번호: 5, 서열 번호: 6
서열 번호: 7, 서열 번호: 8
서열 번호: 9, 서열 번호: 10
서열 번호: 11, 서열 번호: 12
서열 번호: 13, 서열 번호: 14
이러한 결과로부터 αs1 유전자의 엑손 1-2 및 엑손 3-6 및 αs2 유전자의 엑손 1-2 및 17-18에 상당하는 DNA 영역이 예상된 크기의 PCR 생성물을 제공하는 지를 측정하였다.
생식 게놈 DNA를 이전에 유전자형화하고 β-카제인 단백질의 A1 변이체 또는 A2 변이체의 운반체인 것으로 입증된 소로부터 정제하였다. DNA를 5마리 A1 동질접합체성 (A1 DNA) 동물 및 5마리 A2 동질접합체성 동물로부터 동일몰 농도중에서 혼합한 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. A1 DNA 및 A2 DNA로부터의 증폭된 PCR 생성물을 하이 퓨어 PCR 프러덕트 퓨리피케이션 키트 (High Pure PCR Product Purification Kit)로 정제하고 EcoR1 및 Xho1 제한 효소로 분해하고 상기 효소를 70℃에서 20분 동안 가열하여 열불활성화시켰다. 각각의 이러한 샘플의 일부를 이전에 Xho1 및 EcoR1 제한 효소로 분해시킨 플라스미드 pBluescript KS(스트라타젠: Stratagen)으로 결찰시키고 슈림프 알칼리 포스파타아제(아멀샴 파마샤 바이오텍 인크.: Amersham Pharmcia Biotech Inc.)로 처리하고 마지막으로 70℃에서 20분 동안 열불활성화시켰다.
결찰된 플라스미드를 사용하여 컴피턴트 E.coli 종 XL1-Blue를 화학적으로 형질전환시켰다. A1 또는 A2 DNA로부터 유래된 삽입물을 함유하는 개별 콜로니를 콜로니 PCR로 분석하였다. αs1 유전자 영역에 있어서, 엑손 3-6(A1 또는 A2 DNA로부터 각 3) 및 엑손 1-2(A1 DNA로부터 유래된 5 및 A2 DNA로부터 유래된 5)를 서열분석하였다. αs2 유전자 영역에서 엑손 1-2(A1 또는 A2 DNA로부터 각 5) 및 엑손 17-18(A1 및 A2 DNA로부터 유래된 5)에 걸친 영역으로부터 플라스미드를 서열분석하였다. 이러한 서열을 비교하여 다형성 서열 및 누클레오티드의 동정을 할 수 있었다. 상기의 다형성 서열의 예를 서열번호:15 내지 28에서 수득하였다.
실시예 2: 예측 도구로서 SNP의 용도
서열을 Wisconsin Package Version 10.2, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wisc.로부터의 프로그램을 사용한 정렬에 의하여 분석하였다. 놀랍게도, 분석에 의해 많은 SNP가 A1 동물을 A2 동물과 구분하는데 용이하게 이용될 수 있다는 것을 밝혔다. A1 동질접합체성 동물 및 A2 동질접합체성 동물의 α2 유전자로부터 유래된 서열의 정열은 상기 서열에서의 많은 SNP가 직접 A1 또는 A2에 연결되었다는 것을 밝혔다. 따라서, 도 1에서 도시하는 바와 같이, A1 동질접합체성 동물 및 A2 동질접합체성 동물로부터의 5개 풀링된 DNA의 αs2 유전자로부터 유래된 삽입물을 함유한 총 10개의 플라스미드를 pBluescript 플라스미드에서 t7 및 t3 프리아머 부위로부터 양방향으로 서열분석을 하였다.
서열을 프로그램, 겔스타트 (Gelstart), 겔엔터 (Gelenter), 겔머쥐 (Gelmerge) 및 겔어셈블리 (Gelassemble)를 사용하여 정렬시켰다. 겔어셈블리로부터 결과를 도 1에 도시하였으며, 여기서 P1 내지 P5-82_t3 또는 t7로부터 서열을 A1 동질접합체성 젖소떼로부터 수득하고 P6 내지 P10-82_t3 또는 t7의 서열을 A2 동질접합체성 소떼로부터 수득하였다. 컨센스 서열 또한 이러한 정렬에 제공되어 있다. 다중 차이 또는 다형성이 상이한 개체로부터 서열사이에서 발생하였다. 많은 이러한 차이는 개체간에 발생하는 단일 결실 또는 단일 누클레오티드 염기 차이에 있다. 서열에서 컨센서스 서열의 제 1 염기로부터 연속적으로 판독되는 664, 926, 및 1377 위치에서 3개 SNP는 단지 A1 동물 서열에서 각각 구아닌(G), 티민(T) 및 T를 가졌다. 반대로, A2 동물 서열에서는 아데닌(A), G, 및 시토신(C)이 서열의 상기 위치에서 각각 발생하였다. 664, 926 및 1377 위치에서 3개 SNP를 굵은 글씨로 도시하고 밑줄을 그었다. EcoR1(GAATTC) 및 Xho1(CTCGAG) 제한 효소 인식부위를 또한 굵은 글씨로 도시하였다.
이러한 누클레오티드의 동정은 시퀀싱 이외의 방법, 특히 중합효소 연쇄 반응과 같은 게놈 서열-특이적 증폭 기술과 조합하여 사용되는 기술에 의해 측정될 수 있다[참조: Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273(1986); Erlich H. et al., EP 50,424; EP 84,796, EP 258,017, EP 237, 362; Mullis, K., EP 201,184; Mullis K. et a., US 4,683,202; Erlich, H., US 4,582,788; and Saiki, R. et al., US 4,583,194]. 이러한 방법의 예로는 외부핵산가수분해효소 내성 방법(US 4,656,127), DNA 중의 다형 부위를 검정하기 위한 프라이머 유도 누클레오티드 혼입 절차(Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784(1989); Sokolov, B.P., Nucl. Acids Res. 18: 3671(1990); Syvanen, A.C., et al., Genomics 88:684-692(1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88:1143-1147(1991); Prezant, T.R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164(1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112(1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175(1993)), "올리고누클레오티드 리게이션 검정(Oligonucleotide Ligation Assay)"("OLA")(landegren, U. et al., Science 251: 1077-1080(1988)), 피로시퀀싱(pyrosequencing)(Kittles et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001 Sep; 10(9): 943-7) 및 매스어레이(MassARRAY)(Sequenom Corp.)를 포함한다.
실시예 3: 교대 유전자형 판별법을 사용하여 유전자형 또는 표현형을 예측하기 위한 SNP의 용도
본 실시예는, 실시예 2에서 사용된 것보다 큰 집단에서 SNP의 동정이 DNA 시퀀싱 외의 다른 방법으로 측정될 수 있으며, 이러한 SNP가 유전자형 또는 표현형을 예측하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 특히, PCR 증폭, 프라이머 연장 및 시쿼놈 매스 스펙트로스코피 장치(Sequenom Mass Spectroscopy apparatus)로의 프라이머 연장 생성물의 최종 분석을 기초로 하는 방법을, 동물, 또는 동물로부터 유래된 조직이 우유 β-카제인 유전자의 A1(또는 반대로 A2) 변이체를 엔코딩하는 유전자의 한 또는 두개의 복사체 중 어느 하나 또는 두개의 복사체를 함유하는 지를 예측하는데 사용하였다.
공지된 이형접합체성 A1A2 동물로부터의 정액을 젖소에 인공 수정시키는데 사용하였다. DNA 샘플(우유로부터)을 아비로부터, 그리고 이러한 교배 자손으로부터 단리시켰다. 표현형으로 또는 유전자형으로 A1 또는 A2인지 이들 자손을 각각 동정하였다. 총 71마리의 자손을, 시쿼놈 인코포레이티드(Sequenom Inc.)로부터의 표준 절차에 의해 AC00069, AC00070, AC00055, AC00057, AC00058, AC00059, AC00060, AC00061, AC00063, 및 AC00074(서열 목록 참조)로 결합된 SNP에 대해 분석하였다. 이러한 SNP 이외에, 우유 단백질 변이체 β-카제인 A 또는 B의 동정을 측정하는 마아커 AC000069 및 AC000070 또한 유전자형을 판별하였다.
완전 유전자형을 갖는 개개로부터 유전자형을 분석하여 이들의 반수체형(haplotype)을 유도하였다(즉, 마아커의 조합 및 조직화로 이들 마아커가 염색체를 물리적으로 발생시킴). 초기에, 패키지 크리맵(Crimap)을 사용하여 비정상에 대한 SNP를 체크하였으며, 이때 상기 어미 및 두개의 아비 반수체형이 프로그램 심웍(Simwalk)으로 유도되었다. A1 또는 A2 β-카제인 우유 표현형을 측정하는 SNP를 포함하는 이들 SNP의 분석으로부터의 반수체형이 표 1에 기재된다.
표 1: 젖소 개체의 유도된 반수체형
Figure 112004055109480-pct00001
두개의 아비 반수체형 및 36개의 어미 반수체형으로 이루어진, 총 38개의 반수체형이 유도되었다. 그러나, 보다 면밀히 관찰하면, 이들 동물과 관련된 특이적인 반수체형은 단지 18개이다. 보다 중요하게는, 이들 SNP 또는 보다 구체적으로 이들 SNP의 작은 서브셋은 A1 또는 A2 유전자형을 갖는 동물들을 구별하는데 사용될 수 있다. 이러한 연구는, 36마리의 동물 및 아비에서, 이들 동물의 신원이 한마리 를 제외한 모두를 성공적으로 유도하는데(즉, 97%의 정확도) 단지 하나의 SNP(AC00061)의 유전자형 판별을 필요로 함을 보여주었다. 추가의 두개의 SNP(AC00059 ALC AC00063)의 유전자형 판별은, 상기 집단의 모든 동물이 A1 또는 A2 유전자형 및 표현형인지에 비추어 성공적으로 동정될 수 있도록 한다.
표 2: β-카제인 유전자 외측 마아커의 반수체형에 의한 β-카제인 유전자형의 예측
Figure 112004055109480-pct00002
본 발명이 상기 실시예에 의해 기술되어 있지만, 본 발명의 범주로부터 출발하지 않고 변형 및 변경이 이루어질 수 있음은 자명하다. 추가로, 특이적인 특징에 대해 공지의 등가물이 존재하는 경우, 이러한 등가물은 본 명세서에서 구체적으로 언급되어 있는 것으로 포함된다.
서열 목록
Figure 112004055109480-pct00003
Figure 112004055109480-pct00004
Figure 112004055109480-pct00005
Figure 112004055109480-pct00006
Figure 112004055109480-pct00007
SEQUENCE LISTING <110> A2 Corporation <120> Animal Genotyping Method <130> GL223484/62 <140> PCT/NZ03/00102 <141> 2003-05-23 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 tgcctcgagt acttgtcttc cttttagg 28 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 cttgaattct ttgcaagggc aacag 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 3 aaggaattcg taaggaacgc aaa 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 4 tcactcgagg agagctgctc tctg 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 5 tgactcgaga agaaaagaat cgcct 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 6 agtgaattcc agaatcttaa agg 23 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 7 agactcgagc acagatttcc agttcta 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 8 aaagaattca cttgaaattt tattctcag 29 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 9 tcacctcgag catcaaccca gctt 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 10 gatgagaatt ctcatggttg tcaaga 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 11 atcctctcga gcaccaagga ctcc 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 12 tgctgaattc attgaccttc tcctta 26 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 13 actgaaagaa ttcaaagtac cccagctg 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 14 ggcctcgagt ccctctttca tactgtg 27 <210> 15 <211> 300 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 15 ctaatatata tattgtagtc tcattccttc cttctctagt aaacagccag tttcacattc 60 gctgaggtgt aatatcttca actattgagc tgaatattga tctgytctca caaacctttt 120 tagagaagag ggcatttgga cttacatatt tatgattaat aaaaatttta ttatgcaaga 180 gcagtagtta aacagaatat gtatatgtgg tctattttac tgtattattg attctttcta 240 tctcttctcc ttgcactcaa acatatgatt tacaacttga tctcaattta cacactgagt 300 <210> 16 <211> 300 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 16 ctaatatata tattgtagtc tcattccttc cttctctagt aaacagccag tttcacattc 60 gctgaggtgt aatatcttca actattgagc tgaatattga tctgctctca caaacctttt 120 tagagaagag ggsatttgga cttacatatt tatgattaat aaaaatttta ttatgcaaga 180 gcagtagtta aacagaatat gtatatgtgg tctattttac tgtattattg attctttcta 240 tctcttctcc ttgcactcaa acatatgatt tacaacttga tctcaattta cacactgagt 300 <210> 17 <211> 300 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 17 actgacagct taaataaaga aaacttagca aggagataat acaagaaata atattgcaaa 60 aaatattagt gcattcacaa aaagcatatt tattttttaa tttgcagcag caaaatgtaa 120 gatacatttc tttttttttt tttttgatgg aatgaaaaaa aattttatta tattcatttt 180 ctccatttta tgttttaagg ttaacatttt atctytacta tcttgcatta tcaaatgaca 240 actcagaaat gcaagcttaa aagaggaatt ggtaaagtgg agaaagctgt gcagttctgt 300 <210> 18 <211> 410 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 18 aaaattgagg taagtggcta tatataatga acttatttca aaaatttaaa ttataaaatt 60 taatatattt atcatcttat tttaaaacat tgtcattatg aaatgcttat aaagtgaatg 120 tcatgtgcat tatcctgtaa gaggaaacaa gaatatctgg gattctttag taggaatgat 180 aaattaataa caaaagcagg caatgctaat cttaagacag agaataattc ccatgcatac 240 acattctcta aatttgcaca ggcaaagatc accagcaaat ttaacaattt tgagtcaaat 300 aaaatcttgc tgtttaaaaa taattgattt 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attttgttgt gttaatttct tcttgtaaag aactcatcgt 180 attcaaatcc atgtgtttct caatgaatct acttttatca gtcttcattg cccttttcta 240 attatctgaa gataatttaa tacataatta atgaggaaat gtgtgattat aaggagagta 300 aaactgttat taattagctt cttgtctatc tcacaggaca aagyaaacat gaagttcttc 360 atctttacct ccttttgctg ttg 383 <210> 21 <211> 367 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 21 caaacataag tcctaaagta agtcctttca gataattaga aataggctaa gcaaagcaat 60 ggcaaagaaa aaaaaaaaag gtataaaact gatagaaaaa tgacaaaaga aacagagaaa 120 ccaaaactgc aagtcagttt taaagaattt aataatttta gcratttctt aacgtatcag 180 cccattgtca ttttgcataa tgattttgtt ttattaaaat ctagatttca attaggttaa 240 agggttttag gtgcaggaag caataacatt ttatgtttaa taagttattt agaaaataag 300 aataattaaa tgttccttca aagttgctga agtgtaaata tttaccactt tataaataaa 360 tattaat 367 <210> 22 <211> 528 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 22 ctgcaagtca gttttaaaga atttaataat tttagcaatt tcttaacgta tcagcccatt 60 gtcattttgc ataatgattt tgttttatta aaatctagat ttcaattagg ttaaagggtt 120 ttaggtgcag gaagcaataa cattttatgt ttaataagtt atttagaaaa taagaataat 180 taaatgttcc ttcaaagttg ctgaagtgta aatatttacc actttataaa taaatattaa 240 trctactttt atttgttggg ttaaagaaac tggctatcag ttttcactca aacagtaaat 300 tatttcacaa acagttatta aaatcctacc atgtgctaag ttatcatact gaacactaga 360 aaatattaat aatagttaca aataatagca ttttggatac atgtatatgc atggctgaat 420 ccctttgctg ttcacttgaa actaccacaa cattgttaat caaatatatc ccaatacaaa 480 ataaatttta aagtttgaaa aaaataataa cattctgcta aactagta 528 <210> 23 <211> 744 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 23 ctgcaagtca gttttaaaga atttaataat tttagcaatt tcttaacgta tcagcccatt 60 gtcattttgc ataatgattt tgttttatta aaatctagat ttcaattagg ttaaagggtt 120 ttaggtgcag gaagcaataa cattttatgt ttaataagtt atttagaaaa taagaataat 180 taaatgttcc ttcaaagttg ctgaagtgta aatatttacc actttataaa taaatattaa 240 tactactttt atttgttggg ttaaagaaac tggctatcag ttttcactca aacaktaaat 300 tatttcacaa acagttatta aaatcctacc atgtgctaag ttatcatact gaacactaga 360 aaatattaat aatagttaca aataatagca ttttggatac atgtatatgc atggctgaat 420 ccctttgctg 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Claims (25)

  1. 단백질 β-카제인 A1를 엔코딩하는 유전자 및 단백질 β-카제인 A2를 엔코딩하는 유전자 중 어느 하나에 대한 하나 이상의 DNA 마아커의 존재에 대해서 소과 동물의 DNA를 시험하므로써, 이러한 동물이 상기 β-카제인 A1 유전자 또는 β-카제인 A2 유전자를 지니는 지를 측정하는 방법으로서, 하나 이상의 DNA 마아커가 단백질 αS2-카제인을 엔코딩하는 유전자내에 위치한 SEQ ID No:21의 SNP AC000061인 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, SEQ ID No:19의 SNP AC000059, SEQ ID No:23의 SNP ACOOOO63, 또는 둘 모두의 존재에 대해 시험하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 소과 동물이 젖소임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 하나 이상의 DNA 마아커의 존재가 젖소에 의해 얻어진 우유 중의 β-카제인 A1의 존재 또는 부재와 연관됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 하나 이상의 DNA 마아커의 존재가 젖소에 의해 얻어진 우유 중의 β-카제인 A2의 존재 또는 부재와 연관됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 하나 이상의 DNA 마아커가 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자에 대한 마아커임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 하나 이상의 DNA 마아커가 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자에 대한 마아커임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 소과 동물의 DNA가 유핵 세포를 함유하는 소과 동물의 임의의 조직으로부터 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 동물의 DNA가 동물의 혈액, 정액, 털 및 젖으로부터 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
  13. 베타-카제인 A1을 실질적으로 함유하지 않는 우유를 생성하기 위한 방법으로서,
    a) 제 1항에 따라 한 마리 이상의 젖소가 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자 또는 단백질 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 지니는 지를 측정하는 단계;
    b) 단백질 β-카제인 A1을 엔코딩하는 유전자를 지니지 않는 젖소를 선택하는 단계 및
    c) 선택된 젖소에서 우유를 짜내는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 우유가 실질적으로 전부 β-카제인 A2인 β-카제인을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1항의 방법에 따라 각각의 젖소의 DNA를 시험하고 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 지닌 젖소와 β-카제인 A2을 엔코딩하는 유전자를 지니지 않은 젖소를 선택하므로써, 젖소떼를 형성하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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