KR100935904B1 - 항바이러스성 약물의 말레산 단일염 및 이를 함유하는약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 말레산 단일염 및 그의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

피발레이트 유도체, 항바이러스성 약물, 말레산 단일염, 안정성

Description

항바이러스성 약물의 말레산 단일염 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 {A MALEIC ACID MONOSALT OF ANTIVIRAL AGENT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME}

본 발명은 하기 화학식 1의 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트 말레산 단일염 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1의 유리 화합물, 즉 산이 부가되지 않은 화합물은 대한민국 특허등록 제 0441638호 및 국제특허공개 WO02/057288 호에 개시된 새로운 항바이러스 물질이다. 이 유리 화합물은 현재 임상 단계의 연구가 진행 중에 있으며 항 바이 러스 작용에 탁월한 효과를 보이고 있고, 특히, B형 간염 바이러스(HBV) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)로 부터 선택된 바이러스 감염에 대해 탁월한 효과를 나타내고 있다. 그러나, 이 유리 화합물은 열과 수분에 불안정한 단점이 발견되어 완제 의약품을 개발하는데 어려움에 직면하였다.

이러한 문제점을 타개하기 위하여 여러 방면으로 모색하던 중, 본 발명자들은 화학식 1의 말레산 단일염이 결정성을 가지며, 용해도가 우수하고, 조해하지 않을 뿐 아니라 열에 대한 안정성이 월등히 개선되었다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 화학식 1의 말레산 단일염을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 말레산 단일염을 함유하는 약제학적 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트 말레산 단일염은 수분 및 열에 대한 안정성이 우수하며, pH 변화에 따른 용해도가 일정하여 HBV 및 HIV와 같은 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 유효성분으로 장기간 고품질을 유지할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트 말레산 단일염을 제공한다.

[화학식 1]

본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, “화학식 1의 말레산 단일염”은 그의 유리 화합물(즉, 화학식 1의 말레산 단일염의 유리 화합물) 1 당량에 대하여 말레산이 0.7 내지 1.3 당량, 바람직하게는 0.9 내지 1.1 당량, 보다 바람직하게는 1 당량의 비율로 염을 형성하고 있는 것을 나타낸다.

화학식 1의 말레산 단일염은 그의 유리화합물과 말레산을 유기용매의 존재하에 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (참고: Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Donald C. Monkhouse et al, 1, 66(1), 1977 및 Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, Philip L. Gould, 201, 33, 1986).

구체적으로 화학식 1의 말레산 단일염은 유리 화합물을 용매 ㎖ 당 유리 화 합물 50 내지 1000㎎의 비율로 유기용매에 용해시킨 후 여기에 하기 언급한 양의 말레산을 첨가(바람직하게는 적가)하고 교반하여 고체를 생성하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 유기용매는 염 생성에 사용될 수 있는 통상의 유기용매 중에서 제한 없이 선택될 수 있지만, 바람직하게는 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아세토니트릴, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 메틸에틸케톤, 이소프로필아세테이트, 다이옥산, 노말헥산, 사이클로헥산, 디에틸에테르, t-부틸에테르 및 그의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된다. 또한, 첨가되는 말레산의 양은 특별히 제한되지는 않으나, 유리 화합물 1 당량을 기준으로 0.7 내지 1.3당량, 바람직하게는 0.9 내지 1.2 당량, 보다 바람직하게는 1.0 내지 1.1 당량으로 사용하는 것이 좋다. 생성된 고체에 대해 여과, 세척, 건조와 같은 통상적인 후처리 과정을 수행할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 화학식 1의 말레산 단일염은, 바람직하게는 결정성의 고체로 얻어진다. 즉, 본 발명의 말레산 단일염은 독특한 결정구조를 가질 수 있는데, 바람직하게는, 분말 X선 회절도에서 2Θ= 5.6, 12.1, 17.5 및 20.9° (2Θ, +/- 0.2)에서 유의성 있는 피크를 나타내고, 특히 바람직하게는, 2Θ= 5.6, 10.0, 12.1, 13.1, 17.5, 18.8, 20.9, 22.8, 24,3, 25,1 및 26.5° (2Θ, +/- 0.2)의 회절각을 특징적으로 나타내는 결정 구조를 갖는다(도 1참조). 시차주사 열량도 (10℃/분)에서 이 결정의 용융점 흡열 피크 시작점은 129℃이다(도 2 참조).

본 발명에 따른 화학식 1의 말레산 단일염은 그의 유리 화합물이나 기타 염들에 비해 용해도가 우수하고, 조해하지 않을 뿐만 아니라, 열 및 수분에 대해 안 정하고, 결정성 고체로 얻을 수 있는 등 완제 의약품 개발에 적합한 물리화학적 특성을 나타낸다.

후술하는 실험예를 통해서 자세히 설명하겠지만, 항 바이러스 치료제로 개발된 화학식 1의 유리 화합물은 열과 수분에 대해 매우 불안정하여 약제학적 조성물의 원료로 사용되기 힘든 화합물이었고 이에 따라 약물 개발과정이 어려움에 직면하게 되었다. 따라서 이를 극복하기 위한 시도가 필요하였으며, 본 발명자들은 이러한 목적의 일환으로 유리 화합물로부터 약제학적으로 허용되는 여러 종류의 염을 제조하였다. 이 과정에서 일부 염들은 결정성 고체로 얻기가 힘든 것으로 밝혀졌고, 말레산염, p-톨루엔설폰산염, 메탄설폰산염, 나프탈렌설폰산염, 및 에탄설폰산염을 결정성 고체로 얻는데 성공하였다. 이에 유리 화합물과 결정성 고체로 얻어진 여러 염들에 대해 고온에서 안정성 시험을 한 결과, 말레산 단일염을 제외한 유리 화합물 및 기타 염들은 열에 대해 매우 불안정하였다. 말레산 단일염은 60℃ 고온에서도 8주까지 분해가 거의 되지 않은 반면 유리 화합물은 8주 후에 약 1 % 정도만 남고 대부분 분해되었고 기타 결정성 염들도 2주 이내에 대부분 분해되었다. 즉, 본 발명에 따른 말레산 단일염은 그의 유리 화합물이나 다른 유기염들에 비해 월등히 개선된 열 안정성을 나타낸다. 또한 기타 염들은 결정성 고체로 얻는 것이 쉽지 않았으나 말레산 단일염은 상기 설명한 방법에 따라 용이하게 결정성 고체로 얻어졌으며 따라서 대량 생산이 가능하였다.

또한, 본 발명의 말레산 단일염은 pH에 따른 용해도가 현저히 개선되었다. 구체적으로 화학식 1의 유리 화합물은 pH 2 이하의 낮은 pH에서는 36 mg/ml 이상의 높은 용해도를 보이지만 pH가 높아질수록 용해도가 급격히 떨어져 체액의 pH와 유사한 pH 6 이상에서는 용해도가 1 mg/ml 이하로 된다. 이러한 특성으로 인해, 화학식 1의 유리 화합물은 위에서 대부분 녹아 흡수될 수 있지만, 장기로 이동하면서pH가 높아지면 서서히 침전이 발생할 위험을 가지고 있다. 하지만 본 발명에 따른 말레산 단일염은 pH 2 내지 pH 6.5에서 7 mg/ml 내지 3 mg/ml 정도의 비교적 일정한 용해도 경향을 보이고 있으며, pH 6.5에서도 유리 화합물에 비해 3배 이상 높은 용해도를 보인다. 이는 약효적인 측면에서 말레산 단일염이 체내에 더 많이 흡수되며 흡수된 후에도 pH의 변화에 따라 체내에서 침전될 위험을 배제할 수 있음을 시사한다. 즉, 본 발명에 따른 말레산 단일염은 pH에 따른 용해도가 그의 유리 화합물에 비해 현저히 개선되었다.

이상 설명한 바와 같은 물리적, 생리학적 특성으로 인해 본 발명의 말레산 단일염은 바이러스 감염의 예방 또는 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 화학식 1의 말레산 단일염; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 바이러스는 HBV 및 HIV로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.

화학식 1의 말레산 단일염을 유효 활성성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 있어서, 바람직한 투여 형태는 경구투여이며, 경구 투여를 위한 바람직한 제형으로는 정제 또는 캡슐을 예로 들 수 있다.

활성성분으로 사용되는 화학식 1의 말레산 단일염의 “치료학적으로 유효한 양”은 환자의 성별，연령，질병의 정도，영양 상태 등의 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 임상적으로 용이하게 결정될 수 있을 것이다.

화학식 1의 말레산 단일염을 유효성분으로 사용하는 약제학적 조성물의 약리효과, 유효량 범위, 투여 방법에 대해서는 그의 유리 화합물 및 효과를 개시하고 있는 문헌(대한민국 특허등록 제 0441638호 및 국제특허공개 WO02/057288호)을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예와 실험예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예와 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예로 한정되는 것은 아니다.

HPLC 측정을 위한 조건

3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트 유리 화합물 및 그 염들의 양을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 측정하였다. 자세한 측정 조건은 다음과 같다.

컬럼: Waters Symmetry Shield C18 (4.6 X 250 mm, 5㎛)

컬럼온도: 30℃

유속: 1.0 ㎖/분

검출파장: UV 309 nm

용리액: A. 테트라히드로퓨란 / 물 = 3/ 7

B. 테트라히드로퓨란 / 물 = 8/2 (v/v, 기울기 용리)

시간에 따른 용리액의 비율표:

열량측정기 분석을 위한 조건

시차주사열량측정기 (Differential Scanning Calorimetry) Mettler Toledo DSC821를 사용하였다. 알루미늄팬에 시료 2~5㎎을 담은 뒤 알루미늄 뚜껑을 덮고, 압력을 가해 밀폐시키는 기구를 이용해 밀폐시킨 후 구멍을 뚫은 후 측정하였다. 10 ℃/분의 속도로 상온에서 250 ℃까지 가열하였다.

X-선 회절분광기 분석을 위한 조건

약 20 mg의 시료를 시료 홀더에 채워 Philips x-ray generator (PW1710) 에 장착한 후 3 ~ 40°/2 θ의 범위에서 회절 패턴을 얻었다. 자세한 분석 조건은 아래와 같다.

Time per step : 0.5

Stepsize : 0.03

Scan Mode : step

Voltage/ Current : 40 kV /30 mA

2θ/θ Reflection

Cu-target (Ni-filter)

Source Slit : 1.0 mm

Detector Slits : 0.15 mm, 1.0 mm

비교예 1: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 유리 화합물

문헌(참조: 대한민국 특허등록 제 0441638호 및 국제 특허공개 WO02/057288)에 공지된 방법에 따라 표제화합물을 제조하였다.

실시예 : 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 말레산 단일염

비교에 1에서 얻은 유리 화합물 100 mg을 에틸아세테이트 1 ml에 녹인 후 1 당량의 말레산을 첨가하고 한 시간동안 교반하면 고체가 생성되었다. 수득한 고체를 여과하여 에틸아세테이트로 세척한 후 건조하여 111.4 mg (91.3 % 수율)의 말레산 단일염을 결정성 고체의 형태로 얻었다.

함량: 99.3 %

시차주사열량도 : 129 ℃ (흡열 : 111 J/g)

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.64 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.62 (m, 4H), 4.37 (s, 2H), 4.17 (d, 2H), 1.20 (s, 18H), 0.99 (m, 4H).

분말 X선 회절 분석에서의 2세타 (2Θ, +/- 0.2) 회절각 : 5.6, 10.0, 12.1, 13.1, 17.5, 18.8, 20.9, 22.8, 24.3, 25.1 및 26.5°

비교예 2: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 말레 산 삼염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 5 g을 에틸아세테이트 50 ml에 녹인 후 3 당량의 말레산을 첨가하고 12 시간 교반한 후 노말헥산 20 ml를 첨가하면 고체가 생성되었다. 수득한 고체를 여과하여 노말헥산으로 세척한 후 건조하여 6.52 g (78.6 % 수율)의 말레산 삼염을 얻었다.

함량: 98.7 %.

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.70 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 6.31 (s, 6H), 5.62 (m, 4H), 4.38 (s, 2H), 4.17 (d, 2H), 1.20 (s, 18H), 0.99 (m, 4H).

비교예 3: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 p-톨루엔설폰산 단일염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 100 mg을 에틸아세테이트 1 ml에 녹인 후 1 당량의 p-톨루엔설폰산을 첨가하고 한 시간동안 교반하면 고체가 생성되었다. 수득한 고체를 여과하여 에틸아세테이트로 세척한 후 건조하여 106.4 mg (78.2 % 수율)의 p-톨루엔설폰산 단일염을 얻었다.

함량: 99.43 %.

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.74 (s, 1H), 8.57(s, 1H), 7.68 (d, 2H), 7.20 (d, 2H), 5.59 (m, 4H), 4.37 (s, 2H), 4.14 (d, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.13 (s, 18H), 0.98 (m, 4H).

비교예 4: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 p-톨루엔설폰산 이염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 5 g을 에틸아세테이트 50 ml에 녹인 후 2 당량의 p-톨루엔설폰산을 첨가하고 한 시간동안 교반하면 고체가 생성되었다. 수득한 고체를 여과하여 에틸아세테이트로 세척한 후 건조하여 7.01 g (81.5 % 수율)의 p-톨루엔설폰산 이염을 얻었다.

함량: 97.8 %.

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.77 (s, 1H), 8.61(s, 1H), 7.71 (d, 4H), 7.23 (d, 4H), 5.62 (m, 4H), 4.40 (s, 2H), 4.17 (d, 2H), 2.37 (s, 6H), 1.20 (s, 18H), 0.99 (m, 4H).

비교예 5: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 메탄 설폰산 단일염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 100 mg을 에틸아세테이트 1 ml에 녹인 후 1 당량의 메탄설폰산을 적가하고 한 시간 교반하면 고체가 생성되었다. 수득한 고체를 여과하여 에틸아세테이트로 세척한 후 건조하여 95.2 mg (80.6 % 수율)의 메탄설폰산 단일염을 얻었다.

함량: 97.6 %.

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.79 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 5.60 (m, 4H), 4.38 (s, 2H), 4.14 (d, 2H), 2.70 (s, 3H), 1.17 (s, 18H), 1.01 (m, 4H).

비교예 6: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 나프 탈렌설폰산 단일염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 5g을 에틸아세테이트 30 ml에 녹인 후 1 당량의 나프탈렌설폰산 1.97g을 5ml의 물에 녹여 적가한 후 저어주면서 15시간 경과하면 용매를 감압하에 모두 제거하였다. 잔류물에 에탄올과 디에틸에테르를 첨가하면 흰색의 결정이 석출되었다. 수득한 고체를 여과하여 에탄올과 디에틸에테르의 혼합액으로 세척한 후 건조하여 6.2 g (90.0 % 수율)의 나프탈렌설폰산 단일염을 얻었다.

함량: 91.4 %.

¹H NMR (CD₃OD) : δ 8.48 (s, 2H), 8.44 (s, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.83 (m, 3H), 7.50 (m, 2H), 5.63 (m, 4H), 4.23 (s, 2H), 3.95 (d, 2H), 1.18 (s, 18H), 1.01 (m, 4H).

비교예 7: 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일) 메틸 ] 사이클로프로필 } 옥시 ) 메틸 ]-8,8-디메틸-3,7- 디옥소 -2,4,6- 트리옥사 -3λ5- 포스파논 -1-일- 피발레이트의 에탄 설폰산 단일염

비교예 1에서 얻은 유리 화합물 5g을 에틸아세테이트 30 ml에 녹인 후 1 당량의 에탄설폰산 (1.05g)을 첨가하여 모두 녹이고 1시간 정도 저어준 후 용매를 감압하에 모두 제거하였다. 남아있는 잔류물에 에탄올, 디에틸에테르 및 노말 헥산을 첨가하면 흰색 결정이 석출되었다. 수득한 고체를 여과하여 에탄올과 디에틸에 테르의 혼합액으로 세척한 후 건조하여 5.0 g (82.8 % 수율)의 에탄설폰산 단일염을 얻었다.

함량: 90.0 %.

¹H NMR (CDCl₃) : δ 8.60 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 5.63 (m, 4H), 4.32 (s, 2H), 4.00 (d, 2H), 2.92 (m, 2H), 1.29 (m, 3H), 1.19 (s, 18H), 1.01 (m, 4H).

실험예 1: 열과 수분에 대한 안정성 비교 시험 1

실시예에서 수득한 말레산 단일염, 비교예 1 내지 5에서 수득한 유리 화합물 및 염 30~70 mg을 각각 유리 용기에 넣고 40±2℃, 75±5% RH에 보관하였다. 1주, 4주 및 8주 후에 시료를 5 mg 씩 취하여 테트라히드로퓨란:물 = 1:1 용액에 녹이고 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 정리하였다.

[표 1]

화학식 1의 말레산 단일염, 그의 유리 화합물 및 기타 염들에 대한 40℃/75%RH에서의 안정성 결과 (잔류함량, %).

표 1의 결과로부터 알 수 있듯이, 화학식 1의 말레산 단일염은 그의 유리 화합물 및 기타 염에 비해 열에 대한 안정성이 현저히 우수하였다. 말레산 단일염과 유리 화합물의 안정성 결과를 그래프로 도 3에 나타내었다.

실험예 2: 열과 수분에 대한 안정성 비교 시험 2

실시예에서 수득한 말레산 단일염, 비교예 1 및 비교예 6 내지 7 에서 수득한 유리 화합물 또는 기타 염을 각각 약 5~6 mg씩 여러 개의 유리용기에 넣고 60 ℃에 보관하였다. 1주 또는 2주, 4주, 8주 후에 각각 유리 용기 한 개에 들어있는 시료를 테트라히드로퓨란:물 = 1:1 용액에 녹인 후HPLC를 이용하여 분석하였고 그 결과를 하기 표2에 정리하였다.

[표 2]

화학식 1의 말레산 단일염, 그의 유리 화합물 및 기타 염들에 대한 60℃에서의 안정성 결과 (잔류함량, %).

표 2의 결과는 화학식 1의 말레산 단일염이 그의 유리 화합물 또는 기타 염들에 비해 고온 조건에서 현저히 우수한 열안정성을 나타냄을 보여준다.

실험예 3: 여러 pH 에서의 용해도 시험

실시예에서 수득한 말레산 단일염 및 비교예 1에서 수득한 유리 화합물을 각각 약 5~23 mg씩 유리병에 넣고, 특정 pH 를 갖는 여러 종류의 인산 완충용액 및 인산 수용액을 각각 500㎕ 씩 넣었다. 유리병을 25℃ 항온수에서 한 시간 반 동안 교반한 후 여과하여 여과액의 함량을 HPLC로 분석하고 그 액의 pH를 측정하였다. 측정한 pH와 그에 따른 말레산 단일염과 유리 화합물의 용해도를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

화학식 1의 말레산 단일염과 유리 화합물의 pH에 따른 용해도 (mg/ml)

실험예 4: 말레산 단일염 및 유리 화합물의 활성 및 세포독성 시험

1) 세포배양 및 화합물 처리

B형 간염바이러스를 생산하는 세포주인 HepG_{2 2.2.15} 세포 (M. A. Shells, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005 (1987))를 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% ABAM (Antibiotic-Antimycotic), 최종농도 400㎍/ml의 제네티신 (Geneticin)을 첨가한 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Media; Life Technologies) 배지에서 배양하였다. 플라스크 내에 세포가 밀집될 때까지 배양한 후, 트립신 (Trypsin)으로 처리하여 96 웰 마이크로 플레이트에 2x10⁴/웰의 밀도로 세포를 분주하고 24시간 후 비교예 1에서 얻은 유리 화합물 및 실시예에서 얻은 말레산 단일염을 배지 200㎕ 에 최종 농도 50μΜ 부터 8nM까지 3배씩 연속 희석하는 방법으로 2일 간격으로 약물 처리 및 배지 교환을 하였다. 검체당 반복수는 2개로 하였다. 처음 약물을 처리한 지 8일후 배양액을 수집하여 100℃에서10분간 가열하여 세포를 파괴하였다. 배양액 중의 DNA 증폭 반응의 저해 물질을 최소화하기 위해 물로 10배 희석하였다. 대조군으로서 약물을 처리하지 않은 세포 배양액에 대해서도 동일한 조작을 하였다.

2) 약효분석: 실시간 PCR반응을 이용한 정량분석

상기 전처리 과정을 거친 배양액 6㎕ 를 폴리머라제 완충 용액 혼합액 (10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 200μΜ dNTP, 200nM 프라이머, 200nM 탐침, 3mM MgCl₂, 1unit AmpliTaq DNA 폴리머라제(Applied Biosystems, Foster City, CA))에 넣고 실시간 DNA증폭기(Real-time PCR machine: Rotor-gene 2000 Real-time Cycler: CORBETT Research.)를 사용하여 95℃에서3분 반응시킨 후 95℃에서 20초, 56℃에서 30초, 85℃에서 20초 반응 과정을 45회 반복하였다. 형광의 탐지는 85℃ 중합 반응 단계에서 측정하였다.

5’말단 프라이머로 5’-TCAGCTCTGTATCGGGAAGC-3’를 사용하고, 3’말단 프라이머로 5’-CACCCACCCAGGTAGCTAGA-3’(Genotech)를 사용하였고, 형광 탐침으로는 5’-6-FAM-CCTCACCATACTGCACTCAGGCAA-BHQ-1-3’(Proligo)을 사용하였다.

자동적으로 계산된 시료내 HBV DNA의 양은 약물을 처리하지 않은 시료의 값을 기준으로 하여 나머지 시료의 상대적인 값을 계산한 후 통계 프로그램인 PRISM (GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 분석하였다.

3) 세포독성 분석

약물에 의한 독성효과는 배양액을 제거한 후 0.1 mg/ml의 MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide: Sigma) 100㎕ 를 넣고, 37℃에서 2시간 동안 염색하고, DMSO (Dimethyl Sulfoxide: Sigma) 100㎕ 를 넣어 상온에서 2시간 동안 흔들어 녹인 후 540nm에서 흡광도를 조사하여 CC₅₀를 계산하였다.

상기 실험 결과 비교예 1의 유리 화합물 및 실시예의 말레산 단일염 각각에대해 얻어진 EC₅₀ 및 CC₅₀ 값을 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 시험관내(in vitro)의 세포 내 약효 실험 에서 비교예 1의 유리 화합물과 실시예의 말레산 단일염은 유사한 약효 (약 1μM) 와 세포 독성 (약 7μM)을 나타내었다.

도 1은 본 발명에 따른 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 말레산 단일염의 일 구체예의 분말 X-선 회절 분광도 (Powder X-ray Diffraction pattern)를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 말레산 단일염의 일 구체예의 시차주사열량도 (Differential Scanning Calorimeter)를 나타낸 것이다.

도 3은 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 유리 화합물; 및 그의 말레산 단일염의 일 구체예의 시간과 온도에 따른 함량 (%) 변화를 비교한 것이다.

도 4는 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 유리 화합물; 및 그의 말레산 단일염의 일 구체예의 시험관 내(in vitro)의 세포 내 항 HBV 활성 및 세포독성을 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 3-[({1-[(2-아미노-9H-퓨린-9-일)메틸]사이클로프로필}옥시)메틸]-8,8-디메틸-3,7-디옥소-2,4,6-트리옥사-3λ5-포스파논-1-일-피발레이트의 말레산 단일염.
2. 제1항에 있어서, 결정성 고체인 것을 특징으로 하는 말레산 단일염.
3. 제2항에 있어서, 분말 X선 회절 분석에서 2Θ= 5.6, 12.1, 17.5 및 20.9°의 회절각을 가짐을 특징으로 하는 말레산 단일염.
4. 제3항에 있어서, 분말 X선 회절 분석에서 2Θ= 5.6, 10.0, 12.1, 13.1, 17.5, 18.8, 20.9, 22.8, 24,3, 25,1 및 26.5°의 회절각을 가짐을 특징으로 하는 말레산 단일염.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 말레산 단일염; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 바이러스가 HBV 인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제5항에 있어서, 바이러스가 HIV 인 것을 특징으로 하는 조성물.

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