JP7100625B2 - 置換２－ｈ－ピラゾール誘導体の結晶形、塩型及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は置換２－Ｈ－ピラゾール誘導体の結晶形、塩型及びその製造方法に関し、さらに、乳がん及びほかのがんを治療するための医薬の製造における前記結晶形及び塩型の使用に関する。

細胞周期の制御は主に一連のセリン／スレオニンキナーゼに影響される。これらのセリン／スレオニンキナーゼは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）とも呼ばれ、対応する調節サブユニットのサイクリン（ｃｙｃｌｉｎｓ）と結合し、細胞周期の進行、遺伝情報の転写、および細胞の正常な分裂増殖を促進する。ＣＤＫ４／６は、細胞周期を調節するためのキーとなる因子であり、細胞周期の成長期（Ｇ１期）からＤＮＡ複製期（Ｓ１期）への移行を誘発することができる。細胞増殖の過程では、サイクリンＤ（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ）とＣＤＫ４／６からなる複合物は、網膜芽細胞腫タンパク（Ｒｂ）をリン酸化することができる。腫瘍抑制タンパクＲｂがリン酸化されると、リン酸化されていない状態で緊密に結合している転写因子Ｅ２Ｆが離れる。Ｅ２Ｆが活性化され、さらに転写され、細胞周期が制限点（Ｒ点）を通過し、Ｇ１期からＳ期へと進行して細胞増殖の周期に入ることを促進する。したがって、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ－ＣＤＫ４／６複合物にならないように、ＣＤＫ４／６を抑制することによって、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行を阻止し、腫瘍増殖を抑制する目的を達成することができる。エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん（ＢＣ）において、ＣＤＫ４／６は高頻度に活性化されており、ＥＲシグナルの下流に位置する主要な標的である。非臨床データによれば、ＣＤＫ４／６とエストロゲン受容体（ＥＲ）シグナルを共に阻害する場合、相乗的効果を有し、且つＧ１期にあるエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん（ＢＣ）細胞の増殖を抑制できる。

ＣＤＫ４／６ターゲットは競争が激しい研究開発分野である。Ｐｉｅｔｚｓｃｈは２０１０年に、この分野の進展をまとめた（Ｍｉｎｉ－Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，１０，５２７－５３９）。また、Ｍａｌｏｒｎｉは２０１４年に最新のＣＤＫ４／６阻害剤の乳がん非臨床研究及び臨床研究の成果をまとめた（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１４，２６，５６８－５７５）。ＣＤＫ４／６ターゲットに関わる多くの研究は、一連の異なる選択的ＣＤＫ阻害剤の開発を促進し、少数でありながら、いくつかの効果的且つ高選択的ＣＤＫ４／６阻害剤の発見にもつながった。Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ（ＰＤ０３３２９９１）は、上記いくつかの効果的且つ高選択的ＣＤＫ４／６阻害剤の１つであり、ヒト臨床試験段階に入っており、女性の進行または転移性エストロゲン受容体（ＥＲ＋）、ヒト上皮成長因子受容体２陰性（ＨＥＲ２－）乳がんの治療に用いられる。２０１４年８月に、ファイザー社は、ＰＡＬＯＭＡ－１試験の中間データに基づき、ＦＤＡへｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂの新薬承認申請（ＮＤＡ）を提出した。２０１５年２月、ＦＤＡはｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂを承認した。また、ほかの２つのＣＤＫ４／６阻害剤として、Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ（ＬＹ２８３５２１９）及びＬＥＥ－０１１も第ＩＩＩ相臨床試験の被験者を募集し始めている。これら小分子の複素環化合物は、乳がん治療のみならず、ほかの様々ながん治療にも臨床的に有用である。関連特許として、ＷＯ２０１２０１８５４０、ＷＯ２０１２１２９３４４、ＷＯ２０１１１０１４０９、ＷＯ２０１１１３０２３２、ＷＯ２０１００７５０７４、ＷＯ２００９１２６５８４、ＷＯ２００８０３２１５７、ＷＯ２００３０６２２３６が挙げられる。

本発明は式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩を提供する。

本発明の一部の形態においては、上記式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩であって、式（ＩＩ）に示すとおりであり、ｘは０．５～２から選択される。

本発明の一部の形態においては、上記ｘは０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２．０である。

本発明の一部の形態においては、上記式（ＩＩ）で示される化合物は化合物ＷＸ＿１であり、ｘは０．８、０．９、１又は１．１である。

本発明の一部の形態においては、前記化合物ＷＸ＿１であって、ｘは１である。

本発明はさらに、粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を提供する。
４．６９±０．２°、１４．０４±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する。
４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２８．２５±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する。
４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１０．０１±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２３．５３±０．２°、２５．１１±０．２°、２７．８０±０．２°、２８．２５±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する。
４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１０．０１±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１６．８３±０．２°、１７．７３±０．２°、１８．５８±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２１．５８±０．２°、２３．５３±０．２°、２５．１１±０．２°、２５．２７±０．２°、２７．８０±０．２°、２８．２５±０．２°、３３．００±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、特徴的なピークのピーク位置及び強度が表１に示すとおりである。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤパターンは図１に示すとおりであり、つまり、図１に示すＸＲＰＤパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤパターンの解析データは表２に示すとおりである。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形のＤＳＣパターンは図２に示すとおりであり、つまり、図２に示すＤＳＣパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の示差走査熱量曲線が２０８．１８℃±３℃に吸熱ピークを有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形のＴＧＡパターンは図３に示すとおりであり、つまり、図３に示すＴＧＡパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ａ結晶形の熱重量分析曲線における１８８．４９±３℃での減量が０．３１１０±０．２％となる。

本発明の一部の形態においては、上記化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形であって、ｘは１である。

本発明はまた、式（Ｉ）で示される化合物とマレイン酸とを接触させることを含む式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩の製造方法を提供する。

本発明の一部の形態においては、上記化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形の製造方法は、
（１）マレイン酸と溶媒とを混合する工程、
（２）工程（１）の混合物に式（Ｉ）で示される化合物を添加する工程、
（３）濾過して乾燥する工程、
を備え、
前記溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルのうちの１種以上、及びメタノール／水の混合溶媒又はイソプロパノール／水の混合溶媒から選択され、好ましくはメタノール／水の混合溶媒である。

本発明の一部の形態においては、マレイン酸と式（Ｉ）で示される化合物とのモル比は約１～１．１：１である。

本発明の一部の形態においては、メタノール／水の体積比は約１～５０：１であり、好ましくは１～２０：１である。本発明の一部の形態においては、メタノール／水の体積比は約３：１であり、本発明の一部の形態においては、メタノール／水の体積比は約１７～１８：１である。

本発明の一部の形態においては、イソプロパノール／水の体積比は約０．５～５：１であり、好ましくは１：１である。

本発明の一部の形態においては、工程（１）は加熱下で行われる。

本発明の一部の形態においては、工程（１）の加熱温度は約６０～７０℃であり、好ましくは約６５℃である。

本発明の一部の形態においては、工程（２）では式（Ｉ）で示される化合物を添加した後に撹拌する。

本発明の一部の形態においては、工程（２）では式（Ｉ）で示される化合物を添加した後に、約６０～７０℃、好ましくは６５℃の温度下で撹拌する。

本発明の一部の形態においては、工程（３）では、濾過に先立ち、例えば２０℃への冷却を行う。

本発明の一部の形態においては、工程（３）では、必要に応じて冷却後に、例えば１５～２２時間、好ましくは１８時間撹拌してもよい。

本発明の一部の形態においては、工程（３）では、乾燥に先立ち、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン又は酢酸エチル、及びメタノール／水の混合溶媒又はイソプロパノール／水的混合溶媒から選択される溶媒、好ましくはメタノール溶媒で洗浄していてもよい。

本発明はまた、
（ａ）溶媒を４５～５５℃まで昇温し、次いで化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を溶媒に添加する工程と、
（ｂ）４５～５５℃で１～３時間撹拌する工程と、
（ｃ）冷却し、濾過し、濾過ケーキを溶媒で洗浄する工程と、
（ｄ）４８～７２時間乾燥する工程と、
を備え、工程（ａ）及び工程（ｃ）における溶媒はそれぞれ独立して、メタノール、エタノール及びイソプロパノールから選択される１種以上であり、好ましくはメタノール、エタノール又はイソプロパノールから選択される１種であり、さらに好ましくは工程（ａ）及び工程（ｃ）における溶媒はいずれもメタノールである上記化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形の精製方法を提供する。

本発明の一部の形態においては、工程（ａ）は溶媒を５０℃まで昇温し、次いで化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を溶媒に添加する。

本発明の一部の形態においては、工程（ｂ）は５０℃で１～３時間撹拌する。

本発明の一部の形態においては、工程（ｂ）は５０℃で２時間攪拌する。

本発明の一部の形態においては、工程（ｃ）の冷却温度として、３０℃まで冷却する。

本発明の一部の形態においては、工程（ｃ）は６４時間乾燥する。

本発明はまた、粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を提供する。
１２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１９．２１±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２４．１４±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する。
９．８６±０．２°、１２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１９．２１±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２４．１４±０．２°、２６．２９±０．２°、２７．６９±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する。
９．５６±０．２°、９．８６±０．２°、１１．５３±０．２°、１２．０１±０．２°、１２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１５．２１±０．２°、１５．６６±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１８．７９±０．２°、１９．２１±０．２°、１９．７６±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２２．５２±０．２°、２２．９３±０．２°、２４．１４±０．２°、２４．４７±０．２°、２６．２９±０．２°、２７．６９±０．２°、２８．４８±０．２°、２８．７９±０．２°、３０．２５±０．２°、３０．７４±０．２°、３１．６７±０．２°、３４．７９±０．２°、３５．１８±０．２°

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折パターンは、特徴的なピークのピーク位置及び強度が表３に示すとおりである。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形のＸＲＰＤパターンは図４に示すとおりであり、つまり、図４に示すＸＲＰＤパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形のＸＲＰＤパターンの解析データは表４に示すとおりである。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形のＤＳＣパターンは図５に示すとおりであり、つまり、図５に示すＤＳＣパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の示差走査熱量曲線が２２５．７６℃の付近に１つの吸熱ピークを有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の示差走査熱量曲線が２２５．７６℃±３℃に吸熱ピークを有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形のＴＧＡパターンは図６に示すとおりであり、つまり、図６に示すＴＧＡパターンで表される特徴を有する。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の熱重量分析曲線に、５２．８１℃±３℃、１８４．８２℃±３℃及び２３０．０３℃±３℃で減量がある。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の熱重量分析曲線に、５２．８１℃±３℃で、０．１３８４％の重量減少があり、１８４．８２℃±３℃では、さらに０．３５６５％の重量減少があり、２３０．０３℃±３℃では、さらに０．４０８６％の重量減少がある。

本発明の一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の熱重量分析曲線に、５２．８１℃で０．１３８４％の重量減少があり、１８４．８２℃では、さらに０．３５６５％の重量減少があり、２３０．０３℃では、さらに０．４０８６％の重量減少がある。

本発明はさらに、
（ｉ）式（Ｉ）で示される化合物を溶媒に添加し、加熱する工程と、
（ｉｉ）徐々に降温し、静置する工程と、
（ｉｉｉ）遠心分離し、乾燥する工程と、
を備える上記Ｂ結晶形の製造方法を提供する。

一部の形態においては、工程（ｉ）の溶媒はエタノール、水の１種又は２種であり、好ましくはエタノールと水の混合溶媒である。

一部の形態においては、工程（ｉ）の加熱温度は７０～１００℃であり、好ましくは８０℃である。

一部の形態においては、上記Ｂ結晶形の製造方法は、
（ｉ）式（Ｉ）で示される化合物を溶媒に添加し、７０～１００℃で０．５～２時間撹拌する工程と、
（ｉｉ）徐々に降温し、８～１６時間静置する工程と、
（ｉｉｉ）遠心分離し、８～１６時間乾燥する工程と、
を備え、
前記溶媒はエタノールと水の混合溶媒であり、エタノールと水の体積比が３：１である。

本発明の一部の形態においては、工程（ｉ）は式（Ｉ）で示される化合物を溶媒に添加し、８０℃で０．５～２時間撹拌する。

本発明の一部の形態においては、工程（ｉ）は式（Ｉ）で示される化合物を溶媒に添加し、８０℃で１時間撹拌する。

別の一側面において、本発明は、結晶組成物の重量に対して５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは９５％以上である前記化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物を提供する。

別の一側面において、本発明は、結晶組成物の重量に対して５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは９５％以上である前記式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物を提供する。

別の一側面において、本発明は、前記式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩、式（ＩＩ）で示される化合物、化合物ＷＸ＿１、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形、又は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物を含む医薬組成物であって、本発明に係る式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩、式（ＩＩ）で示される化合物、化合物ＷＸ＿１、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形、又は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物を治療有効量で含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は薬学的に許容されるアジュバントを含有してもよく、含有しなくてもよい。

別の一側面において、本発明はまた、乳がん及びほかのがんを治療するための医薬の製造における上記化合物、Ａ結晶形及びＢ結晶形の使用を提供する。

別の一側面において、本発明はさらに、ＣＤＫ４／６媒介性疾患を治療するための医薬の製造における式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩、式（ＩＩ）で示される化合物、化合物ＷＸ＿１、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形、又は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物、又はその医薬組成物の使用提供する。前記疾患はがんを含み、好ましくは乳がん又は肺がんである。

別の一側面において、本発明はまた、哺乳動物（例えば、ヒト）の疾患を治療する方法であって、前記疾患はＣＤＫ４／６媒介性疾患であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩、式（ＩＩ）で示される化合物、化合物ＷＸ＿１、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形、又は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物、又はその医薬組成物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。前記疾患はがんを含み、好ましくは乳がん又は肺がんである。

また、別の一側面において、本発明はさらに、ＣＤＫ４／６媒介性哺乳動物（例えば、ヒト）の疾患を治療するための式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩、式（ＩＩ）で示される化合物、化合物ＷＸ＿１、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形を含む結晶組成物、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形、又は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を含む結晶組成物、又はその医薬組成物を提供する。前記疾患はがんを含み、好ましくは乳がん又は肺がんである。

式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩は、生理活性、安全性、バイオアベイラビリティ等の少なくとも１つにおいて優れた効果を有し、化合物ＷＸ＿１のＡ結晶形及び式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形は非常に安定的であり、吸湿性が低く、水溶性が良好であり、医薬とされる将来性が高い。

図１は化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のＣｕ－Ｋα線のＸＲＰＤパターンである。 図２は化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のＤＳＣパターンである。 図３は化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のＴＧＡパターンである。 図４は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形のＣｕ－Ｋα線のＸＲＰＤパターンである。 図５は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形のＤＳＣパターンである。 図６は式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形のＴＧＡパターンである。

［定義及び説明］
本明細書では、特に断りのない限り、後述の用語及び表現はすべて下記の意味で使用される。ある特定の用語又は表現は、特別に定義されていない場合、不確実または不明確と判断されるべきではなく、通常の意味に従って理解されるべきである。本明細書で記載されている商品名は、かかる商品またはその有効成分を指す。

用語「治療」とは、疾患又はこの疾患に関連する１つ又は複数の症状を予防、改善又は根絶するために、本願に記載の化合物又は製剤を投与することを指し、且つ、
（ｉ）疾患又は疾患の状態、特に哺乳動物が罹っていることが診断されていないが、罹りやすいものである疾患の状態の、哺乳動物における発生、
（ｉｉ）疾患又は疾患の状態への抑制、即ちその進行への抑制、
（ｉｉｉ）疾患又は疾患の状態の緩和、即ち該疾患又は疾患の状態の軽減、
を含む。

用語「治療有効量」とは、（ｉ）特定の疾患、病状又は障害の治療又は予防、（ｉｉ）特定の疾患、病状又は障害の１種又は複数の症状の軽減、改善又は根絶、又は（ｉｉｉ）本明細書中に記載の特定の疾患、病状又は障害の１種又は複数の症状の発症の予防又は遅延のための本願化合物の使用量を指す。「治療有効量」となる本願化合物の量は、該化合物、疾患の状態及び重症度、投与手法、及び治療される哺乳動物の年齢に応じて変化し得るが、その技術知識及び本願の開示に基づき、当業者によって容易に決定され得る。

用語「薬学的に許容される」とは、化合物、材料、組成物及び／又は剤形は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー性反応又はほかの問題や合併症がなく、ヒトや動物の組織と接触させて使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合ったことを意味する。

薬学的に許容される塩として、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。

用語「医薬組成物」とは、１種又は複数種の本願化合物又はその塩と、薬学的に許容されるアジュバントからなる混合物を指す。医薬組成物は、生体への本願の化合物の投与に寄与することを目的とする。

用語「薬学的に許容されるアジュバント」とは、生体に顕著な刺激作用がなく、且つ該活性化合物の生理活性及び性能を損なわないアジュバントを指す。適切なアジュバントとして、例えば炭水化物、ワックス、水溶性及び／又は水膨潤性ポリマー、親水性又は疎水性材料、ゼラチン、油、溶媒、水等当業者に熟知されているものが挙げられる。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含有（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び例えばｃｏｍｐｒｉｓｅｓ又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ等の変形はオープン且つ非排他的な意味を有し、つまり、「含むが、これらに限定されない」と理解されるべきである。

用語「ＰＯ」とは、経口投与を指す。

用語「ＱＤ×３Ｗ」とは、１日に１回、３週間投与し続けることを意味する。

本願の医薬組成物は、本願の化合物と適切な薬学的に許容されるアジュバントを配合して製造できる。例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、膏剤、乳剤、懸濁剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア及びエアゾール剤等固体、半固体、液体又は気体製剤に製造できる。

本願の化合物又はその薬学的に許容される塩又はその医薬組成物の典型的な投与経路は、経口、直腸、局所、吸入、非経口、舌下、膣内、鼻腔内、眼内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内投与を含むが、これらに限定されない。

本願の医薬組成物は、例えば通常の混合方法、溶解方法、造粒方法、糖衣方法、粉砕方法、乳化方法、凍結乾燥方法等当業界周知の方法により製造されることができる。

一部の形態においては、医薬組成物は経口投与される。経口投与の場合、活性化合物と当業界に熟知されている薬学的に許容されるアジュバントとを混合することにより、該医薬組成物を配合することができる。これらアジュバントにより、患者への経口投与のために、本願の化合物を錠剤、丸剤、トローチ剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、スラリー剤、懸濁剤等に配合することができる。

通常の混合、充填又は打錠方法により固体経口投与組成物を製造することができる。例えば、上記の活性化合物を固体アジュバントと混合し、任意に得られた混合物を粉砕してもよく、必要に応じてほかの適切なアジュバントを添加し、次いで該混合物を顆粒に加工し、錠剤又は糖衣錠の内核を得るという方法により得られる。適切なアジュバントは、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、甘味剤又は矯味剤等を含むが、これらに限定されない。

医薬組成物はさらに、非経口投与のために、例えば適切な単位剤形の無菌の溶液、懸濁液又は凍結乾燥物として適用されることができる。

本発明の中間体化合物は、当業者に熟知されている多くの合成方法により製造されることができ、以下に例示されている発明を実施するための形態、それと他の化学合成方法とを組み合わせてなる実施の形態、及び当業者に熟知されている同等の方法が含まれる。好ましい実施の形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の実施の形態の化学反応は適切な溶媒中で行われる。上記溶媒は、本発明の化学変化及び必要な試薬及び材料に適するものでなければならない。本発明の化合物を得るために、当業者は現有の実施の形態に基づき、合成工程又は反応スキームを修正又は選択することが必要になる場合もある。

以下、実施例によって、本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明への限定とはならない。

本発明で使用される溶媒はすべて市販品であり、それをさらに精製する必要がなく、そのまま使用することができる。

本発明では、以下の略語を使用する。すなわち、ＭＷはマイクロ波を示し、ｒ．ｔ．は室温を示し、ａｑは水溶液を示し、ＤＣＭは塩化メチレンを示し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを示し、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを示し、ＮＭＰは１－メチル－２－ピロリドンを示し、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルを示し、ＥｔＯＨはエタノールを示し、ＭｅＯＨはメタノールを示し、ｄｉｏｘａｎｅはジオキサンを示し、ＨＯＡｃは酢酸を示し、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブチルカルボニル基を示し、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基を示し、両者ともアミン保護基であり、Ｂｏｃ_２Ｏはジ－ｔｅｒｔ－ブチルジ炭酸エステルを示し、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを示し、ＴＥＡ又はＥｔ_３Ｎはトリエチルアミンを示し、ＢｎＮＨ_２はベンジルアミンを示し、ＰＭＢＮＨ_２はｐ－メトキシベンジルアミンを示し、ＫＯＡｃは酢酸カリウムを示し、ＮａＯＡｃは酢酸ナトリウムを示し、Ｃｓ_２ＣＯ_３は炭酸セシウムを示し、Ｋ_２ＣＯ_３は炭酸カリウムを示し、ＮａＨＣＯ_３は炭酸水素ナトリウムを示し、Ｎａ_２ＳＯ_４は硫酸ナトリウムを示し、ｐｙｒｉｄｉｎｅはピリジンを示し、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムを示し、ＴＥＡ又はＥｔ_３Ｎはトリエチルアミンを示し、ＮａＨは水素化ナトリウムを示し、ＬｉＨＭＤＳはリチウムビス（トリメチルシリル）アミドを示し、ｉ－ＰｒＭｇＢｒはイソプロピルマグネシウムブロミドを示し、ｔ－ＢｕＯＫはｔｅｒｔ－ブトキシカリウムを示し、ｔ－ＢｕＯＮａはｔｅｒｔ－ブトキシナトリウムを示し、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３はトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）を示し、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４はテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を示し、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２ ＣＨ_２Ｃｌ_２は［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド・ジクロロメタンを示し、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２は酢酸パラジウムを示し、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２はジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）を示し、Ｒｈ（ＰＰｈ_３）_３Ｃｌはクロロトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）を示し、Ｐｄ（ＯＨ）_２は水酸化パラジウムを示し、Ｘａｎｔｐｈｏｓは４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチルキサンテンを示し、Ｘｐｈｏｓは２－（ジシクロヘキシルホスフィノ）－２’，４’，６’－トリ－イソプロピルビフェニルを示し、ＢＩＮＡＰは（±）－２，２’－ビス（ジフェニルホスフィノ）－１，１’－ビナフチルを示し、Ｘａｎｔｐｈｏｓは４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチルキサンテンを示し、Ｘｐｈｏｓ－Ｐｄ－Ｇ１はクロロ－（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，４’，６’－トリイソプロピル－１，１－ビフェニル）［２－（２－アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）を示し、Ｘｐｈｏｓ－ＰＤ－Ｇ_２はクロロ－（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，４’，６’－トリイソプロピル－１，１’－ビフェニル）［２－（２’－アミノ－１，１’－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を示し、Ｘｐｈｏｓ－Ｐｄ－Ｇ_３を示しメタンスルホン酸－（２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，４’，６’－トリイソプロピル－１，１’－ビフェニル）［２－（２’－アミノ－１，１’－ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を示し、Ｉ_２はヨウ素単体を示し、ＬｉＣｌは塩化リチウムを示し、ＨＣｌは塩酸を示し、ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄはマレイン酸を示す。

化合物を手動で又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアにより命名し、市販されている化合物はサプライヤーによるカタログ名を採用する。

本発明の粉末Ｘ－線回折（「Ｘ－線粉末回折」とも呼ばれており、Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法
機器型番：ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ－線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇの試料をＸＲＰＤ検出に使用する。

詳細なＸＲＰＤパラメータは下記のとおりである。
管：Ｃｕ，ｋα，（λ＝１．５４０５６Å）
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
受光スリット：１０．５０ｍｍ
散乱スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４－４０ｄｅｇ
ステップサイズ：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
試料皿回転速度：１５ｒｐｍ

なお、Ｘ線粉末回折分光法（ＸＲＰＤ）において、結晶性化合物から得られる回折パターンは通常、特定の結晶にとって特徴的であり、（特に低角度での）バンドの相対強度は、結晶化条件、粒径及びその他の測定条件の違いによる優先方位効果につれて変化する可能性がある。したがって、回折ピークの相対強度は、対象となる結晶にとって特徴的ではなく、既知の結晶と同じか否かを判断する際に、相対強度よりもピークの相対位置に注意を払う必要がある。さらに、所与の結晶について、ピークの位置にわずかな誤差がある可能性があり、これは結晶学の分野でも公知のことである。例えば、試料を分析する際の温度の変化、試料の移動、又は機器の較正等により、ピークの位置はシフトすることがあり、２θ値の測定誤差は約±０．２°になることがある。したがって、各結晶構造を決める際にこの誤差を考慮に入れるべきである。ＸＲＰＤパターンでは、通常２θ角又は格子面間隔ｄによってピーク位置を示し、両者間の換算関係は簡単である。ｄ＝λ／２ｓｉｎθ（式中、ｄは格子面間隔（「面間隔」とも呼ばれる）を表し、λは入射Ｘ線の波長を表し、θは回折角を表す。）。同種の化合物の同種の結晶について、そのＸＲＰＤパターンのピーク位置は全体からすれば類似性があり、相対強度の誤差が大きくなる可能性がある。さらに、混合物の同定においては、含有量の減少等の要因で一部の回折線が欠落しているため、高純度試料に見られるすべてのバンドに頼る必要はなく、１つのバンドでも所与の結晶にとって特徴的である可能性がある。

本発明の示差走査熱量分析（「示差走査熱量測定」とも呼ばれており、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
機器型番：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：試料（～１ｍｇ）をＤＳＣアルミパンで測定し、５０ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ_２条件下で１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を２５℃から３００℃まで加熱する。

ＤＳＣは、結晶構造の変化又は結晶溶融によって結晶が熱を吸収又は放出するときの転移温度を測定する。同種の化合物の同種の結晶について、連続分析では熱転移温度及び融点の誤差は典型的には約５℃以内であり、通常は約３℃以内であり、化合物が所与のＤＳＣピーク又は融点を有すると言う場合、該ＤＳＣピーク又は融点±５℃を意味する。ＤＳＣは、異なる結晶を同定するための補助的方法を提供する。異なる結晶形をその異なる転移温度特性に基づいて判断することができる。なお、混合物については、そのＤＳＣピーク又は融点はより広い範囲にわたって変化する可能性がある。さらに、物質の溶融に伴って分解も生じるため、溶融温度は昇温速度に関連している。

本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
機器型番：ＴＡ Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析計
測定方法：試料（２～５ｍｇ）をＴＧＡ白金パンで測定し、２５ｍＬ／ｍｉｎ Ｎ_２条件下で１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、試料を室温から３５０℃まで加熱する。

以下、本発明の内容をよりよく理解するために、具体的な実施例によりさらに説明するが、本発明の内容はこれら実施の形態に限定されるものではない。

ＷＸ＿１ Ａ結晶形の製造
２０℃で、マレイン酸（４３９．３０ｇ、９９．６％純度）、メタノール（１１．９０Ｌ）及び水（６６６．００ｍＬ）を５０Ｌの反応釜に添加し、得られた混合物を６５℃に加熱し、次に反応釜に式（Ｉ）で示される化合物（１．６６ｋｇ）を添加した。反応混合物を６５℃で１時間撹拌した後に、２０℃まで冷却し、１８時間撹拌した。得られた混合物を濾過し、濾過ケーキをメタノール（２Ｌ×２）で洗浄した後に、４５℃の条件下で７０時間真空乾燥し、化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の粗生成物（１．５５ｋｇ、９８．８８％純度）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ９．８８（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．１，３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０５（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ），３．６０（ｔｄ，Ｊ＝１４．０，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），３．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ），１．５１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）．

３０℃で、１０Ｌの三つ口フラスコにメタノール（８．６５Ｌ）を添加し、この溶液を５０℃に加熱し、次いでＷＸ＿１ Ａ結晶形の粗生成物（８６５．００ｇ、１．５２ｍｏｌ、１．００当量）を反応フラスコに添加した。反応混合物を５０℃で２時間攪拌した。次いで反応混合物を３０℃まで冷却し、濾過し、濾過ケーキをメタノール（１Ｌ×２）で洗浄した後に、４５℃の条件下で６４時間真空乾燥し、ＷＸ＿１ Ａ結晶形（７８０．００ｇ、９８．９８％純度）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ９．８３（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ），３．６０（ｔｄ，Ｊ＝１４．０，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，４Ｈ），３．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），１．５１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）．

式（Ｉ）で示される化合物の製造
製造スキーム１

第１のステップ
化合物（１）（２０．００ｇ、９８．５３ｍｍｏｌ、１．００当量）のジメチルスルホキシド（５２ｍＬ）溶液に、化合物（２）（２４．００ｇ、１２８．８６ｍｍｏｌ、１．３１当量）及びトリエチルアミン（２０．００ｇ、１９７．６５ｍｍｏｌ、２．０１当量）を添加した。溶液を６０℃に加熱して１８時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）にて反応が完全に進行したことが示された。溶液を水（２００ｍＬ）で希釈して３０分間撹拌した後に、濾過した。濾過ケーキを水で洗浄し、真空乾燥して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラム（石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１～２０：１）で精製し、化合物（３）（２７．００ｇ、８７．５７ｍｍｏｌ、収率：８８．８７％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ８．１８（ｄ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝２．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄｄ，Ｊ＝９．１０，２．９５Ｈｚ，１Ｈ），３．６９－３．５９（ｍ，４Ｈ），３．５１－３．４０（ｍ，４Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）．

第２のステップ
窒素ガス雰囲気で、化合物（３）（２８．００ｇ、９０．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）のメタノール（６００ｍＬ）溶液にパラジウム炭素（６％、１．７ｇ）を添加した。懸濁液からの排気、及び水素ガスの充填を数回繰り返す。溶液を５０℃、水素ガス（５０ｐｓｉ）雰囲気で１８時間攪拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン：メタノール＝１０：１）にて原料が完全に反応したことが示された。懸濁液を濾過し、ろ液を回転蒸発し乾固し、化合物（４）（２４．１３ｇ、８６．６９ｍｍｏｌ、収率：９５．４６％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．７８（ｄ，Ｊ＝２．６４Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．７８，２．８９Ｈｚ，１Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．６０－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．００－２．９２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．

製造スキーム２

第１のステップ
８５％のヒドラジン水和物（１０３．００ｇ、２．０６ｍｏｌ、２３．２０当量）水溶液に化合物（５）（１８．００ｇ、８８．６７ｍｍｏｌ、１．００当量）を徐々に添加し、滴下過程で、白色の固体が徐々に析出した。混合物を１１０℃で１６時間攪拌した。ＬＣＭＳにて混合物のほとんどが目的化合物であることが示された後に、混合物を１６℃まで冷却し、濾過し、濾過ケーキを水（１００ｍＬ）で洗浄して粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製し（石油エーテル：酢酸エチル＝３：２）、化合物（６）（６．５０ｇ、３２．９９ｍｍｏｌ、収率３７．２１％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９７．１（Ｍ＋１）．

第２のステップ
３０℃、窒素ガス雰囲気で、化合物（６）（２０．００ｇ、１０１．５１ｍｍｏｌ、１．００当量）とナトリウムメトキシド（５．４８ｇ、５．４８ｍｍｏｌ、５．４８当量）のメタノール（１５０．００ｍＬ）溶液にヨードメタン（５７．００ｇ、４０１．５８ｍｍｏｌ、３．９６当量）を滴下し、滴下時間を１時間に制御した。その後、混合物を８５℃まで加熱して５時間攪拌し、ＬＣＭＳにて原料がほとんど消費され、且つ所望の化合物のＭＳが検出されたことが示された後に、混合物を１６℃まで冷却して濃縮し、粗生成物を得た。３％のＮａＨＣＯ_３水溶液（３０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（８０ｍＬ×２）で抽出し、有機相を減圧下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製し（石油エーテル：酢酸エチル＝３０：１～１：１）、化合物（７）（８．４０ｇ、３９．８０ｍｍｏｌ、收率３９．２１％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ８．３３（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，８Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｓ，１Ｈ）ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２１０．８（Ｍ＋１）．

第３のステップ
３０℃で、化合物（７）（８．４０ｇ、３９．８０ｍｍｏｌ、１．００当量）の塩化メチレン（９０ｍＬ）溶液にピリジン（４．７２ｇ、５９．７０ｍｍｏｌ、１．５当量）と［ビス（トリフルオロアセトキシ）ヨード］ベンゼン（２０．５４ｇ、４７．７６ｍｍｏｌ、１．２０当量）を添加して混合物を０．５時間攪拌し、次いで、ヨード（１２．１２ｇ、４７．７６ｍｍｏｌ、１．２０当量）を添加して２３．５時間攪拌し続けた。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行したことが示された後に、混合物を濾過し、化合物（８）（８．２０ｇ、粗生成物）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３３６．９（Ｍ＋１）．

第４のステップ
窒素ガス雰囲気で、化合物（８）（７．６８ｇ、２２．７９ｍｍｏｌ、１．００当量）とイソプロペニルホウ酸エステル（４．２１ｇ、２５．０７ｍｍｏｌ、１．１１当量）のジオキサン（９０．００ｍＬ）溶液にＫ_２ＣＯ_３（９．４５ｇ、６８．３８ｍｍｏｌ、３．００当量）の飽和水溶液（３０ｍＬ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２・ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．８６ｇ、２．２８ｍｍｏｌ、０．１０当量）を添加し、混合物を１００℃で３時間攪拌した。ＴＬＣにてほとんど全ての原料が反応したことが示された後に、混合物を３０℃まで冷却し、濾過し、ろ液を酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出し、水（５０ｍＬ×３）で洗浄し、飽和食塩水（２０ｍＬ×３）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過して濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製し（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）、化合物（９）（５．３６ｇ、２１．３４ｍｍｏｌ、收率９３．６６％）を得た。

第５のステップ
窒素ガス雰囲気で、化合物（９）（２．８０ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）とビス（ピナコラト）ジボロン（３．４０ｇ、１３．３８ｍｍｏｌ、１．２０当量）のジオキサン（５６．００ｍＬ）溶液にＫＯＡｃ（３．２８ｇ、３３．４５ｍｍｏｌ、３．００当量）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２・ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．８２ｇ、２．２３ｍｍｏｌ、０．２０当量）を添加し、混合物を１００℃で５時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行し、且つ目的化合物のＭＳが検出されたことが示された後に、混合物を１６℃まで冷却し、混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、濾過してろ液を得た。ろ液をカラムクロマトグラフィーによって精製し（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）、化合物（１０）（３．３０ｇ、９．９６ｍｍｏｌ、收率８９．３３％、純度９０％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２９９．１（Ｍ＋１）．

第６のステップ
窒素ガス雰囲気で、２，４－ジクロロ－５－フルオロ－ピリミジン（１４７．８３ｍｇ、８８５．３４μｍｏｌ、１．２０当量）と化合物（１０）（２２０．００ｍｇ、７３７．７８μｍｏｌ、１．００当量）のジオキサン（４ｍＬ）溶液にＫ_２ＣＯ_３（３０５．９１ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、３．００当量）とＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２・ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０．５０ｍｇ、１４７．５６μｍｏｌ、０．２０当量）を添加し、混合物を１００℃で３．５時間撹拌した。ＴＬＣにてほとんどの原料が完全に反応したことが示され、ＬＣＭＳにてほとんどが目的生成物のＭＳであることが示された後に、混合物を３０℃まで冷却して濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（５ｍＬ）で洗浄し、ろ液を濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィーによって精製し（石油エーテル：酢酸エチル＝１：０～６：１）、化合物（１１）（２１０．０ｍｇ、６９３．６９μｍｏｌ、收率９４．０２％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３０３．０（Ｍ＋１）．

第７のステップ
化合物（１１）（２００．００ｍｇ、６６０．６５μｍｏｌ、１．００当量）のジオキサン（１０．００ｍＬ）溶液に、化合物（４）（２２０．６７ｍｇ、７９２．７９μｍｏｌ、１．２０当量）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（６０．５０ｍｇ、６６．０７μｍｏｌ、０．１０当量）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（７６．４５ｍｇ、１３２．１３μｍｏｌ、０．２０当量）及び炭酸セシウム（４３０．５１ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。溶液を窒素ガス雰囲気で１１０℃まで昇温して１６時間攪拌した。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行したことが示された。溶液を２５℃まで冷却し、濾過し、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を分取ＴＬＣによって精製し（酢酸エチル：石油エーテル＝１：２）、化合物（１２）（３２０．００ｍｇ、５８７．５７μｍｏｌ、収率：８８．９４％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５４５．３（Ｍ＋１）．

第８のステップ
窒素ガス雰囲気で、化合物（１２）（３２０．００ｍｇ、５８７．５７μｍｏｌ、１．００当量）のメタノール（２０．００ｍＬ）溶液にパラジウム炭素（２００．００ｍｇ）及び酢酸（２．１０ｇ、３４．９７ｍｍｏｌ、５９．５２当量）を添加した。懸濁液からの排気、及び水素ガスの充填を数回繰り返す。溶液を５０℃、水素ガス（３２ｐｓｉ）雰囲気で９６時間攪拌した。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行したことが示された。懸濁液を２５℃まで冷却し、濾過し、濃縮して化合物（１３）（５００．００ｍｇ、粗生成物）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５４７．１（Ｍ＋１）．

第９のステップ
２０℃で、化合物（１３）（１０．００ｇ、１８．２９ｍｍｏｌ、１．００当量）の塩化メチレン（８０．００ｍＬ）溶液にＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（４ｍｏｌ／Ｌ、８０．００ｍＬ、１７．５０当量）を添加し、２時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応が完了したことが示された。反応混合物を濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で洗浄した。濾過ケーキを脱イオン水（１００ｍＬ）で溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨを７～８に調整し、該系を塩化メチレン（２００ｍＬ×３）で抽出した。合併した有機相を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後に、濃縮した。得られた粗生成物をｔｅｒｔ－ブタノール（５０ｍＬ）で８０℃で１時間撹拌し、該系を２０℃まで冷却し、濾過し、濾過ケーキをメタノール（３０ｍＬ×２）で洗浄し、乾燥した後に、式（Ｉ）で示される化合物（７．５０ｇ、１６．６３ｍｍｏｌ、收率：９０．９２％、純度：９９％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ_４）δ ８．７２（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄｄ，Ｊ＝９．２，３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｄｄ，Ｊ＝６．１，３．８Ｈｚ，４Ｈ），３．０２－２．９７（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）．ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４７．１（Ｍ＋１）．

式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形の製造
式（Ｉ）で示される化合物約９０ｍｇを１．５ｍＬのガラス瓶に入れ、混合溶媒（ＥｔＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝３：１）約１．２ｍＬを添加し、形成された懸濁液を８０℃で１時間撹拌し、加熱を止め、徐々に降温し、一晩静置し、該懸濁液を高速で遠心分離し（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）、得られた固体をさらに４０℃で真空乾燥器で一晩乾燥させ、式（Ｉ）で示される化合物のＢ結晶形を得た。

式（ａ）で示された化合物の製造

第１のステップ

窒素ガス雰囲気で、ＬｉＡｌＨ_４（１．５ｇ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に６－アミノピリジン－３－カルボン酸メチル（５．００ｇ）のテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）溶液を添加し、混合物を７０℃で１６時間攪拌した。ＴＬＣにて反応が完全に進行したことが示された。混合物を２０℃まで冷却し、水（１．５ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１５％、１．５ｍＬ）水溶液、水（４．５ｍＬ）を順に添加し、０．５時間撹拌した。混合物を濾過し、ろ液を濃縮して黄色の固体を得、（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１０）で洗浄し、残留している黄色の固体は式（ａ－１）で示される化合物であった（２．６ｇ）。

第２のステップ

式（ａ－１）で示される化合物の塩化メチレン（３０ｍＬ）溶液に二酸化マンガン（１７．５１ｇ）を添加し、混合物を５０℃で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）にて反応が完全に進行したことが示された。混合物を２０℃まで冷却して濾過し、ろ液を濃縮して得られた式（ａ－２）で示される化合物（２．１０ｇ）は黄色の固体であった。式（ａ－２）で示される化合物を精製せず、そのまま次の反応に用いた。

第３のステップ

式（ａ－２）で示される化合物（２．００ｇ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に１－エチルピペラジン（１．８７ｇ）を添加し、混合物を２０℃で１時間撹拌し、次にＮａＢＨ_３ＣＮ（シアノ水素化ホウ素ナトリウム、２．５７ｇ）を添加し、混合物を２０℃で１５時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行したことが示された。減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取ＨＰＬＣ（アルカリ性）によって精製し、得られた式（ａ－３）で示された化合物（８００ｍｇ）は黄色の固体であった。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．９７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），３．３８（ｓ，２Ｈ），２．６１－２．３１（ｍ，１０Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．

第４のステップ

窒素ガス雰囲気で、化合物（１１）（２５０．００ｍｇ）及び式（ａ－３）で示された化合物（２００．１３ｍｇ）のジオキサン（８ｍＬ）溶液にＰｄ_２（ｄｂａ）_３（１５１．２４ｍｇ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（１９１．１３ｍｇ）及びＣｓ_２ＣＯ_３（５３８．１４ｍｇ）を添加し、混合物を１００℃で１６時間攪拌し、混合物の色が褐色に変化した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳにて原料が完全に反応したことが示された。混合物を２０℃まで冷却し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（４ｍＬ）で洗浄し、ろ液を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物にメタノール（８ｍＬ）を添加し、３０℃で２時間静置し、黄色の沈殿物を析出させ、濾過し、濾過ケーキをメタノール（２ｍＬ）で洗浄し、乾燥して式（ａ－４）で示された化合物（１４３．００ｍｇ）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ_４）δ ９．９９（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），５．４４（ｓ，１Ｈ），４．１７（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｓ，２Ｈ），２．３８－２．２７（ｍ，１３Ｈ），０．９７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４８７．２（Ｍ＋１）．

第５のステップ

Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）のメタノール（５ｍＬ）に式（ａ－４）で示された化合物（１２０．００ｍｇ）を添加し、系に水素ガスを導入し、圧力を１５ｐｓｉに維持し、混合物を５０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳにて反応が完全に進行したことが示された。濾過し、ろ液を濃縮し、残留物を分取ＨＰＬＣ（ＨＣｌ）によって精製し、式（ａ）で示された化合物（６８．００ｍｇ）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ_４）δ ９．９９（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１６（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｓ，２Ｈ），２．５５－２．３１（ｍ，１０Ｈ），１．５１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ）．ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４８９．３（Ｍ＋１）．

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の吸湿性研究
［実験条件］
機器型番：ＳＭＳＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的水蒸気吸着測定装置
測定条件：試料（１０～１５ｍｇ）をＤＶＳ試料皿に入れて測定する。
ＤＶＳパラメータ
温度：２５℃
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１ ％／ｍｉｎ（最短：１０ｍｉｎ、最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ ＲＨで１２０ｍｉｎ乾燥する
ＲＨ（％）測定段階：１０％
ＲＨ（％）測定段階範囲：０％－９０％－０％
吸湿性評価標準

［実験結果］化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の２５℃、８０％ ＲＨでの吸湿増量は１．４８％であった。

［実験結論］化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形は吸湿性が少しある。

化合物ＷＸ＿１の多結晶形に関する研究
化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形を対応する溶媒中で加熱した後に溶解させ、４０℃、遮光下で２日間撹拌し、溶液を遠心分離して沈殿物を得て乾燥させた後に、ＸＲＰＤ検出に供し、その結果を以下に示す。

式（Ｉ）で示される化合物と化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の溶解度実験
それぞれ試料約２ｍｇ（塩の場合、式（Ｉ）で示される化合物２ｍｇを基準として、塩係数により塩の所要量を計算する。）を秤量し、１．５ｍＬのガラス瓶に添加し、次にそれぞれ異なる溶媒１ｍＬを添加した。上記懸濁液をマグネチックスターラーで撹拌した（室温２５～２７℃）。２４時間の撹拌後にサンプリングし、得られた試料を遠心分離し、上澄み液を取り、溶解状況に応じて適切に希釈した後に、ＨＰＬＣでその濃度を測定し、結果を以下に示す。

上表から分かるように、化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の水における溶解度は式（Ｉ）で示される化合物よりも約１１０倍向上し、溶解性が顕著に向上した。

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の異なるｐＨにおける溶解度に関する研究
［実験方法］
化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形約１０ｍｇを８ｍＬのガラス瓶に添加し、９部を秤量し、次いでそれぞれ異なる溶媒（０．１Ｎ ＨＣｌ、０．０１Ｎ ＨＣｌ、水、ｐＨ３．８、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．５、ｐＨ６．８緩衝液）４ｍＬを添加した。磁力撹拌子を上記懸濁液に添加し、マグネチックスターラーに置いて（温度３７℃、遮光下で）撹拌した。それぞれ４、２４時間撹拌した後にサンプリングして遠心分離し、下層残留固体に対してＸＲＰＤ測定を行い、上層試料をろ過膜で濾過し、ろ液をＨＰＬＣにてその濃度を測定し、且つそのｐＨ値を測定し、ＨＰＬＣシステムを流動相で平衡化した後に試料を分析し始め、結果を下表に示す。

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のＣＤＫ２／４／６酵素活性測定
［実験材料］
ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ａ、ＣＤＫ４／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＣＤＫ６／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＵＬｉｇｈｔ標識ポリペプチド基質ＵＬｉｇｈｔ－４Ｅ－ＢＰ１及びＵＬｉｇｈｔ－ＭＢＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。ユーロピウム標識抗ミエリン塩基性タンパク抗体及びユーロピウム標識ウサギ由来抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーで信号を検出する（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。

［実験方法］
被験化合物を３倍希釈し、１０段階の濃度勾配があり、最終的な濃度範囲が５ｕＭ～０．２５ｎＭである。

● ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ａの酵素反応系
標準的なＬａｎｃｅ Ｕｌｔｒａ方法は、１０μＬの酵素反応系で行われ、ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ａタンパク ０．５ｎＭ、ＵＬｉｇｈｔ－ＭＢＰポリペプチド １００ｎＭ及びＡＴＰ ２５μＭを含む。それぞれ酵素緩衝液で溶解させ、緩衝液は成分として、ＰＨ７．５の２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸溶液 ５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸 １ｍＭ、塩化マグネシウム １０ｍＭ、０．０１％のＢｒｉｊ－３５、ジチオスレイトール ２ｍＭを含む。反応開始後に、トップヒートシールフィルムＴｏｐＳｅａｌ－ＡでＯｐｔｉＰｌａｔｅ３８４ウェルプレートを封止し、室温でで６０分間インキュベートした。

● ＣＤＫ４／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の酵素反応系
標準的なＬａｎｃｅ Ｕｌｔｒａ方法は、１０μＬの酵素反応系で行われ、ＣＤＫ４／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１タンパク ０．３ｎＭ、ＵＬｉｇｈｔ－４Ｅ－ＢＰ１ポリペプチド ５０ｎＭ、及びＡＴＰ ３５０μＭを含む。それぞれ酵素緩衝液で溶解させ、緩衝液は成分として、ＰＨ７．５の２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸溶液 ５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸 １ｍＭ、塩化マグネシウム １０ｍＭ、０．０１％のＢｒｉｊ－３５、ジチオスレイトール ２ｍＭを含む。反応開始後に、トップヒートシールフィルムＴｏｐＳｅａｌ－ＡでＯｐｔｉＰｌａｔｅ３８４ウェルプレートを封止し、室温で１８０分間インキュベートした。

● ＣＤＫ６／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の酵素反応系
標準的なＬａｎｃｅ Ｕｌｔｒａ方法は、１０μＬの酵素反応系で行われ、ＣＤＫ６／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１タンパク ０．８ｎＭ、ＵＬｉｇｈｔ－４Ｅ－ＢＰ１ポリペプチド ５０ｎＭ、及びＡＴＰ ２５０μＭを含む。それぞれ酵素緩衝液で溶解させ、緩衝液は成分として、ＰＨ７．５の２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸溶液 ５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸 １ｍＭ、塩化マグネシウム １０ｍＭ、０．０１％のＢｒｉｊ－３５、ジチオスレイトール ２ｍＭを含む。反応開始後に、トップヒートシールフィルムＴｏｐＳｅａｌ－ＡでＯｐｔｉＰｌａｔｅ３８４ウェルプレートを封止し、室温で１８０分間インキュベートした。

酵素反応終止緩衝液を用意し、１倍希釈された検出緩衝液でＥＤＴＡを溶解させ、終止反応を室温で５分間行った。それぞれＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ Ａ、ＣＤＫ４／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びＣＤＫ６／ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１反応に（それぞれユーロピウム標識抗ミエリン塩基性タンパク抗体及びユーロピウム標識ウサギ由来抗体で配合された）検出混合液を５μＬ添加した。室温で６０ｍｉｎインキュベートし、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移の原理を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ装置で反応信号を検出した。

［実験結果］
方程式（Ｍａｘ－Ｒａｔｉｏ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）＊１００％で生データを阻害率に換算し、ＩＣ_５０値を、４パラメータ曲線フィッティング（ｉＤＢＳ ＸＬＦＩＴ５のＭｏｄｅｌ ２０５）を用いることによって得ることができる。結果を以下に示す。

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のＭＣＦ－７乳がん細胞増殖に対する阻害実験
［実験材料］
ＲＰＭＩ １６４０培地、ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入）。ＭＣＦ－７細胞株（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）から購入）。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。

［実験方法］
ＭＣＦ－７細胞を黒色３８４ウェルプレートに播種し、４５μＬの細胞懸濁液を各ウェルに分注し、ＭＣＦ－７細胞２００個が含まれている。細胞プレートを二酸化炭素培養器で夜通し培養した。

被験化合物をＢｒａｖｏで１０段階目の濃度までに３倍希釈し、即ち１０μＭから０．５０８ｎＭまでに希釈し、ダブルウェル試験を設置した。中間プレートに４９μＬの培地を添加し、対応する位置に合わせて、１ウェル当たり１μＬの勾配希釈した化合物を中間プレート上移行させ、均一に混合した後に、１ウェル当たり５μＬを細胞プレートに移行させた。細胞プレートを二酸化炭素培養器で６日間培養した。

細胞プレートに１ウェル当たり２５μＬのＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートし、発光信号を安定化させた。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーで数値を読み取った。

［実験結果］
方程式（Ｍａｘ－Ｒａｔｉｏ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）＊１００％で生データを阻害率に換算し、ＩＣ_５０値を、４パラメータ曲線フィッティング（ｉＤＢＳ ＸＬＦＩＴ５のＭｏｄｅｌ ２０５）を用いることによって得ることができる。実験結果を以下に示す。

［実験結論］
本発明の化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形はエストロゲン受容体陽性ＭＣＦ－７乳がん細胞に対して顕著な増殖阻害活性を示した。化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形は対照化合物Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ及びＬＹ２８３５２１９よりも高いＭＣＦ－７細胞増殖に対する阻害活性が認められた。

式（Ｉ）で示される化合物のＭＣＦ－７細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４３６細胞増殖に対する阻害実験

［実験材料］
ＲＰＭＩ １６４０培地、ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入）。ＭＣＦ－７細胞株及びＭＤＡ－ＭＢ－４３６細胞株（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）から購入）。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。

［実験方法］
ＭＣＦ－７細胞を黒色３８４ウェルプレートに播種し、４５μＬの細胞懸濁液を各ウェルに分注し、ＭＣＦ－７細胞２００個が含まれている。細胞プレートを二酸化炭素培養器で夜通し培養した。

ＭＤＡ－ＭＢ－４３６細胞を黒色３８４ウェルプレートに播種し、４５μＬの細胞懸濁液を各ウェルに分注し、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６細胞５８５個が含まれている。細胞プレートを二酸化炭素培養器で夜通し培養した。

それぞれ被験化合物をＢｒａｖｏで１０段階目の濃度までに３倍希釈し、即ち１０μＭから０．５０８ｎＭまでに希釈し、ダブルウェル試験を設置した。中間プレートに４９μＬの培地を添加し、対応する位置に合わせて、１ウェル当たり１μＬの勾配希釈した化合物を中間プレート上移行させ、均一に混合した後に、１ウェル当たり５μＬを細胞プレートに移行させた。細胞プレートを二酸化炭素培養器で６日間培養した。

細胞プレートに１ウェル当たり２５μＬのＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートし、発光信号を安定化させた。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダーで数値を読み取った。

［実験結果］
方程式（Ｍａｘ－Ｒａｔｉｏ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）＊１００％で生データを阻害率に換算し、ＩＣ_５０値を、４パラメータ曲線フィッティング（ｉＤＢＳ ＸＬＦＩＴ５のＭｏｄｅｌ ２０５）を用いることによって得ることができる。実験結果を以下に示す。

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の生体内薬効研究（一）
［実験材料］
皮下移植によるＭＣＦ－７乳がん患者由来のヒト腫瘍細胞株に基づいた異種移植（ＣＤＸ）ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雌性、６～８週、体重２０ｇ。合計で１５０匹、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入。

［実験目的］
被験医薬Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ、ＬＹ２８３５２１９及び化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のヒト乳がんＭＣＦ－７細胞皮下異種移植腫瘍モデルにおける生体内薬効を評価する。

［実験方法］
（１）詳細な医薬配合計画

（２）動物実験の群分け及び投与計画

（３）実験操作
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雌性、６～８週、体重は約２０ｇ。マウスを病原体のない特定な環境、且つ個別換気ケージ（１ケージ当たりマウス１０匹）で収容した。すべてのケージ、寝具及び水は、使用前に消毒作業を行った。全ての動物が規格認証された商業実験室食物を自由に取ることができる。合計で１５０匹のＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入されたマウスが研究に使用された。各マウスの左下背部皮下にエストロゲン錠剤（０．１８ｍｇ／錠、６０日間徐放）を埋め込み、３日間後に、腫瘍を成長させるために、各マウスの右下背部皮下に腫瘍細胞（１０×１０^６、０．２ｍＬ リン酸塩緩衝液）を埋め込んだ。平均腫瘍体積が約１５０～２００ｍｍ^３になった時点から投与し始めた。被験化合物を毎日経口投与し、投与量は上表に示している。腫瘍体積について、週２回に２次元キャリパーで腫瘍体積を測定し、体積の単位をｍｍ^３とし、下式により計算した。Ｖ＝０．５ａｘｂ^２（式中、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径を表す。）。抗腫瘍薬効は、化合物で処理済み動物の平均腫瘍増加体積を未処理動物の平均腫瘍増加体積で割った結果で確認した。

［実験結果］
被験化合物の抗腫瘍薬効は下記のとおりである。

［実験結論］
本発明の化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形は、ＭＣＦ－７乳がんのヒト腫瘍細胞株に基づいた異種移植（ＣＤＸ）モデルにおいて顕著な抗腫瘍活性を示した。上表に示したように、実験開始から２０日間経った後、未投与動物群の腫瘍体積は最初の１５３ｍｍ^３から５３７ｍｍ^３に急成長したのに対して、同時期の化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形投与動物群の腫瘍体積はただ最初の１５３ｍｍ^３から９８ｍｍ^３に低減し、対照化合物Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ及びＬＹ２８３５２１９投与群より明らかに小さかった。化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の投与量（１８．７５ｍｇ／ｋｇ）が対照化合物ＬＹ２８３５２１９（２５ｍｇ／ｋｇ）又は対照化合物Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ（２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）（実験により、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ高投与量に耐えられないことが証明された）より少ないため、化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の抗腫瘍活性が対照化合物に比べて顕著に優れていると考えられる。

化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形の生体内薬効研究（二）
［実験材料］
皮下移植によるＬＵ－０１－０３９３肺がん患者由来のヒト腫瘍細胞株に基づいた異種移植（ＣＤＸ）ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雌性、６～８週、体重１７～２０ｇ。合計で７２匹、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＩＰＰＲ－Ｂｋ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入。ヒト肺がんＬＵ－０１－０３９３腫瘍（つまり、非小細胞肺がん）は元々外科の切除手術の臨床サンプルに由来するものであり、ヌードマウスに接種された後にＰ０世代と定義され、Ｐ０世代の腫瘍がさらにヌードマウスに接種された場合はＰ１世代と定義され、これにより類推し、ヌードマウスで継代された。ＬＵ－０１－０３９３－ＦＰ５はＰ４蘇生後に移植して得られたものである。本研究の実験ではＦＰ６世代腫瘍組織を用いる。

［実験目的］
被験医薬Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ、ＬＹ２８３５２１９及び化合物ＷＸ＿１ Ａ結晶形のヒト肺がんＬＵ－０１－０３９３細胞皮下異種移植腫瘍モデルにおける生体内薬効を評価する。

［実験方法］
（１）詳細な医薬配合計画

（２）動物実験の群分け及び投与計画

（３）実験操作
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、雌性、６～８週、体重は約１７～２０ｇ、マウスを病原体のない特定な環境、且つ個別換気ケージで収容した。すべてのケージ、寝具及び水は、使用前に消毒作業を行った。全ての動物が規格認証された商業実験室食物を自由に取ることができる。合計で７２匹のＳｈａｎｇｈａｉ ＳＩＰＰＲ－Ｂｋ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入されたマウスが研究に使用された。ＬＵ－０１－０３９３ ＦＰ６腫瘍組織を２０～３０ｍｍ^３に切断し、各マウスの右背部に接種し、腫瘍の成長を待った。腫瘍平均体積が約１７１ｍｍ^３になった時点にランダムに群分けして投与した。被験化合物を毎日経口投与し、投与量は上表に示している。腫瘍直径について、週２回に２次元キャリパーで腫瘍直径を測定し、下式により計算した。Ｖ＝０．５ａｘｂ^２（式中、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径を表す。）。抗腫瘍薬効は、化合物で処理済み動物の平均腫瘍増加体積を未処理動物の平均腫瘍増加体積で割った結果で確認した。

［実験結果］
被験化合物の抗腫瘍薬効は下記のとおりである。

Claims (28)

1. 式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩。
   

   
2. 式（ＩＩ）に示すとおりであり、ｘは０．５～２から選択される請求項１に記載の式（Ｉ）で示される化合物のマレイン酸塩。
   

   
3. ｘは０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２．０から選択される請求項２に記載のマレイン酸塩。
4. ｘは０．８、０．９、１又は１．１である請求項３に記載のマレイン酸塩。
5. ｘは１である請求項４に記載のマレイン酸塩。
6. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項４又は５に記載のマレイン酸塩の結晶形。
   ４．６９±０．２°、１４．０４±０．２°
7. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項６に記載の結晶形。
   ４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２８．２５±０．２°
8. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項７に記載の結晶形。
   ４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１０．０１±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２３．５３±０．２°、２５．１１±０．２°、２７．８０±０．２°、
   ２８．２５±０．２°
9. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項８に記載の結晶形。
   ４．６９±０．２°、９．３５±０．２°、１０．０１±０．２°、１３．２８±０．２°、１４．０４±０．２°、１６．０３±０．２°、１６．８３±０．２°、１７．７３±０．２°、１８．５８±０．２°、１８．７４±０．２°、２０．０８±０．２°、２１．５８±０．２°、２３．５３±０．２°、２５．１１±０．２°、２５．２７±０．２°、２７．８０±０．２°、２８．２５±０．２°、３３．００±０．２°
10. 粉末Ｘ線回折パターンにおいて、特徴的なピークのピーク位置及び強度が下表に示される請求項９に記載の結晶形。
    

    
11. 示差走査熱量曲線が２０８．１８℃±３℃に吸熱ピークを有する請求項６～１０のいずれか１項に記載の結晶形。
12. 熱重量分析曲線における１８８．４９±３℃での減量が０．３１１０±０．２％となる請求項６～１０のいずれか１項に記載の結晶形。
13. （１）マレイン酸と溶媒とを混合する工程と、
    （２）工程（１）の混合物に式（Ｉ）で示される化合物を添加する工程と、
    （３）濾過して乾燥する工程と、
    を備え、
    前記溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチルのうちの１種以上、及びメタノール／水の混合溶媒又はイソプロパノール／水の混合溶媒から選択される請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形の製造方法。
14. さらに、
    （ａ）溶媒を４５～５５℃まで昇温し、次いで請求項１３に記載の製造方法で得られた結晶形を溶媒に添加する工程と、
    （ｂ）４５～５５℃で１～３時間撹拌する工程と、
    （ｃ）冷却し、濾過し、濾過ケーキを溶媒で洗浄する工程と、
    （ｄ）４８～７２時間乾燥する工程と、
    を備え、工程（ａ）及び工程（ｃ）における溶媒はそれぞれ独立して、メタノール、エタノール及びイソプロパノールから選択される１種以上である請求項１３に記載の製造方法。
15. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する式（Ｉ）で示される化合物の結晶形。
    １２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１９．２１±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２４．１４±０．２°
    

    
16. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項１５に記載の結晶形。
    ９．８６±０．２°、１２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１９．２１±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２４．１４±０．２°、２６．２９±０．２°、２７．６９±０．２°
17. 粉末Ｘ線回折パターンは、下記２θ角の位置に特徴的な回折ピークを有する請求項１６に記載の結晶形。
    ９．５６±０．２°、９．８６±０．２°、１１．５３±０．２°、１２．０１±０．２°、１２．８８±０．２°、１４．１８±０．２°、１５．２１±０．２°、１５．６６±０．２°、１６．７２±０．２°、１７．４９±０．２°、１８．７９±０．２°、１９．２１±０．２°、１９．７６±０．２°、２１．０６±０．２°、２１．６５±０．２°、２２．５２±０．２°、２２．９３±０．２°、２４．１４±０．２°、２４．４７±０．２°、２６．２９±０．２°、２７．６９±０．２°、２８．４８±０．２°、２８．７９±０．２°、３０．２５±０．２°、３０．７４±０．２°、３１．６７±０．２°、３４．７９±０．２°、３５．１８±０．２°
18. 粉末Ｘ線回折パターンにおいて、特徴的なピークのピーク位置及び強度が下表に示される請求項１７に記載の結晶形。
    

    
19. 示差走査熱量曲線が２２５．７６℃に吸熱ピークを有する請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形。
20. 熱重量分析曲線に５２．８１℃で０．１３８４％の重量減少がある請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形。
21. 熱重量分析曲線に１８４．８２℃で０．３５６５％の重量減少がある請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形。
22. 熱重量分析曲線に２３０．０３℃で０．４０８６％の重量減少がある請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形。
23. （ｉ）式（Ｉ）
    

    

    
    で示される化合物を溶媒に添加し、７０～１００℃で０．５～２時間撹拌する工程と、
    （ｉｉ）徐々に降温し、８～１６時間静置する工程と、
    （ｉｉｉ）遠心分離し、８～１６時間乾燥する工程と、
    を備え、
    前記溶媒はエタノールと水の混合溶媒であり、エタノールと水の体積比が３：１である式（Ｉ）で示される化合物の結晶形の製造方法。
24. 請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形又は請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形を含む結晶組成物であって、前記請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形又は請求項１５～１８のいずれか１項に記載の結晶形が結晶組成物の重量に対して５０％以上である結晶組成物。
25. 請求項１～５のいずれか１項に記載のマレイン酸塩、請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の結晶形又は請求項２４に記載の結晶組成物を含む医薬組成物であって、請求項１～５のいずれか１項に記載のマレイン酸塩、請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の結晶形又は請求項２４に記載の結晶組成物を治療有効量で含む医薬組成物。
26. ＣＤＫ４／６媒介性疾患を治療するための医薬の製造における請求項１～５のいずれか１項に記載のマレイン酸塩、請求項６～１２のいずれか１項に記載の結晶形、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の結晶形又は請求項２４に記載の結晶組成物の使用。
27. 前記疾患はがんである、請求項２６に記載の使用。
28. 前記がんが乳がん又は肺がんである、請求項２７に記載の使用。

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