JP2010516668A

JP2010516668A - 抗ウイルス剤のマレイン酸モノ塩及びそれを含有する医薬組成物

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Publication number: JP2010516668A
Application number: JP2009546316A
Authority: JP
Inventors: リー，ジヒェ; パク，キスク; ユン，ジョンミン
Original assignee: エルジーライフサイエンスリミテッド
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: EA015269B1; AR064915A1; MX2009006826A; EA200970690A1; CL2008000070A1; BRPI0806461B1; CN101616674A; KR20080067969A; TW200836744A; CO6210809A2; ZA200904378B; US20090325904A1; BRPI0806461A2; CA2673510C; TWI384986B; CN101616674B; UA91655C2; MY163479A; WO2008088147A1; EP2124953A1

Abstract

本発明は、３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸モノ塩、及びそれを含有する医薬組成物に関する。
【選択図】図３

Description

本発明は、下記一般式（１）の３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートマレイン酸モノ塩及びそれを含有する医薬組成物に関するものである。

上記一般式（１）の化合物に相当する遊離塩基、即ち、酸と結合していない化合物は、大韓民国特許登録第０４４１６３８号及び国際特許出願公開ＷＯ第０２／０５７２８８号公報に開示された新しい抗ウイルス化合物である。この遊離塩基は、現在、臨床研究の進行中にある。遊離塩基は、特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対し、強力な抗ウイルス効果を有している。しかし、この遊離塩基は高温多湿下で不安定であり、医薬製剤として上記化合物を開発するとき、問題を引き起こしている。

本発明らは、遊離塩基が有する上記問題点を解決するために鋭意研究を行った。その研究の結果、本発明者らは、本発明の一般式（１）のマレイン酸モノ塩が結晶性特性と優れた溶解度を有することができ、吸湿性がなく、熱に対して非常に安定していること見出した。

従って、本発明の目的は、一般式（１）のマレイン酸モノ塩を提供することにある。

さらに、本発明は一般式（１）の上記マレイン酸モノ塩を活性成分として含有する医薬組成物を提供する。

図１は、本発明に係る３−[（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル]−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸モノ塩の一実施態様の粉末Ｘ線回折パターンを示す。図２は、本発明に係る３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル]−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸モノ塩の一実施態様の示差走査熱量測定法で測定した結果を示す。図３は、３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートの遊離塩基及びそのマレイン酸モノ塩の一実施態様の時間と温度による含有量（％）変化を示す。図４は、３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートの遊離塩基及びそのマレイン酸モノ塩の一実施態様のＢ型肝炎ウイルスに対するインビトロ活性及び細胞毒性の結果を示す。

本発明は、下記一般式（１）の３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートマレイン酸モノ塩を提供する。

本明細書において、特に断らない限り、用語“一般式（１）のマレイン酸モノ塩”は、その対応する遊離塩基（即ち、一般式（１）のマレイン酸モノ塩の遊離塩基）１当量が０．７〜１．３当量、好ましくは０．９〜１．１当量、より好ましくは１当量のマレイン酸と結合している塩を意味する。

一般式（１）のマレイン酸モノ塩は、その遊離塩基とマレイン酸とを有機溶媒で混合する工程を含む方法によって製造することができ、この方法は当該技術分野でよく知られている（Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Donald C. Monkhouse et al. 1, 66(1), 1977 及び Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, Philip L. Gould, 201, 33, 1986 を参照されたい）。

具体的に、一般式（１）のマレイン酸モノ塩は、溶媒１ｍＬ当たり遊離塩基を５０〜１０００ｍｇの割合で有機溶媒に溶解し、そこに、下記の量のマレイン酸を添加（好ましくは、滴下）し、撹拌して固体を生成する方法で製造することができる。有機溶媒は塩の生成のために使用可能な通常の有機溶媒から限定されること無く選択され得るが、好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチル、アセトニトリル、クロロホルム、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、酢酸イソプロピル、ジオキサン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル及びそれらの混合物からなる群から選択される。また、添加されるマレイン酸の量は、特定の量に限定されるわけではないが、1当量の遊離塩基に対して、好ましくは０．７〜１．３当量、より好ましくは０．９〜１．２当量、及び最も好ましくは１．０〜１．１当量である。得られた固体はろ過、洗浄、乾燥などのような通常的な後処理工程で処理される。

上記方法によって製造された一般式（１）のマレイン酸モノ塩は、好ましくは結晶性固体として得られる。即ち、本発明のマレイン酸モノ塩は、粉末Ｘ線回折パターンで２θ＝５．６、１２．１、１７．５及び２０．９゜（２θ、＋／−０．２）に有意なピークを示す特徴的な結晶構造を有することができる。より好ましくは、マレイン酸モノ塩は、粉末Ｘ線回折パターンで２θ＝５．６、１０．０、１２．１、１３．１、１７．５、１８．８、２０．９、２２．８、２４．３、２５．１及び２６．５゜（２θ、＋／−０．２）に特徴的なピークを示す結晶構造を有する（図１を参照されたい）。この結晶形は示差走査熱量測定（１０℃／分）において、１２９℃で溶融点吸熱開始ピークを示す（図２を参照されたい）。

一般式（１）のマレイン酸モノ塩は、吸湿性がなく、対応する遊離塩基及びそれらの他の塩に比べて優れた溶解度及び高温多湿下での安定性を有する。従って、一般式（１）のマレイン酸モノ塩の物理化学的特性は、医薬製剤の開発に適している。

後記する実験例でさらに詳しく説明されているように、抗ウイルス剤として開発された遊離塩基は高温多湿下で非常に不安定であることから、医薬製剤の原料として使用することは難しい。従って、製剤原料としての遊離塩基の開発には困難を伴った。本発明者らは、数種類の薬学的に許容される塩を製造することによって遊離塩基に関する問題を解決しようと試みた。上記製造過程で、一部の塩は結晶性固体として得ることが容易ではないことが分った。本発明者らはマレイン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、又はエタンスルホン酸との塩を結晶性固体として得ることに成功した。本発明者らは遊離塩基及び結晶性固体として得られた数種類の塩について強化された条件で熱安定性試験を遂行した。上記試験は、マレイン酸モノ塩を除いた遊離塩基及び塩が熱に対して非常に不安定であることを示した。マレイン酸モノ塩は６０℃の高温で８週間までほとんど分解されずにほとんど無傷のままであったのに対して、遊離塩基は８週間後に、わずか約1％残して、ほとんどが分解された。その他の結晶塩も２週間以内に大部分が分解された。従って、本発明に係るマレイン酸モノ塩は遊離塩基又は他の有機塩に比べて優れた熱安定性を示す。また、他の塩から結晶性固体を得ることは容易ではなかったが、マレイン酸モノ塩の結晶性固体は上記方法によって容易に得ることができた。即ち、マレイン酸モノ塩は産業的規模での生産に直ちに適用することができる。

また、本発明のマレイン酸モノ塩はｐＨのレベルに応じて、改善された溶解度も示す。具体的に、遊離塩基は、ｐＨ２又はそれ以下の低いｐＨでは３６ｍｇ/ｍＬ又はそれ以上の高い溶解度を示すが、ｐＨが高くなるにつれて溶解度が急激に低下する。即ち、ｐＨ６又はそれ以上では溶解度が１ｍｇ/ｍＬ又はそれ以下となる。このような特性によって、遊離塩基は胃内で大部分溶けて吸収されるが、化合物が高ｐＨレベルを有する臓器に移動しながら、沈澱しうる危険性がある。しかし、本発明に係るマレイン酸モノ塩は、ｐＨ２〜ｐＨ６．５の範囲で約７〜３ｍｇ/ｍＬの比較的一定の溶解度を示す。実際に、ｐＨ６．５でマレイン酸モノ塩の溶解度は遊離塩基より３倍高い。これは、薬効の側面で、マレイン酸モノ塩が体内によりたくさん吸収され、たとえｐＨが変化しても吸収された後に体内に沈殿する危険性を排除できることを示唆している。即ち、本発明に係るマレイン酸モノ塩は遊離塩基に対して異なるｐＨレベルでも優れた溶解度を示す。

上記の物理的、生理学的特性に基づいて、本発明のマレイン酸モノ塩をウイルス感染の予防又は治療のために使用することに大きな利点がある。従って、本発明は治療有効量の一般式（１）のマレイン酸モノ塩及び薬学的に許容される担体を含む、ウイルス感染を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。本発明によって最も効果的に治療されるウイルスはＨＢＶ及びＨＩＶからなる群から選択される。

一般式（１）のマレイン酸モノ塩を有効成分として含む医薬組成物の最も好ましい投与形態は経口投与であり、特に錠剤又はカプセルである。

活性成分として使用される一般式（１）のマレイン酸モノ塩の“治療有効量”は、患者の性別、年齢及び食習慣、治療する疾病の重症度などによって変わり、当業者によって容易に臨床的に決定され得る。

一般式（１）のマレイン酸モノ塩を有効成分として含む医薬組成物の薬理効果、有効用量の範囲、投与方法については、その対応する遊離塩基及びそれらの効果をそれぞれが開示している文献（大韓民国特許登録第０４４１６３８号及び国際特許出願公開ＷＯ第０２／０５７２８８号公報）を参照することができる。

以下、本発明を下記実施例と実験例に基づいてより詳しく説明するが、これらの実施例と実験例は本発明を説明することを意図していて、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。

ＨＰＬＣの測定条件
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン-９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートの遊離塩基及びその塩の含有量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。詳細な測定条件は次の通りである。

カラム：Waters Symmetry Shield Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ，５μｍ）
カラム温度：３０℃
流速:１．０ｍＬ／分
検出波長：ＵＶ３０９ｎｍ
溶離液：Ａ．テトラヒドロフラン／水＝３／７
Ｂ．テトラヒドロフラン／水＝８／２（ｖ／ｖ、勾配溶離）

示差走査熱量測定の条件
Mettler Toledo DSC821 systemを用いてＤＳＣ曲線を得た。アルミニウムのサンプルパンに試料２〜５ｍｇを入れ、窒素ガス流下で加熱速度１０℃／分で２５〜２５０℃の温度範囲にわたって加熱して、熱挙動を検討した。サンプルパンカバーはサンプルパン内部の圧力増加を避けるためにピンホールを有していた。

Ｘ線回折の条件
約２０ｍｇの試料を試料ホルダーに充填し、Philips X-ray generator (PW1710) に取り付けた。３〜４０゜/２θの範囲で試料の回折パターンを得た。詳細な分析条件は下記の通りである。

Time per step：０．５
Step size：０．０３
Scan Mode：step
Voltage/Current：４０ｋＶ／３０ｍＡ
２θ／θ反射
Cu-target(Ni-filter)
Source Slit：１．０ｍｍ
Detector Slits：０．１５ｍｍ、１．０ｍｍ

比較例１：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートの遊離塩基
大韓民国特許登録第０４４１６３８号及び国際特許出願公開ＷＯ第０２／０５７２８８号公報に記載された方法によって表題化合物を製造した。

実施例：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸モノ塩
比較例１で得た遊離塩基１００ｍｇを酢酸エチル１ｍＬに溶かした。マレイン酸（１当量）を添加し、混合物を１時間撹拌して固体を生成した。生成された固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して、マレイン酸モノ塩（１１１．４ｍｇ、収率９１．３％）を結晶性固体として得た。

含有量：９９．３％
示差走査熱量測定：１２９℃（吸熱：１１１Ｊ／ｇ）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．６４（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｓ，２Ｈ），５．６２（ｍ，４Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｄ，２Ｈ），１．２０（ｓ，１８Ｈ），０．９９（ｍ，４Ｈ）
粉末Ｘ線回折スペクトル：２θ＝５．６，１０．０，１２．１，１３．１,１７．５，１８．８，２０．９，２２．８，２４．３，２５．１及び２６．５゜（２θ，＋／−０．２）

比較例２：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸三塩
比較例１で得た遊離塩基５ｇを酢酸エチル５０ｍＬに溶かした。マレイン酸（３当量）を添加した。混合物を１２時間撹拌し、ｎ−ヘキサン２０ｍＬを加えて固体を生成した。生成された固体をろ過し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥して、マレイン酸三塩（６．５２ｇ、収率７８．６％）を得た。

含有量：９８．７％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．７０（ｓ，１Ｈ），８．４６（ｓ，１Ｈ），６．３１（ｓ，６Ｈ），５．６２（ｍ，４Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｄ，２Ｈ），１．２０（ｓ，１８Ｈ），０．９９（ｍ，４Ｈ）

比較例３：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのｐ−トルエンスルホン酸モノ塩
比較例１で得た遊離塩基１００ｍｇを酢酸エチル１ｍＬに溶かした。ｐ−トルエンスルホン酸（１当量）を添加し、混合物を１時間撹拌して固体を生成した。生成された固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して、ｐ−トルエンスルホン酸モノ塩（１０６．４ｍｇ、収率７８．２％）を得た。

含有量：９９．４３％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．７４（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，２Ｈ），７．２０（ｄ，２Ｈ），５．５９（ｍ，４Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｄ，２Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），１．１３（ｓ，１８Ｈ），０．９８（ｍ，４Ｈ）

比較例４：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのｐ−トルエンスルホン酸二塩
比較例１で得た遊離塩基５ｇを酢酸エチル５０ｍＬに溶かした。ｐ−トルエンスルホン酸（２当量）を添加し、混合物を１時間撹拌して固体を生成した。生成された固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して、ｐ−トルエンスルホン酸二塩（７．０１ｇ、収率８１．５％）を得た。

含有量：９７．８％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．７７（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，４Ｈ），７．２３（ｄ，４Ｈ），５．６２（ｍ，４Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｄ，２Ｈ），２．３７（ｓ，６Ｈ），１．２０（ｓ，１８Ｈ），０．９９（ｍ，４Ｈ）

比較例５：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのメタンスルホン酸モノ塩
比較例１で得た遊離塩基１００ｍｇを酢酸エチル１ｍＬに溶かした。メタンスルホン酸（１当量）を滴下し、混合物を１時間撹拌して固体を生成した。生成された固体をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して、メタンスルホン酸モノ塩（９５．２ｍｇ、収率８０．６％）を得た。

含有量：９７．６％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．７９（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），５．６０（ｍ，４Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｄ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｓ，１８Ｈ），１．０１（ｍ，４Ｈ）

比較例６：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのナフタレンスルホン酸モノ塩
比較例１で得た遊離塩基５ｇを酢酸エチル３０ｍＬに溶かした。ナフタレンスルホン酸（１．９７ｇ、１当量）を水（５ｍＬ）に溶かして、滴下した。混合物を１５時間攪拌した後、溶媒を減圧下で完全に除去した。残渣にエタノールとジエチルエーテルを加えて白色結晶を析出した。生成された固体をろ過し、エタノールとジエチルエーテルとの溶媒混合液で洗浄し、乾燥して、ナフタレンスルホン酸モノ塩（６．２ｇ、収率９０．０％）を得た。

含有量：９１．４％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．４８（ｓ，２Ｈ），８．４４（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ），７．８３（ｍ，３Ｈ），７．５０（ｍ，２Ｈ），５．６３（ｍ，４Ｈ），４．２３（ｓ，２Ｈ），３．９５（ｄ，２Ｈ），１．１８（ｓ，１８Ｈ），１．０１（ｍ，４Ｈ）

比較例７：
３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのエタンスルホン酸モノ塩
比較例１で得た遊離塩基５ｇを酢酸エチル３０ｍＬに溶かした。エタンスルホン酸（１．０５ｇ、１当量）を添加して、完全に溶かした。混合物を１時間攪拌した後、溶媒を減圧下で完全に除去した。残渣にエタノール、ジエチルエーテル及びｎ−ヘキサンを加えて白色結晶を析出した。生成された固体をろ過し、エタノールとジエチルエーテルとの溶媒混合液で洗浄し、乾燥して、エタンスルホン酸モノ塩（５．０ｇ、収率８２．８％）を得た。

含有量：９０．０％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），５．６３（ｍ，４Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），４．００（ｄ，２Ｈ），２．９２（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｍ，３Ｈ），１．１９（ｓ，１８Ｈ），１．０１（ｍ，４Ｈ）

実験例１：高温多湿下での安定性比較試験１
実施例のマレイン酸モノ塩、比較例１〜５の遊離塩基及び塩のそれぞれ３０〜７０ｍｇを、ガラス瓶に入れ、４０±２℃、及び７５±５％ＲＨ下で保管した。１、４及び８週間後に、それぞれの試料５ｍｇを採取し、テトラヒドロフラン／水（１／１、ｖ／ｖ）の溶媒混合液に溶かし、ＨＰＬＣを用いて分析した。その結果を下記表１にまとめた。

表１の結果から分かるように、一般式（１）のマレイン酸モノ塩は、対応する遊離塩基及びその他の塩に比べて優れた熱安定性を示した。マレイン酸モノ塩と遊離塩基の安定性結果を図３に示した。

実験例２：高温多湿下での安定性比較試験２
実施例のマレイン酸モノ塩、遊離塩基及び比較例６〜７の塩のそれぞれ約５〜６ｍｇをガラス瓶に入れ、６０℃で保管した。１又は２、４及び８週間後に、ガラス瓶に入っているそれぞれの試料を採取し、テトラヒドロフラン／水（１／１、v／v）の溶媒混合液に溶かし、ＨＰＬＣを利用して分析した。その結果を下記表２にまとめた。

表２の結果は、一般式（１）のマレイン酸モノ塩が対応する遊離塩基及びその他の塩に比べて、高温下で顕著に優れた熱安定性を示すことを明らかにしている。

実験例３: 多様なｐＨでの溶解度試験
実施例のマレイン酸モノ塩及び比較例１の遊離塩基のそれぞれ５〜２３ｍｇをガラス瓶に入れた。これに、特定のｐＨ値を有する多様なリン酸緩衝溶液及びリン酸水溶液をそれぞれ５００μＬ加えた。ガラス瓶を水中に入れて２５℃の恒温を保持し、混合物を１．５時間撹拌した。ろ過後、ろ液の含有量をＨＰＬＣで分析し、その溶液のｐＨを測定した。測定されたｐＨ値とマレイン酸モノ塩及び遊離塩基の溶解度とを下記表３に示した。

実験例４：マレイン酸モノ塩及び遊離塩基の薬理学的効果及び細胞毒性
１）細胞培養及び化合物処理
Ｂ型肝炎ウイルスを産生する細胞株であるＨｅｐＧ_{２２．２．１５}（M. A. Shells, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005 (1987)）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％ＡＢＡＭ（Antibiotic-Antimycotic）、最終濃度４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Geneticin）を含有するＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Media; Life Technologies）中で培養した。細胞が密集するまで培養した後、トリプシンで処理し、９６ウェルマイクロプレートに２×１０^４細胞／ウェルの密度で細胞を分注した。２４時間後に培地を交換して、比較例１の遊離塩基及び実施例のマレイン酸モノ塩を２００μＬの培地に最終濃度が５０μΜ〜８ｎＭになるように３倍ずつ連続希釈する方法で、２日間隔で、化合物処理を行った。全ての検体について重複して２回実施した。最初の薬物処理から８日後、培養培地を収集し、細胞を１００℃で１０分加熱して溶解した。ＤＮＡ増幅反応の阻害物質を最小化するために、培養培地を水で１０倍に希釈した。薬物で処理しない対照群の細胞培養培地についても上記と同じ方法で処理した。

２）薬理学的効果の判定：リアルタイムＰＣＲ反応を用いた定量分析
上記のように前処理した培養培地６μＬをポリメラーゼ／緩衝溶液混合物［１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μΜのｄＮＴＰ、２００ｎＭのプライマー、２００ｎＭのプローブ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA）］に加えた。リアルタイムＰＣＲ装置（Rotor-Gene 2000 Real-Time Cycler: CORBETT Research）を使用して、９５℃で３分反応させた後、９５℃で２０秒、５６℃で３０秒、８５℃で２０秒の反応を４５回繰り返した。８５℃重合反応で蛍光を検出した。

５’−末端プライマーとして５’−ＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＣ−３’を、３’−末端プライマーとして５’−ＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＡ−３’（Genotech)をそれぞれ使用し、蛍光プローブとして５’−６−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡ−ＢＨＱ−１−３’（Proligo）を使用した。

自動的に計算された試料中ＨＢＶＤＮＡの量は、薬物で処理しない試料の値に対する対象試料の相対値を計算し、統計プログラムであるＰＲＩＳＭ(GraphPad Software, Inc.）を使用して分析した。

３）細胞毒性の判定
薬物のＣＣ_５０値は培地を除去した後、残渣に０．１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide: Sigma）１００μＬを加え、３７℃で２時間染色し、ＤＭＳＯ（Dimethyl Sulfoxide: Sigma）１００μＬを加え、生成された混合物を室温で２時間撹拌して溶かし、５４０ｎｍで吸光度を測定することによって算定した。

上記実験から得られた比較例１の遊離塩基及び実施例のマレイン酸モノ塩のＥＣ_５０及びＣＣ_５０値は下記表４に示した。

表４の結果から分かるように、細胞内薬理学的活性のインビトロ試験は、比較例１の遊離塩基と実施例のマレイン酸モノ塩の両方が類似な活性（約１ｍＭ）と細胞毒性（約７ｍＭ）を示すことを明らかにした。

本発明の３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートマレイン酸モノ塩は、高温多湿下で優れた安定性を示し、異なったｐＨレベルで一定の溶解度を保持する。従って、本発明により、ＨＢＶ及びＨＩＶ感染のようなウイルス感染を予防又は治療するための医薬組成物の有効成分の高い品質を長期間保持することができる。

Claims

３−［（｛１−［（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）メチル］シクロプロピル｝オキシ）メチル］−８，８−ジメチル−３，７−ジオキソ−２，４，６−トリオキサ−３λ５−ホスファノン−１−イル−ピバレートのマレイン酸モノ塩。
結晶性固体の形態である、請求項１に記載のマレイン酸モノ塩。
その粉末Ｘ線回折パターンにおいて、２θ＝５．６、１２．１、１７．５及び２０．９゜にピークを有している、請求項２に記載のマレイン酸モノ塩。
その粉末Ｘ線回折パターンにおいて、２θ＝５．６、１０．０、１２．１、１３．１、１７．５、１８．８、２０．９、２２．８、２４．３、２５．１及び２６．５゜にピークを有している、請求項３に記載のマレイン酸モノ塩。
請求項１〜４のいずれかに記載のマレイン酸モノ塩；及び薬学的に許容される担体；を含む、ウイルス感染を予防又は治療するための医薬組成物。
ウイルスがＨＢＶである、請求項５に記載の組成物。
ウイルスがＨＩＶである、請求項５に記載の組成物。